MX2011001910A - Composicion inmunologica. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones inmunológicas que comprenden sulfolipo-ciclodextrina (SL-CD) y saponina o Quil A y opcionalmente al menos un antígeno. La invención se refiere a procedimientos y composiciones inmunológicas que comprenden al menos un antígeno, que puede ser un antígeno veterinario. El antígeno veterinario en los procedimientos y composiciones inmunológicas de la invención puede ser un antígeno bovino. La invención se refiere a procedimientos y composiciones inmunológicas que comprenden virus de la fiebre efímera bovina (VFEB), herpes virus bovino 1 (RBI) o virus de la lengua azul (VLA). La invención comprende procedimientos para provocar una respuesta inmune frente a VFEB, RBI o VLA en un animal, que comprenden administrar al animal una composición de la invención. En la invención, particularmente la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora. La invención comprende un procedimiento para preparar una composición inmunológica que comprende añadir Quil A a un virus.

Description

COMPOSICIÓN INMUNOLÓGICA REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de conformidad con 35 U. S. C. § 119(a) de la Solicitud Provisional Australiana N° 2008904261 presentada el 19 de agosto de 2008 y de acuerdo con 35 U. S. C. § 119(e) de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos N° 61/092091 , presentada el 27 de agosto de 2008. Los contenidos completos de estas solicitudes se incorporan en el presente documento por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones inmunológicas que comprenden sulfolipo-ciclodextrina (SL-CD) y saponina o Quil A y opcionalmente al menos un antígeno. La invención también se refiere a procedimientos para preparar composiciones inmunológicas que comprenden SL-CD, saponina o Quil A y un antígeno. La presente invención también proporciona procedimientos para usar composiciones inmunogénicas para provocar una respuesta inmune frente al virus de la fiebre efímera bovina (VFEB), al herpes virus bovino 1 (RBI) o al virus de la lengua azul (VLA). La presente invención proporciona kits que comprenden una composición inmunológica de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los adyuvantes de saponina son una clase conocida de adyuvantes que se han usado en el Mercado en vacunas para animales. Las saponinas son una clase de metabolitos secundarios que se encuentran en diversas especies de plantas. Estas son glicósidos antipáticos agrupados fenomenológicamente por la espuma similar a jabón que producen cuando se agitan en soluciones acuosas. Estructuralmente, las saponinas se componen de uno o más restos de glicósidos hidrófilos combinados con un derivado de triterpeno lipofílico. Las saponinas comerciales principalmente se aislan a partir de la corteza del árbol suramericano Quillaja Saponaria Molina y la planta Yuca de Mojave que también se denomina Yucca schidigera. Las saponinas están disponibles en varias Fuentes incluyendo Berghausen Corporation (Cincinnati, OH). La forma refinada de saponina se denomina comúnmente Quil A y está disponible en el Mercado a partir de varias Fuentes incluyendo Berghausen Corporation, Sergeant Chemical Company (Clifton, NJ), Superfos a/s (Vedbaek, Dinamarca) y Brenntag Biosector (Frederikssund, Dinamarca). Las características físicas y químicas de Quil-A se exponen en la bibliografía comercial disponible en Superfos, titulada Purified Saponin Adyuvante Quil-A. Quil-A se caracteriza químicamente como un resto de carbohidrato en enlace glicosídico con el ácido quillaico triterpenoide.

Se han expedido varias patentes de los Estados Unidos que describen Quil A como un adyuvante. Por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Números 6,416,764 y 6,291 ,228 se refieren una vacunas que usan Quil A como un adyuvante y que comprenden una cepa no citopatogénica del virus de la diarrea viral bovina. La Patente de los Estados Unidos N° 4,432,969 se refiere a una composición de alérgeno inhalante que comprende un alérgeno inhalante y un adyuvante de saponina o Quil A.

La Patente de los Estados Unidos Número 4,900,549 describe un procedimiento para preparar complejos inmunogénicos que contienen Quil A.

La Patente de los Estados Unidos Número 6,165,995 se refiere a la preparación de derivados de SL-CD. La Patente de los Estados Unidos Número 6,610,310 se refiere a polímeros poli iónicos, tales como SL-CD, como adyuvantes.

La Fiebre Efímera Bovina (FEB) es una enfermedad viral debilitante que afecta al ganado tanto de leche como de carne, particularmente en Australia del norte. La FEB también se reconoce en la mayoría de los países asiáticos en los que se cría ganado con fines comerciales. La FEB se conoce como "la enfermedad de los tres días" y puee afectar considerablemente el rendimiento de leche diario o provocar una morbilidad en ganado de carne y de leche (Walker, P. J., 2005, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 292: 57-80).

El agente causante de la FEB es el virus de la fiebre efímera bovina (VFEB). Este virus es un rabdovirus que se ha clasificado en el género Ephemerovirus. El virión de VFEB tiene forma de bala o de cono y contiene un genoma de ARN de hélice única negativa. El genoma de VFEB codifica una nucleoproteína, una proteína asociada a polimerasa, una proteína de matriz, una ARN polimerasa dependiente de ARN grande y dos glicoproteínas.

En Australia ha estado disponible una vacuna de FEB viva modificada durante muchos años y se proporciona mediante refuerzo anual antes de la temporada de FEB. Esta vacuna requiere una prescripción veterinaria y se presenta en una forma liofilizada que requiere la reconstitución con un diluyente que contiene adyuvante antes de la administración. Los animales sin tratamiento previo requieren dos dosis de vacuna seguidas por revacunación anual.

La Publicación PCT N° WO/1994004685 se refiere a la preparación de una vacuna de VFEB que comprende la glicoproteína de superficie de VFEB.

Vanselow y col. (1995, Vet. Microbiol. 46: 117-130) describe el ensayo de diversas vacunas de FEB.

Hsieh y col. (2006, J. Vet. Med. Sci. 68: 543-548) se refiere una vacunas de VFEB que usan cepas virales Tn88128 y Tn73. Estas vacunas se prepararon inactivando el virus mediante la adición de etilenimina binaria e hidróxido de aluminio o adyuvantes de agua:aceite:agua.

Una vacuna recombinante que comprende la glicoproteína estructural de VFEB clonada en un vector del virus de la enfermedad de la piel aterronada (Neethling de tipo SA) se ha descrito por Wallace, D. B. y Viljoen G. J. (2005, Vaccine 23: 3061-3067).

Chuang y col. (2007, J. Virol. Meth. 145: 84-87) se refiere al uso de interferencia de ARN y supresión de la expresión del gen de la glicoproteína de superficie de VFEB.

El Herpes virus bovino 1 también se conoce como el virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina. Se encuentra abreviado como RIB o RBI. Herpes virus bovino 1 es un virus de la familia Herpesviridae que provoca enfermedades en vacas, que incluyen rinotraqueitis, vaginitis, balanopostitis, aborto, conjuntivitis y enteritis. RIB-1 también es un factor que contribuye en la fiebre del transporte. Se propaga a través del contacto sexual, inseminación artificial y transmisión por aerosol. Al igual que otros herpes virus, RIB-1 provoca una infección latente de por vida y presencia del virus. Existe una vacuna disponible que reduce la gravedad e incidencia de la enfermedad. La enfermedad respiratoria causada por RIB-1 se conoce comúnmente como rinotraqueitis infecciosa bovina.

El virus de la lengua azul (VLA) es el virus prototipo del género Orbivirus, que pertenece a la familia Reoviridae de ARN de doble hélice. El VLA provoca enfermedad grave en ganado tal como ovejas, cabras, vacas y ciervos. En la bibliografía se registran veinticuatro serotipos como problemas causales que varían desde infección no evidente hasta infección fulminante aguda. También se han reconocido vacas con presencia de virus persistente crónica. Están disponibles vacunas para el tratamiento de la Lengua Azul en ganado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA I NVENCIÓN La presente divulgación proporciona composiciones inmunológicas que comprenden sulfolipo-ciclodextrina (SL-CD) y saponina y opcionalmente, al menos un antígeno. En algunas realizaciones de la invención la saponina es Quil A. En algunas realizaciones de la invención, el al menos un antígeno se selecciona entre bacterias, virus, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones de la invención, el al menos un antígeno es un antígeno veterinario. En algunas realizaciones de la invención, el antígeno veterinario es un antígeno bovino. En algunas realizaciones de la invención, el antígeno es un antígeno viral. En algunas realizaciones de la invención el antígeno viral es herpes virus bovino 1 (RBI), virus de la lengua azul (VLA) o virus de la fiebre efímera bovina (VFEB). El antígeno viral puede ser atenuado vivo, recombinante, muerto o inactivado. En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición inmunogénica donde el antígeno es un virus atenuado vivo. En algunas realizaciones de la invención, el virus es virus de la fiebre efímera bovina (VFEB). En diversas realizaciones de la invención, el virus es de una reserva congelada, una reserva seca, una reserva liofilizada o una reserva fresca. En diversas realizaciones la saponina está presente en la composición inmunológica de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.5 mg/ml. En diversas realizaciones, Quil A está presente en la composición inmunológica de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 0.2 mg/ml. En algunas realizaciones, en la composición inmunológica de la invención Quil A está presente en una concentración final de aproximadamente 0.158 mg/ml. En diversas realizaciones, en la composición inmunológica de la invención- SL-CD está presente en una concentración final de aproximadamente 0.2 ml/ml. En algunas realizaciones, la composición inmunológica de la invención que comprende saponina y SL-CD o que comprende Quil A y SL-CD, comprende al menos un adyuvante adicional. En diversas realizaciones de la invención, el adyuvante adicional se selecciona entre hidróxido de aluminio, aceite de SP o carbopol. En algunas realizaciones de la invención, el antígeno es un polipéptido, que en algunas realizaciones es una subunidad viral. En algunas realizaciones de la invención, la subunidad viral se selecciona entre VFEB, RBI o VLA.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmune frente a un antígeno veterinario en un animal, que comprende administrar al animal una composición inmunogénica que comprende saponina, SL-CD y al menos un antígeno veterinario. En una realización, la respuesta inmune se provoca después de la administración de una dosis única de la composición inmunogénica. En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmune frente a RBI en un animal, que comprende administrar al animal una composición inmunogénica que comprende saponina, SL-CD y al menos RBI como un antígeno. En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmune frente a VLA en un animal, que comprende administrar al animal una composición inmunogénica que comprende saponina, SL-CD y al menos VLA como un antígeno.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmune frente a VFEB en un animal, que comprende administrar al animal una composición inmunogénica que comprende Quil A, SL-CD y un antígeno. En una realización, la respuesta inmune se provoca después de la administración de una dosis única de la composición inmunogénica. En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmune frente a RBI en un animal, que comprende administrar al animal una composición inmunogénica que comprende saponina, SL-CD y un antígeno. En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmune frente a VLA en un animal, que comprende administrar al animal una composición inmunogénica que comprende saponina, SL-CD y un antígeno. En algunas realizaciones de la invención, la respuesta inmune provocada después de la administración de la composición inmunogénica de la invención es una respuesta inmune protectora.

