CN1909925B - 一种免疫佐剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免疫佐剂。本发明所提供的免疫佐剂是左旋咪唑，或左旋咪唑的衍生物，或左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与下述至少一种物质组成的组合物：白油、甘油、油酸、双十八烷基二甲基溴化铵或皂素。本发明的免疫佐剂能够有效地提高蛋白质疫苗，核酸疫苗，多肽疫苗和灭活疫苗激发机体完全免疫反应的能力，增强机体T细胞的免疫效果，延长保护期；本发明免疫佐剂的制备方法简单无需复杂的设备和操作步骤，易于实施，在医学领域中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。

Description

一种免疫佐剂
技术领域
本发明涉及一种免疫佐剂。
背景技术
提高机体免疫力是预防各种病原体感染的最主要的手段，一般可通过接种疫苗达到该目的，因而接种疫苗是预防各种病原体感染的有效措施之一。常见的病原体有病毒、微生物、真核细胞、寄生虫和环境因子等多种有机体和分子。目前已报道有多种方法可用来生产抗传染性病原体的疫苗，如灭活疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗等，这些疫苗的基本作用原理是相同的，即借助与病原体结合的靶蛋白激发免疫反应，达到免疫个体不被传染性病原体感染的目的。当个体与传染性病原体接触时，其免疫系统能够识别病原体蛋白而产生有效的保护反应抵抗传染。目前所用的多种疫苗就是由从病原体中分离出来的非传染性和低传染性的蛋白或核酸物质所组成。核酸疫苗的优点在于可以激活体液免疫反应和细胞免疫反应，而更有效地激发保护性和清除性的免疫反应，达到防治病原体感染，抗肿瘤，治疗自主免疫疾病和清除毒素引起的中毒症状等抵抗外来病源体的感染和内在病变，同时核酸疫苗因制备方便，成本低廉，安全性好等特点而备受推崇。但是核酸疫苗的缺点是在体内激活机体产生完全免疫反应的效率较低，单独使用还不能达到保护作用或保护性不稳定。补以激活、提高、调节核酸疫苗免疫反应的佐剂正是解决此问题的关键。
佐剂具有多种类型，按种类可分为溶性铝盐类佐剂(Glenny，J.Path.Bacteriol，34，267，1926)、油水乳剂佐剂(如弗氏佐剂)、微生物及其代谢产物佐剂(R.Germanier，ed.，Bacterial Vaccines，Academic Press Inc.NewYork，1984)、人工合成佐剂(Coughlin et al.，P.The Journal of InfectiousDiseases，171：1049-1052，1995)、免疫刺激组合物(ISCOM)佐剂(Coughlin etal.，P.The Journal of Infectious Diseases，171：1049-1052，1995)、细胞因子类佐剂(Trinchieri G.Immunology 13：251-276，1995)、核酸及其类似物佐剂(美国专利6,372,227；Manmohan Singh & Derek O’Hagan.NatureBiotechnology 17，1075-1081，1999；Virgil EJC Schijns.Current Opinionin Immunology，12：456-463，2000)；按作用方式可分为三种：1)在接种部位形成抗原贮存库，使抗原缓慢释放，从而与免疫细胞较长时间接触并激发对抗原应答的佐剂；2)辅助抗原暴露并将能刺激特异性免疫应答的抗原表位提呈给免疫细胞的佐剂；3)诱导介导免疫应答的细胞因子释放的佐剂。
但是上述佐剂各存在一些问题，如其中大部分是针对提高抗体水平而开发设计的，但对机体的T细胞免疫水平并没有促进；相反有的佐剂对T细胞免疫还有较大抑制作用，从而使其在蛋白质、多肽和灭活疫苗应用上表现出免疫原性不强、细胞水平低下、保护期短等缺点，使得此类佐剂在应用上受到限制。
发明公开
本发明的目的是提供一种可提高T细胞免疫水平的免疫佐剂。
本发明所提供的免疫佐剂，是左旋咪唑，或左旋咪唑的衍生物，或左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与下述至少一种物质组成的组合物：白油、甘油、油酸、双十八烷基二甲基溴化铵或皂素。
本发明的免疫佐剂的具体组成如下：
所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物。
所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与白油的组合物。所述白油与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为20∶1-1∶20，优选的质量比为10∶1-1∶1。
