CN102186502B

CN102186502B - 免疫学组合物

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Publication number: CN102186502B
Application number: CN200980141319.3A
Authority: CN
Inventors: 菲利普.R.莱尔巴克; 威廉.J.切希尔; 辛志先
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: PAHW LLC
Priority date: 2008-08-19
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2029-08-19
Also published as: CA2734654C; CN102186502A; BRPI0917290A2; CA2734654A1; ZA201102082B; HK1157182A1; TW201010719A; AU2009282581B2; EP2331126A1; WO2010022135A1; KR101320141B1; MX2011001910A; UA101385C2; KR20110044791A; AU2009282581A1; US20100047279A1; AR076437A1; BRPI0917290A8; CO6341568A2; RU2011105863A

Abstract

本发明涉及免疫学组合物，其包含磺基脂-环糊精(SL-CD)以及，皂素或Quil A，并任选至少一种抗原。本发明涉及含至少一种抗原的方法和免疫学组合物，所述抗原可以是兽用抗原。本发明的方法和免疫学组合物中的兽医抗原可以是牛抗原。本发明涉及含牛暂时热病毒(BEFV)，牛疱疹病毒1(IBR)或蓝舌病毒(BTV)的方法和免疫学组合物。本发明包含在动物中激发抗BEFV，IBR，或BTV的免疫应答的方法，其包括对所述动物施用本发明的组合物。在本发明中，所述免疫应答尤其是保护性免疫应答。本发明包含免疫学组合物的方法，包括给病毒添加QuilA。

Description

免疫学组合物

相关申请的交叉参考

按照35U.S.C.§119(a)的规定，本申请要求2008年8月19日提交的澳大利亚临时申请2008904261的权益，另外，按照35U.S.C.§119(e)的规定，要求2008年8月27日提交的美国临时申请61/092091，filed August 27，2008的权益。这些申请的全部内容都引入本文作参考。

发明领域

本发明涉及免疫学组合物(immunological composition)，其包含磺基脂-环糊精(sulpholipo-cyclodextrin，SL-CD)，并包含皂素(saponin)或Quil A，还任选含有至少一种抗原。本发明还涉及制备免疫学组合物的方法，所述组合物含SL-CD，皂素或Quil A，以及抗原。本发明还提供了应用致免疫学组合物激发抗牛暂时热病毒(bovine ephemeral fever virus，BEFV)、抗牛疱疹病毒1(IBR)、或抗蓝舌病毒(bluetongue virus，BTV)的免疫应答的方法。本发明提供了含本发明免疫学组合物的试剂盒。

发明背景

皂素佐剂是已在商业上应用于动物疫苗的一类已知佐剂。皂素是多种植物中发现的一类次级代谢产物。它们是一些两亲性糖苷，因在水溶液中振荡时产生肥皂样泡沫这一现象而被归为一类。在结构上，皂素由一或多个亲水糖苷组分与一个亲脂性三萜(triterpene)衍生物组合而成。商购的皂素大都是从南美树种QuillajaSaponaria Molina和Mohave Yucca植物(也称Yucca schidigera)的树皮中分离出来的。皂素可从多种来源获得，所述来源包括Berghausen Corporation(Cincinnati，OH)。皂素的精炼形式通常称为Quil A，可从多种来源商购，包括BerghausenCorporation，Sergeant Chemical Company(Clifton，NJ)，Superfos a/s(Vedbaek，Denmark)，以及Brenntag Biosector(Frederikssund，Denmark)。Quil-A的理化特性可参见Superfos的题为Purified Saponin Adjuvant Quil-A的商业出版物。Quil-A在化学方面的特征在于，碳水化合物组分经糖苷键与三萜皂皮酸(triterpenoidquillaic acid)连接。

多个已授权的美国专利讨论了作为佐剂的Quil A。例如，美国专利6,416,764和6,291,228涉及一些疫苗，它们将Quil A用作佐剂，并包含牛病毒性腹泻病毒的非致病株。美国专利4,432,969涉及一种吸入性过敏原组合物，其包含吸入性过敏原，并包含皂素或Quil A佐剂。

美国专利4,900,549描述了制备含Quil A的致免疫复合物的方法。

美国专利6,165,995涉及制备SL-CD衍生物。美国专利6,610,310涉及聚离子聚合物如SL-CD作为佐剂。

牛暂时热(Bovine Ephemeral Fever，BEF)是一种引起虚弱的病毒性疾病，既感染奶牛，也感染肉牛，在北美尤其如此。BEF也见于商业化养牛的大多数亚洲国家。已知BEF是“三日病(three day sickness)”，能实质上影响牛奶产量或引起肉牛和奶牛死亡(Walker，P.J.，2005，Curr.Top.Microbiol.Immunol.292：57-80)。

BEF的致病因子是牛暂时热病毒(BEFV)。此病毒是归为短暂热病毒属(Ephemerovirus)的弹状病毒(rhabdovirus)。BEFV的病毒粒子是子弹状或锥状，包含负链单链RNA基因组。BEFV基因组编码核蛋白，聚合酶相关蛋白，基质蛋白，大的RNA-依赖性RNA聚合酶，以及两种糖蛋白。

改良BEF活疫苗在澳大利亚已上市多年，每年都在BEF季之前进行强化接种。此疫苗要求有兽医医嘱，是冻干形式，需要在施用前用含佐剂的稀释剂重建。未受过感染的动物需要接种两剂疫苗且随后每年补种。

PCT出版物WO/1994004685涉及含上述BEFV表面糖蛋白的BEFV疫苗制剂。

Vanselow et al.(1995，Vet.Microbiol.46：117-130)描述了对各种BEF疫苗的测试。

Hsieh et al.(2006，J.Vet.Med.Sci.68：543-548)涉及的BEFV疫苗用到了Tn88128和Tn73毒株。这些疫苗通过添加二乙烯亚胺和氢氧化铝或水∶油∶水佐剂灭活病毒而制得。

含BEFV结构性糖蛋白的重组病毒可参见Wallace，D.B.and Viljoen G.J.(2005，Vaccine 23：3061-3067)，其中的糖蛋白已克隆至疙瘩皮肤病(lumpy skin disease)病毒(SA-Neethling型)载体中。

Chuang et al.(2007，J.Virol.Meth.145：84-87)涉及用RNA干扰且抑制BEFV表面糖蛋白基因的表达。

牛疱疹病毒-1也已知是感染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovinerhinotracheitis virus)。其缩写为BHV或IBR。牛疱疹病毒-1是疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒，在牛群中引起疾病，包括鼻气管炎，阴道炎，龟头包皮炎(balanoposthitis)，流产，结膜炎(conjunctivitis)，和肠炎。BHV-1也引起船运热(shipping fever)。它通过性接触，人工授精，以及气溶胶播散来传播。象其它疱疹病毒一样，BHV-1引起终身的潜伏感染并排出病毒。已有疫苗能减轻疾病的严重性和发生率。由BHV-1引起的呼吸道疾病通常被称为感染性牛鼻气管炎。

蓝舌病毒(BTV)是环状病毒属(Orbivirus)的原型病毒(prototype virus)，该属归为双链RNA病毒科：呼肠孤病毒科(Reoviridae)。BTV在诸如绵羊、山羊、牛和鹿等牲畜中引起严重疾病。文献中报道了24种血清型，它们引起的问题从不明显的感染到急性烈性感染(fulminating infection)都有。慢性、持续性排出病毒的牛也已被发现。已有疫苗用于治疗牲畜的蓝舌病。