En una realización, la presente invención proporciona una composición inmunugénica preparada mediante la combinación de Quil A y virus antes de añadir SL-CD. El virus puede ser atenuado vivo, recombinante, muerto o inactivado. En algunas realizaciones de la invención, la Quil A y el virus se combinan a temperatura ambiente. En algunas realizaciones de la invención, la Quil A y el virus se combinan durante al menos 15 minutos. En algunas realizaciones de la invención, la Quil A y el virus se combinan durante al menos 120 minutos.

En una realización, la presente invención proporciona un kit que comprende una composición inmunogénica de la invención para provocar una respuesta inmune en un animal.

En diversas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmune en vacas frente a infección viral o fiebre efímera bovina causada por VFEB. Los procedimientos para inducir una respuesta inmune frente a VFEB comprenden administrar a las vacas una composición que comprende VFEB, SL-CD y Quil A.

En una realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica o vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de VFEB, SL-CD y Quil A.

En diversas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para inducir en vacas una respuesta inmune frente a infección viral por herpes o rinotraqueitis bovina causada por RBI. Los procedimientos para inducir una respuesta inmune frente a RBI comprenden administrar a las vacas una composición que comprende RBI, SL-CD y saponina.

En diversas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para inducir en vacas una respuesta inmune frente a infección viral o lengua azul bovina causada por VLA. Los procedimientos para inducir una respuesta inmune frente a VLA comprenden administrar a las vacas una composición que comprende VLA, SL-CD y saponina.

En una realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica o vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de RBI, SL-CD y saponina.

En una realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica o vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de VLA, SL-CD y saponina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que una composición inmunológica que comprende SL-CD y saponina o Quil A, puede mejorar la inmunogenicidad de al menos un antígeno. En diversas realizaciones de la invención, el al menos un antígeno se puede seleccionar entre bacterias, virus, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones de la invención el al menos un antígeno es un antígeno veterinario. En diversas realizaciones de la invención un antígeno veterinario puede ser un antígeno bovino.

En una realización de la invención, el antígeno veterinario puede ser un antígeno viral. En algunas realizaciones de la invención, el antígeno viral incluye, pero sin limitación, una cepa de VFEB, RBI o VLA. VFEB es un rabdovirus que se conoce que causa la fiebre efímera bovina en Australia, África, el Oriente Medio y Asia. Se conocen muchas cepas de VFEB, tales como BB2271-919 y su cepa parental (919), TN73, Tn88128, cepas 1-1 1 de BEFV2001 o cepas 1-3 de BEFV2004. La selección de la cepa puede ser variada dependiendo del país en el que se va a usar la composición inmunogénica de la invención. Herpes virus bovino 1 también se denomina RIB o RBI y es un virus de la familia Herpesviridae que provoca enfermedades en vacas, incluyendo rinotraqueitis, vaginitis, balanopostitis, aborto, conjuntivitis y enteritis. RBI también es un factor que contribuye en la fiebre del transporte. Se propaga a través del contacto sexual, inseminación artificial y transmisión por aerosol. Al igual que otros herpes virus, RBI causa infección latente de por vida y presencia del virus. La enfermedad respiratoria causada por RBI se conoce comúnmente como rinotraqueitis infecciosa bovina.

El virus de la lengua azul (VLA) es el virus prototipo del género Orbivirus, que pertenece a la familia Reoviridae de ARN de doble hélice. El VLA provoca enfermedad grave en ganado tal como ovejas, cabras, vacas y ciervos. En la bibliografía se registran veinticuatro serotipos como problemas causales que varían desde infección no evidente hasta infección fulminante aguda. También se han reconocido vacas con presencia de virus persistente crónica. La Lengua Azul se ha observado en Australia, América del Norte, África, el Oriente Medio, Asia y Europa.

En diversas realizaciones de la invención, el virus en la composición inmunogénica puede ser atenuado vivo, recombinante, muerto o inactivado. Los procedimientos para preparar virus atenuado vivo se conocen en la bibliografía. Por ejemplo, un virus se puede atenuar mediante el pase del virus a través de un huésped ajeno tal como cultivo de tejido, huevos embrionados o animales vivos. El VFEB atenuado se puede seleccionar para cultivo preferencial en células no bovinas y, en el transcurso de la selección, se hacen menos capaces de crecer en células bovinas. Debido a que estas cepas atenuadas se replican muy mal en huéspedes bovinos, las mismas inducen inmunidad pero no enfermedad cuando se proporcionan a vacas. Se dice que un virus está atenuado si su virulencia por el huésped nativo ha disminuido y aumentado su virulencia por el huésped nuevo. Algunas cepas del virus atenuado pueden estar presentes en la naturaleza. Se puede usar ingeniería genética para atenuar virus de maneras definidas. Los procedimientos para preparar un virus muerto o inactivado para su uso en composiciones, vacunas y procedimientos inmunogénicos se conocen en la técnica. En un procedimiento de inactivación química, una muestra de virus o muestra de suero adecuada que contiene el virus, se trata durante una longitud de tiempo suficiente con una cantidad o concentración suficiente de agente inactivante a una temperatura o pH suficientemente elevado (o bajo, dependiendo del agente de inactivación) para inactivar el virus. Por ejemplo, un virus se puede tratar con agentes de inactivación tales como formalina, etilenimina binaria (BEI) o disolventes hidrófobos, ácidos, etc. El virus se puede inactivar por radiación con luz ultravioleta o rayos X, por calentamiento, etc. La inactivación por calentamiento se conduce a una temperatura y durante una longitud de tiempo suficiente para inactivar el virus. La inactivación por radiación se conduce usando una longitud de onda de luz u otra fuente de energía durante una longitud de tiempo suficiente para inactivar el virus. En algunas realizaciones de la invención, la composición inmunogénica comprende un virus atenuado vivo.

En algunas realizaciones de la invención, la composición inmunogénica comprende un antígeno obtenido de una reserva congelada, una reserva seca o una reserva fresca. Si el antígeno se obtiene de una reserva seca, el mismo se puede obtener de una reserva liofilizada. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica de la invención comprende un antígeno de una reserva congelada.

Las saponinas son glicósidos esteroideos o de triterpeno distribuidos ampliamente en los reinos vegetal y animal marino. Las saponinas se destacan por formar soluciones coloidales en agua, que se espuman a la agitación y por precipitar el colesterol. Cuando las saponinas están cerca de las membranas celulares las mismas crean estructuras similares a poro en la membrana, lo cual provoca que la membrana se rompa. Las saponinas se usan como adyuvantes en vacunas para animales. La actividad adyuvante y hemolítica de las saponinas individuales se ha estudiado de manera extensa (Lacaille-Dubois y Wagner, 1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins" Phytomedicine vol 2 págs. 363-386). Las saponinas son una clase de metabolitos secundarios que se encuentran en diversas especies de planta. Estas son glicósidos antipáticos agrupados fenomenológicamente por la espuma similar a jabón que producen cuando se agitan en soluciones acuosas. Estructuralmente, se componen de uno o más restos de glicósidos hidrófilos combinados con un derivado de triterpeno lipofílico. Las saponinas comerciales principalmente se extraen a partir de Quillaja Saponaria Molina y Yucca schidigera. "Quil A" se refiere a la forma refinada de saponina.

La saponina puede estar presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.4 mg/ml a aproximadamente 0.6 mg/ml. La saponina puede estar presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.5 mg/ml. Quil A puede estar presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 0.2 mg/ml. Quil A puede estar presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.12 mg/ml a aproximadamente 0.18 mg/ml. Quil A puede estar presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.14 mg/ml a aproximadamente 0.16 mg/ml. Quil A puede estar presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.158 mg/ml. En una realización, Quil A está presente en una concentración final de aproximadamente 0.158 mg/ml en las composiciones inmunogénicas de la invención.

Se usó sulfolipo-ciclodextrina en emulsión de escualano en agua (SL-CD/escualano) en la preparación de diferentes vacunas. SL-CD/escualeno se puede preparar como se ha descrito por Hilgers y col. (Sulfolipo-cyclodextrin in squalane in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. Vaccine 17 (1999), págs.. 219-228; Fort Dodge Animal Health Holland, Weesp, Países Bajos).