所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与甘油的组合物。所述甘油与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为5∶1-1∶5，优选的质量比为2∶1-1∶2。
所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与油酸的组合物。所述油酸与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为5∶1-1∶5，优选的质量比为2∶1-1∶2。
所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与双十八烷基二甲基溴化铵的组合物。所述双十八烷基二甲基溴化铵与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为20∶1-1∶20，优选的质量比为10∶1-1∶5。
所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与皂素的组合物。所述皂素与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为20∶1-1∶20，优选的质量比为10∶1-1∶5。
其中，所述左旋咪唑衍生物可为盐酸左旋咪唑或磷酸盐酸左旋咪唑。
所述白油为食品用白油或注射用白油。
本发明的佐剂可和疫苗组成免疫组合物。所述疫苗可为蛋白质疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗或灭活疫苗。
所述蛋白质疫苗和多肽疫苗是人工合成的或者通过生物体生产的作为疫苗的特异性抗原物质。所述生物体为大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌或真核细胞等可在人工培养条件下生产放大的生物体。
所述灭活疫苗是将病原体经公知的方法灭活后作为疫苗的抗原物质。
所述免疫组合物可通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
所述免疫组合物可通过以下方法得到：将蛋白质疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或灭活疫苗溶于含有质量百分浓度为0.1％至10％的左旋咪唑(或左旋咪唑衍生物)的生理盐水中；或者溶于含有质量百分浓度为0.1％至10％的左旋咪唑(或左旋咪唑衍生物)和质量百分含量为1％至20％的白油的生理盐水中；或者溶于含有质量百分浓度为0.1％至10％的左旋咪唑(或左旋咪唑衍生物)和质量百分浓度为1％至10％的甘油的生理盐水中；或溶于含有质量百分浓度为0.1％至10％的左旋咪唑(或旋咪唑衍生物)和质量百分含量为0.1％至5％的油酸的生理盐水中；或溶于含有质量百分浓度为0.1％至10％的左旋咪唑(或左旋咪唑衍生物)和质量百分浓度为0.1％至10％的双十八烷基二甲基溴化铵的生理盐水中；或溶于含有质量百分浓度为0.1％至10％的左旋咪唑(或左旋咪唑衍生物)和质量百分浓度为0.1％至5％的皂素的生理盐水中，使蛋白质疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或灭活疫苗的终浓度为1至200微克/毫升。
本发明的免疫佐剂与相应疫苗一起使用，可增强机体对以下致病病原体的免疫应答能力：病毒、原核细胞、真核细胞。其中，真核细胞病原体包括单细胞致病病原体和多细胞寄生虫类。病毒性病原体包括但不局限于呼吸道病毒(流感和轮状病毒)、疮疹病毒(德国麻疹、水痘、牛痘、天花、带状疮疹等)、中枢神经系统病毒(沅病毒)、免疫系统病毒(艾滋病毒)、生殖系统病毒(尖锐湿疣)、动物病毒(口蹄疫病毒、猪瘟病毒、禽流感病毒、新城疫病毒)。
附图说明
图1为PCR扩增的FMDV VP1基因的1％琼脂糖凝胶电泳图谱
图2为对重组表达载体SuperY/VP1进行酶切鉴定的电泳图谱
图3为VP1基因表达产物的SDS-PAGE图谱
图4为Western-blot实验检测VP1蛋白的表达图谱
图5为VP1蛋白与不同佐剂形成的免疫组合物免疫小鼠产生的抗体滴度变化曲线
图6为146S抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠产生T细胞特异性扩增的影响
图7为猪生殖与呼吸综合征灭活病毒抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠产生的抗体滴度比较