发明概述

本文提供了免疫学组合物，其包含磺基脂-环糊精(SL-CD)和皂素，以及任选地，含至少一种抗原。在本发明一些实施方案中，皂素是Quil A。在本发明一些实施方案中，所述至少一种抗原选自细菌、病毒、肽、多肽、核酸、或它们的组合。在本发明一些实施方案中，所述至少一种抗原是兽医抗原(veterinary antigen)。在本发明一些实施方案中，兽医抗原是牛抗原。在本发明一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原。在本发明一些实施方案中，病毒抗原是牛疱疹病毒1(IBR)、蓝舌病毒(BTV)、或牛暂时热病毒(BEFV)。病毒抗原可以是减毒活的、重组的、杀死的(killed)、或灭活的(inactivated)。在一些实施方案中，本发明提供了致免疫组合物，其中所述抗原是减毒活病毒。在本发明一些实施方案中，所述病毒是牛暂时热病毒(BEFV)。在本发明多种实施方案中，所述病毒是来自冷冻的储存物(frozen stock)，干的储存物(dried stock)，冻干的储存物(freeze-dried stock)，或新鲜的储存物(fresh stock)。在多种实施方案中，皂素在本发明免疫学组合物中终浓度约0.5mg/mL。在多种实施方案中，Quil A在本发明免疫学组合物中终浓度约0.1mg/mL至约0.2mg/mL。在一些实施方案中，本发明免疫学组合物中Quil A的终浓度为约0.158mg/mL。在多种实施方案中，本发明免疫学组合物中SL-CD的终浓度为约0.2mL/mL。在一些实施方案中，含皂素和SL-CD或含QuilA和SL-CD的本发明免疫学组合物包含至少一种另外的佐剂。在本发明多种实施方案中，所述另外的佐剂选自氢氧化铝、SP-油，或卡波普(carbopol)。在本发明一些实施方案中，所述抗原是多肽，其在一些实施方案中是病毒亚单位。在本发明一些实施方案中，病毒亚单位选自BEFV、IBR、或BTV。

在一实施方案中，本发明提供在动物中激发抗兽医抗原的免疫应答的方法，包括对该动物施用致免疫组合物，所述组合物含皂素、SL-CD、和至少一种兽医抗原。在一实施方案中，所述免疫应答在施用单剂致免疫组合物之后被激发。在一实施方案中，本发明提供在动物中激发抗IBR的免疫应答的方法，包括对该动物施用致免疫组合物，所述组合物含皂素、SL-CD、和至少一种作为抗原的IBR。在一实施方案中，本发明提供在动物中激发抗BTV的免疫应答的方法，其包括对该动物施用致免疫组合物，所述组合物含皂素、SL-CD、和至少一种作为抗原的BTV。

在一实施方案中，本发明提供在动物中激发抗BEFV的免疫应答的方法，包括对该动物施用致免疫组合物，所述组合物含QuilA、SL-CD、和抗原。在一实施方案中，所述免疫应答在施用单剂致免疫组合物之后被激发。在一实施方案中，本发明提供在动物中激发抗IBR的免疫应答的方法，包括对该动物施用致免疫组合物，所述组合物含皂素、SL-CD、和抗原。在一实施方案中，本发明提供在动物中激发抗BTV的免疫应答的方法，其包括对该动物施用致免疫组合物，所述组合物含皂素、SL-CD、和抗原。在本发明一些实施方案中，施用本发明致免疫组合物之后激发的免疫应答是保护性免疫应答。

在一实施方案中，本发明提供致免疫组合物，其通过在添加SL-CD之前将Quil A与病毒组合而制得。所述病毒可以是减毒活的、重组的、杀死的、或灭活的。在本发明一些实施方案中，Quil A和病毒在室温混合。在本发明一些实施方案中，Quil A的病毒混合至少15分钟。在本发明一些实施方案中，Quil A和病毒混合至少120分钟。

在一实施方案中，本发明提供了含本发明致免疫组合物以激发动物的免疫应答的试剂盒。

在多种实施方案中，本发明提供了在牛中诱导出抵抗由BEFV引起的病毒感染或牛暂时热的免疫应答的方法。所述诱导抗BEFV的免疫应答的方法包括对牛施用含BEFV、SL-CD、以及QuilA的组合物。

在一实施方案中，本发明提供了致免疫组合物或疫苗，其包含免疫学有效量的BEFV、SL-CD、以及QuilA。

在多种实施方案中，本发明提供了在牛中诱导出抵抗由IBR引起的疱疹病毒感染或牛鼻气管炎的免疫应答的方法。所述诱导抗IBR的免疫应答的方法包括对牛施用含IBR、SL-CD、和皂素的组合物。

在多种实施方案中，本发明提供了提供了在牛中诱导出抵抗由BTV引起的病毒感染或牛蓝舌病的免疫应答的方法。所述诱导抗BTV的免疫应答的方法包括对牛施用含BTV、SL-CD、和皂素的组合物。

在一实施方案中，本发明提供了致免疫组合物或疫苗，其包含免疫学有效量的IBR、SL-CD、和皂素。

在一实施方案中，本发明提供了致免疫组合物或疫苗，其包含免疫学有效量的BTV、SL-CD、和皂素。

发明详述

本文是基于，至少部分地基于，发现含SL-CD、和皂素或Quil A的免疫学组合物能增强至少一种抗原的致免疫性。在本发明多种实施方案中，所述至少一种抗原可以选自细菌、病毒、肽、多肽、核酸、或它们的组合。

在本发明一些实施方案中，所述至少一种抗原是兽医抗原。在本发明多种实施方案中，兽医抗原可以是牛抗原。

在本发明一个实施方案中，兽医抗原可以是病毒抗原。在本发明一些实施方案中，病毒抗原包括但不限于BEFV，IBR，或BTV株。BEFV是已知在澳大利亚、非洲、中东和亚洲引起牛暂时热的弹状病毒。BEFV的多个株是已知的，如BB2271-919和其亲本株(919)，TN73，Tn88128，BEFV2001的1-11株，或BEFV2004的1-3株。根据使用本发明致免疫组合物的国家的不同，对病毒株的选择也不同。牛疱疹病毒-1也称BHV或IBR，是在牛中引起疾病的疱疹病毒科病毒，所述疾病包括鼻气管炎，阴道炎，龟头包皮炎，流产，结膜炎，和肠炎。IBR也引起船运热。它通过性接触，人工授精，以及气溶胶播散来传播。象其它疱疹病毒一样，IBR引起终身的潜伏感染并排出病毒。由IBR引起的呼吸道疾病通常被称为感染性牛鼻气管炎。

蓝舌病毒(BTV)是环状病毒属的原型病毒(prototype virus)，该属归为双链RNA病毒科：呼肠孤病毒科。BTV在诸如绵羊、山羊、牛和鹿等牲畜中引起严重疾病。文献中报道了24种血清型，它们引起的问题从不明显的感染到急性烈性感染都有。慢性、持续性排出病毒的牛也已被发现。蓝舌病可见于澳大利亚、北美、非洲、中东、亚洲、以及欧洲。

在本发明多种实施方案中，致免疫组合物中的病毒可以是减毒活的、重组的、杀死的、或灭活的。制备减毒活病毒的方法是文献中已知的。例如，病毒可以通过在外源宿主如组织培养物、胚卵、或活体动物中传代而减毒。可以选出减毒的BEFV，以便在非牛的细胞中优先生长，并在选择过程中，变得越来越不能够在牛的细胞中生长。因为这些减毒的病毒株在牛宿主中复制能力很弱，当它们被给予牛以后，诱导免疫力而非引起疾病。当一种病毒对其天然宿主的毒力降低而对新宿主的毒力增加时，认为该病毒被减毒。一些减毒病毒株可天然产生。遗传工程可以用于按照指定的方向使病毒减毒。制备杀死的或灭活的病毒以用于致免疫组合物、疫苗和方法中的方法是本领域已知的。在化学灭活过程中，合适的病毒样品或含该病毒的血清样品用足量的灭活剂在足够高(或低，取决于该灭活剂)的温度或pH处理足够长的时间以灭活该病毒。例如，病毒可以用诸如福尔马林、二乙烯亚胺(binary ethyleneimine，BEI)，或或疏水溶剂、酸等灭活剂处理。病毒也可以通过用紫外线或X-线辐射、或通过加热等方式来灭活。热灭活是在足以灭活该病毒的温度加热足够长的时间。辐射灭活是用一定波长的光或其它能量处理足够长的时间以灭活该病毒。在本发明一些实施方案中，致免疫组合物包含减毒活病毒。

在本发明一些实施方案中，致免疫组合物包含从冷冻的储存物、干的储存物、或新鲜储存物获得的抗原。当所述抗原从干的储存物获得时，可从冻干的储存物获得。在一些实施方案中，本发明的致免疫组合物包含从冷冻的储存物获得的抗原。

