KR101320141B1

KR101320141B1 - 면역학적 조성물

Info

Publication number: KR101320141B1
Application number: KR1020117006189A
Authority: KR
Inventors: 필립 랄프 레르바흐; 윌리엄 존 체셔; 지시안 신
Original assignee: 조에티스 더블유 엘엘씨
Priority date: 2008-08-19
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2013-11-13
Also published as: RU2011105863A; AU2009282581B2; WO2010022135A1; CA2734654C; CA2734654A1; ZA201102082B; EP2331126A1; KR20110044791A; JP2012500282A; TW201010719A; CN102186502A; BRPI0917290A2; RU2506094C2; MX2011001910A; HK1157182A1; UA101385C2; AU2009282581A1; BRPI0917290A8; AR076437A1; US20100047279A1

Abstract

본 발명은 설포리포-사이클로덱스트린(SL-CD) 및 사포닌 또는 퀼(Quil) A, 및 선택적으로 하나 이상의 항원을 포함하는 면역학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 하나 이상의 항원(수의학적 항원일 수 있음)을 포함하는 면역학적 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 면역학적 조성물 중 수의학적 항원은 소 항원일 수 있다. 본 발명은 소 유행열 바이러스(BEFV), 소 헤르페스바이러스 1(IBR) 또는 청설병 바이러스(BTV)를 포함하는 면역학적 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서 BEFV, IBR 또는 BTV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 본 발명에서, 특히 면역 반응은 보호성 면역 반응이다. 본 발명은 퀼 A를 바이러스에 첨가함을 포함하는 면역학적 조성물의 제조 방법을 포함한다.

Description

면역학적 조성물{IMMUNOLOGICAL COMPOSITION}

본 발명은 설포리포-사이클로덱스트린(SL-CD) 및 사포닌 또는 퀼(Quil) A, 및 선택적으로 하나 이상의 항원을 포함하는 면역학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 SL-CD, 사포닌 또는 퀼 A 및 항원을 포함하는 면역학적 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 소 유행열 바이러스(BEFV), 소 헤르페스바이러스 1(IBR) 또는 청설병 바이러스(BTV)에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물의 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 면역학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 2008년 8월 19일자로 출원된 제 35 U.S.C. §119(a) 호하의 오스트레일리아 특허 출원 제 2008904261 호 및 2008년 8월 27일자로 출원된 제 35 U.S.C. §119(e) 호하의 미국 특허 출원 제 61/092,091 호를 우선권 주장한다. 이들 특허 출원의 전체 내용은 본원에서 참고로서 인용된다.

사포닌 보조제는 동물용 백신에서 상업적으로 사용되고 있는 보조제의 공지된 부류이다. 사포닌은 다양한 식물 종에서 발견된 2차 대사물 부류이다. 이들은 수용액에서 진탕될 경우 비누형 거품을 생성시킴으로써 현상적으로 그룹화되는 양친매성 글리코시드이다. 구조적으로, 사포닌은 친유성 트라이테르펜 유도체와 조합된 하나 이상의 친수성 글리코시드 잔기로 구성된다. 시판되는 사포닌은 남아메리카 대륙의 나무인 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 및 유카 쉬디게라(Yucca schidigera)로도 불리우는 모하비(Mohave) 유카 식물의 껍질로부터 주로 단리된다. 사포닌은 버그하우젠 코포레이션(Berghausen Corporation)(미국 오하이오주 신시내티 소재)을 비롯한 몇몇 공급처로부터 입수된다. 사포닌의 정제된 형태는 통상 퀼 A로서 지칭되고, 이는 버그하우젠 코포레이션, 써전트 케미칼 컴파니(Sergeant Chemical Company)(미국 뉴저지주 클리프톤 소재), 수퍼포스(Superfos) a/s(덴마크 베드백 소재) 및 브렌타그 바이오섹터(Brenntag Biosector)(덴마크 프레데릭선드 소재)를 비롯한 몇몇 공급처로부터 시판된다. 퀼 A의 물리적 및 화학적 특징은 정제된 사포닌 보조제 퀼 A라는 명칭의 수퍼포스로부터 입수가능한 무역 교본에 기술되어 있다. 퀼 A는 화학적으로 트라이테르페노이드 퀼락산(quillaic acid)에의 글리코시드 연결에서 탄수화물 잔기를 특징으로 한다.

보조제로서 퀼 A를 논의하는 몇몇 미국 특허가 허여되었다. 예를 들면, 미국 특허 제 6,416,764 호 및 제 6,291,228 호는 보조제로서 퀼 A를 사용하고 소 바이러스성 설사증 바이러스의 비세포병원성 균주를 포함하는 백신에 관한 것이다. 미국 특허 제 4,432,969 호는 흡입성 알레르겐 및 사포닌 또는 퀼 A 보조제를 포함하는 흡입성 알레르겐 조성물에 관한 것이다.

미국 특허 제 4,900,549 호는 퀼 A를 함유하는 면역원성 복합체의 제조 방법을 기재한다.

미국 특허 제 6,165,995 호는 SL-CD 유도체의 제법에 관한 것이다. 미국 특허 제 6,610,310 호는 보조제로서 다이온성 중합체, 예컨대 SL-CD에 관한 것이다.

소 유행열(BEF)은 젖소 및 육우, 특히 북오스트레일리아에서 둘 다에게 영향을 미치는 무기력 바이러스 질환이다. 또한, 소를 상업적으로 사육하는 대부분의 아시아 국가에서는 BEF를 인지하고 있다. BEF는 "3일병"으로서 알려져 있으며, 우유 산출에 상당히 영향을 미치거나 육우 및 젖소의 사망을 일으킬 수 있다(문헌[Walker, P.J., 2005, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 292: 57-80]).

BEF의 원인 물질은 소 유행열 바이러스(BEFV)이다. 이 바이러스는 에페메로바이러스(Ephemerovirus) 속으로 분류된 랍도바이러스이다. BEFV 비리온은 탄환 또는 뿔 모양이고, 네가티브 단일 가닥 RNA 게놈을 함유한다. BEFV 게놈은 핵단백질, 중합효소-결합 단백질, 기질 단백질, 대형 RNA-의존 RNA 중합효소 및 두 개의 당단백질을 암호화한다.

수년 동안 오스트레일리아에서 변형된 생 BEF 백신이 이용가능하였으며, 이는 BEF 유행기 전에 매년 추가접종되었다. 이러한 백신은 수의학적 처방을 필요로 하며, 투여 전에 보조제를 함유하는 희석제에 의한 재구성을 필요로 하는 동결-건조된 형태로 존재한다. 면역반응을 겪지 않은 동물(naive animal)은 2회의 백신 투약 후 매년 재접종할 것이 요구된다.

국제 특허 출원 공개 제 WO 1994/004685 호는 BEFV 표면 당단백질을 포함하는 BEFV 백신의 제법에 관한 것이다.

반셀로브(Vanselow) 등의 문헌[1995, Vet. Microbiol. 46: 117-130]은 다양한 BEF 백신 시험을 기재하고 있다.

시에(Hsieh) 등의 문헌[2006, J. Vet. Med. Sci. 68: 543-548]은 바이러스 균주 Tn88128 호 및 Tn73을 사용하는 BEFV 백신에 관한 것이다. 이들 백신은 2가 에틸렌이민 및 수산화알루미늄 또는 물:오일:물 보조제의 첨가에 의해 바이러스를 불활성화시킴으로써 제조된다.

람피 스킨병 바이러스(유형 SA-니트링(SA-Neethling)) 벡터로 클로닝된 BEFV 구조 당단백질을 포함하는 재조합 백신이 문헌[Wallace, D.B. and Viljoen G.J. 2005, Vaccine 23: 3061-3067]에 기재되어 있다.

추앙(Chuang) 등의 문헌[2007, J. Virol. Meth. 145: 84-87]은 RNA 간섭 및 BEFV 표면 당단백질 유전자 발현의 억제를 사용하는 것에 관한 것이다.

소 헤르페스바이러스 1은 또한 감염성 소 비기관염 바이러스로서 공지되어 있다. 이는 BHV 또는 IBR 중 어느 하나로 약칭된다. 소 헤르페스바이러스 1은 소에서 비기관염, 질염, 귀두포피염, 유산, 결막염 및 장염을 비롯한 질병을 유발하는 헤르페스바이러스과(Herpesviridae)의 바이러스이다. 또한, BHV-1은 수송열의 기여 인자이다. 이는 성 접촉, 인공 수정 및 공기 전파를 통해 퍼진다. 다른 헤르페스바이러스와 달리, BHV-1은 바이러스의 오랜 잠복 감염 및 발산을 유발한다. 질병의 중증도 및 발병률을 감소시키는데 이용가능한 백신이 존재한다. BHV-1에 의해 유발된 호흡기 질병은 감염성 소 비기관염으로서 통상적으로 알려져 있다.