图8为猪生殖与呼吸综合征灭活病毒抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠的T细胞特异性扩增活性比较
图9为猪生殖与呼吸综合征灭活病毒抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠的迟发性免疫反应的比较
图10为146S抗原免疫过的BABL/C小鼠T细胞增殖的结果
图11为146S抗原免疫过的C57BL/6小鼠T细胞增殖的结果
图12为猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原免疫过的BABL/C小鼠T细胞增殖的结果
图13为猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原免疫过的C57BL/6小鼠T细胞增殖的结果
图14为在HPRT看家基因定量调节后cDNA浓度的电泳图
图15为免疫过146S抗原的BABL/c小鼠表达IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ的电泳图
图16为Bio-Rad Image软件分析免疫过146S抗原的C57BL/6小鼠的IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ表达的结果
图17为Bio-Rad Image软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的BABL/c小鼠的IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ表达的结果
图18为Bio-Rad Image软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的C57BL/6小鼠的IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ表达的结果
图19为免疫过146S抗原的BABL/c小鼠表达MHC、共刺激分子的电泳图
图20为Bio-Rad Image软件分析免疫过146S抗原的C57BL/6小鼠的MHC、共刺激分子表达的结果
图21为Bio-Rad Image软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的BABL/c小鼠MHC、共刺激分子表达的结果
图22为Bio-Rad Image软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的C57BL/6小鼠的MHC、共刺激分子表达的结果
图23为Bio-Rad Image软件分析免疫过146S抗原的BABL/c小鼠的SOCS1和SOCS3表达的结果
图24为Bio-Rad Image软件分析免疫过146S抗原的C57BL/6小鼠的SOCS1和SOCS3表达的结果
图25为Bio-Rad Image软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的BABL/c小鼠的SOCS1和SOCS3表达的结果
图26为Bio-Rad Image软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的C57BL/6小鼠的SOCS1和SOCS3表达的结果
图27为鸡新城疫病毒抗原免疫过的BABL/C小鼠T细胞增殖的结果
实施发明的最佳方式
下述实施例中所提到的实验方法如无特别说明，均为常规方法；所提到的百分含量如无特别说明均为质量百分含量。
实施例1、牛口蹄疫(FMDV)VP1蛋白疫苗的制备
一、牛口蹄疫VP1的cDNA克隆
感染牛口蹄疫病毒的口腔病变组织，利用RNA提取试剂盒(购自上海生物工程公司)采用异硫氰酸胍一步法按照试剂盒的说明提取病毒总RNA，具体步骤如下：取病变组织破碎分离细胞，加入0.5mL异硫氰酸胍溶液，0.5mL的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)溶液，4℃12000rpm离心5分钟，将上清液移至一新的1.5毫升塑料离心管中，加等量的异丙醇，-20℃放置30分钟，12000rpm离心10分钟，弃去上清液，沉淀用70％乙醇清洗，沉淀干燥后溶于30μL DEPC处理水中，变性琼脂糖凝胶电泳检测结果表明得到病毒RNA。