皂素是广泛分布于植物和海洋动物王国的类固醇或三萜糖苷。皂素引起注意的特点是，在水中形成振荡后能起泡的胶体溶液，以及能沉淀胆固醇。当皂素靠近细胞膜时，它们在膜上产生孔状结构，引起膜破裂。皂素被用作动物疫苗的佐剂。各种皂素的佐剂活性和溶血活性已被深入研究(Lacaille-Dubois and Wagner，1996，A review of the biological and pharmacological activities of saponins”Phytomedicine vol 2 pp 363-386)。皂素是多种植物中发现的一类次级代谢产物。它们是一些两亲性糖苷，因在水溶液中振荡时产生肥皂样泡沫这一现象而被归为一类。在结构上，皂素由一或多个亲水糖苷组分与一个亲脂性三萜衍生物组合而成。商购的皂素大都是Quillaja Saponaria Molina和Yucca schidigera中提取的。“Quil A”是指皂素的精炼形式。

皂素在本发明致免疫组合物中的终浓度可以是约0.4mg/mL至约0.6mg/mL。皂素在本发明致免疫组合物中的终浓度可以是约0.5mg/mL。Quil A在本发明致免疫组合物中的终浓度可以是约0.1mg/mL至约0.2mg/mL。Quil A在本发明致免疫组合物中的终浓度可以是约0.12mg/mL至约0.18mg/mL。Quil A在本发明致免疫组合物中的终浓度可以是约0.14mg/mL至约0.16mg/mL。Quil A在本发明致免疫组合物中的终浓度可以是约0.158mg/mL。在一实施方案中，Quil A在本发明致免疫组合物中的终浓度是约0.158mg/mL。

在水包角鲨烷(squalane in-water)乳液(SL-CD/角鲨烷)中的磺基脂-环糊精被用于制备不同疫苗。SL-CD/角鲨烯(squalene)可以按Hilgers等所述来制备(Sulfolipo-cyclodextrin in squalane in-water as a novel and safe vaccine adjuvant.Vaccine 17(1999)，pp.219-228；Fort Dodge Animal Health Holland，Weesp，TheNetherlands)。

SL-CD在本发明致免疫组合物中的终浓度可以是约0.09mL/mL至约0.3mL/mL。SL-CD在本发明致免疫组合物中的终浓度可以是约0.1mL/mL，约0.15mL/mL，约0.17mL/mL，约0.2mL/mL，或约0.25mL/mL。本发明致免疫组合物还可包含除了Quil A和SL-CD以外的佐剂。所述另外的佐剂可以选择本领域已知的任一种佐剂，见后文详述。

在一些实施方案中，本发明提供了激发免疫应答的方法，包括对动物施用含皂素和SL-CD的免疫学组合物。在一些实施方案中，所述方法包括对动物施用含皂素、SL-CD和至少一种抗原的免疫学组合物。在一些实施方案中，所述至少一种抗原是兽医抗原。在本发明一些实施方案中，兽医抗原是牛抗原。在本发明一些实施方案中，兽医抗原是病毒抗原。在一些实施方案中，病毒抗原是BEHV，IBR或BTV。在一些实施方案中，病毒是减毒活的，重组的，杀死的，或灭活的。在一些实施方案中，病毒是杀死的。在一些实施方案中，抗原从冷冻的储存物，干的储存物，或新鲜的储存物获得。当抗原从干的储存物获得时，它可以从冻干的储存物获得。在一些实施方案中，抗原从冷冻的储存物获得。

在一些实施方案中，本发明提供了激发免疫应答的方法，包括对动物施用含QuilA和SL-CD的免疫学组合物。在一些实施方案中，所述方法包括对动物施用含Quil A、SL-CD和至少一种抗原的免疫学组合物。在一些实施方案中，用在所述方法中的至少一种抗原是兽医抗原。在一些实施方案中，用在所述方法中的兽医抗原是牛抗原。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原。在一些实施方案中，病毒抗原是IBR，BEHV或IBR。在一些实施方案中，病毒抗原是减毒活的，重组的，杀死的，或灭活的。在一些实施方案中，病毒是减毒活的。在一些实施方案中，抗原从冷冻的储存物，干的储存物，或新鲜的储存物获得。当抗原从干的储存物获得时，它可以从冻干的储存物获得。在一些实施方案中，抗原从冷冻的储存物获得。

本发明的致免疫组合物可以在施用多剂之后激发免疫应答。在一些实施方案中，本发明的致免疫组合物可以在施用两剂之后激发免疫应答。在一些实施方案中，本发明的致免疫组合物可以在施用单剂之后激发免疫应答。由本发明的致免疫组合物激发的免疫应答可以是保护性免疫应答。施用了起始剂量的本发明致免疫组合物之后，可以在约4周后施用加强剂量，以增强该致免疫应答。还可以进一步施用加强剂量。

在一实施方案中，本发明提供了在动物中激发免疫应答的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含致免疫组合物，组合物包含皂素和SL-CD和任选地至少一种抗原。在一些实施方案中，试剂盒中的皂素是Quil A。在一些实施方案中，试剂盒中的至少一种抗原是兽医抗原。在一些实施方案中，试剂盒中的兽医抗原是牛抗原。在一些实施方案中，试剂盒中的兽医抗原是病毒抗原。在一些实施方案中，试剂盒中的病毒抗原是BEFV，IBR，或BTV。在一些实施方案中，试剂盒中的抗原可以是减毒活的，重组的，杀死的或灭活的。在一些实施方案中，试剂盒中的抗原可以是减毒获得。在一些实施方案中，试剂盒中的抗原可以是杀死的。在一些实施方案中，试剂盒中的抗原可以从冷冻的储存物，干的储存物，或新鲜的储存物获得。在一些实施方案中，试剂盒中的抗原从冷冻的储存物获得。

本发明提供了含SL-CD以及皂素和/或Quil A的试剂盒，免疫学组合物，和疫苗，其可包含至少一种另外的佐剂。可以使用的佐剂很多，例如，氢氧化铝，阿夫立定(avridine)，二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecyl ammoniumbromide，也称DDAB或DODAB)，聚磷腈(polyphosphazene)，基于矿物油的水包油乳液如SPT乳液(见例如Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach，1995，编辑Michael F.Powel and Mark J.Newman，Plennum Press，New York andLondon，pages 147-204)，基于可代谢油的油包水乳液，如美国专利6,368,601所述，以及美国专利5,422,109所述的那些。合适的佐剂的另一些例子包括角鲨烷和角鲨烯(或动物来源的其它油)；嵌段共聚物如(L121)皂素；去污剂如-80，矿物油如或植物油如花生油；棒状杆菌衍生的佐剂如短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)；丙酸杆菌衍生的佐剂；牛分枝杆菌(Bacillus Calmette and Guerinn，或BCG)；白细胞介素如白介素2和白介素-12；单核因子如白介素1；肿瘤坏死因子；干扰素如伽玛干扰素；脂质体；iscom佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成的糖肽如胞壁酰二肽或其它衍生物；阿夫立定；脂质A；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或带有磷酸铝的DEAE-葡聚糖；羧聚乙烯(carboxypolymethylene)，如卡波EMA；丙烯酸共聚物乳剂如A640(见美国专利5,047,238)；豆苗病毒或动物痘病毒蛋白；亚病毒粒子佐剂如环状病毒；霍乱毒素；dimethyidiocledecylammonium bromide；或它们的组合物。其它佐剂可以选自表面活性剂(如十六烷基胺(hexadecylamine)，十八烷基胺，溶血卵磷脂(lysolecithin)，二甲基双十八烷基溴化铵，N，N-双十八烷基-n′-N-二(2-羟乙基丙烷二胺)，甲氧基十六烷基甘油，和pluronic多元醇)；聚阴离子(如吡喃(pyran)，硫酸葡聚糖，聚IC，聚丙烯酸，卡波普)，肽(如，胞壁酰二肽，二甲基甘氨酸，他福新(tuftsin))，油性乳剂，明矾，以及它们的混合物。也可以选择多种佐剂的多种组合。