SL-CD puede estar presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.09 ml/ml a aproximadamente 0.3 ml/ml. SL-CD puede estar presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una concentración final de aproximadamente 0.1 ml/ml, a aproximadamente 0.15 ml/ml, a aproximadamente 0.17 ml/ml, a aproximadamente 0.2 ml/ml o a aproximadamente 0.25 ml/ml. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender además al menos un adyuvante adicionalmente a Quil A y SL-CD. Tal adyuvante adicional se puede seleccionar entre uno cualquiera de los adyuvantes conocidos en la técnica, como se describe con mayor detalle en el presente documento.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmune, que comprende administrar a un animal una composición inmunológica que comprende saponina y SL-CD. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende administrar a un animal una composición inmunológica que comprende saponina, SL-CD y al menos un antígeno. En algunas realizaciones, el al menos un antígeno es un antígeno veterinario. En algunas realizaciones de la invención el antígeno veterinario es un antígeno bovino. En algunas realizaciones de la invención el antígeno veterinario es un antígeno viral. En algunas realizaciones, el antígeno viral es BEHV, RBI o VLA. En algunas realizaciones, el virus está atenuado vivo, recombinante, muerto o inactivado. En algunas realizaciones, el virus está muerto. En algunas realizaciones, el antígeno se obtiene de una reserva congelada, una reserva seca o una reserva fresca. Si el antígeno se obtiene de una reserva seca, el mismo se puede obtener de una reserva liofilizada. En algunas realizaciones, el antígeno se obtiene de una reserva congelada.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmune, que comprende administrar a un animal una composición inmunológica que comprende Quil A y SL-CD. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende administrar a un animal una composición inmunológica que comprende Quil A, SL-CD y al menos un antígeno. En algunas realizaciones, el al menos un antígeno usado en el procedimiento es un antígeno veterinario. En algunas realizaciones, el antígeno veterinario usado en el procedimiento es un antígeno bovino. En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno viral. En algunas realizaciones, el antígeno viral es RBI, VFEB o RBI. En algunas realizaciones, el antígeno viral es atenuado vivo, recombinante, muerto o inactivado. En algunas realizaciones, el virus es atenuado vivo. En algunas realizaciones, el antígeno se obtiene de una reserva congelada, una reserva seca o una reserva fresca. Si el antígeno se obtiene de una reserva seca, el mismo se puede obtener de una reserva liofilizada. En algunas realizaciones, el antígeno se obtiene de una reserva congelada.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden provocar una respuesta inmune después de la administración de múltiples dosis. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden provocar una respuesta inmune después de la administración de dos dosis. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la invención provocan una respuesta inmune después de la administración de una dosis única. La respuesta inmune provocada por las composiciones inmunogénicas de la invención puede ser una respuesta inmune protectora. Después de la administración de una dosis inicial de la composición inmunogénica de la invención, se puede administrar una dosis de refuerzo después de un periodo de aproximadamente cuatro semanas para potenciar la respuesta inmunogénica. También se pueden administrar dosis adicionales de refuerzo.

En una realización, la invención proporciona un kit para provocar una respuesta inmune en un animal. En algunas realizaciones, el kit comprende una composición inmunogénica que comprende saponina y SL-CD y, opcionalmente, al menos un antígeno. En algunas realizaciones, la saponina en el kit es Quil A. En algunas realizaciones, el al menos un antígeno en el kit es un antígeno veterinario. En algunas realizaciones, el antígeno veterinario en el kit es un antígeno bovino. En algunas realizaciones, el antígeno veterinario en el kit es un antígeno viral. En algunas realizaciones, el antígeno viral en el kit es VFEB, RBI o VLA. En algunas realizaciones, el antígeno en el kit puede ser atenuado vivo, recombinante, muerto o inactivado. En algunas realizaciones, el antígeno en el kit es atenuado vivo. En algunas realizaciones, el antígeno en el kit es muerto. En algunas realizaciones, el antígeno en el kit se puede obtener de una reserva congelada, reserva seca o una reserva fresca. En algunas realizaciones, el antígeno en el kit se obtiene de una reserva congelada.

La invención proporciona kits, composiciones inmunológicas y vacunas que comprenden SL-CD y, saponina y/o Quil A, que pueden comprender al menos un adyuvante adicional. Entre los adyuvantes que se pueden usar, se pueden mencionar a modo de ejemplo hidróxido de aluminio, avridina, bromuro de dimetildioctadecilamonio (también conocido como DDAB o DODAB), polifosfacenos, emulsiones de aceite-en-agua basadas en aceite mineral tal como SPT emulsión (véase, por ejemplo Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, editado por Michael F. Powel y Mark J. Newman, Plennum Press, Nueva York y Londres, páginas 147-204), emulsiones de agua en aceite basadas en aceite metabolizable como se describe en la Patente de los Estados Unidos N° 6,368,601 , así como las emulsiones descritas en la Patente de los Estados Unidos N° 5,422,109. Otros ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen escualano y escualeno (u otros aceites de origen animal); copolímeros de bloque tales como saponina pluronic ®(L121); detergentes tales como Tween®-80, aceites minerales tales como DRAKEOL® o Marcol®; aceites vegetales tales como aceite de cacahuete; adyuvantes obtenidos de corynebacteríum tales como corynebacterium parvum, adyuvantes obtenidos de propionibacteríum; Mycobacterium bovis (Bacillus de Calmette y Guérinn o BCG); interleuquinas tales como interleuquina 2 e interleuquina-12; monoquinas tales como interleuquina 1 ; factor de necrosis tumoral; interferones tales como interferón gamma; liposomas; adyuvante iscom; extracto de pared celular micobacteriana; glicopéptidos sintéticos tales como muramil dipéptidos u otros derivados; Avridina; Lípido A; dextran sulfato; DEAE-Dextran o DEAE-Dextran con fosfato de aluminio; carboxipolimetileno, tal como Carbopol®; EMA; emulsiones de copolímero acrílico tales como Neocryl® A640 (véase la Patente de los Estados Unidos N° 5,047,238); proteínas de vaccinia o poxvirus animal; adyuvantes de partícula subviral tales como orbivirus; toxina del cólera; bromuro de dimetildidodecilamonio o mezclas de los mismos. Otros adyuvantes se pueden seleccionar entre tensioactivos (por ejemplo, hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-n'-N-bis(2-hidroxietilpropano diamina), metoxihexadecilglicerol y polioles pluriónicos); polianiones (por ejemplo, pirano, dextran sulfato, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol), péptidos (por ejemplo, muramil dipéptido, dimetilglicina, tuftsina), emulsiones oleosas, alumbre y mezclas de los mismos. También es posible elegir combinaciones de adyuvantes.

En una realización, la invención proporciona una composición inmunogénica preparada mediante la combinación de Quil A y el antígeno antes de añadir un antígeno adicional tal como SL-CD. Los expertos en la materia comprenden que mediante la combinación del virus con Quil A se disminuirá el título de virus eficaz (Walker, P. J., 2005, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 292: 57-80). La combinación e la Quil A y el antígeno, antes de añadir al menos un ingrediente diferente a la composición inmunogénica, se puede realizar durante cualquier longitud de tiempo. Un experto en la materia comprenderá fácilmente que la composición inmunogénica de la invención se puede preparar mediante la combinación de la Quil A y el antígeno, antes de añadir al menos un ingrediente diferente a la composición inmunogénica, durante diversos periodos de tiempo. Por ejemplo, la Quil A y el antígeno se pueden combinar desde al menos 5 minutos a al menos 200 minutos. En algunas realizaciones, la Quil A y el antígeno se combinan durante cualquier longitud de tiempo incluyendo de al menos 10 minutos a al menos 190 minutos. En algunas realizaciones, la Quil A y el antígeno se combinan durante al menos 15 minutos. Los expertos en la materia apreciarán que la composición inmunogénica de la invención se puede preparar mediante la combinación de la Quil A y el antígeno a una cualquiera de muchas temperaturas. La combinación de la Quil A y el antígeno se puede realizar a temperaturas más bajas o más altas que la temperatura ambiente siempre y cuando la composición resultante sea inmunogénica. La Quil A y el antígeno se pueden combinar a temperatura ambiente. En algunas realizaciones, el antígeno en la composición inmunogénica preparada mediante la combinación de Quil A y un antígeno antes de añadir SL-CD es un virus. En algunas realizaciones, el virus es VFEB. En algunas realizaciones, el virus puede ser atenuado vivo, recombinante, muerto o inactivado. En algunas realizaciones, el antígeno es atenuado vivo. En algunas realizaciones, el antígeno se puede obtener a partir de una reserva congelada, reserva seca o una reserva fresca. En algunas realizaciones, el antígeno se obtiene a partir de una reserva congelada.

En una realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica para provocar una respuesta inmune, la composición inmunogénica que comprende saponina y SL-CD. En algunas realizaciones de la invención, la composición inmunogénica para provocar una respuesta inmune comprende saponina y SL-CD; y al menos un antígeno. En algunas realizaciones de la invención, la saponina in la composición inmunogénica para provocar una respuesta inmune es Quil A. En algunas realizaciones de la invención el al menos un antígeno in la composición inmunogénica para provocar una respuesta inmune se puede seleccionar entre bacterias, virus, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, in la composición inmunogénica de la invención, el al menos un antígeno es un antígeno veterinario. En algunas realizaciones, in la composición inmunogénica de la invención, el antígeno veterinario es un antígeno bovino. En algunas realizaciones, in la composición inmunogénica de la invención, el antígeno es un antígeno viral. En algunas realizaciones de la invención el antígeno viral es al menos una cepa de VFEB, VLA o RBI. En algunas realizaciones, se añade saponina o Quil A al antígeno viral antes de añadir SL-CD. En algunas realizaciones el antígeno puede ser atenuado vivo, recombinante, muerto o inactivado. En algunas realizaciones, el antígeno es atenuado vivo. En algunas realizaciones, el antígeno es muerto. En algunas realizaciones, el antígeno se puede obtener a partir de una reserva congelada, reserva seca o una reserva fresca. En algunas realizaciones, el antígeno se obtiene a partir de una reserva congelada.