청설병 바이러스(BTV)는 오르비바이러스(Orbivirus) 속의 원형 바이러스이며, 이는 이중 가닥 RNA 리오바이러스과(Reoviridae)에 속한다. BTV는 양, 염소, 소 및 사슴과 같은 가축에서 심각한 질병을 유발한다. 24개의 혈청형이 불현성 감염으로부터 급성 전격성 감염에 이르는 문제를 유발하는 것으로서 문헌에 기록되어 있다. 또한, 만성 지속성 바이러스 발산 소가 인지되어 왔다. 가축에서 청설병의 치료를 위한 백신이 이용가능하다.

본 발명은 설포리포-사이클로덱스트린(SL-CD) 및 사포닌, 및 선택적으로 하나 이상의 항원을 포함하는 면역학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 사포닌은 퀼 A이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 항원은 박테리아, 바이러스, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 항원은 수의학적 항원이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 수의학적 항원은 소 항원이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 바이러스 항원은 소 헤르페스바이러스 1(IBR), 청설병 바이러스(BTV) 또는 소 유행열병 바이러스(BEFV)이다. 바이러스 항원은 생-약독화, 재조합, 사멸 또는 불활성화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 항원이 생-약독화된 바이러스인 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 바이러스는 소 유행열 바이러스(BEFV)이다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 바이러스는 동결된 원료, 건조된 원료, 동결-건조된 원료 또는 새로운 원료로부터의 것이다. 다양한 실시양태에서, 사포닌은 약 0.5mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역학적 조성물에 존재한다. 다양한 실시양태에서, 퀼 A는 약 0.1 내지 약 0.2mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역학적 조성물에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역학적 조성물에서 퀼 A는 약 0.158mg/ml의 최종 농도로 존재한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 면역학적 조성물에서 SL-CD는 약 0.2ml/ml의 최종 농도로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 사포닌 및 SL-CD를 포함하거나, 퀼 A 및 SL-CD를 포함하는 본 발명의 면역학적 조성물은 하나 이상의 추가의 보조제를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 추가의 보조제는 수산화알루미늄, SP-오일 및 카보폴로 이루어진 군 중에서 선택된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 항원은 폴리펩타이드이고, 몇몇 실시양태에서 이는 바이러스 아단위이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 바이러스 아단위는 BEFV, IBR 및 BTV로 이루어진 군 중에서 선택된다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 사포닌, SL-CD 및 하나 이상의 수의학적 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서 수의학적 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 면역 반응은 면역원성 조성물의 단일 투여량의 투여 후 유도된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 사포닌, SL-CD, 및 항원으로서 적어도 IBR을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서 IBR에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 사포닌, SL-CD, 및 항원으로서 적어도 BTV를 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서 BTV에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 퀼 A, SL-CD 및 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서 BEFV에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 면역 반응은 면역원성 조성물의 단일 투여량의 투여 후 유도된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 사포닌, SL-CD 및 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서 IBR에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 사포닌, SL-CD 및 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물에서 BTV에 대해 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여 후 유도되는 면역 반응은 보호성 면역 반응이다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 SL-CD를 첨가하기 전에 퀼 A와 바이러스를 조합함으로써 제조된 면역원성 조성물을 제공한다. 바이러스는 생-약독화, 재조합, 사멸 또는 불활성될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 퀼 A 및 바이러스는 실온에서 조합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 퀼 A 및 바이러스는 15분 이상 동안 조합된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 퀼 A 및 바이러스는 120분 이상 동안 조합된다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 동물에서 면역 반응을 유도하는 본 발명의 면역원성 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

다양한 실시양태에서, 본 발명은 BEFV에 의해 유발된 소 유행열 또는 바이러스 감염에 대해 소에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다. BEFV에 대해 면역 반응을 일으키는 방법은 BEFV, SL-CD 및 퀼 A를 포함하는 조성물을 소에게 투여함을 포함한다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 면역학적 효과량의 BEFV, SL-CD 및 퀼 A를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제공한다.

다양한 실시양태에서, 본 발명은 IBR에 의해 유발된 소 비기관염 또는 헤르페스바이러스 감염에 대해 면역 반응을 소에서 일으키는 방법을 제공한다. IBR에 대해 면역 반응을 일으키는 방법은 IBR, SL-CD 및 사포닌을 포함하는 조성물을 소에게 투여함을 포함한다.

다양한 실시양태에서, 본 발명은 BTV에 의해 유발된 소 청설병 또는 바이러스 감염에 대해 면역 반응을 소에서 일으키는 방법을 제공한다. BTV에 대해 면역 반응을 일으키는 방법은 BTV, SL-CD 및 사포닌을 포함하는 조성물을 소에게 투여함을 포함한다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 면역학적 효과량의 IBR, SL-CD 및 사포닌을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제공한다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 면역학적 효과량의 BTV, SL-CD 및 사포닌을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명은 SL-CD, 및 사포닌 또는 퀼 A를 포함하는 면역학적 조성물이 하나 이상의 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있다는 발견에 일부 기초한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 항원은 박테리아, 바이러스, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 항원은 수의학적 항원이다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 수의학적 항원은 소 항원일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 수의학적 항원은 바이러스 항원일 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 바이러스 항원은 BEFV, IBR 또는 BTV의 균주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. BEFV는 오스트레일리아, 아프리카, 중동 및 아시아에서 소 유행열을 유발하는 것으로 공지된 랍도바이러스이다. BEFV의 많은 균주, 예컨대 BB2271-919 및 그의 모 균주(919), TN73, Tn88128, BEFV2001의 균주 1-11, 또는 BEFV2004의 균주 1-3이 공지되어 있다. 균주의 선택은 본 발명의 면역원성 조성물이 사용되는 나라마다 다를 수 있다. 소 헤르페스바이러스 1은 또한 BHV 또는 IBR로서 지칭되며, 이는 소에서 비기관염, 질염, 귀두포피염, 유산, 결막염 및 장염을 비롯한 질병을 유발하는 헤르페스바이러스과의 바이러스이다. 또한, IBR은 수송열의 기여 인자이다. 이는 성 접촉, 인공 수정 및 공기 전파를 통해 퍼진다. 다른 헤르페스바이러스와 달리, IBR은 바이러스의 오랜 잠복 감염 및 발산을 유발한다. IBR에 의해 유발된 호흡기 질병은 감염성 소 비기관염으로서 통상적으로 알려져 있다.

청설병 바이러스(BTV)는 오르비바이러스 속의 원형 바이러스이며, 이는 이중 가닥 RNA 리오바이러스과에 속한다. BTV는 양, 염소, 소 및 사슴과 같은 가축에서 심각한 질병을 유발한다. 24개의 혈청형이 불현성 감염으로부터 급성 전격성 감염에 이르는 문제를 유발하는 것으로서 문헌에 기록되어 있다. 또한, 만성 지속성 바이러스 발산 소가 인지되어 왔다. 청설병은 오스트레일리아, 북아메리카, 아프리카, 중동, 아시아 및 유럽에서 관찰되었다.

본 발명의 다양한 실시양태에서, 면역원성 조성물 중 바이러스는 생-약독화, 재조합, 사멸 또는 불활성될 수 있다. 생-약독화된 바이러스의 제조 방법은 문헌에 공지되어 있다. 예를 들면, 바이러스는 외래 숙주, 예컨대 조직 배양물, 수정란 또는 살아 있는 동물을 통한 바이러스의 대이음을 통해 약독화될 수 있다. 약독화된 BEFV는 소가 아닌 세포에서 선호적 성장을 위해 선택될 수 있고, 선택 과정시에 소 세포에서 덜 성장할 수 있게 된다. 이러한 약독화된 균주가 소 숙주에서 열등하게 복제되므로, 상기 균주가 소에 주어지는 경우 질병이 아닌 면역성을 일으킨다. 바이러스가 천연 숙주에 대한 발병력을 감소시키고 새로운 숙주에 대한 발병력을 증가시키는 경우 바이러스가 약독화되었다고 부른다. 몇몇 약독화된 바이러스 균주는 자연적으로 발생할 수 있다. 유전 공학 처리를 사용하여 소정의 방식으로 바이러스를 약독화시킬 수도 있다. 면역원성 조성물, 백신 및 방법에 사용되는 사멸된 또는 불활성된 바이러스의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 화학적 불활성 과정에서, 적합한 바이러스 샘플, 또는 상기 바이러스를 함유하는 혈청 샘플이 충분한 시간 동안 충분히 높은(또는 불활성화제에 따라 낮은) 온도 또는 pH에서 충분한 양 또는 농도의 불활성제로 처리하여 바이러스를 불활성화시킨다. 예를 들면, 바이러스는 불활성화제, 예컨대 포르말린, 2가 에틸렌이민(BEI), 또는 소수성 용매, 산 등으로 처리될 수 있다. 바이러스는 자외선 또는 X-선에 의한 조사 또는 가열 등에 의해 불활성화될 수 있다. 가열에 의한 불활성화는 바이러스를 불활성화시키는데 충분한 시간 및 온도에서 수행된다. 조사에 의한 불활성화는 바이러스를 불활성화시키는데 충분한 시간 동안 빛의 파장 또는 다른 에너지원을 사용하여 수행된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물은 생-약독화된 바이러스를 포함한다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물은 동결된 원료, 건조된 원료 또는 새로운 원료로부터 수득한 항원을 포함한다. 항원이 건조된 원료로부터 수득되는 경우, 이는 동결-건조된 원료로부터 수득될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 동결된 원료로부터의 항원을 포함한다.

