MXPA96005503A - Vacuna mejorada de virus sincitial respiratorio debovino (brsv) vivo, modificado - Google Patents
Vacuna mejorada de virus sincitial respiratorio debovino (brsv) vivo, modificadoInfo
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Abstract
La presente invención proporciona una composición de vacuna de BRSV mejorada, la cual proporciona ventajosamente una inmunidad contra la infección después de una sola administración. La composición comprende un virus de BRS vivo, modificado, y un adyuvante, los cuales en combinación proporcionan inmunidad contra la infección del BRSV después de una sola administración, y produce una respuesta inmune específica para el BRSV y que incluye una inmunidad medida por la célula y una inmunidad local (IgA secretoria). En una modalidad preferida, el virus de BRS es la cepa 375, y el adyuvante comprende un hidrocarburo de turpina insaturada, preferiblemente el escualeno o el escualano, y un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, más preferiblemente uno en donde el copolímero tenga un componente de polioxipropileno (POP) con un peso molecular promedio de aproximadamente 3250 a 4000 y el componente de polioxietileno (POE) comprende aproximadamente 10-20%de la molécula total. El adyuvante puede incluir opcionalmente un agente tensioactivo, preferiblemente un polioxietileno monooleato de sorbitan.
Description
VACUNA MEJORADA DE VIRUS SIMCITIAL RESPIRATORIO DE BOVINO (BRSV) VIVO, MODIFICADO
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a métodos mejorados para inducir una inmunidad protectora contra el Virus Sin- citial Respiratorio de Bovino (BRSV), empleando específicamente una vacuna viva, modificada, adecuada para la adminis-Q tración a animales receptores o que son pacientes, en una sola dosis .
Antecedentes de la Invención
El Virus Sincitial Respiratorio del Bovino (BRSV) es reconocido ahora como un agente etiológico importante
,' en el Complejo de la Enfermedad Respiratoria del Bovino (BRDC). La enfermedad está caracterizada por una respiración rápida, tos, pérdida de apetito, descarga ocular y nasal, 0 Y temperaturas elevadas. En un brote agudo de la enfermedad, puede ocurrir la muerte a las 48 horas del inicio de los síntomas . El BRSV infecta el ganado de todas las edades, incluyendo terneros lactantes. El BRSV es considerado el 5 patógeno viral más común en la neumonía enzoótica en terne-
REF: 23559 , «. ros, y también ha sido asociado con el enfisema pulmonar entre los terneros recién destetados. Por consiguiente, existe una necesidad de una profilaxis efectiva contra este virus en el ganado y sus ganados o rebaños periódicos.
El establecimiento de una inmunidad protectora contra el BRSV es problemático. Como en algunas otras enfermedades mediadas viralmente, los niveles de anticuerpos del suero contra el BRSV no necesariamente se correlacionan con la protección contra la enfermedad. Este fenómeno 0 puede reflejar un papel para el IgA producido localmente, dirigido contra el BRSV (Kimman et al., J. Clin. Microbiol. 25: 1097-1106, 1987), y/o un requerimiento de una inmunidad mediada por la célula para montar una defensa efectiva contra este virus. El establecimiento de una imunidad protec- 5 tora en terneros lactantes presenta obstáculos adicionales, puesto que los anticuerpos maternales para el BRSV pueden agotar el inmunógeno inyectado y neutralizar efectivamente la vacuna. Finalmente, la inconveniencia y el costo de vacunaciones múltiples hace deseable una vacuna de una 0 sola dosis. Por consiguiente existe una necesidad en la técnica de las formulaciones de vacuna contra el BRSV de una sola dosis que produzcan una respuesta inmune vigorosa y de facetas múltiples. El régimen de administración estándar para las 5 vacunas contra el BRSV de la técnica previa, es de dos dosis (Stott et al., J. Hyg. Camb . 93: 251-261, 1984; Thomas et al., Agri-Practice 5: 1986; y Syvrud et al., Vet.Med. 83: 429-430, 1988; Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, Edition 8 1993/94, pp. 484, 740-741, 956-960, 982-983). Como se muestra en Kucera et al., (Agri-Practice, Vet.Med., Vol. 78, Octubre 1983, pp. 1599-1604, 1983), una vacunación contra BRSV experimental, única, indujo niveles relativamente bajos de concentración de anticuerpos de la neutralización del suero (SN) con respecto al BRSV, mientras que dos dosis de la vacuna produjeron concentraciones de anticuerpos de SN de 1:10 a 1:320. Además, las animales del ganado aparentemente expuestos al BRSV durante los ensayos de campo, aproximadamente 48% de animales no