Las composiciones inmunológícas de la invención se pueden preparar a partir de cultivos virales mediante procedimientos que son convencionales en la técnica. Por ejemplo, el virus se puede propagar en células de cultivo de tejido tales como células epiteliales renales de mono verde africano (células Vero), fibroblastos diploides humanos, MDBK (Riñon Bovino de Madin-Darby) u otras células de bovino. El crecimiento del virus se supervisa mediante técnicas convencionales (observación de efecto citopático, inmunofluorescencia u otros ensayos basados en anticuerpo) y se recogen cuando se ha conseguido un título viral lo suficientemente elevado (tal como 106 TCID50/ mi). Las reservas virales posteriormente se pueden concentrar o liofilizar mediante procedimientos convencionales antes de la inclusión en la formulación de vacuna. Se pueden emplear otros procedimientos para preparar reserva de virus, tales como los descritos por Thomas, y col. (1986, Agri-Practice, 7 (5): 26-30).

Las composiciones inmunológicas de la invención se pueden proporcionar solas o como un componente de una composición inmunológica polivalente, es decir, en combinación con otras composiciones inmunológicas. El virus en una formulación inmunogénica puede estar vivo o muerto; cualquier virus vivo o muerto se puede liofilizar y, opcionalmente, reconstituir como se conoce en la técnica. Las composiciones inmunogénicas se pueden proporcionar en kits, que también pueden comprender etiquetado e instrucciones apropiadas para administrar una composición inmunogénica a un sujeto animal (por ejemplo, ganado, un ungulado, un animal de compañía) o un pájaro (por ejemplo, aves de corral).

Las composiciones inmunogénicas que comprenden SL-CD y saponina o Quil A; y al menos un antígeno viral también pueden comprender vehículos farmacéuticamente y veterinarios aceptables. Los expertos en la materia conocen bien tales vehículos e incluyen macromoléculas grandes metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. En la vacuna también se pueden usar sales farmacéuticamente y veterinarias aceptables, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos o sulfatos, así como las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, proprionatos, malonatos o benzoatos. Las vacunas también pueden contener líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol, así como sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsif ¡cantes o agentes de tamponamiento del pH. También se pueden usar liposomas como vehículos para virus muerto. (Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N° 5,422,120, Publicación PCT N° WO 95/13796, Publicación PCT N° WO 91/14445 o Patente Europea N° 524,968 B1.) Las composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden administrar mediante las vías intramuscular o subcutánea o mediante las vías intranasal, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, ¡ntrabronquial u oral. Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar mediante pulverización a presión, mediante inoculación en el ojo o mediante escarificación. Otro procedimiento conveniente de administración de una composición inmunogénica de la invención a mamíferos (tales como ganado, ungulados o animales de compañía) es mediante administración oral (por ejemplo, en el alimento o el agua de bebida o en señuelo). Es particularmente conveniente aplicarlos por encima o mezclar el alimento con la composición inmunogénica. Típicamente, los animales grandes (por ejemplo, ganado/ungulados tales como vacas) se dosifican con aproximadamente 10 6 TCID50/ml tal vez 06, 5 a 107,TCID50 por dosis de la composición inmunogénica.

Para administración de dosis única, la composición inmunogénica debe contener una cantidad de VFEB correspondiente a de aproximadamente 104 a aproximadamente 107 TCID50 /mi, preferentemente 106 TCID50 /mi. Se pueden administrar aproximadamente uno a cinco mi de composición inmunogénica, preferentemente 2 mi, por animal, por vía intramuscular, por vía subcutánea o por vía intraperitoneal.

La composición inmunogénica debe contener una cantidad de RBI correspondiente a de aproximadamente 6.8 logs/ml. Se pueden administrar aproximadamente uno a cinco mi de composición inmunogénica que comprende RBI, preferentemente 2 mi, por animal, por vía intramuscular, por vía subcutánea o por vía intraperitoneal.

La composición inmunogénica debe contener una cantidad de 6.7 VLA correspondiente a de aproximadamente 10 TCID50 de VLA de serotipo 7.3 1 y/o aproximadamente 10 TCID50 de VLA de serotipo 8. Se pueden administrar aproximadamente uno a cinco mi de composición inmunogénica que comprende VLA, preferentemente 2 mi, por animal, por vía intramuscular, por vía subcutánea o por vía intraperitoneal.

La preparación de las composiciones inmunogénicas se encuentra en la bibliografía, por ejemplo en "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"", mencionado anteriormente y " Vaccines" (2008, quinta edición, Plotkin, S.A. y col., editores, Saunders Elsevier).

La presente invención proporciona composiciones inmunológicas que son particularmente útiles para la profilaxis y tratamiento de infecciones por FEB, RBI o VLA en animales. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a procedimientos para la profilaxis y tratamiento de infecciones por FEB, RBI o VLA en animales caracterizado por que una composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención se administra a un animal que necesita tal profilaxis o tratamiento. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden administrar mediante inyección intramuscular o subcutánea o a través de administración intranasal, intratraqueal, oral, cutánea, percutánea o intracutánea. Preferentemente, para vacunas de VFEB, RBI o VLA, la vacunación es subcutánea o intramuscular, siendo la más preferida la intramuscular. Las vacunas vivas para VFEB, RBI o VLA preferentemente se administran desde los seis meses de edad.

La invención también proporciona un procedimiento para la inmunización de animales, en particular vacas, frente a uno o diversos agentes infecciosos simultáneamente, que comprende la administración oral, nasal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular o en aerosol (o combinaciones de los mismos) de una vacuna que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición proporcionada por la presente invención.

Definiciones Los términos usados en el presente documento tienen los significados reconocidos y conocidos por los expertos en la materia, sin embargo, por comodidad e integridad, los términos particulares y sus significados se exponen más adelante.

Como se usan en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto lo estipule claramente de otra manera. Por tanto, por ejemplo, las referencias a "el procedimiento" incluyen uno o más procedimientos, y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que se harán evidentes para los expertos en la materia tras la lectura de la presente divulgación y demás.

El término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor. Un intervalo de este tipo puede estar dentro de n orden de magnitud, típicamente dentro del 50%, más típicamente dentro del 20%, más típicamente aun dentro del 10% e incluso más típicamente dentro del 5% de un valor o intervalo dado. La variación que se puede permitir incluida por el término "alrededor de" o "aproximadamente" depende del sistema particular que se esté estudiando y se puede apreciar fácilmente por un experto en la materia.

Una "unidad infecciosa" de VFEB se define como la cantidad de virus necesaria para infectar o matar el 50% de las células de cultivo de tejido. Esto se puede expresar como el 50% de dosis infectiva en cultivo de tejido o TCIDso- Se dice que un virus está atenuado si ha disminuido la virulencia por el huésped nativo. Un virus se considera inactivado si es incapaz de propagarse en una célula susceptible a la infección por el virus.

El término "antígeno" significa una molécula que algunas veces estimula una respuesta inmune. Un antígeno es cualquier sustancia que se puede reconocer por el sistema inmune adaptativo. Los antígenos habitualmente son proteínas o polisacáridos. Un antígeno puede ser una parte de una bacteria, un virus u otro microorganismo, tal como un revestimiento, cápsula, pared celular, flagelos, fimbrias o toxina. Un antígeno también puede ser un lípido o un ácido nucleico. El antígeno usado en la composición se puede obtener a partir de un cultivo fresco, una reserva congelada, una reserva liofilizada o cualquier otra reserva disponible comúnmente. Si el antígeno es un virus, puede ser vivo inactivado o atenuado.

"Adyuvante" significa una o más sustancias que potencian la antigenicidad de una composición, típicamente una composición de vacuna. Un adyuvante puede servir como un depósito tisular que libera lentamente el antígeno y también como un activador de sistema linfoide que potencia de forma inespecífica la respuesta inmune (Hood, y col., Immunology, Segunda Ed., Menlo Park, C A: Benjamin/Cummings, 1984. pág. 384). Con frecuencia, una vacunación primaria con un antígeno en solitario, en ausencia de un adyuvante, no provocará una respuesta inmune humoral o celular. También, dependiendo de las circunstancias, una exposición primaria con un antígeno en solitario, en ausencia de un adyuvante, puede no provocar una respuesta inmune humoral o celular. Muchas citoquinas o linfoquinas han demostrado tener actividad inmuno-moduladora y, por tanto, son útiles como adyuvantes, incluyendo, las interleuquinas 1- a, 1- ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N° 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes); los interferones- , ß y ?; factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N° 5,078,996); factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF); factor estimulante de colonias de granulocitos (G- CSF); y los factores de necrosis tumoral a y ß. Aun otros adyuvantes que son útiles con las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento incluyen quimoquinas, que incluyen sin limitación, proteína quimotáctica de monocitos 1 (MCP-1), Proteínas Inflamatorias de Macrófagos (MIP) por ejemplo, MIP-1 a y ???-1 ß, también conocidas como CCL-3 y CCL-4; y Expresado y Secretado por células T Normales Regulado por la Activación (RANTES); moléculas de adhesión, tales como una selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina y E-selectina; moléculas similares a mucina, por ejemplo, CD34 (también conocida como sialoforina, leucosialina o SPN), GlyCAM-1 y MadCAM-1 ; un miembro de la familia de integrina tal como moléculas asociadas a función de linfocitos LFA-1 , 2 y 3, VLA-1 , Mac-1 y p150.95; un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas tal molécula de adhesión de la plaqueta a la célula endotelial (PECAM), moléculas de adhesión intercelular, por ejemplo, ICAM-1 , ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4 y ICAM-5, CD2 y LFA-3; moléculas co-estimuladoras tales como CD40 y CD40L; factores del crecimiento incluyendo factor del crecimiento vascular, factor del crecimiento nervioso, factor del crecimiento de fibroblastos, factor del crecimiento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1 y factor del crecimiento endotelial vascular; moléculas receptoras incluyendo Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1 , p55, WSL-1 , DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6; y Caspasa (ICE).