在一实施方案中，本发明提供了在添加另外的抗原如SL-CD之前将与抗原组合而制得的致免疫组合物。本领域技术人员应理解，将病毒与Quil A组合将降低病毒的有效滴度(Walker，P.J.，2005，Curr.Top.Microbiol.Immunol.292：57-80)。在向所述致免疫组合物中添加至少一种另外的组分之前，将Quil A与抗原组合的步骤可以持续任意长的时间。本领域技术人员很容易理解，本发明致免疫组合物可以通过，在向所述致免疫组合物中添加至少一种另外的组分之前，在不同长度的时间内，将Quil A与抗原组合而制得的。例如，Quil A和抗原可以混合至少5-至少200分钟。在一些实施方案中，Quil A和抗原可以混合任意长的时间，包括从至少10分钟至至少190分钟。在一些实施方案中，Quil A和抗原混合至少15分钟。本领域技术人员应理解，本发明的致免疫组合物可以通过将Quil A和所述抗原在众多温度的任一种温度中组合。Quil A与所述抗原可以在低于或高于室温的温度进行混合，只要所得组合物具有致免疫性就可以。Quil A和所述抗原可以在室温混合。在一些实施方案中，通过在SL-CD添加之前将Quil A与抗原混合而制得的致免疫组合物中的抗原是病毒。在一些实施方案中，所述病毒是BEFV。在一些实施方案中，所述病毒可以是减毒活病毒，重组病毒，杀死的病毒或灭活的病毒。在一些实施方案中，所述抗原是减毒活的。在一些实施方案中，所述抗原可以从冷冻的储存物，干的储存物，或新鲜的储存物获得。在一些实施方案中，所述抗原从冷冻的储存物获得。

在一实施方案中，本发明提供了激发免疫应答的致免疫组合物，其包含皂素和SL-CD。在本发明一些实施方案中，激发免疫应答的致免疫组合物包含皂素和SL-CD；以及至少一种抗原。在本发明一些实施方案中，激发免疫应答的致免疫组合物中的皂素是Quil A。在本发明一些实施方案中，激发免疫应答的致免疫组合物中的至少一种抗原可以选自细菌、病毒、肽、多肽、核酸、或它们的组合。在一些实施方案中，在本发明致免疫组合物中，所述至少一种抗原是兽医抗原。在一些实施方案中，在本发明致免疫组合物中，所述兽医抗原是牛抗原。在一些实施方案中，在本发明致免疫组合物中，所述抗原是病毒抗原。在本发明一些实施方案中，病毒抗原至少是BEFV，BTV，或IBR株。在一些实施方案中，皂素或Quil A在添加SL-CD之前添加给病毒抗原。在一些实施方案中，所述抗原可以是减毒活的，重组的，杀死的或灭活的。在一些实施方案中，所述抗原是减毒活的。在一些实施方案中，所述抗原是杀死的。在一些实施方案中，所述抗原可以从冷冻的储存物，干的储存物，或新鲜的储存物获得。在一些实施方案中，所述抗原从冷冻的储存物获得。

本发明的免疫学组合物可以用本领域常规方法从病毒培养物制得。例如，病毒可以在组织培养细胞如非洲绿猴肾上皮细胞(Vero cells)，人二倍体成纤维细胞，MDBK(Madin-Darby牛肾)，或其它牛细胞中繁殖。病毒的生长可以用标准技术来监控(观察致细胞病变效应、免疫荧光或其它基于抗体的分析)，当病毒滴度达到足够高水平(如10⁶TCID₅₀/mL)时进行收获。病毒储存物可以用常规方法进一步浓缩或冻干，再添加至疫苗配制剂中。也可以采用其它制备病毒储存物的方法，参见诸如Thomas等(1986，Agri-Practice，7(5)：26-30)所述。

本发明的免疫学组合物可以单独施用，或作为多价免疫学组合物的一种成分来施用，即与其它免疫学组合物组合后施用。致免疫配制剂中的病毒可以是活的或杀死的；活的或杀死的病毒都可以是冻干的，且任选按照本领域已知的那样进行重建。致免疫组合物可以提供在试剂盒中，该试剂盒还可以包含合适的标签以及对动物主体(如牲畜，有蹄类动物(ungulate)，伴侣动物(companion animal))或鸟(如家禽)施用致免疫组合物的说明。

含SL-CD以及，皂素或Quil A；以及至少一种病毒抗原的致免疫组合物还可以包含可药用和兽用的载体。这样的载体是本领域技术人员熟悉的，包括被缓慢代谢的大分子如蛋白，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，和完整的病毒粒子。可药用且可兽用的盐也可以用在所述疫苗中，例如，矿物盐如盐酸盐(hydrochloride)，氢溴酸盐(hydrobromide)，磷酸盐，或硫酸盐，以及有机酸的盐如乙酸盐，丙酸盐，丙二酸盐(malonate)，或苯甲酸盐(benzoate)。疫苗也可以含有脂质，如水，盐水，甘油，和乙醇，以及诸如增湿剂、乳化剂，或pH缓冲剂等物质。脂质体也可以用作杀灭的病毒的载体(见例如，美国专利5,422,120，PCT出版物WO 95/13796，PCT出版物WO 91/14445，或欧洲专利524,968B1)。

本发明的致免疫组合物可以通过肌肉内或皮下途径施用，或通过鼻内、腹腔、皮内、支气管内、或口服途径施用。本发明的致免疫组合物可以通过喷雾、眼接种、或划痕(scarification)来施用。另一种将本发明致免疫组合物递送至哺乳动物(如牲畜，有蹄类动物，伴侣动物)的便利方法是通过口服(如放在饲料或饮用水或诱饵中)给药。特别方便的是将所述致免疫组合物作为敷料(top-dress)或混合喂食。通常，大的动物(如牲畜/有蹄类动物如牛)被给予约10⁶TCID₅₀/mL，可以是每剂致免疫组合物10^6，5至10⁷，TCID₅₀。

单剂给药时，所述致免疫组合物应含有对应于约10⁴至约10⁷TCID₅₀/mL，，优选10⁶TCID₅₀/mL的BEFV量。可以按照每只动物约1-5mL致免疫组合物的量，优选2mL，经肌肉、皮下或腹腔途径施用。

所述致免疫组合物应包含对应于约6.8logs/mL的IBR量。可以按照每只动物约1-5mL含IBR的致免疫组合物的量，优选2mL，经肌肉、皮下或腹腔途径施用。

所述致免疫组合物应包含对应于约10^6.7TCID₅₀BTV血清型1和/或约10^7.3TCID₅₀的BTV血清型8的BTV量。可以按照每只动物约1-5mL含BTV的致免疫组合物的量，优选2mL，经肌肉、皮下或腹腔途径施用。

致免疫组合物的制备可参见文献，例如，“Vaccine Design，The Subunit andAdjuvant Approach”，上文所述，和″Vaccines”(2008，第5版，Plotkin，S.A.et al.，editors，Saunders Elsevier)。

本发明提供了特别有用于预防和治疗动物的BEF，IBR，或BTV感染的免疫学组合物。因此，本发明另一方面涉及预防和治疗动物的BEF，IBR，或BTV感染的方法，特征在于，对需要所述预防或治疗的动物施用本发明的致免疫组合物本发明的致免疫组合物可以通过肌肉或皮下注射方式来施用，或通过鼻内、气管内、口服、皮肤(cutane)、经皮(percutane)或皮内(intracutane)途径施用。优选地，对于BEFV，IBR，或BTV疫苗而言，进行皮下或肌肉接种，最优选肌肉接种。BEFV，IBR，或BTV的活疫苗优选从6月龄开始施用。

本发明还提供了对动物尤其是牛进行免疫，以便同时抵抗一或多种传染物的方法，其包括口服、鼻内、皮下、皮内、腹腔、肌肉、或气溶胶形式施用疫苗(或将它们组合施用)，所述疫苗含有免疫学有效量的由本发明提供的组合物。

定义

本文所用术语具有本领域技术人员认识到的和已知的含义，但，为了方便起见，也为了完整，下面给出一些具体术语和它们的含义。

除非上下文有清楚的说明，本说明书和所附权利要求中用到的单数形式“一个”(“a”，“an”)和“该”(“the”)包括复数含义。因此，例如，“该方法”包括一或多种方法，和/或步骤，它们属于本文所述类型和/或是本领域技术人员阅读了本文后很明显能认识到的。