在如下反应条件下合成第一链cDNA：2μg牛口蹄疫病毒RNA，50mmol/LTris-HCl(pH8.3)，75mmol/L KCl，10mmol/L DTT，3mmol/L MgCl2，500μmol/LdNTPs，100μg随机六聚体引物，500单位MMLV反转录酶，总体积20μL，37℃保温1h。以第一链cDNA产物为模板，在引物1：5’-AAG AATTCGGAGGTACCACCTCTGCGGGTGAG-3’；和引物2：5’-AATCTAGACCTCCGGAACCCAGAAGCTGTTTTGCGGG-3’，(在引物1和引物2，分别引入EcoRI识别位点和XbaI识别位点)的引导下PCR扩增牛口蹄疫病毒VP1的cDNA。反应体系：5μL第一链cDNA产物，引物1和引物2各10pmol，500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH8.4)，1.5mM MgCl2，100μg/mL BSA，1mM dNTPs，2.5U TaqDNA聚合酶，总体积为50μL。反应条件为：94℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环。PCR扩增的FMDV VP1基因的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示(泳道M为DNA Marker；泳道1为PCR产物)，图中箭头所指为目的条带的位置，表明目的片段的大小为639bp，与VP1基因片段大小一致，用低熔点胶回收该扩增片段。
二、表达载体SuperY/VP1的构建与鉴定
用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切步骤一获得的口蹄疫VP1 cDNA片段，电泳，回收后，将VP1基因片段克隆入穿梭质粒SuperY(在购自美国Invitrogen公司的质粒pGAPZa的SphI和HpaI位点上加入卡那霉素抗性基因(Kanr)得到SuperY的EcoRI和XbaI酶切位点之间，再用EcoRI和XbaI限制性内切酶对重组载体进行酶切鉴定，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图2所示(泳道M为DNA Marker；泳道1为酶切产物)，其中的小片段大小为639bp，与VP1基因片段大小一致，表明VP1已正确克隆至SuperY上，并将该重组载体命名为SuperY/VP1，然后将SuperY/VP1转化大肠杆菌Top10 F′感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，对阳性克隆进行序列分析，结果表明扩增产物的核苷酸序列与VP1基因一致，并已成功克隆至SuperY质粒中。
三、VP1基因在酵母中的表达及其表达产物的检测
将步骤二构建的重组表达载体SuperY/VP1采用电击法转化酵母SMD1168，筛选鉴定阳性克隆，挑取单菌落30℃摇瓶培养48-96小时后(同时设酵母SMD1168和转化有SuperY的酵母SMD1168为对照)，取上清变性后进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝G250染色后，用凝胶成像系统照相，结果如图3所示(泳道1：酵母SMD1168上清；泳道2：转化有SuperY的酵母SMD1168的表达上清；泳道3：转化有SuperY/VP1的酵母SMD1168表达上清；泳道M：低分子量蛋白标准)，由泳道3可知VP1的表达产物为两种，分子量分别为66kD和43kD，表明SuperY/VP1中的VP1基因在酵母细胞中获得表达。再将该重组表达载体SuperY/VP1的表达产物进行Western blotting分析，具体方法为：将表达的蛋白变性后，用SDS-PAGE分离蛋白质，再将其电转移至NC膜，用5％脱脂牛奶作封闭剂，然后依次用牛抗口蹄疫病毒高免血清(购于新疆建设兵团兽医总站)、羊抗牛IgG-HRP酶标抗体(美国Sigma公司购买处)孵育，最后在DAB/H2O2下显色，结果如图4所示(泳道M：低分子量蛋白标准；泳道1：转化有SuperY/VP1的酵母SMD1168表达上清；泳道3：酵母SMD1168上清；泳道4：转化有SuperY的酵母SMD1168的表达上清)，泳道1在66kD和43kD附近出现了特异性的显色带，而泳道2和3均未出现条带，表明表达的蛋白能与抗FMDV血清反应产生特异性反应带，表达的蛋白产物具有FMDV的免疫原性。表达的上清经脱盐纯化后保存在-20℃，可作为牛口蹄疫VP1蛋白疫苗。
实施例2、动物免疫实验
抗原及佐剂的配制：
1、146S抗原的制备：去除牛口蹄疫O型灭活疫苗(购自兰州兽医研究所)中的矿物油，4℃保存。
2、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原的制备：去除购自哈尔滨兽医研究所的生殖与呼吸综合症病毒灭活疫苗中的矿物油，4℃保存。
3、灭活的Lasota新城疫病毒抗原购自于北京生物制品厂，4℃保存。
4、VP1蛋白：纯化后的VP1蛋白质溶于0.9％生理盐水中，4℃保存。