Los adyuvantes adecuados usados para potenciar una respuesta inmune incluyen además, sin limitación, MPL™ (monofosforil lípido A 3-0- desacilado, Corixa, Hamilton, MT), los cuales se describen en la Patente de los Estados Unidos N° 4,912,094. También son adecuados para su uso como adyuvantes los análogos sintéticos de lípido A o compuestos de aminoalquil glucosamina fosfato (AGP) o derivados o análogos de los mismos, los cuales están disponibles en Corixa (Hamilton, MT) y que se describen en la Patente de los Estados Unidos N° 6,113,918. Un AGP de este tipo es 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Desoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido, que se conoce también como 529 (conocido anteriormente como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (FA) o como una emulsión estable (EE).

Otros adyuvantes adicionales incluyen muramil péptidos, tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuram¡l-L-alanina-2-(1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE); emulsiones de aceite-en-agua, tales como MF59 (Publicación Internacional PCT N° WO 90/14837) (que contiene Escualeno al 5%, Tween® 80 al 0.5% y Span 85 al 0.5% (opcionalmente que contiene diversas cantidades de MTP-PE) formuladas en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA)) y SAF (que contiene Escualeno al 10%, Tween 80 al 0.4%, polímero bloqueado pluriónico L121 al 5% y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a vórtex para generar una emulsión con tamaño de partícula más grande); adyuvante de Freund incompleto (IFA); sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; Amphigen; Avridina; L121 /escualeno; D-láctido-poliláctido/glicósido; polioles pluriónicos; Bordetella muerta; saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descrita en la Patente de los Estados Unidos N° 5,057,540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descrito en la Patente de los Estados Unidos N° 5,254,339 y complejos inmunoestimulantes (ISCOMS); Mycobacterium tuberculosis; lipopolisacáridos bacterianos; polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos N° 6,207,646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Austria), descrito en las Patentes Europeas N° 1 ,296,713 y 1 ,326,634; una toxina de pertussis (TP) o muíante de la misma, una toxina de cólera o muíante de la misma (por ejemplo, Publicación Iníernacional PCT N° WO00/18434, WO02/098368 y WO02/098369); o una toxina lermolábil de E. coli (LT), paríicularmeníe LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129; véase, por ejemplo, la Publicación Iníernacional PCT N° WO 93/13302 y WO 92/19265.

Los adyuvaníes que se pueden añadir a las composiciones de la invención pueden incluir SL-CD, hidróxido de aluminio, aceile de SP o carbopol o un aceiíe meíabolizable íal como uno o más hidrocarburos de ferpeno insaíurados, por ejemplo escualeno o escualano y un copolímero de bloque de polioxietileno-polipropileno íal como Pluronic®.

El íérmino "Mamíferos" incluye monoíremas (por ejemplo, plalypus), marsupiales (por ejemplo, canguro) y placeníarios, que incluyen ganado (animales domésticos criados para alimento, leche o fibras tales como cerdos, ovejas, vacas y caballos) y animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos). "Ungulados" incluye, pero sin limitación, vacas (animales bovinos), búfalo de agua, bisonte, oveja, cerdo, ciervo, elefantes y yaks. Cada uno de éstos incluye formas tanto adultas como en desarrollo (por ejemplo, terneros, lechones, corderos, etc.). La composición inmunogénica de la invención se pueden administrar bien a o mamíferos adultos o en desarrollo, preferentemente ganado.

La "cantidad inmunológicamente eficaz" es la cantidad de antígeno que provocará una respuesta inmune. Una cantidad inmunológicamente eficaz de virus de la fiebre efímera bovina (VFEB) es la cantidad de VFEB que provocará una respuesta inmune frente a un virus de la fiebre efímera bovina. Una cantidad inmunológicamente eficaz de herpes virus bovino 1 (RBI) es la cantidad de RBI que provocará una respuesta inmune frente a infección por RBI. Una cantidad inmunológicamente eficaz de virus de la lengua azul (VLA) es la cantidad de VLA que provocará una respuesta inmune frente a infección por VLA. La "cantidad inmunológicamente eficaz" dependerá de la especie, raza, edad y estado de salud del animal receptor. La "cantidad inmunológicamente eficaz" estará influida por la exposición previa del animal a una o más cepas del antígeno independientemente de si esa una o más cepas es una virulenta cepa o una cepa avirulenta de virus. Como se usa en el presente documento, una "cantidad inmunológicamente eficaz" de virus de la fiebre efímera bovina (VFEB), cuando se emplea en combinación con al menos un adyuvante adecuado, es aquella cantidad de VFEB que es suficiente para potenciar la inmunogenicidad del virus de la fiebre efímera bovina y, por tanto, proporciona inmunidad protectora frente a exposición a una cepa virulenta del virus de la fiebre efímera bovina. En una realización, una cantidad inmunológicamente eficaz de VFEB es aproximadamente 10620 TCID50 por mi de composición.

Como se usa en el presente documento, una "cantidad inmunológicamente eficaz" de herpes virus bovino 1 (RBI), cuando se emplea en combinación con al menos un adyuvante adecuado, es aquella cantidad que es suficiente para potenciar la inmunogenicidad del herpes virus bovino y, por tanto, proporciona inmunidad protectora frente a exposición a una cepa virulenta de herpes virus bovino. En una realización, una cantidad inmunológicamente eficaz de RBI es aproximadamente 6.8 logs por mi de composición.

Como se usa en el presente documento, una "cantidad inmunológicamente eficaz" de virus de la lengua azul (VLA), cuando se emplea en combinación con al menos un adyuvante adecuado, es aquella cantidad que es suficiente para potenciar la inmunogenicidad del virus de la lengua azul y, por tanto, proporciona inmunidad protectora frente a exposición a una cepa virulenta del virus de la lengua azul. En una realización, una cantidad inmunológicamente eficaz de VLA es aproximadamente 1?6·7 TCID50 de VLA de serotipo 1 y/o aproximadamente 10?-3 TCID50 de VLA de serotipo 8 por mi de composición.

En algunas realizaciones de la invención, el antígeno viral puede ser al menos una cepa de herpes virus bovino infeccioso 1 (denominado también virus de rinotraqueitis bovina o RBI), virus de parainfluenza, virus sincitial respiratorio bovino, virus de la diarrea viral bovina, virus de la enfermedad de pie y boca, virus de la lengua azul, virus de la fiebre efímera bovina, parvovirus canino, virus de distemper canino, adenovirus canino, virus de parainfluenza canino, coronavirus canino, virus de la rabia, virus de panleucopenia felina, calicivirus felino, virus de rinotraqueitis viral felina, virus de peritonitis infecciosa felina, virus de leucemia felina, virus de inmunodeficiencia felina, virus del Nilo Occidental, virus de encefalomielitis equina, virus de influenza equina, virus del herpes equino (rinoneumonitis), virus de arteritis equina, parvovirus porcino, cirocovirus porcino, virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino, rotavirus porcino, virus de influenza de cerdo, virus de pseudorrabia, virus de la enfermedad infecciosa de la bursa, virus de la enfermedad de Marek, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de bronquitis infecciosa, virus de laringotraqueitis infecciosa, virus de encefalomielitis aviar, reovirus aviar, virus de influenza aviar.

Como se usa en el presente documento, la expresión "subunidad viral" significa una parte de un virión. Por ejemplo, una subunidad del virus de la fiebre efímera bovina (VFEB) puede ser al menos una parte de un virión de VFEB, al menos una parte del genoma de VFEB, al menos una parte de una proteína codificada por VFEB, tal como la nucleoproteína de VFEB, la proteína asociada a polimerasa de VFEB, la proteína de matriz de VFEB, la ARN polimerasa dependiente de ARN de VFEB o una glicoproteína de VFEB.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunogénica" significa que la composición es capaz de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular. Una cepa inmunogénica también es antigénica. Una composición inmunogénica es una composición que provoca una respuesta inmune humoral y/o celular cuando se administra a un animal.

La expresión "composición inmunogénica" se refiere a cualquier composición farmacéutica que contiene un antígeno, por ejemplo un microorganismo, composición que se puede usar para provocar una respuesta inmune en un animal. La respuesta inmune puede incluir una respuesta de células T, una respuesta de células B o una respuesta tanto de células T como de células B. La composición puede servir para sensibilizar al mamífero mediante la presentación de antígeno en asociación con moléculas de MHC en la superficie celular. Adicionalmente, se pueden generar linfocitos T específicos de antígeno o anticuerpos para permitir la protección futura de un huésped inmunizado. Una "composición inmunogénica" puede comprender un antígeno vivo, atenuado o muerto/inactivado. El antígeno puede ser un microorganismo entero o una parte inmunogénica obtenida a partir del mismo que induce una respuesta inmune. La composición inmunogénica puede proteger al animal de uno o más síntomas asociados con la infección por el microorganismo o puede proteger al animal de la muerte debido a la infección con el microorganismo.