术语“约”或“接近”是指统计学意义上的范围值。这样的范围可以是在一个数量级之内，通常在指定数值或范围的50％以内，更通常在20％以内，还更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”或“接近”所涵盖的能允许的变化取决于研究的具体体系，是本领域技术人员可以很容易地认识到的。

BEFV的“感染单位(infectious unit)”是指，感染或杀死50％的组织培养细胞所需的病毒量。这可以表示为50％组织培养感染剂量或TCID₅₀。

当病毒对天然宿主的毒力下降时，该病毒被认为是减毒的。当病毒不能在易感于该病毒的细胞中繁殖时，该病毒被认为是灭活的。

术语“抗原”是指有时能刺激免疫应答的分子。抗原是任何能被后天免疫系统识别的物质。抗原通常是蛋白或多糖。抗原可以是细菌、病毒、或其它微生物的一部分，如外壳(coat)、荚膜(capsule)、细胞壁、鞭毛(flagella)、纤毛(fimbrae)、或毒素。抗原也可以是脂质或核酸。所述组合物中用到的抗原可以从新鲜培养物、冷冻的储存物、冻干的储存物、或其它任何公众可活动的储存物获得。当抗原是病毒时，它可以是活-灭活的或减毒的。

“佐剂”是指一或多种能增强组合物(通常是疫苗组合物)的抗原性的物质。佐剂可以作为缓慢释放抗原的组织储库(tissue depot)的形式起作用，也可以作为非特异性增强免疫应答的淋巴系统激活剂起作用(Hood，et al.，Immunology，SecondEd.，Menlo Park，CA：Benjamin/Cummings，1984.p.384)。通常，单独用抗原进行初步接种，不使用佐剂，不能激发出体液或细胞的免疫应答。而且，根据情况的不同，单独用抗原进行初步攻击，不使用佐剂，不能激发出足够的体液或细胞免疫应答。已有多种细胞因子或淋巴因子被发现具有免疫调节活性，因此能用作佐剂，它们包括，白细胞介素1-α，1-β，2，4，5，6，7，8，10，12(见例如，美国专利5,723,127)，13，14，15，16，17和18(及它的突变形式)；干扰素-α，β和γ；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(见例如，美国专利5,078,996)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；以及肿瘤坏死因子α和β。其它可用于本文所述致免疫组合物的佐剂包括趋化因子，包括但不限于，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，巨噬细胞炎性蛋白(MIP)如MIP-1α和MIP-1β，也称CCL-3和CCL-4；以及活化后调节的、正常T细胞表达并分泌的分子(RANTES)；粘附分子，诸如选择蛋白，例如L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白；黏蛋白-样分子，例如，CD34(也称涎福林(sialophorin)，白细胞唾液素(leukosialin)，或SPN)，GlyCAM-1和MadCAM-1；整联蛋白家族的成员诸如淋巴细胞功能相关分子LFA-1，2，和3，VLA-1，Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族的成员诸如血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)，细胞间粘附分子，例如ICAM-1，ICAM-2，ICAM-3，ICAM-4，和ICAM-5，CD2和LFA-3；协同刺激分子诸如CD40和CD40L；生长因子，包括血管生长因子，神经生长因子，成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，B7.2，PDGF，BL-1，以及血管内皮细胞生长因子；受体分子，包括Fas，TNF受体，Flt，Apo-1，p55，WSL-1，DR3，TRAMP，Apo-3，AIR，LARD，NGRF，DR4，DR5，KILLER，TRAIL-R2，TRICK2，和DR6；以及Caspase(ICE)。

用于增强免疫应答的合适的佐剂还包括，但不限于，MPL^TM(3-O-脱酰化单磷酰脂质A，Corixa，Hamilton，MT)，见美国专利4,912,094。适合用作佐剂的还有合成的脂质A类似物或氨基烷基磷酸葡糖胺化合物(AGP)，或它们的衍生物或类似物，都可从Corixa(Hmilton，MT)获得，都可参见美国专利6,113,918。一种这样的AGP是2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-瞵酰基(phosphono)-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基-氨基]-b-D-葡糖吡喃糖苷，也称529(以前称RC529)。该529佐剂被配制成含水形式(AF)或为稳定的乳液(SE)。

其它佐剂还包括，胞壁酰肽，诸如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳剂，诸如MF59(PCT出版物WO90/14837)(含5％角鲨烯，0.5％80，和0.5％Span 85(任选含不同量的MTP-PE)，用高压纳米均质机(microfluidizer)如110Y型高压纳米均质机(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米粒子(submicron particle))，和SAF(含10％角鲨烯，0.4％Tween 80，5％pluronic-嵌段共聚物L121，和thr-MDP，经高压纳米均质机处理成亚微米乳液或涡旋形成大颗粒乳液)；不完全福氏佐剂(IFA)；铝盐(alum)，诸如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝；爱菲金(Amphigen)；阿夫立定；L121/角鲨烯；D-交酯(lactide)-聚交酯/糖苷；pluronic多元醇；杀死的博德特氏菌(Bordetella)；皂素，诸如Stimulon^TM QS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，见美国专利5,057,540，ISCOMATRIX(CSL Limited，Parkville，Australia)，见美国专利5,254,339，以及免疫刺激复合物(ISCOMS)；结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；细菌脂多糖；合成的多核苷酸诸如含CpG基序的寡核苷酸(例如美国专利6,207,646)；IC-31(Intercell AG，Vienna，Austria)，见欧洲专利1,296,713和1,326,634；百日咳毒素(PT)或其突变体，霍乱毒素或其突变体(例如，PCT出版物WO00/18434，WO02/098368和WO02/098369)；或大肠杆菌不耐热毒素(LT)，特别是LT-K63，LT-R72，PT-K9/G129；见例如，PCT出版物WO 93/13302和WO92/19265。

本发明组合物中可以添加的佐剂可包括SL-CD，氢氧化铝，SP-oil，或卡波普，或可代谢的油，诸如一或多种不饱和萜烃(terpene hydrocarbon)，例如角鲨烯或角鲨烷，以及聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物如

术语“哺乳动物”包括单孔类动物(monotreme)(例如鸭嘴兽(platypus))，有袋类动物(marsupial)(例如袋鼠)，以及有胎盘哺乳动物(placental)，其包括牲畜(为提供肉、奶、或纤维而饲养的动物，如狗，绵羊，牛，和马)和伴侣动物(例如狗，猫)。“有蹄类动物”包括，但不限于，牛，水牛(water buffalo)，野牛(bison)，绵羊，猪，鹿，大象，牦牛。这些中的每一种都包括成年形式和发育形式(例如小牛，小猪，小羊等)。本发明的致免疫组合物可以对成年的或发育中的哺乳动物(优选牲畜)施用。

“免疫学有效量”是激发免疫应答的抗原量。牛暂时热病毒(BEFV)的免疫学有效量是激发抗牛暂时热病毒的免疫应答的BEFV量。牛疱疹病毒1(IBR)的免疫学有效量是激发抗IBR的免疫应答的IBR量。蓝舌病毒(BTV)的免疫学有效量是激发抗BTV的免疫应答的BTV量。“免疫学有效量”取决于受体动物的物种，品种(breed)，年龄，大小和健康状况。“免疫学有效量”受该动物在先暴露于该抗原的一或多个株、而所述一或多个株是毒力株还是无毒力的病毒株的影响。本文中，牛暂时热病毒(BEFV)的“免疫学有效量”，当与至少一种合适的佐剂组合应用时，是足以增强该牛暂时热病毒的免疫原性、并因此提供抵抗毒力牛暂时热病毒株攻击的保护性免疫力的BEFV量。在一实施方案中，BEFV的免疫学有效量是约10^6.20TCID₅₀/mL组合物。

本文中，牛疱疹病毒1(IBR)的“免疫学有效量”，当与至少一种合适的佐剂组合应用时，是足以增强该牛疱疹病毒的免疫原性、并因此提供抵抗毒力牛疱疹病毒株攻击的保护性免疫力的量。在一实施方案中，IBR的免疫学有效量是约6.8logs/mL组合物。