5、灭活禽流感病毒H5N1疫苗(购买于哈尔滨兽医研究所)除去乳剂，4℃保存。
6、注射用白油购自中国石化集团杭州炼油厂。
7、皂素(Saponin)购自美国Sigma公司。
8、左旋咪唑衍生物盐酸左旋咪唑、或磷酸左旋咪唑(南京白敬义制药厂)。
以上抗原，用Bradford法进行蛋白定量。
使用时，以上抗原和本发明的佐剂均溶于0.9％的NaCl水溶液(生理盐水)中。
一、小鼠免疫实验
1、小白鼠抗口蹄疫抗体时效的检测
将盐酸左旋咪唑溶于0.9％NaCl溶液中，配置成以下浓度的佐剂：0.5％盐酸左旋咪唑、1％盐酸左旋咪唑、1％注射用白油+1％盐酸左旋咪唑、5％注射用白油+1％盐酸左旋咪唑、1％甘油+1％盐酸左旋咪唑、5％甘油+1％盐酸左旋咪唑、0.5％油酸+1％盐酸左旋咪唑、0.5％双十八烷基二甲基溴化铵+1％盐酸左旋咪唑、1％双十八烷基二甲基溴化铵+1％盐酸左旋咪唑、0.5％皂素+1％盐酸左旋咪唑、1％皂素+1％盐酸左旋咪唑。将6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠(14组，每组6只，含空白对照组和阴性对照组)，阴性对照组组肌肉注射1％注射用白油和含20微克146S抗原的组合物100微升，空白对照组注射0.9％NaCl溶液100微升，其余12组分别肌肉注射含20微克146S抗原与上述不同佐剂的组合物100微升，第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14、28、56和80天取血清用ELISA法测定其抗体滴度，检测方法为：将96孔酶标板用8ug/ml抗原包被，4℃过夜，3％小牛血清37℃封闭1h；PBST(0.05％Tween20溶于PBS)洗涤3次，每次5分钟；加入不低于1∶100稀释度的免疫动物(小鼠)血清，以未免疫的小鼠血清作对照，37℃孵育2小时；PBST洗板三次后，每孔辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(二抗，Sigma，St.Louis)100μl，37℃孵育1小时后弃去，PBST洗涤3次，每次5分钟；PBST洗三次，加入底物TMB液100μl，室温显色反应30分钟，2M硫酸中止反应，用酶标仪测定OD450/620光密度值，实验孔的OD值达到对照孔OD值的两倍时认为是阳性。结果如表1所示：
表1抗口蹄疫抗体滴度的时效变化
  免疫佐剂组   14天   28天   56天   80天
  未免疫   0   0   0   0
  1％注射用白油   2000   4000   8000   4000
  0.5％盐酸左旋咪唑   4000   4000   8000   4000
  1％盐酸左旋咪唑   4000   4000   8000   8000
  1％注射用白油+1％盐酸左旋咪唑   4000   4000   8000   8000
  5％注射用白油+1％盐酸左旋咪唑   4000   4000   8000   16000
  1％甘油+1％盐酸左旋咪唑   4000   4000   8000   8000
  5％甘油+1％盐酸左旋咪唑   4000   4000   16000   16000
  0.5％油酸+1％盐酸左旋咪唑   4000   4000   8000   8000
  0.5％双十八烷基二甲基溴化铵+1％盐酸左旋咪唑   4000   8000   32000   16000
  免疫佐剂组   14天   28天   56天   80天
  1％双十八烷基二甲基溴化铵+1％盐酸左旋咪唑   4000   8000   32000   32000
  0.5％皂素+1％盐酸左旋咪唑   4000   8000   16000   16000
  1％皂素+1％盐酸左旋咪唑   4000   8000   32000   16000
表1表明，利用盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑+注射用白油、盐酸左旋咪唑+甘油、盐酸左旋咪唑+双十八烷基二甲基溴化铵、盐酸左旋咪唑+皂素为佐剂，与传统的矿物油佐剂(注射用白油)相比抗体滴度在时效上明显提高，且抗体滴度出现早。
2、比较SuperY/VP1重组质粒表达产物VP1抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠产生抗体滴度的变化