La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa administración mediante medios diferentes de a través del tracto gastrointestinal, particularmente a la introducción de sustancias en un organismo mediante inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular o intramedular, pero también a otras vías de administración no orales y no nasales tales como inyección intraperitoneal o aplicación tópica.

Las expresiones "vacuna" o "composición de vacuna", se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una composición inmunogénica que induce una respuesta inmune en un animal. Una vacuna o composición de vacuna puede proteger al animal de enfermedad o muerte posible debido a una infección y puede o no incluir uno o más componentes adicionales que potencien la actividad inmunológica del componente activo. Una vacuna o composición de vacuna puede comprender adicionalmente componentes adicionales típicos en las composiciones farmacéuticas. Los componentes adicionales pueden incluir, por ejemplo, uno o más adyuvantes o inmunomoduladores. El componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender organismos vivos completos en su forma original o como organismos atenuados en una vacuna viva modificada u organismos inactivados mediante procedimientos apropiados en una vacuna muerta o inactivada o vacunas de subunidad que comprenden uno o más componentes inmunogénicos del virus o vacunas modificadas por ingeniería genética, mutadas o clonadas preparadas mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Una vacuna o composición de vacuna puede comprender uno o, de forma simultánea, más de uno de los elementos descritos anteriormente.

Por consiguiente, en la presente solicitud, se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología e inmunología dentro de la especialidad de la técnica. Tales técnicas se explican en su totalidad en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de mezcla de virus de la fiebre efímera Bovína/Quil A Se obtuvo antígeno viral vivo de fiebre efímera bovina (FEB) en reserva congelada. Después de descongelar a temperatura ambiente, el virus se combinó con Quil A antes de añadir los ingredientes restantes para una vacuna.

Se obtuvo polvo de Quil A, producido por Brenntag, de APS (una división de Nuplex Industries, Australia) como el código de producto N° 04307503.

Se produjo solución madre de Quil A mediante dilución en agua hasta 10 mg/ml.

En resumen, 149.96 mi de reserva de antígeno vivo de FEB (1.38 x107TCID5o/ml) se diluyeron con 36.34 mi de 9.643 g/ml de NaCI y 20.70 mi de 10 mg/ml de Quil A se añadieron a 1 mg/ml. La mezcla se agitó durante 2.5 horas a temperatura ambiente.

EJEMPLO 2 Preparación de vacuna de VFEB Para preparar una vacuna de VFEB, se añadieron los siguientes ingredientes, en orden, mientras se agitaba la mezcla durante 5 minutos entre adiciones. 384.3 mi de 8.5 g/ml de NaCI 94.87 g de mezcla VFEB/QUIL A preparada como en el Ejemplo 1 120.00 mi de 10 mg/ml reserva de SL-CD* para obtener el 20% (v/v) 1.36 g de Tiomersal al 9.9 % (w/v) *SL-CD se preparó como se ha descrito por Hilgers y col. (Sulpholipo-cyclodextrin in squalene-in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. Vaccine 17 (1999). págs. 219-228) Después de haber añadido todos los ingredientes, la vacuna se agitó durante 30 minutos y el pH se ajusto hasta 7.18.

La vacuna se agitó durante 30 minutos adicionales y se usó para llenar envases de almohadilla etiquetados.

EJEMPLO 3 Ensayo animal de la vacuna de VFEB Los ensayos de seguridad de la vacuna se realizaron en el Fort Dodge Australia, en Penrith. La seguridad de la vacuna safety se ensayó en vacas de conformidad con las directrices de EP2002:0062.

Diez cobayas y dos vacas se inocularon con la vacuna preparada anteriormente para determinar la respuesta serológica a la fracción de antígeno de FEB. Cada una de las diez cobayas que pesaban entre 250 g y 400 g se inoculó por vía subcutánea con 2.0 mi de vacuna. Se tomaron muestras de sangre de las cobayas seis semanas después de la inoculación. Dos vacas menores de 1 año se inocularon por vía subcutánea con 4 mi de vacuna. Se tomaron muestras de sangre de las vacas a los 14 días después de la inoculación. Los sueros obtenidos de estos animales se ensayaron mediante neutralización de virus (NV) siguiendo el protocolo del Biosecurity Sciences Laboratory, Department of Primary Industries y Fisheries Animal Research Institute, Queensland (Australia). El procedimiento de ensayo de neutralización de virus usado de conformidad con "Australia standard diagnostic procedures." Los resultados de los ensayos para los dos lotes de vacuna se muestran en la Tabla 1 , más adelante: TABLA 1 Resultados de seguridad usando dosis única de vacuna de FEB base a experimentos usando una vacuna de FEB inactivada en ensayos de vacas y conejos, existe evidencia de una correlación entre la serología animal de laboratorio y la protección en vacas del VFEB. Por tanto, los resultados de cobayas mostrados en la Tabla 1 confirman que la composición inmunogénica de la invención proporcionará a las vacas protección del VFEB.

Una formulación de vacuna de dosis única de FEB preparada como anteriormente produjo una emulsión estable. Esta vacuna se ensayó para determinar la seguridad e inicialmente no produjo reacciones en sitio en el ensayo de seguridad en vacas. Aunque no se observaron reacciones sistémicas ni del comportamiento, la vacuna produjo algunas reacciones locales en el sitio de inyección hacia el final del periodo de observación.

La Tabla 2, más adelante, representa los síntomas que aparecen en vacas después de una vacunación de dosis única con 4 mi de la formulación de vacuna presentada anteriormente.

TABLA 2 Reacción local sistémica En resumen, el uso de una composición inmunogénica que comprende saponina (Quil A) y SL-CD como adyuvantes en una formulación que comprende VFEB produce una vacuna de VFEB eficaz que es útil como una vacuna de dosis única.

EJEMPLO 4 Preparación de combinaciones de vacuna de RBI Para seleccionar un adyuvante apropiado para vacunas futuras, se preparó una vacuna de herpes virus bovino 1 recombinante muerto, también conocido como virus de rinotraqueitis bovina infecciosa (RBI) combinada con diferentes adyuvantes y se evaluó. Se prepararon vacunas con tres combinaciones de adyuvante diferentes con un título 1X de 6.04 logs/ml de RBI (EU). La vacuna A contenía AIOH (15%) & saponina; la vacuna B contenía 5% aceite de SP; y la vacuna C contenía SL-CD al 20% & saponina. La saponina se obtuvo en Berghausen N° de Cat. 603013.

TABLA 3 Vacuna a de rbir monovalente (EU) con aloh (15%) & saponina como adyuvantes Factor de conc Volumen total por Componente Cantidad/Dosis Conc/Dosis de reserva 200 mi RBIr N° de Lote 9.8X = 7.03 rlBREU-02 log10 ml 6.8 log 0s 30.00% 60.000 mi Gel estéril 2%; con timerosal 15.00% 30.000 mi (cont)Solución de saponina (100 mg/ml) 100 mg/ml 1 mg 0.50% 1.000 mi NZ Amina AS al 20% 20% NA 5.00% 10.000 mi Timerosal al 5% 5% NA 0.19% 0.370 mi Combinando diluyente con Hepes sin rojo fenol 49.32% 98.630 mi HCI al 20% mi TABLA 4 Vacuna b rbir monovalente (EU) con aceite sp al 5% como adyuvante TABLA 5 Vacuna c de rbir monovalente (EU): con sl-cd al 20% & saponina como adyuvantes *SL-CD/escualano preparado como se ha descrito por Hilgers y col. (Sulpholipo-cyclodextrin in squalene-in-water as a novel and safe vaccine adjuvant. Vaccine 17 (1999), págs. 219-228.) EJEMPLO 5 Ensayo animal de vacunas de RBI Los ensayos de vacuna se realizaron en lowa. Un total de 27terneros, de 5-6 meses de edad, se aleatorizaron en grupos como se muestra en la Tabla 6, más adelante: TABLA 6 Animales ensayados con vacunas de RBI A excepción de los terneros de los Grupos 4-6, los terneros se vacunaron dos veces por vía subcutánea, con 3 semanas de diferencia. Dos semanas después de la segunda vacunación (o tres semanas después de la vacunación para el Grupo 4), todos los terneros (excepto dos terneros del Grupo 6) se expusieron a virus RBI virulento por vía intranasal. Todos los terneros se supervisaron diariamente durante 14 días después de la exposición para determinar los signos clínicos de la enfermedad. Los signos clínicos incluyeron, pero sin limitación, descarga nasal mucopurulenta, descarga ocular, disnea, poco apetito (rechazo del alimento) y depresión.

También se tomaron las temperaturas rectales diariamente durante 14 días después de la exposición. Se tomaron muestras de sangre para suero de los animales periódicamente a lo largo de todo el estudio y se determinaron los anticuerpos frente a RBI usando ensayo de neutralización de suero. Se recogieron frotis nasales diariamente durante el aislamiento del virus desde dos días antes de la exposición hasta 14 días después de la exposición. Se determinó el título de virus aislado de cada ternero para cada día. Se retiró un animal del Grupo 2 del estudio antes de la exposición debido a mala salud.

Los signos clínicos observados que se asociaron exposición a RBI se resumen en la Tabla 7, más adelante y los resultados de presencia viral se representan en la Tabla 8. Los títulos de anticuerpos de neutralización Anti-RBI en suero se enumeran en la Tabla 9.

TABLA 7 Incidencias medias3 de signos clínicos observados en animales expuestos a RBI virulento El valor se expresa como la media + desviación típica.