本文中，蓝舌病毒(BTV)的“免疫学有效量”，当与至少一种合适的佐剂组合应用时，是足以增强该蓝舌病毒的免疫原性、并因此提供抵抗毒力蓝舌病毒株攻击的保护性免疫力的量。在一实施方案中，BTV的免疫学有效量是约10^6.7TCID₅₀BTV血清型1和/或约10^7.3TCID₅₀BTV血清型8/mL组合物。

在本发明一些实施方案中，所述病毒抗原可以是以下病毒的至少一个株：感染性牛疱疹病毒1(也称牛鼻气管炎病毒或IBR)，副流感病毒，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹泻病毒，手足口病病毒，蓝舌病毒，牛暂时热病毒，犬细小病毒，犬温热病毒，犬腺病毒，犬副流感病毒，犬冠状病毒，狂犬病病毒，猫瘟病毒(panleukopania virus)，猫嵌杯样病毒(calicivirus)，猫病毒性鼻气管炎病毒，猫传染性腹膜炎病毒，猫白血病病毒，猫免疫缺陷病毒，西尼罗病毒，马脑脊髓炎病毒，马流感病毒，马疱疹(鼻肺炎)病毒，马动脉炎病毒，猪细小病毒，猪圆环病毒(cirocovirus)，猪生殖呼吸综合征病毒，猪轮状病毒，猪流感病毒，假狂犬病病毒，传染性法氏囊病病毒，Marek病病毒，新城疫病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，禽脑脊髓炎病毒，禽呼肠孤病毒，禽流感病毒。

本文中，术语“病毒亚单位”是指病毒体的一个部分。例如，牛暂时热病毒(BEFV)亚单位可以是BEFV病毒体的至少一部分，BEFV基因组的至少一部分，BEFV编码蛋白的至少一部分，如BEFV核蛋白，BEFV聚合酶相关蛋白，BEFV基质蛋白，BEFV RNA-依赖性RNA聚合酶，或BEFV糖蛋白。

本文中，术语“致免疫”是指，所述组合物能激发体液和/或细胞免疫应答。致免疫株也是具有抗原性的。致免疫组合物是给予动物后激发体液和/或细胞免疫应答的组合物。

术语“致免疫组合物”涉及含有抗原例如微生物的任何药物组合物，该组合物可用于在动物中激发免疫应答。所述免疫应答可包括T细胞应答，B细胞应答，或两者。所述组合物可以通过在细胞表面呈递与MHC分子相关的抗原而使该哺乳动物致敏。此外，可产生抗原特异性T-淋巴细胞或抗体，以允许将来保护被免疫的宿主。“致免疫组合物”可包含活的，减毒的，或杀死的/灭活的抗原。所述抗原可以是完整微生物或从它衍生出的能诱导免疫应答的致免疫部分。致免疫组合物可保护动物而避免与该微生物感染有关的一或多种症状，或可保护该动物不发生因该微生物感染所致的死亡。

术语“肠胃外给药”在本文中是指，不通过胃肠道，通过其它途径给药，特别是通过静脉、皮下、肌肉或髓内(intramedullar)注射将物质引入生物，但也可以指另外的非-口服和非-鼻途径给药诸如腹腔注射或表面局部应用(topicalapplication)。

术语“疫苗”或“疫苗组合物”在本文中可互换使用，是指药物组合物，其含有至少一种在动物中诱导免疫应答的致免疫组合物。疫苗或疫苗组合物可保护该动物而避免归因于感染的疾病或可能的死亡，而且可以包括或不包括一或多种另外的增强该活性成分之免疫学活性的成分。疫苗或疫苗组合物还可包含药物组合物常见的其它成分。其它成分可包括，例如，一或多种佐剂或免疫调节剂。疫苗的致免疫活性成分可包含完整的活生物，为它们的原始形式，或为改良活疫苗中的减毒生物形式，或杀死的或灭活的疫苗中的通过适当方法失活的生物，或含有所述病毒的一或多种致免疫组分的亚单位疫苗，或经本领域技术人员已知的方法制得的基因工程化、突变的、或克隆化的疫苗。疫苗或疫苗组合物可包含一种或同时包含不止一种上述元件。

相应地，在本申请中，可以采用本领域技术范畴内的常规分子生物学，微生物学和免疫学技术。这样的技术在文献中有详细解释。见例如，Sambrook，Fritsch& Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York。

实施例

实施例1制备牛暂时热病毒/QUIL A混合物(mix)

牛暂时热(BEF)活病毒抗原从冷冻的储存物获得。室温解冻后，在添加疫苗中的其它成分之前，将病毒与Quil A混合。

Quil A粉末由Brenntag制备，从APS(Nuplex Industies，Australia的分支机构)以产品编号04307503获得。

QuilA储液通过在水中稀释至10mg/mL而制得。

简言之，149.96mL活BEF抗原储存物(1.38x10⁷TCID₅₀/mL)用36.34mL9.643g/mL NaCl稀释，在1mg/mL添加20.70mL 10mg/mL Quil A。将该混合物室温搅拌2.5小时。

实施例2

制备BEFV疫苗

为制备BEFV疫苗，依次添加以下成分，每两次添加之间将混合物搅拌5分钟。

384.3mL 8.5g/mL NaCl

94.87g BEFV/QUILA混合物，按实施例1制备

120.00mL 10mg/mL SL-CD*储存物至20％(v/v)

1.36g硫柳汞9.9％(w/v)

*SL-CD按Hilgers等所述来制备(Sulpholipo-cyclodextrin in squalene-in-wateras a novel and safe vaccine adjuvant.Vaccine 17(1999)，pp219-228)。

添加了所有成分后，将疫苗搅拌30分钟，将pH调至7.18。

再将疫苗搅拌30分钟，用其充满标记好的枕式包装(pillow packs)中。

实施例3

BEFV疫苗的动物试验

疫苗安全性测试在Fort Dodge Australia，Penrith site进行。疫苗安全性按照EP2002：0062指南在牛中测试。

10只豚鼠和两头牛接种如上述制得的疫苗，以确定对BEF抗原级分的血清型反应。这10只豚鼠体重为250-400g，每只都皮下接种2.0mL疫苗。六周后给豚鼠采血。两头不到1岁的牛皮下接种4mL疫苗。接种的14天后给牛采血。所得血清按照Biosecurity Sciences Laboratory，Department of Primary Industriesand Fisheries Animal Research Institute，Queensland(Australia)的试验方案进行病毒中和(VN)测试。所用的病毒中和测试方法遵循“澳大利亚标准诊断程序(Australiastandard diagnostic procedures)”。

两批疫苗的试验结果见下表1：

表1

用单剂BEF疫苗的安全性结果

根据用BEF灭活疫苗在牛和兔中进行的试验，有证据表明，实验室的动物血清学与牛的抗BEFV保护作用存在相关性。故，表1所示豚鼠结果证实，本发明的致免疫组合物能给牛提供抗BEFV的保护作用。

如上述制得的单剂BEF疫苗制剂产生了稳定的乳剂。在牛安全性测试中，该疫苗经过了安全性测试，最初未产生接种部位的反应。尽管未发现全身反应或行为反应，但在观察期结束时，这种疫苗在注射部位产生一些局部反应。

下表2描述了牛接种单剂4mL上述疫苗制剂后出现的症状。

表2

全身反应和局部反应

总之，在含BEFV的配制剂中用含皂素(Quil A)和SL-CD作为佐剂的致免疫组合物产生有效的能用作单剂疫苗的BEFV疫苗。

实施例4

制备IBR疫苗混合物(Blends)

为选出将来的疫苗的合适佐剂，将杀死的重组牛疱疹病毒-1(也称感染性牛鼻气管炎病毒(IBR))疫苗与不同佐剂混合，并予以评价。用1X滴度的6.04logs/mLIBR(EU)制得与三种不同佐剂组合的疫苗。疫苗A含有AlOH(15％)和皂素；疫苗B含有5％SP油；疫苗C含有20％SL-CD和皂素。皂素从Berghausen以产品目录号603013获得。