사포닌은 식물 및 해산 동물계에 널리 분포하는 스테로이드 또는 트라이테르펜 글리코시드이다. 사포닌은 물에서 콜로이드성 용액을 형성하는 것으로 명시되어 있고, 이는 진탕시 거품을 형성하며, 콜레스테롤을 침전시킨다. 사포닌이 세포막 근처인 경우, 이들은 막에서 공극형 구조를 생성하고, 이는 막을 파열시킨다. 사포닌은 동물용 백신에서 보조제로서 사용된다. 개별 사포닌의 보조제 및 용혈성 활성은 광범위하게 연구되었다(문헌[(Lacaille-Dubois and Wagner, 1996, "A review of the biological and pharmacological activities of saponins" Phytomedicine vol 2 pp 363-386]). 사포닌은 다양한 식물 종에서 발견된 2차 대사물 부류이다. 이들은 수용액에서 진탕될 경우 비누형 거품을 생성시킴으로써 현상적으로 그룹화되는 양친매성 글리코시드이다. 구조적으로, 사포닌은 친유성 트라이테르펜 유도체와 조합된 하나 이상의 친수성 글리코시드 잔기로 구성된다. 시판되는 사포닌은 퀼라자 사포나리아 몰리나 및 유카 쉬디게라로부터 주로 추출된다. "퀼 A"는 사포닌의 정제된 형태를 지칭한다.

사포닌은 약 0.4 내지 약 0.6mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 사포닌은 약 0.5mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 퀼 A는 약 0.1 내지 약 0.2mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 퀼 A는 약 0.12 내지 약 0.18mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 퀼 A는 약 0.14 내지 약 0.16mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 퀼 A는 약 0.158mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 퀼 A는 약 0.158mg/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재한다.

스쿠알란 수중 에멀젼 중 설포리포-사이클로덱스트린(SL-CD/스쿠알란)은 다양한 백신의 제조에 사용된다. SL-CD/스쿠알렌은 문헌[Hilgers et al, Sulfolipo-cyclodextrin in squalane in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. Vaccine 17 (1999), pp. 219-228; Fort Dodge Animal Health Holland, Weesp, The Netherlands]에 의해 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

SL-CD는 약 0.09 내지 약 0.3ml/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. SL-CD는 약 0.1ml/ml, 약 0.15ml/ml, 약 0.17ml/ml, 약 0.2ml/ml 또는 약 0.25ml/ml의 최종 농도로 본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 퀼 A 및 SL-CD 외에도 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 추가의 보조제는 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 당해 분야에 공지된 보조제 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 사포닌 및 SL-CD를 포함하는 면역학적 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 사포닌, SL-CD 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역학적 조성물을 동물에게 투여함을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 항원은 수의학적 항원이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 수의학적 항원은 소 항원이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 수의학적 항원은 바이러스 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스 항원은 BEHV, IBR 또는 BTV이다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스는 생-약독화, 재조합, 사멸 또는 불활성된다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스는 사멸된다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 동결된 원료, 건조된 원료 또는 새로운 원료로부터 수득된다. 항원이 건조된 원료로부터 수득되는 경우, 이는 동결-건조된 원료로부터 수득될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 동결된 원료로부터 수득된다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 퀼 A 및 SL-CD를 포함하는 면역학적 조성물을 동물에게 투여함을 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 퀼 A, SL-CD 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역학적 조성물을 동물에게 투여함을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법에 사용된 하나 이상의 항원은 수의학적 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법에 사용된 수의학적 항원은 소 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 바이러스 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스 항원은 IBR, BEFV 또는 IBR이다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스 항원은 생-약독화, 재조합, 사멸 또는 불활성화된다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스는 생-약독화된다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 동결된 원료, 건조된 원료 또는 새로운 원료로부터 수득된다. 항원이 건조된 원료로부터 수득되는 경우, 이는 동결-건조된 원료로부터 수득될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 동결된 원료로부터 수득된다.

본 발명의 면역원성 조성물은 다중 투여량으로 투여 한 후 면역 반응을 유도할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 2회 투여량으로 투여한 후 면역 반응을 유도할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 단일 투여량으로 투여한 후 면역 반응을 유도한다. 본 발명의 면역원성 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 보호성 면역 반응일 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물을 최초 투여량으로 투여한 후, 약 4주 후에 추가접종량을 투여하여 면역원성 반응을 향상시킬 수 있다. 추가의 추가접종량을 또한 투여할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 동물에서 면역 반응을 유도하는 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 키트는 사포닌 및 SL-CD, 및 선택적으로 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 사포닌은 퀼 A이다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 하나 이상의 항원은 수의학적 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 수의학적 항원은 소 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 수의학적 항원은 바이러스 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 바이러스 항원은 BEFV, IBR 또는 BTV이다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 항원은 생-약독화, 재조합, 사멸 또는 불활성화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 항원은 생-약독화된다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 항원은 사멸된다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 항원은 동결된 원료, 건조된 원료 또는 새로운 원료로부터 수득될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 키트 중 항원은 동결된 원료로부터 수득된다.

본 발명은 SL-CD 및 사포닌 및/또는 퀼 A를 포함하고 하나 이상의 추가의 보조제를 포함할 수 있는 키트, 면역학적 조성물 및 백신을 제공한다. 사용될 수 있는 보조제 중에서, 예를 들면 수산화알루미늄, 아브리딘, 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(또한 DDAB 또는 DODAB로서 공지됨), 폴리포스파젠, 미네랄 오일에 기초한 수중유 에멀젼, 예컨대 SPT 에멀젼(예를 들면, 문헌[Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, edited by Michael F. Powel and Mark J. Newman, Plennum Press, New York and London, pages 147-204]을 참고), 미국 특허 제 6,368,601 호에 기재된 바와 같이 대사성 오일에 기초한 유중수 에멀젼 및 미국 특허 제 5,422,109 호에 기재된 에멀젼을 언급할 수 있다. 다른 적합한 보조제의 예는 스쿠알란 및 스쿠알렌(또는 동물 기원의 다른 오일); 블록 공중합체, 예컨대 플루로닉(pluronic, 등록상표명)(L121) 사포닌; 세제, 예컨대 트윈(Tween, 등록상표명)-80, 미네랄 오일, 예컨대 다케올(DRAKEOL, 등록상표명) 또는 마르콜(Marcol, 등록상표명); 식물성 오일, 예컨대 땅콩유; 코리네박테리움-유래된 보조제, 예컨대 코리네박테리움 파붐; 프로피오니박테리움-유래된 보조제; 미코박테리움 보비스(바실러스 칼메트(Bacillus Calmette) 및 구에린(Guerinn) 또는 BCG); 인터류킨, 예컨대 인터류킨 2 및 인터류킨 -12; 모노카인, 예컨대 인터류킨 1; 종양 괴사 인자; 인터페론, 예컨대 감마 인터페론; 리포솜; 이스콤 보조제; 미코박테리아 세포벽 추출물; 합성 글리코펩타이드, 예컨대 무라밀 다이펩타이드 또는 다른 유도체; 아브리딘; 지질 A; 덱스트란 설페이트; 인산알루미늄을 갖는 DEAE-덱스트란 또는 DEAE-덱스트란; 카복시폴리메틸렌, 예컨대 카보폴(Carbopol, 등록상표명); EMA; 아크릴성 공중합체 에멀젼, 예컨대 네오크릴(Neocryl, 등록상표명) A640(미국 특허 제 5,047,238 호 참고); 백시니아 또는 동물 폭스바이러스 단백질; 아바이러스 입자 보조제, 예컨대 오르비바이러스; 콜레라 독소; 다이메틸이디오클레데실암모늄 브로마이드; 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 보조제는 계면활성제(예컨대, 헥사데실아민, 옥타데실아닌, 리소레시틴, 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-다이옥타데실-n'-N-비스(2-하이드록시에틸프로페인 다이아민), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루로닉 폴리올); 다가음이온(예컨대, 피란, 덱스트란 설페이트, 폴리 IC, 폴리아크릴산, 카보폴), 펩타이드(예컨대, 무라밀 다이펩타이드, 다이메틸글리신, 투프트신), 오일 에멀젼, 알룸 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 또한, 보조제들의 조합물을 선택할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 추가의 항원, 예컨대 SL-CD를 첨가하기 전에 퀼 A와 항원을 조합함으로써 제조된 면역원성 조성물을 제공한다. 당해 분야의 숙련자는 바이러스와 퀼 A의 조합이 효과적인 바이러스 역가를 낮출 것임을 이해한다(문헌[Walker, P.J., 2005, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 292: 57-80]). 하나 이상의 다른 성분을 면역원성 조성물에 첨가하기 전에 퀼 A와 항원의 조합을 임의의 시간 동안 수행할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 면역원성 조성물이 하나 이상의 다른 성분을 면역원성 조성물에 첨가하기 전에 여러 시간 동안 퀼 A와 항원을 조합함으로써 제조될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들면, 퀼 A 및 항원은 5분 이상 내지 200분 이상 동안 조합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 퀼 A 및 항원은 10분 이상 내지 190분 이상을 비롯한 임의의 시간 동안 조합된다. 몇몇 실시양태에서, 퀼 A 및 항원은 15분 이상 동안 조합된다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 면역원성 조성물이 여러 온도 중 어느 한 온도에서 퀼 A와 항원을 조합함으로써 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 퀼 A와 항원의 조합은 생성된 조성물이 면역원성인 한 실온 이하 또는 이상의 온도에서 수행될 수 있다. 퀼 A와 항원은 실온에서 조합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, SL-CD를 첨가하기 전에 퀼 A와 항원을 조합함으로써 제조된 면역원성 조성물 중 항원은 바이러스이다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스는 BEFV이다. 몇몇 실시양태에서, 바이러스는 생-약독화, 재조합, 사멸 또는 불활성화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 생-약독화된다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 동결된 원료, 건조된 원료 또는 새로운 원료로부터 수득될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 동결된 원료로부터 수득된다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 사포닌 및 SL-CD를 포함하는, 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물은 사포닌 및 SL-CD, 및 하나 이상의 항원을 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물 중 사포닌은 퀼 A이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물 중 하나 이상의 항원은 박테리아, 바이러스, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물에서 하나 이상의 항원은 수의학적 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물에서 수의학적 항원은 소 항원이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물에서 항원은 바이러스 항원이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 바이러스 항원은 적어도 BEFV, BTV 또는 IBR의 균주이다. 몇몇 실시양태에서, 사포닌 또는 퀼 A는 SL-CD를 첨가하기 전에 바이러스 항원에 첨가된다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 생-약독화, 재조합, 사멸 또는 불활성화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 생-약독화된다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 사멸된다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 동결된 원료, 건조된 원료 또는 새로운 원료로부터 수득될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항원은 동결된 원료로부터 수득된다.