vacunados requirieron el tratamiento para la enfermedad respiratoria, compara-do con el 27% y 21% entre los vacunados de una sola dosis y de dosis dobles, respectivamente. Sin embargo, el agente causante de la enfermedad respiratoria en los ensayos de campo no demostró en forma concluyente que va a ser el BRSV. También, se señaló que una vacuna de una sola dosis no parece que va a ser muy inmunogénica . Las últimas evaluaciones concluyeron que dos dosis de esta vacuna podrían ser esenciales para obtener una buena protección (Bovine Vet.Forum 1: No. 2 pp. 2-16, 1986; Syvrud, et al., Vet.Med. 429-430, 1988). La Solicitud de Patente Europea No. 129,923 (publicada el l/o. de Febrero de 1985 y expedida como una patente el 9 de Julio de 1988) describe un método para preparar una vacuna contra BRSV, viva, que involucra disolver la vacuna viva en una vacuna inactivada que contiene uno o más antíge-nos (particularmente el virus de influenza inactivado) formulada como una emulsión de aceite en agua. Una respuesta serológica se obtuvo en animales jóvenes que todavía tienen una inmunidad maternal. La aplicación también describe una preparación viva, modificada, que incluye BRSV y adyu-vante. Sin embargo, no se presentó ningún dato sobre la eficacia protectora de alguna vacuna contra el reto o desafío presentado por el BRSV. Un objeto de la invención es proporcionar una vacuna efectiva contra el BRSV que produzca una inmunidad protectora y que prevenga la enfermedad provocada por este virus . Un objeto adicional de la invención es proporcionar un adyuvante adecuado para su uso en una vacuna contra el BRSV, en donde el adyuvante mejora la inmunogenicidad del virus de modo que produzca una imunidad protectora después una dosis única de la vacuna.
Breve Descripción de la Invención
La invención abarca una composición para mejorar las respuestas inmune que comprende un copolímero de bloques, tal como un copolímero de bloques de polioxipropileno- polioxietileno (POP-POE), preferiblemente PluronicR L121 por ejemplo la Patente U.S. No. 4,772,466), y un componente 5 orgánico, tal como un aceite metabolizable , por ejemplo un hidrocarburo de turpina no saturado, preferiblemente escualano ( 2 , 6 , 10 , 15 , 19 , 23-hexametiltetracosano) o escuale- no. La composición también puede incluir un detergente no iónico o agente tensioactivo, preferiblemente un
• , - - _ 0 polioxietileno-monooleato de sorbitan tal como un detergente
Tween R , más preferiblemente TweenR-80, es decir polioxietileno (20) monooleato de sorbitan. En esta mezcla adyuvante en almacenamiento, el copolímero de bloques, el aceite orgánico, y el agente
tensioactivo pueden estar presentes en cantidades que varían desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40 ml/1, aproximadamente 20 hasta aproximadamente 80 ml/1, y aproxi-r —' madamente 1.5 hasta aproximadamente 6.5 ml/1, respectivamente. En una modalidad preferida del adyuvante en almace-20 namiento, el componente orgánico es escualano presente en una cantidad de aproximadamente 40 ml/1, el agente ten- sioactivo es monooleato de sorbitan polioxietileno (Tween -80) presente en una cantidad de aproximadamente 3.2 ml/1, y el copolímero de bloques de POP-POE es Pluronic L121 pre- p
senté en una cantidad de aproximadamente 20 ml/1. Pluronic " -. L121 es un copolímero líquido a 15-40 C, en donde el componente de polioxipropileno (POP) tiene un peso molecular de 3250 a 4000 y el componente de polioxietileno (POE) comprende aproximadamente 10-20%, preferiblemente 10%,
de la molécula total. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica para inmunizar a un animal contra la infección por el Virus Sincitial Respiratorio del Bovino (BRSV), que comprende un Virus de BRS vivo,
modificado, combinado con el adyuvante anterior y un estabi- lazor, portador o diluyente aceptable farmacéuticamente. El adyuvante está presente en esta composición de la vacuna a una concentración final de aproximadamente 1-25% (v/v), preferiblemente 5% (v/v). La composición también puede
incluir otros virus, tales como el Virus de Rhinotracheitis de Bovino Infeccioso (IBRV), el Virus de la Diarrea Viral del Bovino (BVDV), y el Virus de la Parainfluenza 3 (PI-3V), f . -^ y puede ser administrada por las vías intramuscular o subcutánea . 20 En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método para proteger a un animal contra la enfermedad provocada por el Virus Sincitial Respiratorio del Bovino, administrando una dosis única de la vacuna anterior que comprende un BRSV vivo, modificado, y un adyu- 25 vante .