表3

单价rIBR(EU)疫苗A有ALOH(15％)和皂素作为佐剂

表4

单价rIBR(EU)疫苗B有SP OIL(5％)作为佐剂

表5

单价rIBR(EU)疫苗C：有SL-CD(20％)和皂素作为佐剂

*SL-CD/角鲨烷按Hilgers等(Sulpholipo-cyclodextrin in squalene-in-water as a novel andsafe vacine adjuvant.Vaccine 17(1999)，pp219-228)所述制备。

实施例5

IBR疫苗的动物实验

疫苗测试在Iowa进行。总共27头5-6月龄的牛按下表6随机分组：

表6

用IBR疫苗测试的动物

组	动物编号	疫苗	接种号
				1	5	rIBR，Al(OH)₂/皂素	2
2	5	rIBR，SP油	2
				3	5	rIBR，SL-CD/皂素	2
4	5	rIBR，SL-CD/皂素	1
				5	5	无	无
6	2	无	无

除了第4-6组的牛以外，其它牛皮下接种两次，中间间隔3周。第二次接种的2周后(或组4在接种的3周后)，所有牛(除了组6的两头牛)用毒力IBR病毒进行鼻内攻击。所有的牛在攻击后的14天内每天监控该疾病的临床症状。临床症状包括但不限于流粘液脓性鼻涕(mucopurulent nasal discharge)，流眼泪(oculardischarge)，呼吸困难(dyspnea)，胃口不好(食欲不良(off-feed))，和抑郁。攻击后的14天内还每天测直肠温度。整个研究其间，定期对动物取血以获得血清，用血清中和实验测定抗IBR抗体。从攻击前2天到攻击后14天，每天鼻拭子进行病毒分离。确定每天从每头牛分离到的病毒滴度。组2有一头牛在攻击前就因健康太糟糕而退出。

观察到的与IBR攻击有关的临床症状见下表7，病毒排出的结果见表8。抗-IBR血清中和抗体滴度见表9。

表7

经毒力IBR攻击的动物中观察到的临床症状的平均发生率 ^a

组	发热^b	流粘液脓性鼻涕	咳嗽
				rIBR，Al(OH)₂/皂素	1.8±1.5	0.4±0.5	1.2±0.8
rIBR，SP油	3.0±2.9	0.5±0.6	1.0±2.0
				rIBR，SL-CD/皂素，2剂	2.8±3.4	0.6±0.9	0.6±0.9
rIBR，SL-CD/皂素，1剂	4.0±3.2	0.8±0.8	0.6±0.5
				攻击对照	5.2±1.8	1.0±1.0	2.2±3.3
环境对照	0	0	0

^a所述值表示为均值±标准偏差。

^b直肠温度≥103.5°F，且比基线高1°F。

由于组内个体不多，观察到的接种动物与对照之间的差异并不是统计学意义上的不同。但是，多个差异确实表明了接种效果，尤其是对前三组而言。

发病率和排出的病毒滴度见下表8：

表8

经毒力IBR攻击的动物中的平均排病毒滴度 ^a 和发生率 ^b

组	滴度	发生率
			rIBR，Al(OH)₂/皂素	6.1±0.6*	7.2±1.5*
rIBR，SP油	5.9±0.8*	7.3±0.5*
			rIBR，SL-CD/皂素，2剂	4.2±2.1	4.6±2.7
rIBR，SL-CD/皂素，1剂	6.1±0.5*	6.2±1.1*
			攻击对照	6.6±0.4*	8.2±1.8*
环境对照	0	0

^a所述值表示为平均log₁₀TCID₅₀滴度±标准偏差。

^b所述值表示为平均±标准偏差。

*所示数值显著不同于接种两剂带SL-CD/皂素佐剂的rIBR的组，p＜0.05.

病毒排出结果表明，SL-CD+皂素通过减小病毒排出的数量(至少减少100倍)和发生率，而提供了最佳保护作用。这种被正是的保护作用很可能归因于实验性攻击之时显著较高的抗体滴度，见下表9所示：

表9

抗-IBR血清中和抗体滴度 ^a

在接种了不同佐剂中的rIBR死疫苗的动物中

组	滴度
		rIBR，Al(OH)₂/皂素	25±2*
rIBR，SP油	32±2*
		rIBR，SL-CD/皂素，2剂	63±4
rIBR，SL-CD/皂素，1剂	4±3*

^a所述值表示为几何平均滴度±标准偏差。血清样品在攻击当日采集。

*所示数值显著不同于接种两剂带SL-CD/皂素佐剂的rIBR的组，p＜0.05。

该研究结果表明，所评价的三种佐剂中，SL-CD/皂素组合提供了最佳性能。

实施例6

制备蓝舌病毒疫苗

将5种不同的抗蓝舌病毒血清型1和8的灭活疫苗与不同浓度的BTV8抗原、以及与不同的佐剂组合物一起配制。BTV血清型1的滴度(10^6.7TCID₅₀)在所测试的所有疫苗中保持不变。给牛接种两次，期间间隔两周。疫苗组合E-43，E-44，E-45，E-47，和E-48见下表10-14：

表10

BTV疫苗E-43*的组成

组分	AMOUNT
		BTV灭活血清型1，毒株ALG2006/01E1	10^6.7TCID₅₀
BTV灭活血清型8，毒株BEL2006/02	10^7.3TCID₅₀
		氢氧化铝胶3％	4mg Al³⁺
皂素	0.4mg
		盐水溶液	q.s.2.0mL
硫柳汞	0.2mg

*批号为E-43的1+8Bovis疫苗在西班牙注册(紧急许可)。

表11

BTV疫苗E-44的组成

组分	量
		BTV灭活血清型1，毒株ALG2006/01E1	10^6.7TCID₅₀
BTV灭活血清型8，毒株BEL2006/02	10^7.5TCID₅₀
		氢氧化铝胶3％	4mg Al³⁺
皂素	0.4mg
		盐水溶液	q.s.2.0mL
硫柳汞	0.2mg

表12

BTV疫苗E-45的组成

组分	量
		BTV灭活血清型1，毒株ALG2006/01E1	10^6.7TCID₅₀
BTV灭活血清型8，毒株BEL2006/02	10^7.3TCID₅₀
		氢氧化铝胶3％	4mg Al³⁺
皂素	1.0mg
		盐水溶液	q.s.2.0mL
硫柳汞	0.2mg

表13

BTV疫苗E-47的组成

组分	量
		BTV灭活血清型1，毒株ALG2006/01E1	10^6.7 TCID₅₀
BTV灭活血清型8，毒株BEL2006/02	10^7.3 TCID₅₀
		SL-CD*	20％
皂素**	1.0mg
		盐水溶液	q.s.2.0mL
硫柳汞	0.2mg

*SL-CD/角鲨烷按Hilgers等所述(出处同上)制备。

**Brenntag目录号27031012600

表14

BTV疫苗E-48的组成

组分	量
		BTV灭活血清型1，毒株ALG2006/01E1	10^6.7TCID₅₀
BTV灭活血清型8，毒株BEL2006/02	10^7.0TCID₅₀
		SLCD	20％
皂素	1.0mg
		盐水溶液	q.s.2.0mL
硫柳汞	0.2mg

实施例7

血清中和结果

中和抗体滴度在接种的1周后(+28)和2周后(+35)在所有牛中测量。血清中和结果见下表15-20。中和抗体的存在表明保护作用，但无中和抗体的动物也可以因细胞介导的应答而受保护。

表15

用疫苗E-43获得的结果

BTV-1＝10exp ^6，7 BTV-8＝10exp ^7，3

表16

用疫苗E-44获得的结果

表17

用疫苗E-45获得的结果

表18

用疫苗E-47获得的结果

表19

用疫苗E-48获得的结果

表20

对照

BTV1和BTV8病毒血症的存在在攻击的4，5，和8天后的动物中测量，所述动物接种了疫苗E-43：ZULVAC 1+8(BTV1：106.7+BTV8：107.3)(Al³⁺+皂素：真正的配制剂)和E-47：ZULVAC 1+8(BTV1 106.7+BTV8：107.3)(SLCD+2.5x皂素：新佐剂)。

疫苗E-43：ZULVAC 1+8(BTV1：10^6.7+BTV8：10^7.3)(Al³⁺+皂素：真正的配制剂)