"Temperatura rectal >39.7°C y -17.2°C por encima de la línea basal.

Debido al tamaño de grupo pequeño, las diferencias observadas entre los animales vacunados y los controles no fueron diferentes estadísticamente. Sin embargo, las diferencias numéricas sí indican un efecto de vacunación, especialmente para los primeros tres grupos.

La incidencia y el título de presencia viral se representan en la Tabla 8, más adelante: TABLA 8 Títulos3 e incidencias11 de presencia viral medios en animales expuestos a RBI virulento El valor se expresa como título de logio TCID5o medio + desviación típica. b El valor se expresa como media + desviación típica.

* El valor indicado es significativamente diferente del del grupo vacunado dosis de RBIr con adyuvante de SL-CD/Saponina, p<0.05.

Los resultados de la presencia viral indican que SL-CD + Saponina aportaron la mejor protección reduciendo el número (al menos 100 veces) e incidencias de presencia del virus. Esta protección demostrada probablemente se debe a un título de anticuerpos significativamente más elevado en el momento de la exposición experimental como se muestra en la Tabla 9, más adelante: TABLA 9 Títulos8 de anticuerpos de neutralización ANTI-RBI en suero en animales vacunados con una vacuna de muerto RBIR en diferentes adyuvantes a Los valores se expresan como título medio geométrico + desviación típica. Las muestras de suero se recogieron el día de la exposición. * El valor indicado es significativamente diferente del grupo vacunado con dos dosis de RBIr con adyuvante de SL-CD/Saponina, p<0.05.

Resultados de este estudio indican que, entre los tres adyuvantes evaluados, la combinación de SL-CD/Saponina proporciona el mejor rendimiento.

EJEMPLO 6 Preparación de vacunas del virus de la lengua azul Se formularon cinco vacunas inactivadas diferentes frente a virus de la lengua azul de serotipo 1 y 8 con diferente concentración de antígeno BTV8 y con diferente composición de adyuvante. El título de VLA de serotipo 1 (1fj6-7 TCID50) permaneció constante en todas las vacunas ensayadas. Los terneros recibieron dos inoculaciones con dos semanas de diferencia. La composición de las vacunas E-43, E-44, E-45, E-47 y E-48 se representan en las Tablas 10 a 14, más adelante: TABLA 10 * El lote E-43 de la vacuna Zulvac® 1 +8 Bovis es el que está registrado en España (Licencia de Emergencia).

TABLA 11 Composición de vacuna de VLA E-44 COMPONENTE CANTIDAD VLA inactivado de serotipo 1 , cepa ALG2006/01 E1 106 7 TCID50 VLA inactivado de serotipo 8, Cepa BEL2006/02 10 S TCIDso Gel de Hidróxido de aluminio al 3% 4 mg Al3+ Saponina 0.4 mg Solución salina c.s.,2.0 mi Tiomersal 0.2 mg TABLA 12 Composición de vacuna de VLA E-45 TABLA 13 Composición de vacuna de VLA E-47 *SL-CD/escualano preparado como se ha descrito por Hilgers (Mencionado anteriormente).

**Brenntag N° de Catálogo 27031012600 TABLA 14 Composición de vacuna de VLA E-48 EJEMPLO 7 Resultados de seroneutralización Los títulos de anticuerpo neutralizante se midieron en todos los terneros una semana (+28) y dos semanas (+35) después de la vacunación. Los resultados de seroneutralización se muestran en las tablas 15 a 20, más adelante. La presencia de anticuerpos neutralizantes es indicativa de protección pero los animales sin anticuerpos neutralizantes también pueden estar protegidos debido a la respuesta mediada por células.

TABLA 15 Resultados obtenidos con la vacuna E-43 VLA-1 = 10 exp 6 7 VLA-8 = 10 +28 +35 Ternero VLA 1 VLA 8 VLA 1 VLA 8 79 1.4 1.4 4 4 243 1 2 16 5.7 349 4 2.8 32 1 1.3 365 2 1 16 2.8 524 1.4 5.7 22.6 4 638 1.4 2.8 22.6 22.6 660 1 1.3 1 22.6 5.7 695 8 2.8 22.6 8 720 4 1.4 16 4 841 8 1.4 32 5.7 893 16 11.3 22.6 16 922 32 4 64 32 1027 1 1.3 4 45.3 1 1.3 1324 8 8 45.3 1 1.3 1327 8 4 64 22.6 1608 45.3 11.3 45.3 8 2039 11.3 16 128 16 2996 2 5.7 4 5.7 5371 5.7 8 8 8 6352 2.8 1.4 16 16 GM 5.4 3.4 23.4 8.9 TABLA 16 Resultados obtenidos con la vacuna E-44 +28 +2 (5 Ternero VLA 1 VLA 8 VLA 1 VLA 8 287 2 1.4 4 2 332 22.6 8 128 1 1.3 346 45.3 32 32 16 502 8 2.8 16 16 539 11.3 4 90.5 8 608 4 1.4 16 1 628 16 2 32 16 630 2.8 1.4 22.6 1.4 647 45.3 16 128 32 887 22.6 2.8 128 5.7 1046 1 1.3 2 45.3 1.4 2881 45.3 4 16 32 3035 16 8 22.6 1 1.3 3046 16 5.7 16 8 3824 2.8 2 1 1.3 1 4341 22.6 4 11.3 4 4656 22.6 5.7 22.6 8 6927 8 1 8 4 6997 5.7 8 22.6 2 8097 1 5.7 2.8 5.7 GM 10.5 3.9 23.0 5.7 TABLA 17 Resultados obtenidos con la vacuna E-45 +28 +35 Ternero VLA 1 VLA 8 VLA 1 VLA 8 87 8 2 16 8 296 4 4 11.3 5.7 520 11.3 11.3 64 11.3 607 8 8 90.5 11.3 612 11.3 16 64 16 623 11.3 8 8 11.3 717 16 4 45.3 4 731 16 16 128 16 789 8 11.3 16 8 871 64 8 90.5 16 886 11.3 2.8 128 5.7 914 4 1 64 2 977 11.3 8 45.3 32 1024 32 8 90.5 32 1542 4 1.4 22.6 5.7 2654 4 2 16 5.7 2843 16 5.7 45.3 16 6772 11.3 5.7 45.3 4 8004 5.7 4 8 8 8327 4 4 22.6 32 GM 9.7 5.1 36.8 9.7 TABLA 18 Resultados obtenidos con la vacuna E-47 +28 +35 Ternero VLA 1 VLA 8 VLA 1 VLA 8 22 2 1.4 4 16 345 32 8 181 22.6 422 2.8 5.7 4 8 501 8 4 32 8 535 8 16 22.6 8 536 4 1 5.7 1.4 551 1 2 1 1.3 8 617 8 8 32 16 735 1 1 16 2 748 16 4 64 16 817 4 2.8 1 1.3 16 894 4 4 16 4 982 5.7 2 16 16 1009 1 4 1 1.3 1 1.3 1157 16 8 128 22.6 1187 5.7 8 45.3 1 1.3 5515 8 2.8 64 4 5982 5.7 2.8 1 1.3 2 6776 16 8 22.6 1 1.3 7797 4 1 32 8 GM 5.1 3.5 21.5 8.3 TABLA 19 Resultados obtenidos con la vacuna E-48 +28 +35 Ternero VLA 1 VLA 8 VLA 1 VLA 8 130 4.0 2 45.3 2 316 5.7 2 1 4 344 2.8 1 16 2.8 428 5.7 2.8 8 2.8 442 1.4 2.8 16 1 514 22.6 2.8 64 8 645 64.0 5.7 128 4 740 32.0 5.7 181 5.7 787 1.0 2.8 45.3 8 790 5.7 2 32 1 836 2.8 1 890 8.0 2.8 32 5.7 1278 16.0 4 32 8 1789 11.3 4 90.5 16 3654 1.4 1.4 1.4 4 6783 4.0 1 16 1.4 7085 32.0 4 22.6 4 9872 16.0 1.4 32 4 40552 5.7 2.8 8 1 80552 8 1.4 5.7 2 GM 7.0 2.3 24.3 3.4 TABLA 20 Controles La presencia de viremia para BTV1 y BTV8 se determinó 4, 5 y 8 días después de la exposición en animales vacunados con Vacunas E-43: ZULVAC 1+8 (BTV1 : 106.7 + BTV8: 107.3) (AI3+ + Saponina : formulación real) y E-47: ZULVAC 1 +8 (BTV1 106.7 + BTV8: 107.3) (SLCD + 2.5xSaponina : adyuvante nuevo).

Vacuna E-43: ZULVAC 1+8 (BTV1 : 106 7 + BTV8: 107 3) (Al3+ + Saponina: formulación real) Prevención de viremia del 100% para BTV1 (0/8) Prevención de viremia del 87.5% para BTV8 (1/8) Vacuna E-44: ZULVAC 1+8 (BTV1 106 7 + BTV8: 107 5) (Al3+ + Saponina : 1.58 más antígeno de BTV8 que la formulación real) Prevención de viremia del 100% para BTV1 (0/8) Prevención de viremia del 87.5% para BTV8 (1/8) Los resultados inmediatamente anteriores indican que un aumento de VLA de serotipo 8 en una vacuna en 1.58 X no induce una protección mejor.