본 발명의 면역학적 조성물은 당해 분야에 표준인 방법에 의해 바이러스 배양물로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 바이러스는 조직 배양 세포, 예컨대 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포(베로(Vero) 세포), 인간 이배체 섬유모세포, MDBK(마딘-다비(Mardin-Darby) 소 신장) 또는 다른 소 세포에서 증식될 수 있다. 바이러스의 성장은 표준 기법(세포병원성 효과, 면역형광 또는 다른 항체계 분석의 관찰)에 의해 모니터되고, 충분히 높은 바이러스 역가가 달성되는 경우(예컨대, 10⁶ TCID₅₀/ml) 수집한다. 바이러스 원료는 백신 제형에 포함시키기 전에 통상적인 방법으로 더욱 농축하거나 동결건조시킬 수 있다. 바이러스 원료의 다른 제조 방법(예컨대, 문헌[Thomas, et al., 1986, Agri-Practice, 7 (5):26-30]에 기재된 것들)을 사용할 수 있다.

본 발명의 면역학적 조성물은 다가 면역학적 조성물의 성분으로서, 즉 다른 면역학적 조성물과 조합하여 또는 단독으로 주어질 수 있다. 면역원성 제형 중 바이러스는 살아있거나 사멸될 수 있고; 생 또는 사 바이러스 중 하나는 동결건조되고, 선택적으로 당해 분야에 공지된 바와 같이 재구성될 수 있다. 면역원성 조성물은 키트 내에 제공될 수 있으며, 이는 또한 면역원성 조성물을 동물 대상(예컨대, 가축, 유제류, 반려 동물) 또는 새(예컨대, 가금류)에게 투여하기 위한 적절한 라벨 및 지침서를 포함할 수 있다.

SL-CD, 및 사포닌 또는 퀼 A; 및 하나 이상의 바이러스 항원을 포함하는 면역원성 조성물은 또한 약학적으로 및 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 크고 느린 대사작용을 하는 거대분자, 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자를 포함한다. 또한, 약학적으로 및 수의학적으로 허용가능한 염, 예를 들면 미네랄 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 또는 설페이트 및 유기산, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 또는 벤조에이트의 염이 백신에 사용될 수 있다. 또한, 백신은 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올, 및 습윤화제, 에멀젼화제 또는 pH 완충제와 같은 물질을 함유할 수 있다. 또한, 리포솜이 사 바이러스용 담체로서 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제 5,422,120 호, 국제 특허 출원 공개 제 WO 95/13796 호, 제 91/14445 호 또는 유럽 특허 제 524,968 B1 호를 참고한다).

본 발명의 면역원성 조성물은 근육내 또는 피하 경로에 의해, 또는 비강내, 복강내, 정맥내, 피내, 기관지내 또는 구강 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 분무, 안구 접종 또는 난절법에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물을 포유동물(예컨대, 가축, 유제류 또는 반려 동물)에게 전달하는 또 다른 편리한 방법은 구강 투여(예컨대, 섭식 또는 음용 또는 미끼에 의해)에 의한 것이다. 면역원성 조성물로 거름을 주거나 사료와 혼합하는 것이 특히 편리하다. 전형적으로, 거대 동물(예를 들면, 가축/유제류, 예컨대 소)은 면역원성 조성물의 투여량 당 약 10⁶ TCID₅₀/ml, 아마도 10^6,5내지 10⁷, TCID₅₀이 투약된다.

단일-투여량 투여를 위해, 면역원성 조성물은 약 10⁴ 내지 약 10⁷ TCID₅₀/ml, 바람직하게는 10⁶ TCID₅₀/ml에 해당하는 BEFV 양을 함유해야 한다. 면역원성 조성물 약 1 내지 5ml, 바람직하게는 2ml가 동물에게 근육내, 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다.

면역원성 조성물은 약 6.8 logs/ml에 해당하는 IBR 양을 함유해야 한다. IBR을 포함하는 면역원성 조성물 약 1 내지 5ml, 바람직하게는 2ml가 동물에게 근육내, 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다.

면역원성 조성물은 BTV 혈청형 1의 약 10^6.7TCID₅₀및/또는 BTV 혈청형 8의 약 10^7.3TCID₅₀에 해당하는 BTV 양을 함유해야 한다. BTV를 포함하는 면역원성 조성물 약 1 내지 5ml, 바람직하게는 2ml가 동물에게 근육내, 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다.

면역원성 조성물의 제법은 문헌, 예를 들면 상기 언급한 문헌[Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach] 및 문헌["Vaccines"(2008, fifth edition, Plotkin, S.A. et al., editors, Saunders Elsevier)]에서 발견된다.

본 발명은 동물에서 BEF, IBR 또는 BTV 감염을 예방하고 치료하는데 특히 유용한 면역학적 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 면역원성 조성물이 BEF, IBR 또는 BTV 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는 동물에서 상기 감염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 면역원성 조성물은 근육내 또는 피하 주사에 의해 또는 비강내, 기관내, 구강, 피부, 경피 또는 피내 투여를 통해 투여될 수 있다. 바람직하게는, BEFV, IBR 또는 BTV 백신에 있어서, 백신접종은 피하 또는 근육내이며, 근육내가 가장 바람직하다. BEFV, IBR 또는 BTV에 대한 생 백신은 바람직하게는 6개월령으로부터 투여된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 면역학적 효과량의 조성물을 함유하는 백신의 경구, 비강, 피하, 피내, 복강내, 근육내 또는 분무 투여(또는 이들의 조합)를 포함하는, 하나의 감염원 또는 동시에 다양한 감염원에 대한 동물, 특히 소의 면역화 방법을 제공한다.

정의

본원에서 사용되는 용어는 당해 분야의 숙련자에게 인식되고 공지된 의미를 갖지만, 편리성과 완성도를 위해 특정 용어 및 그의 의미를 하기에서 기술하였다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 용어는 달리 명확하게 기재되지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면 "방법"에 관한 대상은 본원에서 기재된 유형의 하나 이상의 방법들 및/또는 단계들을 포함하고/하거나 이들은 본 개시물 등을 읽을 때 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다.