100％百分之百阻止BTV1病毒血症(0/8)

87.5％百分之百阻止BTV8病毒血症(1/8)

疫苗E-44：ZULVAC 1+8(BTV1 10^6.7+BTV8：10^7.5)(Al³⁺+皂素：比真正的配制剂多1.58倍的BTV8抗原)

100％百分之百阻止BTV1病毒血症(0/8)

87.5％百分之百阻止BTV8病毒血症(1/8)

以上结果表明，将疫苗中的BTV血清型8增加1.58倍也没有诱导出更好的保护作用。

疫苗E-47：ZULVAC 1+8(BTV1 10^6.7+BTV8：10^7.3)(SLCD+2.5X皂素：新佐剂)

100％百分之百阻止BTV1病毒血症(0/8)

100％百分之百阻止BTV8病毒血症(0/8)

疫苗E-45：ZULVAC 1+8(BTV1 106.7+BTV8：107.3)(Al3++2X皂素：比真正的配制剂多2x的皂素)

100％百分之百阻止BTV1病毒血症(0/8)

100％百分之百阻止BTV8病毒血症(0/8)

实施例8

生成伽玛干扰素

用Bovigam TB测试(Prionics)来检测血样中的伽玛干扰素。简言之，制备外周血单核细胞(PBMC)，一部分用VP7刺激，一部分用VP2刺激。伽玛干扰素的生成仅在用VP7刺激的血细胞中检测到。

接种疫苗E-43和E-47的动物中γ-IFN的特异性生成的评价结果如下。第1次接种(D+0)；第2次接种(D+21)；攻击(D+45)

30头3月龄的不含抗BTV抗体的Frisean牛包括在本研究中。牛的性别不予考虑。仅正常健康的牛包括在该研究中。它们的健康状况在抵达时验证。每头牛通过耳标进行识别。将30头血清阴性Frisean牛随机分为4个处理组(用Microsoft Excel程序分)，如下：

组1：10头牛，接种并再次接种疫苗E-43

组2：10头牛，接种并再次接种疫苗E-47

组3：10头对照牛，不接种

用2mL疫苗通过肌肉途径(i.m.)接种，这是对牛给予疫苗最常见的途径。

组1和2的牛在第0天接种(D+0)，3周后再接种(D+21)。

组3的牛保持为未接种对照。

在以下时间点从牛取血：第0天(D+0)，第一次接种之前；3周后(D+21)再次接种(或第二次接种)之前；以及第42天，攻击前(D+42)。从每份样品制备外周血单核细胞(PBMCs)。

第二次接种的24天后，将牛都转移到Fort Dodge Veterinaria的3号攻击室，在那里，于再次接种后第24天(D+45)，每组8头牛用BTV-1或BTV-8攻击。攻击的5天后，从牛取血，评价抗VP7和VP2的γ-IFN的特异性生成。

γ-IFN检测

在有肝素存在的情况下，在每次接种当天、攻击前一天、以及感染后第5天，对该实验中的所有牛取血。经密度梯度离心提取PBMC(Histopaque 1077)，用添加了胎牛血清的RPMI 1640洗后，重悬至终浓度5x10⁶个细胞/mL。将细胞铺在已有重组蛋白VP2和VP7(1μg/mL)的96孔板上。用伴刀豆蛋白A(5μg/mL)作为阳性对照。将这些板37℃保温16-过夜。γ-IFN实验在上清中用牛干扰素测试(Bovigam TB，Prionics)进行。结果扣除每头牛的未刺激值后表示为A450单位。

仅VP7重组蛋白能在接种过的动物中在第二次接种后诱导γ-IFN的特异性生成。

在攻击当天，10头接种疫苗E-47的牛有3头(30％)显示生成抗VP7的γ-IFN。攻击的5天后，阳性动物比例增加至63％。接种过疫苗E-43的动物在攻击的5天后显示抗VP7γ-IFN的阳性生成(8头中的2头，25％)，但在攻击当天未如此。

结果见表21，表示为A450单位，是γ-IFN生成的比例(＞0.065)。

表22

攻击当天两种疫苗之间的交叉数据(CROSSTAB)

无显著性差异：p＝0.105

表23

攻击后第5天两种疫苗之间的交叉数据

无显著性差异：p＝0.157

表24

攻击当天疫苗E-47和对照之间的交叉数据

无显著性差异：p＝0.105

表25

攻击后第5天疫苗E-47和对照之间的交叉数据

显著性差异：p＝0.009

表26

攻击后第5天疫苗E-43和对照之间的交叉数据

结论

接种了ZULVAC 1+8批号为E-47(BTV1：10^6.7+BTV8：10^7.3)(SLCD+2.5x皂素：新佐剂)的牛，在攻击当天(第二次接种的3周后)以及攻击后第5天，显示出比对照、以及比接种了ZULVAC 1+8(BTV1：10^6.7+BTV8：10^7.3)(AI³⁺+皂素：真正的配制剂)的牛更高水平的γ-IFN。

接种了疫苗E-43(真正的配制剂)的牛直至攻击后第5天也未显示生成抗VP7的γ-IFN。其数值显著低于(p＝0.021)疫苗E-47(新佐剂)诱导的数值。

仅VP7重组蛋白能诱导可检测的量的γ-IFN，因此VP7可以作为细胞免疫力的增强剂。

Claims

1.免疫学组合物，包含磺基脂-环糊精(SL-CD)和Quil A。

2.权利要求1的免疫学组合物，还包含至少一种抗原。

3.权利要求2的免疫学组合物，其中所述至少一种抗原选自细菌、病毒、肽、核酸、或它们的组合。

4.权利要求2的免疫学组合物，其中所述至少一种抗原是牛抗原。

5.权利要求3的免疫学组合物，其中所述至少一种抗原是病毒抗原。

6.权利要求5的免疫学组合物，其中所述病毒抗原是牛暂时热病毒(BEFV)，牛疱疹病毒1(IBR)，或蓝舌病毒(BTV)。

7.权利要求6的免疫学组合物，其中SL-CD的终浓度为0.2mg/mL。

8.权利要求6的免疫学组合物，其中Quil A的终浓度为0.5mg/mL。

9.权利要求1的免疫学组合物，其中Quil A的终浓度为0.1mg/mL至0.2mg/mL。

10.权利要求9的免疫学组合物，其中Quil A的终浓度为0.158mg/mL。

11.权利要求7的免疫学组合物在制备用于在有需要的动物中激发免疫应答的的试剂盒中的用途，其中所述Quil A的终浓度是0.1mg/mL至0.2mg/mL，或Quil A的终浓度是0.158mg/mL。

12.权利要求5的免疫学组合物，是在添加SL-CD之前将Quil A与病毒抗原组合而制得的。

13.权利要求12的免疫学组合物，还包含至少一种另外的佐剂。

14.权利要求13的免疫学组合物，其中所述至少一种另外的佐剂选自氢氧化铝，SP-oil，或卡波普。

15.权利要求12的免疫学组合物，其中所述SL-CD的终浓度为0.2mL/mL。

16.权利要求12的免疫学组合物，其中所述Quil A的终浓度为0.1mg/mL至0.2mg/mL。

17.权利要求16的免疫学组合物，其中所述Quil A的终浓度为0.158mg/mL。

18.权利要求12的免疫学组合物，其中所述病毒抗原是牛抗原。

19.权利要求18的免疫学组合物，其中所述病毒抗原选自BEFV，IBR，和BTV。

20.权利要求19的组合物在用于制备在动物中激发抗BEFV的免疫应答的试剂盒中的用途。

21.权利要求20的用途，其中所述免疫应答在施用单剂量的所述组合物之后被激发。

22.权利要求20的用途，其中所述免疫应答是保护性免疫应答。

23.激发动物免疫应答的试剂盒，包含SL-CD和Quil A。

24.权利要求23的试剂盒，还包含至少一种抗原。

25.权利要求24的试剂盒，其中所述至少一种抗原选自细菌，病毒，肽，核酸，或它们的组合。

26.权利要求25的试剂盒，其中所述至少一种抗原是病毒抗原。

27.权利要求26的试剂盒，其中所述病毒抗原选自BEFV,IBR,和BTV。