Descripción Detallada de la Invención
Todas las patentes, solicitudes de patentes, y otra literatura citada aquí son incorporadas aquí para referencia en su totalidad. En el caso de inconsistencias, siempre prevalecerá la presente descripción. Cuando se utilice aquí, una "vacuna viva modificada" es una vacuna que comprende un virus que ha sido alterado, típicamente haciéndolo pasar en células de cultivo y I d del tejido, para atenuar su capacidad para provocar la enfermedad, pero la cual mantiene su capacidad para proteger contra la enfermedad o infección cuando se administre a animales . "Adyuvante" significa una composición comprendida
de una o más substancias que mejora la inmunogenicidad y la eficacia del BRSV cuando se combina con el BRSV en una composición de vacuna. Í -" Una "unidad infecciosa" de BRSV está definida como una TCID-^, o la cantidad del virus requerida para
infectar o matar 50% de las células del cultivo del tejido. La presente invención proporciona una vacuna contra el BRSV que es adecuada para la administración de una sola dosis. La vacuna es de la variedad del virus vivo modificado. Esto proporciona la ventaja de preservar la
inmunogenicidad y/o la eficacia del virus mientras que »~_ reduce su virulencia. La vacuna puede ser preparada a partir de cultivos virales colectados recientemente por métodos que son estándares en la técnica (véase el Ejemplo 1 posterior). Es 5 decir, el virus puede ser propagado en las células del cultivo del tejido tales como en los fibroblastos diploides humanos o preferiblemente las células de MDBK (del Riñon de Bovino de Madin-Darby) u otras células de bovino. El crecimiento del virus es verificado por técnicas estándares
± 0 (observación del efecto citopático, inmunof luorescencia u otros ensayos a base de anticuerpos), y colectados cuando una concentración viral suficientemente elevada ha sido lograda. Las substancias en almacenamiento virales pueden ser concentradas o liofilizadas adicionalmente por métodos
convencionales antes de la inclusión en la formulación de la vacuna. Otros métodos, tales como aquellos descritos <- en Thomas, et al., Agri-Practice, V.7 No. 5, pp.26-30., pueden ser empleados. La vacuna de la presente invención comprende
el virus vivo modificado, combinado con uno o más estabilizadores, portadores y adyuvantes aceptables farmacéuticamente. Los portadores adecuados para su uso incluyen salmuera, una solución salada amortiguada con fosfato, un medio esencial Mínimo (MEM), o MEM con una solución amortiguadora
de HEPES. Los estabilizadores incluyen pero no están limita- *', dos a sucrosa, gelatina, peptona, extractos de proteína digeridos, tales como NZ-Amina o NZ-Amina AS. En particular, la presente invención incluye un adyuvante que mejora la inmunogenicidad del virus vivo modificado y proporciona 5 una administración única para producir la inmunidad protectora . Los ejemplos no limitativos de adyuvantes adecuados incluyen escualano y escualeno (u otros aceites de JJ origen animal); copolímeros de bloques tales como Pluronic
<• -iO (L121) Saponina; detergentes tales como Tween R-80; QuilR
A, aceites minerales tales como Drakeol R o MarcolR , aceites vegetales tales como aceite de cacahuate; adyuvantes derivados de Corynebacterium tales como corynebacterium parvum; adyuvantes derivados de Propionibacterium tales como Propio- 15 nibacterium acné; Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette and Guerinn, o BCG); las interleucinas tales como la inter-?. . leucina 2 y la interleucina 12; monocinas tales como la interleucina 1; el factor de necrosis del tumor; las inter- feronas tales como la gamma interferona; combinaciones JJ 20 tales como saponina-hidróxido de aluminio o Quil -A hidróxido de aluminio; liposomas; adyuvante de iscom; extractos de paredes celulares micobacterianas ; glicopéptidos sintéticos tales como dipéptidos de muramilo u otros derivados; Avridina, Lípido A; sulfato de dextrano; DEAE-Dextrano 25 o DEAE-Dextrano con fosfato de aluminio; carboxipolimetile- JJ no, tal como Carbopol ; EMA; emulsiones de copolímero acrí- lico tales como Neocryl A640 (por ejemplo Patente U.S. No. 5,047,238); vaccinia o proteínas de poxvirus de animal; adyuvantes de partículas subvirales tales como orbivirus; 5 toxina del cólera; bromuro de dimetildiocledecilamonio ; o mezclas de los mismos. La formulación de una mezcla adyuvante preferida se describe en el Ejemplo 2 posterior. La vacuna de la presente invención puede ser 10 administrada preferiblemente por las vías intramuscular o subcutánea, o menos preferiblemente por las vías intranasal, intraperitoneal, u oral. Para la administración de una sola dosis, la vacuna debe contener una cantidad de BRSV correspondiente
a desde aproximadamente 10 " hasta aproximadamente 10 4 5 de TCID50/ml, preferiblemente 10 hasta 10 de TCID50/ml.