용어 "약" 또는 "대략"은 통계적으로 유의적인 값의 범위 내에 속함을 의미한다. 그러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 10 자리 수 이내, 전형적으로 50% 이내, 보다 전형적으로 20% 이내, 보다 더 전형적으로 10% 이내, 훨씬 더 전형적으로 5% 이내에 속할 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포괄되는 허용가능한 변형은 연구 중인 특정 시스템에 따라 좌우되며, 당해 분야의 숙련자에 의해 즉시 이해될 수 있다.

BEFV의 "감염 단위"는 조직 배양 세포의 50%를 사멸하거나 감염시키는데 필요한 바이러스의 양으로서 정의된다. 이는 50% 조직 배양 감염성 투여량 또는 TCID₅₀으로서 표현될 수 있다.

바이러스가 천연 숙주에 대한 발병력을 감소시키는 경우 바이러스는 약독화되었다고 불린다. 바이러스에 의해 감염되기 쉬운 세포에서 바이러스가 증식할 수 없는 경우 바이러스는 불활성화된 것으로 간주된다.

용어 "항원"은 때때로 면역 반응을 자극시키는 분자를 의미한다. 항원은 적응성 면역계에 의해 인식될 수 있는 임의의 물질이다. 항원은 일반적으로 단백질 또는 다당류이다. 항원은 박테리아, 바이러스 또는 다른 미생물의 일부, 예컨대 코트, 캡슐, 세포벽, 편모, 술 또는 독소일 수 있다. 또한, 항원은 지질 또는 핵산일 수 있다. 조성물에 사용되는 항원은 새로운 배양물, 동결된 원료, 동결-건조된 원료 또는 임의의 다른 통상적으로 이용가능한 원료로부터 수득될 수 있다. 항원이 바이러스인 경우, 이는 생-불활성화 또는 약독화될 수 있다.

"보조제"는 조성물, 전형적으로 백신 조성물의 항원성을 향상시키는 하나 이상의 물질을 의미한다. 보조제는 항원을 서서히 방출시키는 조직 데포(depot)로서 작용할 수 있으며, 또한 면역 반응을 비특이적으로 향상시키는 림프구 시스템 활성제로서 작용할 수 있다(문헌[Hood, et al., Immunology, Second Ed., Menlo Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. p. 384]). 종종, 보조제의 부재하에 항원 단독에 의한 1차 백신접종은 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도하지 못할 것이다. 또한, 환경에 따라, 보조제의 부재하에 항원 단독에 의한 1차 공격은 충분한 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도하지 못할 수 있다. 다수의 사이토카인 또는 림포카인이 면역-조절 활성을 갖는 것으로 입증되어 왔으며, 따라서 이들은 보조제로서 유용하고, 예를 들면 인터류킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예컨대, 미국 특허 제 5,723,127 호 참고), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이 형태); 인터페론-α, β 및 γ; 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)(예컨대, 미국 특허 제 5,078,996 호 참고); 대식세포 집락 자극 입자(M-CSF); 과립구 집락 자극 인자(G-CSF); 및 종양 괴사 인자 α 및 β가 있다. 본원에 기재된 면역원성 조성물과 함께 유용한 또 다른 보조제는 비제한적으로 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-1), 대식세포 염증성 단백질(MIP), 예컨대 MIP-1α 및 MIP-1β, 또한 CCL-3 및 CCL-4로서 공지됨; 및 발현되고 분비된 정상 T 세포 활성화 조절(Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted, RANTES); 부착 분자, 예컨대 셀렉틴, 예를 들면 L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴; 뮤신-유사 분자, 예컨대 CD34(또한 시알로포린, 류코시알린 또는 SPN으로도 공지됨), GlyCAM-1 및 MadCAM-1; 인테그린 과의 구성원, 예컨대 림프구 작용-관련 분자 LFA-1, 2 및 3, VLA-1, Mac-1 및 p150.95; 면역글로불린 상과의 구성원, 예컨대 혈소판 내피 세포 부착 분자(PECAM), 세포간 부착 분자, 예컨대 ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4 및 ICAM-5, CD2 및 LFA-3; 공동-자극 분자, 예컨대 CD40 및 CD40L; 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, B7.2, PDGF, BL-1 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한 성장 인자; Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6을 비롯한 수용체 분자; 및 카스파제(Caspase)(ICE)를 포함한 케모카인을 포함한다.

면역 반응을 향상시키는데 사용되는 적합한 보조제는 비제한적으로 MPL(상표명)(3-O-데아실화된 모노포스포릴 지질 A, 미국 몬타나주 하밀톤 소재의 코릭사(Corixa))을 추가로 포함하며, 이는 미국 특허 제 4,912,094 호에 기재되어 있다. 또한, 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 이들의 유도체 또는 유사체가 보조제로서 사용하기에 적합하며, 이들은 코릭사(미국 몬타나주 하밀톤 소재)로부터 입수가능하며, 미국 특허 제 6,113,918 호에 기재되어 있다. 이러한 한가지 AGP는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노] 에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노사이드이며, 이는 또한 529로서 공지되었다(이전에는 RC529로서 공지됨). 이러한 529 보조제는 수성 형태(AF) 또는 안정한 에멀젼(SE)으로서 제형화된다.

또 다른 보조제는 무라밀 펩타이드, 예컨대 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닌-2-(1'-2' 다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE); 수중유 에멀젼, 예컨대 MF59(국제 특허 출원 공개 제 WO 90/14837 호)[모델 110Y 초고압유화기(Microfluidizer)(미국 메사추세스주 뉴톤 소재의 마이크로플루이딕스(Microfluidics))를 사용하여 서브마이크론 입자로 제형화되는, 5% 스쿠알렌(Squalene), 0.5% 트윈(등록상표명) 80 및 0.5% 스판(Span) 85(선택적으로 다양한 양의 MTP-PE를 함유함)를 함유함], 및 SAF[서브마이크론 에멀젼으로 초고압유화되거나 와동되어 거대 입자 크기 에멀젼을 형성하는, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유함]; 불완전 프레운드(Freund) 보조제(IFA); 알루미늄 염(알룸), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄; 암피겐(Amphigen); 아브리딘; L121/스쿠알렌; D-락타이드-폴라락타이드;글리코시드; 플루론산 폴리올; 사멸된 보르데텔라(Bordetella); 사포닌, 예컨대 스티물론(Stimulon, 상표명) QS-21(미국 메사추세스주 프라밍검 소재의 안티제닉스(Antigenics))(미국 특허 제 5,057,540 호에 기재됨), ISCOMATRIX(오스트레일리아 파크빌 소재의 CSL 리미티드(CSL Limited))(미국 특허 제 5,254,339 호에 기재됨), 및 면역자극 복합체(ISCOMS); 미코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis); 박테리아성 지질다당류; 합성 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 미국 특허 제 6,207,646 호에 기재됨); IC-31(오스트리아 비엔나 소재의 인터셀 AG(Intercell AG))(유럽 특허 제 1,296,713 호 및 제 1,326,634 호에 기재됨); 백일해 독소(PT) 또는 이의 돌연변이, 콜레라 독소 또는 이의 돌연변이(예컨대 국제 특허 출원 공개 제 WO 00/18434 호, 제 WO02/098368 호 및 제 WO02/098369 호); 또는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 열-불안정성 독소(LT), 특히 LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129를 포함하고, 예컨대, 국제 특허 출원 공개 제 WO 93/13302 호 및 제 WO 92/19265 호를 참고한다.

본 발명의 조성물에 첨가될 수 있는 보조제는 SL-CD, 수산화알루미늄, Sp-오일, 또는 카보폴, 또는 대사성 오일, 예컨대 하나 이상의 불포화 테르펜 탄화수소, 예를 들면 스쿠알렌 또는 스쿠알란 및 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체, 예컨대 플루로닉(등록상표명)을 포함할 수 있다.

용어 "포유동물"은 단공류(예컨대, 오리너구리), 유대류(예컨대, 캥거루) 및 태반류를 포함하며, 이들은 가축(식품, 우유 또는 섬유를 위해 사육되는 가축, 예컨대 돼지, 양, 소 및 말) 및 반려 동물(예컨대, 개, 고양이)을 포함한다. "유제류"는 소(소 동물), 물소, 들소, 양, 돼지, 사슴, 코끼리 및 야크를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 각각은 다 자란 형태 및 발육중인 형태(예컨대, 송아지, 새끼 돼지, 새끼 양 등)를 포함한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 다 자란 포유동물 또는 발육중인 포유동물, 바람직하게는 가축에게 투여될 수 있다.