Vacuna E-47: ZULVAC 1 +8 (BTV1 106 7 + BTV8: 107 3) (SLCD + 2.5 X Saponina : adyuvante nuevo) Prevención de viremia del 100% para BTV1 (0/8) Prevención de viremia del 100% para BTV8 (0/8) Vacuna E-45: ZULVAC 1 +8 (BTV1 106.7 + BTV8: 107.3) (AI3+ + 2 X Saponina: 2x más Saponina que la formulación real) Prevención de viremia del 100% para BTV1 (0/8) Prevención de viremia del 100% para BTV8 (0/8) EJEMPLO 8 Producción de interferón gamma Se usó el ensayo Bovigam TB (Prionics) para la detección de interferón gamma en muestras de sangre. En resumen, se prepararon y estimularon células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en parte con VP7 y en parte con VP2. La producción de interferón gamma se detectó únicamente después de la estimulación de las células sanguíneas con VP7.

Los resultados de evaluación de la producción específica de ?-IFN en animales vacunados con las vacunas E-43 y E-47 se presentan a continuación. 1a Vacunación (D+0); 2a Vacunación (D+21); Exposición (D+45) Un total de 30 terneros Frisean, de 3 meses de edad sin anticuerpos frente a VLA se incluyeron en el estudio. No se tomó en cuenta el sexo de los terneros. En el estudio se incluyeron únicamente animales normales y sanos. Su estado de salud se verificó tras su llegada. Los animales se identificaron individualmente con crotales. Los 30 terneros Frisean seronegativos se asignaron aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento (usando el programa Microsoft Excel), de la manera siguiente: Grupo 1 : 10 terneros, vacunados y revacunados con vacuna E-43 Grupo 2: 10 terneros, vacunados y revacunados con vacuna E- 47 Grupo 3: 10 terneros de control, no vacunados Las vacunaciones se realizaron por la vía intramuscular (i.m.), la vía más común para administración de vacunas en vacas, usando 2 mi de vacuna.

Los terneros de los grupos 1 y 2 se vacunaron el día 0 (D+0) y revacunaron 3 semanas más tarde (D+21 ).

Los terneros del grupo 3 se dejaron como controles no vacunados.

Se tomaron muestras de sangre de los terneros el día 0 (D+0), antes de la primera vacunación; antes de la revacunación (o 2a vacunación) tres semanas más tarde (D+21 ); y el día 42, antes de la exposición (D+42). Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon a partir de las muestras individuales.

Veinticuatro días después de la 2a vacunación, los temeros se trasladaron a Fort Dodge Veterinaria's Challenge Facilities N° 3. donde 24 días después de la revacunación (D+45), 8 animales de cada grupo se expusieron a VLA-1 o VLA- 8. Se tomaron muestras de sangre de los animales 5 días después de la exposición, para la evaluación de producción específica de ?-IFN frente a VP7 y VP2.

Detección de ?-IFN Se tomaron muestras de sangre recogida en presencia de heparina de todos los animales en el experimento el día de cada vacunación, el día antes de la exposición y 5 días después de la infección. Se extrajeron PBMC en un gradiente de densidad (Histopaque 1077), se lavaron y resuspendieron hasta una concentración final de 5 x 106 células/ml in medio RPMI 1640 complementado con suero fetal de ternero. Las células se sembraron en placas en placas de 96 pocilios con proteínas recombinantes VP2 y VP7 {^ µg/p^\). Se usó Concavalina A ^g/ml) como un control positivo.

Las placas se incubaron a 37°C durante 16-durante una noche. Se realizaron ensayos de ?-IFN en los sobrenadantes usando el ensayo de interferón bovino (Bovigam TB, Prionics). Los resultados se expresaron en unidades A450 después de restar los valores no estimulados de cada animal. Únicamente la proteína recombinante VP7 fue capaz de inducir la producción específica de ?-IFN in vacunado animales después de una segunda vacunación.

El día de exposición, 3 de 10 (30%) terneros vacunados con vacuna E-47 mostraron producción de ?-IFN frente a VP7. Cinco días después de la exposición, la proporción de animales positivos aumentó hasta el 63%. Los animales vacunados con vacuna E-43 mostraron producción positiva de ?-IFN frente a VP7 cinco días después de la exposición (2 de 8, 25%) pero no el día de exposición.

Los resultados se muestran en la Tabla 21 expresados como unidades A450 y como proporciones de producción positiva de ?-IFN (>0.065).

TABLA 21 Estadística de cada grupo de tratamiento el día de cada vacunación, el día de exposición y 5 días después de la exposición El día de exposición, cuando se usó el ensayo de Mann-Whitney, se encontraron diferencias significativas entre los grupos vacunados con E-43 y E-47 y el grupo de control: E-43 frente a los controles: p=0.035; E-47 frente a los controles: P=0.003 Cinco días después de la exposición, cuando se usó el ensayo de Mann-Whitney, se encontraron diferencias significativas entre los grupos vacunados con E-43 y E-47 y el grupo de control: E-43 frente a E-47: p=0.021 ; E-47 frente a los controles: p=0.006 TABLA 22 Referencias cruzadas entre las dos vacunas el día de exposición Sin diferencias significativas: p= 0.105 TABLA 23 Referencias cruzadas entre las dos vacunas 5 días después de la exposición Tratamiento E-43 E-47 Total VP7D+5Ch Negativo Recuento 6 3 9 % dentro de 75.0% 37.5% 56.3% Tratamiento Recuento 2 5 7 % dentro de Positivo 25.0% 62.5% 43.8% Tratamiento Total Recuento 8 8 16 % dentro de 100.0% 100.0% 100.0% Tratamiento Sin diferencias significa! ivas: p= 0.157 TABLA 24 Referencias cruzadas entre vacuna E-47 y controles el día de exposición Sin diferencias signi ¡cativas: p= 0.105 TABLA 25 Referencias cruzadas entre vacuna E-47 v controles 5 días después de la exposición Diferencias significativas: p= 0.009 TABLA 26 Referencias cruzadas entre vacuna E-43 y controles 5 días después de la exposición Conclusión > Los terneros vacunados con ZULVAC 1 +8, lote E-47 (BTV1 : 106 7 + BTV8: 107 3) (SLCD + 2.5x Saponina: adyuvante nuevo) mostraron cantidad más alta de ?-IFN el día de exposición (3 semanas después de la 2a vacunación) y 5 días después de la exposición que los controles y que los terneros vacunados con ZULVAC 1+8 (BTV1 : 106 7 + BTV8: 107 3) (Al3+ + Saponina: formulación en curso). > Los terneros vacunados con vacuna E-43 (formulación en curso) no mostraron producción de ?-IFN frente a VP7 hasta 5 días después de la exposición. Sus valores fueron significativamente más bajos (p=0.021) que los inducidos por la vacuna E-47 (adyuvante nuevo). > Únicamente la proteína recombinante VP7 ha sido capaz de inducir cantidades detectables de ?-IFN, por ló tanto VP7 podría potenciador de inmunidad celular.

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. - Una composición inmunológica que comprende sulfolipo-ciclodextrina (SL-CD) y saponina.

2. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos un antígeno.

3. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el al menos un antígeno se selecciona entre bacterias, virus, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos o una combinación de los mismos.

4. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el al menos un antígeno es un antígeno veterinario.

5. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el al menos un antígeno es un antígeno bovino.

6. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el al menos un antígeno es un antígeno viral.

7. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el antígeno viral es virus de la fiebre efímera bovina (VFEB); herpes virus bovino 1 (RBI) o virus de la lengua azul (VLA).

8. - La composición inmunológica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además porque el SL-CD está presente en una concentración final de aproximadamente 0.2 ml/ml.

9. - La composición inmunológica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque la saponina está presente en una concentración final de aproximadamente 0.5 mg/ml.

10.- La composición inmunológica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque la saponina es Quil A.

1 1. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la Quil A está presente en una concentración final de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 0.2 mg/ml.

12. - La composición inmunológica de conformidad con la reivindicación 10 u 11 , caracterizada además porque la Quil A está presente en una concentración final de aproximadamente 0.158 mg/ml.

13.- El uso de la composición inmunológica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la elaboración de un medicamento para provocar una respuesta inmune en un animal.

14.- Una composición inmunológica preparada mediante la combinación de Quil A y al menos un antígeno viral antes de añadir al menos un adyuvante adicional.

15. - La composición inmunológica preparada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos un adyuvante adicional.

16. - La composición inmunológica preparada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el al menos un adyuvante adicional se selecciona entre SL-CD, hidróxido de aluminio, aceite SP o carbopol.

17. - La composición inmunológica preparada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el al menos un adyuvante adicional es SL-CD.

18. - La composición inmunológica preparada de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el SL-CD está presente en una concentración final de aproximadamente 0.2 ml/ml.

19. - La composición inmunológica preparada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizada además porque la Quil A está presente en una concentración final de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 0.2 mg/ml.

20. - La composición inmunológica preparada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizada además porque la Quil A está presente en una concentración final de aproximadamente 0.158 mg/ml.

21. - La composición inmunológica preparada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, caracterizada además porque el antígeno viral es un antigeno bovino.

22. - La composición inmunológica preparada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 , caracterizada además porque el antígeno viral se selecciona entre VFEB, RBI y VLA.

23. - El uso de la composición de la reivindicación 22, para la elaboración de un medicamento para provocar una respuesta inmune frente a VFEB en un animal.

24. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde la respuesta inmune se provoca después de la administración de una dosis única de la composición.

25. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 23 ó 24, en donde la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora.

26. - Un kit para provocar una respuesta inmune en un animal, que comprende SL-CD y saponina.

27. - El kit de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la saponina es Quil A.

28. - El kit de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, caracterizado además porque comprende adicionalmente al menos un antígeno.

29. - El kit de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el al menos un antígeno se selecciona entre bacterias, virus, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos o combinaciones de los mismos.

30. - El kit de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el al menos un antígeno es un antígeno viral.

31. - El kit de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque el antígeno viral se selecciona entre VFEB, RBI y VLA.