*•._- Aproximadamente uno a cinco ml, preferiblemente 2 ml, pueden ser administrados por animal, intramuscular, subcutánea o intraperitonealmente . Uno a diez ml, preferiblemente 20 2 a 5 ml , pueden ser administrados oral o intranasalmente . Los siguientes ejemplos están propuestos para ilustrar adicionalmente la invención sin limitar su alcance.
'- Ejemplo 1: Crecimiento y colección del BRSV
A) Descripción de substancias en almacenamiento virales : El BRSV puede ser obtenido de cualquier número de fuentes fácilmente disponibles. En una modalidad, se puede usar la cepa 375 del BRSV. Esta cepa virulenta del BRSV es originaria de la Iowa State University, Ames Iowa. Cualquier cepa de BRSV adecuada está contemplada e incluida dentro de la invención. En forma similar, los virus de BHV-1 , BVDV, y PI-3V están fácilmente disponibles. Cuando se obtienen en forma virulenta, estos virus pueden ser atenuados, por medios conocidos, para proporcionar virus vivos modificados, adecuados para el uso de la vacuna. Los virus también pueden ser sacrificados o exterminados por métodos convencionales para proporcionar virus inactivados adecuados para el uso en la vacuna. Los métodos de atenua- ción o inactivación de los virus para el uso en la vacuna son bien conocidos. Las vacunas de virus de BRSV, BHV-1 , BVDV, y PI-3V vivos y/o exterminados, modificados, son bien cono- cidas y están disponibles comercialmente. Véase , por ejemplo, Thomas, et al., supra , y Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, supra y Apéndice 2, A-31-45. B) Cultivo de células: La línea celular de MDBK (NBL-1), libre de BVD, se compró de la American Type Culture Collection. La misma se mantuvo en OptiMEM (Gibco, /„t. Grand Island, NY) , suplementado con hasta 10% (v/v) de suero de bovino, hasta 0.5% de hidrolizado de lactalbúmina (JRH, Lenexa, KS), hasta 30 mcg/ml de polymixin B (Phizer, NY, NY) y neomicina (Upjohn, Kalamazzo, MI), y hasta 2.5 5 mcg/ml de anfotericina B (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) , piruvato de sodio, bicarbonato de sodio, glucosa, L-glutamina y cloruro de calcio también pueden ser agregados cuando se requiera para sostener el crecimiento de las células. Para la propagación del virus, el OptiMEM, el l? MEM de Eagle, el Médium 199, o un medio equivalente es suministrado con hasta 2% de suero de bovino, hasta 0.5% de albúmina del suero de bobino, hasta 0.5% del hidrolizado de lactalbúmina, hasta 30 mcg/ml de polymyxin B y neomicina, y hasta 2.5 mcg/ml de anfotericina B. El piruvato de sodio,
el bicarbonato de sodio, la glucosa, la L-glutamina y el cloruro de calcio también pueden ser agregados cuando se
, ¡ requiera para sostener el crecimiento celular. C) Inoculación de cultivos: Los cultivos subcon- fluentes individuales de las células de MDBK se inoculan
con BRSV, BVDV, PI-3V, o BHV-1V utilizando una multiplicidad de infección de 1:5 hasta 1:5,000 unidades infecciosas por célula. El medio de crecimiento de las células fue desechado y se remplazó con el medio de propagación viral (véase anteriormente), después de lo cual el virus sembrado
fue agregado directamente al recipiente de cultivo. Los cultivos infectados viralmente se mantuvieron a 36°C. El crecimiento viral se determinó por examinación microscópica del efecto citopático o por el teñido de anticuerpos fluorescente. Para el BRSV, las células infectadas mostraron la formación de sincitios y células fusiformes alargadas, las cuales progresaron hasta que esencialmente la hoja o lámina celular completa estuvo involucrada. Para el BHV-1V, las células infectadas exhibieron una granulación citoplásmica seguido por el redondeo y/o conformación en una bola de las células infectadas. Para el BVDV, las células infectadas forman vacuolas intracelulares, redondeadas, y dejan circunscritas las áreas libres de células. Los cambios citopáticos en las células infectadas por PI-3V son similares a aquellos en las células infectadas por BHV-1V.
D. Colección del Virus: Los fluidos del cultivo se colectaron en los recipientes estériles. Las colecciones múltiples pueden empezar cuando 50% de la hoja o lámina celular exhibe la citopatología característica, y continúa hasta que el 100% de las células son afectadas. Los fluidos de los virus pueden o no pueden ser clarificados por centrifugación o filtración. Los fluidos virales son almacenados a -50°C o a una temperatura más fría, o son liofilizados y almacenados en el intervalo de 2 a 8°C.