"면역학적 효과량"은 면역 반응을 유도하는 항원의 양이다. 소 유행열 바이러스(BEFV)의 면역학적 효과량은 소 유행열 바이러스에 대해 면역 반응을 유도하는 BEFV의 양이다. 소 헤르페스바이러스 1(IBR)의 면역학적 효과량은 IBR 감염에 대해 면역 반응을 유도하는 IBR의 양이다. 청설병 바이러스(BTV)의 면역학적 효과량은 BTV 감염에 대해 면역 반응을 유도하는 BTV의 양이다. "면역학적 효과량"은 수용자 동물의 종, 품종, 나이, 크기 및 건강 상태에 따라 좌우된다. "면역학적 효과량"은 하나 이상의 균주가 바이러스의 악성 균주 또는 비악성 균주인지 아닌지 간에 동물이 항원의 하나 이상의 균주로 미리 노출되는 것에 영향을 받는다. 본원에서 사용되는 소 유행열 바이러스(BEFV)의 "면역학적 효과량"은 하나 이상의 적합한 보조제와 함께 사용되는 경우 소 유행열 바이러스의 면역원성을 향상시키기에 충분하며 따라서 악성 소 유행열 바이러스 균주에 의한 공격에 대해 보호성 면역을 제공하는 BEFV의 양이다. 하나의 실시양태에서, BEFV의 면역학적 효과량은 조성물 1ml 당 약 10^6.20 TCID₅₀이다.

본원에서 사용되는 소 헤르페스바이러스 1(IBR)의 "면역학적 효과량"은 하나 이상의 적합한 보조제와 함께 사용되는 경우 소 헤르페스바이러스의 면역원성을 향상시키기에 충분하며 따라서 악성 소 헤르페스바이러스 균주에 의한 공격에 대해 보호성 면역을 제공하는 양이다. 하나의 실시양태에서, IBR의 면역학적 효과량은 조성물 1ml 당 약 6.8 logs이다.

본원에서 사용되는 청설병 바이러스(BTV)의 "면역학적 효과량"은 하나 이상의 적합한 보조제와 함께 사용되는 경우 청설병 바이러스의 면역원성을 향상시키기에 충분하며 따라서 악성 청설병 바이러스 균주에 의한 공격에 대해 보호성 면역을 제공하는 양이다. 하나의 실시양태에서, BTV의 면역학적 효과량은 조성물 1ml 당 약 10^6.7 TCID₅₀의 BTV 혈청형 1 및/또는 약 10^7.3 TCID₅₀의 BTV 혈청형 8이다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 바이러스 항원은 적어도 감염성 소 헤르페스바이러스 1(또한 소 비기관염 바이러스 또는 IBR로서 지칭됨), 파라인플루엔자 바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 소 바이러스성 설사증 바이러스, 구제역 바이러스, 청설병 바이러스, 소 유행열 바이러스, 개 파보바이러스, 개 홍역 바이러스, 개 아데노바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스, 개 코로나바이러스, 광견병 바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 캘리시바이러스, 고양이 바이러스성 비기관염 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 말 뇌척수염 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 말 헤르페스(비폐렴) 바이러스, 말 동맥염 바이러스, 돼지 파보바이러스, 돼지 시로코 바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스, 돼지 로타바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 가성광견병 바이러스, 감염성 에프낭병 바이러스, 마렉(Marek)병 바이러스, 뉴캐슬(Newcastle)병 바이러스, 감염성 기관지염 바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스의 균주일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "바이러스 아단위"는 비리온의 일부를 의미한다. 예를 들면, 소 유행열 바이러스(BEFV) 아단위는 BEFV 비리온의 적어도 일부, BEFV 게놈의 적어도 일부, BEVF-암호화된 단백질의 적어도 일부, 예컨대 BEFV 핵단백질, BEFV 중합효소-결합 단백질, BEFV 기질 단백질, BEFV RNA-의존 RNA 중합효소, 또는 BEFV 당단백질일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 조성물이 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있음을 의미한다. 면역원성 균주는 또한 항원성이다. 면역원성 조성물은 동물에게 투여되는 경우 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 조성물이다.

용어 "면역원성 조성물"은 항원, 예컨대 미생물을 함유하는 임의의 약학 조성물을 지칭하며, 이 조성물은 동물에서 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 면역 반응은 T 세포 반응, B 세포 반응, 또는 T 세포 및 B 세포 반응 둘 다를 포함할 수 있다. 조성물은 세포 표면에서 MHC 분자와 결합된 항원 제시에 의해 포유동물을 민감화시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 항원-특이적 T-림프구 또는 항체가 면역화된 숙주의 추가 보호를 허용하기 위해 생성될 수 있다. "면역원성 조성물"은 살아 있는, 약독화된, 또는 사멸된/불활성화된 항원을 포함할 수 있다. 항원은 전체 미생물 또는 그로부터 유래된 면역원성 부분일 수 있으며, 이들은 면역 반응을 유도한다. 면역원성 조성물은 미생물에 의해 감염과 관련된 하나 이상의 증상으로부터 동물을 보호할 수 있거나, 미생물에 의한 감염으로 인한 사망으로부터 동물을 보호할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "비경구 투여"는 위장관을 통해서라기 보다 몇몇 다른 수단에 의해, 특히 정맥내, 피하, 근육내 또는 척수내 주사에 의해 물질을 유기체에 도입시키는 투여, 뿐만 아니라 투여의 다른 비구강 또는 비비강 경로, 예컨대 복강내 주사 또는 국소 투여를 의미한다.

용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 본원에서 호환적으로 사용되며, 동물에서 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 면역원성 조성물을 포함하는 약학 조성물을 지칭한다. 백신 또는 백신 조성물은 감염으로 인한 질병 또는 가능한 사망으로부터 동물을 보호할 수 있고, 활성 성분의 면역학적 활성을 향상시키는 하나 이상의 추가의 성분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 백신 또는 백신 조성물은 약학 조성물에 전형적인 추가의 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 추가의 성분은, 예를 들면 하나 이상의 보조제 또는 면역조절제를 포함할 수 있다. 백신의 면역학적 활성 성분은 그의 원시 형태의 완전한 생 유기체, 또는 변형된 생 백신에서 약독화된 유기체, 또는 사멸된 또는 불활성화된 백신, 또는 바이러스의 하나 이상의 면역원성 성분을 포함하는 아단위 백신, 또는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 제조된 유전 공학 처리되거나, 돌연변이되거나 클로닝된 백신에서 적절한 방법에 의해 불활성화된 유기체를 포함할 수 있다. 백신 또는 백신 조성물은 상기 기재된 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 동시에 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명에서 당해 분야의 기술 내에서 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 면역학 기법을 사용할 수 있다. 이러한 기법은 문헌에 자세하게 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.]을 참고한다.

실시예

실시예 1

소 유행열 바이러스/퀼 A 혼합물의 제조

소 유행열(BEF) 생 바이러스 항원을 동결된 원료로부터 수득하였다. 실온에서 해동시킨 후, 바이러스를 퀼 A와 조합시킨 후 나머지 백신용 성분을 첨가하였다.

브렌타그에 의해 생성된 퀼 A 분말을 제품 코드 제 07307503 호로서 APS(오스트레일리아 소재의 누플렉스 인더스티즈(Nuplex Industies)의 한 부서)로부터 입수하였다.

퀼 A 원료 용액을 물에서 10mg/ml로 희석하여 제조하였다.

요약하면, BEF 생 항원 원료(1.38×10⁷ TCID₅₀/ml) 149.96ml를 9.643g/ml NaCl 36.34ml로 희석하고, 10mg/ml 퀼 A 20.70ml를 1mg/ml에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다.

실시예 2

BEFV 백신의 제조

BEFV 백신을 제조하기 위해, 첨가 사이에 5분 동안 혼합물을 교반하면서 다음과 같은 성분을 순서대로 첨가하였다:

384.3ml 8.5g/ml NaCl

실시예 1에서와 같이 제조된 94.87g BEFV/퀼 A 혼합물

20%(v/v)를 얻기 위한 10mg/ml SL-CD^* 원료 120.00ml

1.36g 티오메르살 9.9%(w/v)

^*SL-CD는 문헌[Hilgers et al. Sulpholipo-cyclodextrin in squalene-in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. Vaccine 17 (1999), pp219-228.]에 기재된 바와 같이 제조하였다.

모든 성분들을 첨가한 후에, 30분 동안 백신을 교반하고, pH를 7.18로 조정하였다.

백신을 추가로 30분 동안 교반하고 이를 사용하여 라벨링된 필로우(pillow) 포장을 충전시켰다.

실시예 3

BEFV 백신의 동물 시험

펜리스 소재의 포트 다지 오스트레일리아(Fort Dodge Australia)에서 백신 안정성 시험을 수행하였다. EP2002:0062 지침서에 따라 소에서 백신 안정성을 시험하였다.