Para la preparación de una vacuna final, los substancias en almacenamiento virales, ya sea solas o en combinación, son mezcladas con el adyuvante. Cuando se utilizan substancias en almacenamiento virales líquidas, 19 partes de las substancias en almacenamiento virales son mezcladas con una parte del adyuvante, preferiblemente el adyuvante del Ejemplo 2. Cuando se utilizan substancias en almacenamiento virales, liofilizadas , una solución diluida al 5 % (v/v) del adyuvante en salmuera es preparada (mezclando 1 parte de adyuvante con 19 partes de salmuera). La substancia en almacenamiento viral, liofilizada, es reconstituida ( rehidratada) con el adyuvante diluido para formar la composición de la vacuna final. El trimerisol puede ser agregado a la formulación final, a una concentración final de 1:10,000.
Ejemplo 2: Formulación de un adyuvante de la substancia en almacenamiento preferida
Un adyuvante preferido para su uso en la presente invención se preparó de acuerdo con la siguiente formulación :
copolímero de bloques de polioxipropileno- > polioxietileno (por ejemplo Pluronic L121, BASF, Parsippany, NJ) 20 ml Escualano (por ejemplo, Kodak, Rochester, NY) 40 ml
monooleato de sorbitan polioxietileno j> (por ejemplo Tween -80, Sigma Chemical, St. Louis, MO) 23 ml
solución salada amortiguada (por ejemplo Solución D-V PAS , Libre de Ca , Mg) 936.8 ml
Los ingredientes son mezclados y homogeneizados hasta que se forma una masa o emulsión estable. Previo a la homogeneización, los ingredientes o la mezcla pueden ser tratados en un autoclave. La emulsión puede ser esterilizada adicionalmente por filtración. Se puede agregar formalina hasta una concentración final de 0.2%. Se puede agregar Thimerosal a una dilución final de 1:10,000.
Ejemplo 3: Mejoramiento de una Vacuna de BRSV Viva, Modificada
Para este estudio, se prepararon dos vacunas de BRSV, una con y una sin la mezcla adyuvante descrita en el Ejemplo 2. La vacuna que carece del adyuvante contuvo 2.52 unidades infecciosas log de BRSV por 2 ml, mientras que la vacuna que contiene el adyuvante contuvo 2.96 unidades infecciosas log por 2 ml y 5% (v/v) del adyuvante. Cada una de veinte vacas o ganado recibió una dosis de 2 ml de una vacuna que carece de adyuvante, diez intramuscularmente y diez subcutáneamente. Cinco vacas o ganado, adicionales, recibieron una dosis de 2 ml de la vacuna que contiene el adyuvante. Todas las vacunaciones fueron repetidas a los 21 días. Se obtuvieron muestras del suero el sexto día a continuación de la segunda vacúnación, y se probaron para verificar la presencia de los anticuerpos de neutralización del suero anti-BRSV. El ensayo de los anticuerpos de la neutralización del suero se describe en el Ejemplo 4. Los resultados de este estudio indicaron que 4 de los 5 terneros inoculados con la vacuna contra el BRSV que contiene el adyuvante, mostraron evidencia de anticuerpos anti-BRSV (seroconversión), mientras que ninguno de los veinte animales inoculados con la vacuna contra el BRSV que carece del adyuvante mostraron evidencia de anticuerpos. Esto indica que el adyuvante descrito en el Ejemplo 2 tiene la propiedad de mejorar la inmunogenicidad de las vacunas contra el BRSV vivas, modificadas.
Ejemplo 4: Administración de una Sola Dosis de la Vacuna Contra el BRSV Mejorada
El siguiente estudio de vacunación y de prueba se efectuó para determinar si un Virus Sincitial Respiratorio de Bovino (BRSV) vivo, modificado, para una sola inmunización, formulado con un adyuvante, podría inducir la inmunidad protectora en el ganado. En segundo lugar, el estudio se diseñó para determinar si la administración concurrente del Virus de Diarrea Viral de Bovino (BVDV) vivo, modificado, el Herpesvirus del Bovino, Tipo 1 (BHV-1 o IBRV) , y el Virus de Parainfluenza de Bovino (PI3) podría interferir con la inducción de la inmunidad protectora con respecto al BRSV. A) Vacunas Experimentales: El Virus Sincitial
Respiratorio del Bovino (BRSV) vivo, modificado, en cinco pasadas más allá de la siembra maestra o principal, se hizo crecer en células del Riñon de Bovino de Madin Darby (MDBK) en la pasada 20 de las substancias en almacenamiento de las células maestras o principales. Brevemente, las células de MDBK fueron plantadas en botellas giratorias de 850 cm3 a una densidad de 3 X 10 células por botella giratoria en un Medio Esencial Mínimo (MEM) que contiene 5% de suero de bovino, 0.5% de LAH, y 30 ¿í-g/ml de Gentami-ciña. A las células se les permitió que crecieran a 37°C durante 2 días previo a la infección con el virus. El medio se decantó desde las botellas giratorias y el virus se agregó en una Multiplicidad de Infección de 1:600 en 100 ml del medio de propagación del virus por botella (MEM que contiene 2% de suero de bovino, 0.5% de LAH, y 30 5 L g / l de Gentamicina. Siete días después de la infección, se presentó una citopatología del 100% y se colectaron los fluidos sobrenadantes. El virus se estabilizó con 25% (v/v) del estabilizador SGGK3 y se liofilizó. El día de la vacunación, el virus liofilizado se reconstituyó con 0 5% (v/v) del adyuvante diluido en un diluyente de salmuera (Véase , el Ejemplo 2). El virus de BRSV reconstituido se combinó con los virus de PI3, BVDV, y BHV-1. La concentración de cada componente de la vacuna se determinó por titulación del replicado el día de la vacunación. 15 B) Animales Experimentales Utilizados: Un total de 30 animales o ganado se utilizaron para este estudio.
•/ ~' Este ganado fue susceptible al BRSV como se indicó por una concentración de anticuerpos de neutralización del suero (SN) < 2 el día de la vacunación para los animales
de prueba y el día del estudio para los animales de control. Los animales se dejaron afuera con acceso a un resguardo con tres lados, abierto al sur. Los animales de control fueron alojado separadamente de los vacunados previo al estudio para evitar la exposición al virus de la vacuna.
Una ración completa se suministró una vez cada día, se suministro forraje y agua ad libitum. C) Vacunación : Un volumen de 2 ml de la vacuna combinada se administra una vez a cada animal vacunado. Veinte (20) animales fueron vacunados (diez por la vía subcutánea y diez por la vía intramuscular) y los diez animales restantes no fueron vacunados y sirvieron como controles del estudio. D) Estudio Experimental: Los animales fueron inoculados con el virus de BRSV virulento catorce días a continuación de la vacunación. Un mínimo de 10 5.7 TCID 50 del virus de BRSV virulento se administraron a cada res o vaca por la inoculación con aerosol tres días consecutivos . E) Observaciones Clínicas: El ganado fue obser-vado diariamente desde los días -2 hasta 14 a continuación de la inoculación para verificar los signos o señales clíni-cas de la enfermedad y la fiebre (temperatura rectal). El ganado fue observado para detectar las señales de la infección de BRSV que incluyen, pero que no está limitado a, la descarga nasal y ocular, conjuntivitis, tos, disnea, anorexia, y depresión. La temperatura rectal se registró diariamente durante todo el período de observación. F) Ensayos 1. Ensayo de Anticuerpos de Neutralización del Suero (SN) Las diluciones en serie del suero inactivado con calor fueron mezcladas con volúmenes iguales de las suspensiones virales, en una prueba de neutralización del virus constante del suero, variable, utilizando 100 a 500 TCID..- del BRSV. Las mezclas del virus del suero se incuban a 37°C durante 1 hora luego se inoculan sobre células VERO en placas de microtitulación de 96 cavidades. La presencia de concentraciones de anticuerpos de SN se indicaron por la ausencia de virus como se detectó por el efecto citopático. Para la determinación de las concentraciones de anticuerpos de SN, los puntos finales de neutralización al 50% se calcularon de acuerdo con el método de Reed y Muench. 2. Titulación del Virus en la dilución Final de la Vacuna La concentración del virus de BRSV en la vacuna se determinó por la titulación del replicado el día de la vacunación. Brevemente, la vacuna en combinación se combinó con el antisuero de neutralización apropiado. La mezcla de la vacuna y del antisuero se incuba a 37°C durante 45 a 60 minutos. Las diluciones en serie de la vacuna y del antisuero fueron hechas y se inocularon sobre las células VERO. La presencia del virus se indicó por la presencia del efecto citopático y se confirmó por la inmunofluorescencia específica (FA). La concentración del "* ' virus se calculó sobre cada replicado por el Método de
Reed y Muench. La concentración promedio de la fracción de BRSV de la vacuna fue de 10 3 " 4 TCID..» por dosis. 3. Titulación del Virus de Inoculación 5 La dilución del virus de inoculación del
BRSV administrado, se diluyó y se inoculó en serie sobre las células de MDBK en placas de microtitulación de 96 cavidades. La presencia del virus se indicó por la presencia o presentación del efecto citopático y se confirmó por
la inmunofluorescencia específica como se describió para el aislamiento del virus. Para interpretar los resultados, las marcas o evaluaciones clínicas fueron asignadas como sigue: Señal o signo clínico evaluación/observación
Descarga Nasal Serosa severa 2 " Mucopurulenta suave 2 Mucopurulenta moderada 3 Mucopurulenta severa 4 20 Descarga Ocular Serosa severa 1 Mucopurulenta suave 2 Mucopurulenta moderada 3 Mucopurulenta severa 4 Conjuntivitis 2
Tos 2 Disnea 2 Anorexia 1 Hiperepemia y enrojecimiento de la mucosa nasal
Fiebre (debe estar al menos 0.55°C (1°F) arriba de la línea base) 39.72 a 39.94°C 1 40.00 a 40.50°C 2 40.55 a 41.05°C 3 > 41.11SC 4
La descarga nasal u ocular serosa, suave, se considera que va a ser normal para el ganado que se deja a la intemperie. La fiebre se considera significativa solo si estuvo al menos un grado arriba de la temperatura corporal de la línea base. La temperatura corporal de la línea base fue determinada como la temperatura corporal promedio para cada animal el día previo a y el día de la inoculación o estudio. Las evaluaciones clínicas totales para cada animal fueron sumadas. Las evaluaciones clínicas de los animales vacunados y de control fueron comparados por el Análisis de Sumas Clasificadas de Mann Whitney.