10 마리의 기니아(Guinea) 돼지 및 2 마리의 소에게 상기 제조한 백신을 접종하여 BEF 항원 단편에 대한 혈청학 반응을 결정하였다. 250 내지 400g의 무게가 나가는 10 마리이의 기니아 돼지에게 각각 백신 2.0ml를 피하 접종시켰다. 접종 후 6주째에 기니아 돼지로부터 채혈하였다. 1살 미만의 2 마리 소에게 백신 4ml를 피하 접종시켰다. 접종 후 14일째에 소로부터 채혈하였다. 이들 동물로부터 유래된 혈청을 오스트레일리아 퀸스랜드 소재의 프라이머리 인더스트리즈 앤드 피셔리즈 애니멀 리서치 인스티튜드(Primary Industries and Fisheries Animal Research Institute)의 한 부서인 생물안정성 과학 실험실(Biosecurity Sciences Laboratory)의 프로토콜에 따라 바이러스 중화(VN)에 의해 시험하였다. 사용된 바이러스 중화 시험 방법은 "오스트레일리아 표준 진단 절차"에 따랐다.

2개의 백신 배치에 대한 시험 결과를 하기 표 1에 나타내었다:

소 및 토끼 시험에서 불활성화된 BEF 백신을 사용하는 실험에 근거하여, 실험실용 동물 혈청학과 BEFV로부터의 소 보호 사이에 상관관계에 대한 증거가 존재한다. 따라서, 표 1에 나타난 기니아 돼지의 결과는 본 발명의 면역학적 조성물이 BEFV로부터 소 보호를 제공한다는 것을 확인해준다.

상기와 같이 제조된 단일 투여량 BEF 백신 제형은 안정한 에멀젼을 생성시켰다. 이 백신을 안정성에 대해 시험하고, 처음에는 소 안정성 시험에서 어떠한 부위-반응도 일어나지 않았다. 전신 또는 행동 반응이 주지되지 않았지만, 백신은 관찰된 기간의 끝 무렵에 주사 부위에서 몇몇 국소 반응을 일으켰다.

하기 표 2는 상기 열거된 백신 제형 4ml로 단일 투여량 백신접종한 후 소에서 나타나는 증상을 설명하였다:

요약하면, BEFV를 포함하는 제형에서 보조제로서 SL-CD 및 사포닌(퀼 A)을 포함하는 면역원성 조성물의 사용은 단일 투여량 백신으로서 유용한 효과적인 BEFV 백신을 생성한다.

실시예 4

IBR 백신 블렌드의 제조

추가의 백신에 적절한 보조제를 선택하기 위해, 사멸된 재조합 소 헤르페스바이러스 1(또한 감염성 소 비기관염 바이러스(IBR)로도 공지됨) 백신을 상이한 보조제와 블렌딩하여 제조하고 평가하였다. 3개의 상이한 보조제 조합물을 갖는 백신을 IBR(EU)의 6.04 logs/ml의 1× 역가로 제조하였다. 백신 A는 AlOH(15%) 및 사포닌을 함유하고, 백신 B는 5% SP 오일을 함유하고, 백신 C는 20% SL-CD 및 사포닌을 함유하였다. 사포닌을 버그하우젠 색인 제 603013 호로부터 입수하였다.

실시예 5

IBR 백신의 동물 시험

백신 시험을 로바(lowa)에서 수행하였다. 총 27마리의 5 내지 6월령 송아지를 하기 표 6에 나타난 바와 같이 무작위로 그룹지었다:

그룹 4 내지 6으로부터의 송아지를 제외하고, 송아지를 피하로 2회 3주 간격으로 백신접종하였다. 두 번째 백신접종 후 3주(또는 그룹 4의 경우 백신접종 후 3주)째에, 모든 송아지(그룹 6으로부터의 두 마리 송아지를 제외)는 악성 IBR 바이러스를 비강내로 공격받았다. 모든 송아지를 질병의 임상 징후에 대해 공격 후 14일 동안 매일 모니터링하였다. 임상 징후는 비제한적으로 점액성 비강 배출, 눈물, 호흡곤란, 식욕 부진(식욕 없음) 및 우울증을 포함한다. 또한, 공격 후 14일 동안 매일 직장 온도를 측정하였다. 연구 기간 동안 주기적으로 동물로부터 혈청을 얻기 위해 채혈하고, 혈청 중화 분석을 사용하여 IBR에 대한 항체를 측정하였다. 공격 전 2일로부터 공격 후 14일까지 바이러스 단리를 위해 매일 비강 도말을 수집하였다. 매일 송아지 한마리 마다 단리된 바이러스 역가를 측정하였다. 좋지 않은 건강상의 이유로 공격 전에 그룹 2로부터 한 마리 동물을 연구에서 제외시켰다.

IBR 공격과 관련된 관찰된 임상 징후를 하기 표 7에 요약하였으며, 바이러스 발산 결과를 표 8에 설명하였다. 항-IBR 혈청 중화 항체 역가를 표 9에 열거하였다:

작은 그룹의 크기로 인하여, 백신접종된 동물과 대조군 사이에 관찰된 차이가 통계적으로 상이하지 않았다. 그러나, 수적인 차이는 특히 첫번째 3마리 그룹에 대해 백신접종 효과가 나타났다.

바이러스 발산의 발병률 및 역가를 하기 표 8에서 설명하였다:

바이러스 발산으로부터의 결과는 SL-CD + 사포닌이 바이러스 발산의 개수(100배 이상) 및 발병률을 감소시킴으로써 가장 우수한 보호를 제공한다는 것을 나타낸다. 이러한 증명된 보호는 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 실험적 공격시에 상당히 높은 항체 역가에 기인할 것이다:

이 연구로부터의 결과는, 평가된 3가지 보조제 중에서, SL-CD/사포닌 조합물이 가장 우수한 성능을 제공함을 나타내었다.

실시예 6

청설병 바이러스 백신의 제조

청설병 바이러스 혈청형 1 및 8에 대한 4개의 상이한 불활성화된 백신을 상이한 BTV8 항원 농도 및 상이한 보조제 조성으로 제형화하였다. BTV 혈청형 1(10^6.7 TCID₅₀)의 역가는 시험된 모든 백신에서 여전히 일정하였다. 송아지를 2주 간격으로 2회 접종시켰다. 백신 E-43, E-44, E-45, E-47 및 E-48의 조성을 하기 표 10 내지 14에 나타내었다:

실시예 7

혈청중화 결과

중화 항체 역가를 백신접종 후 1주(+28) 및 2주(+35)째에 모든 송아지에서 측정하였다. 혈청중화 결과를 하기 표 15 내지 20에 나타내었다. 중화 항체의 존재는 보호를 나타내지만 중화 항체가 없는 동물도 또한 세포-매개된 반응에 기인하여 보호될 수 있다:

BTV1 및 BTV8에 대한 바이러스 혈증의 존재는 백신 E-43: 줄바크 1+8(BTV:1 10^6.7 + BTV8: 10^7.3)(Al3+ 사포닌: 실제 제형) 및 E-47: 줄바크 1+8(BTV1 10^6.7+ BTV8: 10^7.3)(SLCD + 2.5×사포닌: 새로운 보조제)으로 백신접종된 동물에서 공격 후 4, 5 및 8일째에 측정되었다.

백신 E-43: 줄바크 1+8(BTV1: 10^6.7 + BTV8: 10^7.3)(Al³⁺ 사포닌: 실제 제형)

BTV1에 대한 바이러스 혈증 100% 존재(0/8)

BTV8에 대한 바이러스 혈증 87.5% 존재(1/8)

백신 E-44: 줄바크 1+8(BTV1: 10^6.7 + BTV8: 10^7.3)(Al³⁺ 사포닌: 실제 제형보다 1.58 더 많은 BTV8의 항원)

BTV1에 대한 바이러스 혈증 100% 존재(0/8)

BTV8에 대한 바이러스 혈증 87.5% 존재(1/8)

상기 직접적인 결과는 백신에서 1.58배 만큼의 BTV 혈청형 8의 증가가 보다 나은 보호를 유도하지 않음을 나타낸다.

백신 E-47: 줄바크 1+8(BTV1: 10^6.7 + BTV8: 10^7.3)(SLCD + 2.5×사포닌: 새로운 보조제)

BTV1에 대한 바이러스 혈증 100% 존재(0/8)

BTV8에 대한 바이러스 혈증 100% 존재(0/8)

백신 E-45: 줄바크 1+8(BTV1: 10^6.7 + BTV8: 10^7.3)(Al³⁺ + 2×사포닌: 실제 제형보다 2배 더 많은 사포닌)

BTV1에 대한 바이러스 혈증 100% 존재(0/8)

BTV8에 대한 바이러스 혈증 100% 존재(0/8)

실시예 8

감마 인터페론의 생성

혈액 샘플에서 감마 인터페론의 검출을 위해 보비감(Bovigam) TB 시험(프라이오닉스(Prionics))을 사용하였다. 요약하면, 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 제조하고, 이를 VP7로 일부 VP2로 일부 자극시켰다. 감마 인터페론의 생성은 VP7에 의한 혈액 세포 자극 후에만 검출되었다.