'*- Los signos o señales clínicas de la enfermedad se observaron en el ganado de control desde los días 5 hasta 10 después de la inoculación o estudio (Tabla 1). La totalidad de los animales de control (100%) se observó que tienen señales 5 de la enfermedad respiratoria en días múltiples. Las señales específicas de la enfermedad respiratoria incluyeron descarga nasal serosa severa (la descarga que realmente gotea desde la ventana de la nariz), descarga nasal mucopurulenta, descarga ocular, y tos. La evaluación clínica promedio
para los terneros de control fue de 3.7. En comparación, los signos o señales respiratorias fueron mucho menos prevalecientes en los animales vacunados. Solamente 40% de los animales vacunados tuvieron algunos signos o señales de enfermedad respiratoria y sola- 15 mente dos (10%) tuvieron signos o señales clínicas en días múltiples. La evaluación clínica promedio para el grupo vacunado fue de 1.0. Existió una reducción significativa estadísticamente en la enfermedad clínica en los animales vacunados comparado con los animales de control por el
Análisis de Sumas Clasificadas de Mann Whitney (p<0.05). Estos datos muestran que una administración de una sola dosis de la vacuna del virus de BRSV vivo, modificado, con el adyuvante, de acuerdo con la invención, proporciona protección contra la inoculación del BRSV virulento.
Esta vacuna y método es efectiva, aún cuando otras vacunas sean coadministradas con la vacuna contra el BRSV.
-~ Por consiguiente, la invención proporciona una composición de vacuna para inmunizar a un animal contra la infección por el Virus Sincitial Respiratorio del Bovino (BRSV). La vacuna comprende un Virus de BRS vivo, modifica- 5 do, un adyuvante, y un portador aceptable farmacéuticamente, de tal modo que la combinación proporcione inmunidad contra la infección del BRSV después de una sola administración, y produzca una respuesta inmune específica para el BRSV y seleccionada de la inmunidad mediada por la célula y
,0 la inmunidad local (IgA secretoria). La inmunidad mediada por la célula incluye la estimulación de las Células Ayudantes o Auxiliadoras de T (T-Helper), las Células Exterminadoras de T (T-Killer), y las Células de Hipersensiblidad Retardada de T, así como
la estimulación de los macrófagos, monocitos, y otras linfocinas y la producción de interferonas. La presencia de la -' inmunidad mediada por las células puede ser determinada por los ensayos in vitro e in vivo convencionales. La inmunidad local, tal como la IgA secretoria, puede ser determi- 20 nada por los ensayos de ELISA o IFA convencionales que muestran una concentración de anticuerpos de neutralización del suero de 1-2 o más grande. De acuerdo con la invención, la inmunidad local o mediada por la célula de las consecuencias es específica para o está asociada con el BRSV. 25 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes
Claims (22)
1. Una composición de vacuna para inmunizar a un animal contra la infección por el Virus Sincitial Respirato- 5 rio del Bovino (BRSV), caracterizada porque comprende: un Virus de BRS vivo, modificado, un adyuvante, y un portador aceptable farmacéuticamente, de tal modo que la composición proporcione inmunidad contra la infección ,. por BRSV después de una sola administración, y provoque 10 una respuesta inmune específica para el BRSV y seleccionada de la inmunidad mediada por la célula y la inmunidad local (IgA secretoria).
2 . Una composición de conformidad con la reivindi- 15 cación 1, caracterizada porque el adyuvante comprende un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno "r-- y un hidrocarburo de turpina no saturada.