백신 E-43 및 E-47로 백신접종된 동물에서 γ-IFN의 특이적 생성의 평가 결과는 다음과 같다. 제 1 백신접종 (D+0): 제 2 백신접종 (D+21); 공격 (D+45)

BTV에 대한 항체가 없는 총 30마리의 3개월령 프리이즌(Frisean) 송아지를 연구에 포함시켰다. 송아지의 성별을 고려하지 않았다. 단지 정성적인 건강한 동물을 연구에 포함시켰다. 이들의 건강 상태를 도착하자마자 확인하였다. 동물들은 귀 태그에 의해 개별적으로 확인되었다. 30마리의 혈청음성 프라이즌 송아지를 다음과 같이 무작위로 4개의 처리 그룹으로서 할당하였다(마이크로소프트 엑셀 프로그램 사용):

그룹 1: 10마리 송아지, 백신 E-43으로 백신접종되고 재접종됨

그룹 2: 10마리 송아지, 백신 E-47로 백신접종되고 재접종됨

그룹 3: 10마리 대조군 송아지, 백신접종되지 않음

백신 2ml를 사용하여 소의 백신 투여에 가장 통상적인 경로인 근육내 경로(i.m.)에 의해 백신접종을 수행하였다.

그룹 1 및 2에서의 송아지를 0일째에(D+0) 백신접종하고 3주 후에(D+21) 재접종하였다.

그룹 3의 송아지는 백신접종되지 않은 대조군으로서 두었다.

제 1 백신접종 전, 즉 0일째(D+0), 재접종(또는 제 2 백신접종) 전, 즉 3주 후(D+21), 및 공격 전, 즉 42일째(D+42)에 송아지로부터 채혈하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 개별 샘플로부터 제조하였다.

제 2 백신접종 후 24일째에, 송아지를 포트 다지 수의학 공격 시설 제 3 호로 옮기고 여기에서 재접종 후 24일째(D+45)에 각 그룹 중 8 마리 동물을 BTV-1 또는 BTV-8로 공격하였다. VP7 및 VP2에 대한 γ-IFN의 특이적 생성을 평가하기 위해 공격 후 5일째에 동물로부터 채혈하였다.

γ-IFN 검출

헤파린의 존재하에 모은 혈액을 백신접종시에, 공격 전에 및 감염 후 5일째에 실험에서 모든 동물로부터 모았다. PBMC를 밀도 구배(히스토파크(Histopaque) 1077)에서 추출하고, 세척하고, 우 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 5×10⁶ 세포/ml의 최종 농도로 재현탁하였다. 세포를 재조합 단백질 VP2 및 VP7 중 어느 하나(1㎍/ml)를 갖는 96 웰 플레이트에서 평판 배양하였다. 양성 대조군으로서 콘카발린(Concavalin) A(5㎍/ml)를 사용하였다. 16시간 동안 37℃에서 플레이트를 배양하였다. 소 인터페론 시험(보비감 TB, 프라이오닉스)을 사용하여 상청액 중 γ-IFN 분석을 수행하였다. 결과는 각 동물의 비자극된 값을 감산한 후 A450 단위로 표현하였다.

단지 VP7 재조합 단백질만이 제 2 백신접종 후 백신접종된 동물에서 γ-IFN의 특이적 생성을 유도할 수 있었다.

공격시에, 백신 E-47로 백신접종된 10 마리 중 3 마리(30%) 송아지가 VP7에 대해 γ-IFN을 생성하는 것으로 나타났다. 공격 후 5일째에, 양성 동물의 비율은 63%로 증가하였다. 백신 E-43으로 백신접종된 동물은 공격 후 5일째에 VP7에 대한 γ-IFN의 양성 생성을 나타냈으나(8 마리 중 2 마리, 25%), 공격시에는 그렇지 않았다.

결과는 A450 단위 및 γ-IFN의 양성 생성의 비율(>0.065)로 표현하여 하기 표 21에 나타내었다:

공격시에, 만-비트니(Mann-Whitney) 시험을 사용하는 경우, 유의차가 E-43 및 E-47로 백신접종된 그룹과 대조군 그룹 사이에서 발견되었다: E-43 대 대조군: p = 0.035; E-47 대 대조군: p = 0.003

공격 후 5일째에, 만-비트니 시험을 사용하는 경우, 유의차가 E-43 및 E-47로 백신접종된 그룹과 대조군 그룹 사이에서 발견되었다: E-43 대 E-47: p = 0.021; E-47 대 대조군: p = 0.006

결론:

· 줄바크 1+8, 배치 E-47(BTV:1 10^6.7 + BTV8: 10^7.3)(SLCD + 2.5×사포닌: 새로운 보조제)로 백신접종된 송아지는 줄바크 1+8(BTV:1 10^6.7 + BTV8: 10^7.3)(Al³⁺ 사포닌: 실제 제형)로 백신접종된 송아지 및 대조군 보다 공격시(제 2 백신접종 후 3주) 및 공격후 5일째에 높은 양의 γ-IFN을 나타내었다.

· 백신 E-43(실제 제형)으로 백신접종된 송아지는 공격 후 5일까지 VP7에 대한 γ-IFN의 생성을 나타내지 않았다. 이 값은 백신 E-47(새로운 보조제)에 의해 유도된 것보다 상당히 낮았다(p = 0.021).

· 단지 VP7 재조합 단백질만이 γ-INF의 검출가능한 양을 유도할 수 있었고, 따라서 VP7은 세포 면역의 향상제일 수 있다.

Claims

설포리포-사이클로덱스트린(SL-CD), 사포닌 및 하나 이상의 항원을 포함하는, 상기 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 면역학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
하나 이상의 항원이 박테리아, 바이러스, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택되는 면역학적 조성물.
제 3 항에 있어서,
하나 이상의 항원이 수의학적 항원인 면역학적 조성물.
제 4 항에 있어서,
하나 이상의 항원이 소 항원인 면역학적 조성물.
제 3 항에 있어서,
하나 이상의 항원이 바이러스 항원인 면역학적 조성물.
제 6 항에 있어서,
바이러스 항원이 소 유행열 바이러스(BEFV), 소 헤르페스바이러스 1(IBR) 또는 청설병 바이러스(BTV)인 면역학적 조성물.
제 7 항에 있어서,
SL-CD가 0.2ml/ml의 최종 농도로 존재하는 면역학적 조성물.
제 7 항에 있어서,
사포닌이 0.5mg/ml의 최종 농도로 존재하는 면역학적 조성물.
제 7 항에 있어서,
사포닌이 퀼(Quil) A인 면역학적 조성물.
제 10 항에 있어서,
퀼 A가 0.1mg/ml 내지 0.2mg/ml의 최종 농도로 존재하는 면역학적 조성물.
제 11 항에 있어서,
퀼 A가 0.158mg/ml의 최종 농도로 존재하는 면역학적 조성물.
삭제
제 6 항에 있어서,
사포닌 및 바이러스 항원을 조합한 후 SL-CD를 첨가함으로써 제조되는 면역학적 조성물.
제 14 항에 있어서,
하나 이상의 추가의 보조제를 추가로 포함하는 면역학적 조성물.
제 15 항에 있어서,
하나 이상의 추가의 보조제가 수산화알루미늄, SP-오일 및 카보폴로 이루어진 군 중에서 선택되는 면역학적 조성물.
제 14 항에 있어서,
사포닌이 퀼 A인 면역학적 조성물.
제 14 항에 있어서,
SL-CD가 0.2ml/ml의 최종 농도로 존재하는 면역학적 조성물.
제 17 항에 있어서,
퀼 A가 0.1mg/ml 내지 0.2mg/ml의 최종 농도로 존재하는 면역학적 조성물.
제 19 항에 있어서,
퀼 A가 0.158mg/ml의 최종 농도로 존재하는 면역학적 조성물.
제 14 항에 있어서,
바이러스 항원이 소 항원인 면역학적 조성물.
제 21 항에 있어서,
바이러스 항원이 BEFV, IBR 및 BTV로 이루어진 군 중에서 선택되는 면역학적 조성물.
제 22 항에 있어서, 동물에서 BEFV에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 면역학적 조성물.
제 23 항에 있어서,
면역 반응이 조성물의 단일-투여량 투여 후 유도되는 면역학적 조성물.
제 23 항에 있어서,
면역 반응이 보호성 면역 반응인 면역학적 조성물.
SL-CD 및 사포닌을 포함하는, 동물에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 키트.
삭제
제 26 항에 있어서,
항원을 추가로 포함하는 키트.
제 28 항에 있어서,
하나 이상의 항원이 박테리아, 바이러스, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택되는 키트.
제 29 항에 있어서,
하나 이상의 항원이 바이러스 항원인 키트.
제 30 항에 있어서,
바이러스 항원이 BEFV, IBR 및 BTV로 이루어진 군 중에서 선택되는 키트.