3. Una composición de conformidad con la reivin- 20 dicación 2, caracterizada porque el hidrocarburo de turpina no saturada es uno de escualeno y escualano, y el copolímero tiene un componente de polioxipropileno con un peso molecular promedio de aproximadamente 3250 a 4000 y el componente de polioxietileno comprende aproximadamente 10-20% de la 25 molécula total.
4. Una composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el copolímero está presente en una concentración final de aproximadamente 0.01 hasta 1% (v/v) y el componente de hidrocarburo está presente en una concentración final de aproximadamente 0.02 hasta 2% (v/v).
5. Una composición de conformidad con la reivin-dicación 2, caracterizada porque el adyuvante comprende adicionalmente un agente tensioactivo.
6. Una composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el adyuvante también comprende un agente tensioactivo presente en una concentración final de aproximadamente 0.0015 hasta 0.20% (v/v).
7. Una composición de conformidad con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizada porque el agente tensioactivo es un polioxietileno monooleato de sorbitan.
8. Una composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el hidrocarburo es uno de escualeno y escualano, y el copolímero tiene un componente de polioxipropileno con un peso molecular promedio de aproximadamente 3250 hasta 4000 y el componente de polioxietileno comprende aproximadamente 10-20% de la molécula total .
9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque además comprende el Virus de Rhinotracheitis de Bovino (BHV-IV), el Virus de la Diarrea Viral de Bovino (BVDV), y el Virus de la Parainfluenza 3 (PI-3V).
10. Una composición de vacuna para inmunizar a un animal contra la infección por el Virus Sincitial Respiratorio del Bovino (BRSV), caracterizada porque comprende : un Virus de BRS vivo, modificado, un portador aceptable farmacéuticamente, y un adyuvante que comprende un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno y un hidrocarburo de turpina insaturada, de tal modo que la composición proporcione inmunidad contra la infección de BRSV después de una sola administración.
11. Una composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el hidrocarburo es uno del escualeno y escualano y el copolímero tiene un componen-te de polioxipropileno con un peso molecular promedio de aproximadamente 3250 a 4000 y el componente de polioxietileno comprende aproximadamente 10-20% de la molécula total.
12. Una composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el copolímero de bloques está presente en una concentración final de aproximadamente 0.01 hasta 1% (v/v) y el componente orgánico está presente en una concentración final de aproximadamente 0.02 hasta 2% (v/v).
13. Una composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el adyuvante comprende adicionalmente un agente tensioactivo presente en una concentración final de aproximadamente 0.0015 hasta 0.20% (v/v).
14. Una composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el agente tensioactivo es el polioxietileno monooleato de sorbitan.
15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-14, caracterizada porque además comprende al menos un virus vivo modificado seleccionado del grupo que consiste del Virus de Rhinotracheitis de Bovino (BHV-IV), el Virus de la Diarrea Viral del Bovino (BVDV), y el Virus de la Parainfluenza 3 (PI-3V)
16. Un método para proteger a un animal contra la enfermedad provocada por el Virus Sincitial Respiratorio del Bovino (BRSV), caracterizado porque comprende el paso de administrar al animal una composición inmunogénica que comprende : un Virus de BRS vivo, modificado, un adyuvante, y un portador aceptable farmacéuticamente, de tal modo que la composición proporcione inmunidad contra la infección del BRSV después de una sola administración, y produzca una respuesta inmune específica para el BRSV y seleccionada de la inmunidad mediada por la célula y la inmunidad local (IaG secretoria).
17. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el virus está presente en 3 un intervalo de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 10 unidades infecciosas por mililitro
18. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de la administración comprende una de las administraciones intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, oral, e intranasal.
'- 19. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el adyuvante comprende un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno en una concentración final de aproximadamente 0.01 hasta 5 1% (v/v) y un hidrocarburo de turpina insaturada en una concentración final de aproximadamente 0.02 hasta 2% (v/v).
20. Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el adyuvante comprende adicio-?0 nalmente un agente tensioactivo no iónico en una concentración final de aproximadamente 0.0015 hasta 0.20% (v/v).
21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el hidrocarburo es uno de 15 escualeno y escualano, el agente tensioactivo es polioxietileno monooleato de sorbitan, y el copolímero tiene un compo- , - nente de polioxipropileno con un peso molecular promedio de aproximadamente 3250 hasta 4000 y el componente de polioxietileno comprende aproximadamente 10-20% de la molécula 20 total.
22 . El método de conformidad con cualquiera de las re i v indicaciones 16-21 , carac ter i zado porque además comprende la c oadministrac ión de l Virus de Rhinot racheitis 25 del Bovino (BHV-IV) , el Virus de la Diarrea Viral del Bovino (BVDV) , y el Virus de la Parainfluenza 3 (PI-3V) .
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1995
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