将24只6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠均分两组，一组肌肉注射含1％盐酸左旋咪唑与实施例一获得的牛口蹄疫VP1蛋白(20微克)的组合物100微升，另一组肌肉注射含1％注射用白油和20微克牛口蹄疫VP1蛋白的组合物100微升进行免疫，第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14、28、42和56天取血清用ELISA法测定其抗体滴度，检测方法与步骤1相同，结果如图5所示(◇：牛口蹄疫VP1蛋白+1％注射用白油，○：VP1蛋白+1％盐酸左旋咪唑)，表明盐酸左旋咪唑或油佐剂与VP1蛋白的组合疫苗均能刺激特异性抗体产生，但以盐酸左旋咪唑为佐剂的疫苗抗体滴度较高。
3、比较口蹄疫146S抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠产生T细胞特异性扩增的影响
将60只6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠均分两组，第一组肌肉注射含50％注射用白油和20微克146S抗原的疫苗组合物100微升；第二组肌肉注射含20微克抗原146S和1％盐酸左旋咪唑的组合物100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾脏T细胞测定其T细胞扩增活性，具体方法为：在无菌条件下，取脾制成单个细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，然后用PBS液洗三次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×106个/ml，将每组细胞悬液分三份加入96孔培养板中。其中一份加入100μl刀豆蛋白(Con-A)至终浓度为5μg/ml，一份加入相应的特异性抗原(146S抗原)作为刺激物至终浓度为2μg/ml，另一份不加刺激物，24小时后，每孔加入100μl MTT至终浓度为5mg/ml，48h后，每孔加入100μl SDS-DMSO(20％SDS溶于50％DMSO，pH2.0)，使其完全溶解，孵育4h后，在酶标仪上读取570nm处的OD值，计算刺激指数(SI＝实验刺激数÷非刺激数)。结果如图6所示，表明利用盐酸左旋咪唑作为口蹄疫病毒灭活疫苗的佐剂，与其相应的油佐剂疫苗相比，其T细胞扩增活性明显提高于其油佐剂灭活疫苗。图6中，ConA表示阳性对照。
4、比较猪生殖与呼吸综合征病毒抗原与不同佐剂形成免疫组合物后免疫小鼠产生抗体的影响
将60只6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠均分为五组，每组分别肌肉注射含20微克猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和下述佐剂之一的组合物100微升进行免疫，所述佐剂为：50％注射用白油、0.5％盐酸左旋咪唑、1％盐酸左旋咪唑、2％盐酸左旋咪唑或1％盐酸左旋咪唑+0.5％甘油。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第28、42、56、63、77和84天取血清用ELISA法测定其抗体滴度，检测方法与步骤1相同，结果如图7所示，表明利用不同浓度的盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑+甘油为佐剂，与传统的注射用白油佐剂相比抗体滴度在时效上明显提高。
5、比较猪生殖与呼吸综合征病毒抗原与不同佐剂形成免疫组合物后免疫小鼠T细胞特异性扩增的影响
将72只6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠均分为七组，分别肌肉注射含20微克生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和下述其中一种佐剂的组合物100微升，所述佐剂为：无佐剂，50％注射用白油，0.25％盐酸左旋咪唑，0.5％盐酸左旋咪唑、1％盐酸左旋咪唑、2％盐酸左旋咪唑、1％盐酸左旋咪唑+0.5％甘油。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾脏T细胞测定其T细胞扩增活性，具体方法除刺激物为猪生殖与呼吸综合征病毒抗原外，其它与步骤3相同，结果如图8所示，表明用不同浓度的盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑+甘油为佐剂，与传统的注射用白油佐剂相比T细胞扩增活性明显提高。图8中，BSA表示阴性刺激物对照，none表示无佐剂，oil表示50％注射用白油，LMS表示盐酸左旋咪唑。
6、比较猪生殖呼吸综合征病毒抗原与不同佐剂形成免疫组合物后免疫小鼠迟发性免疫反应的影响
将60只6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠均分为五组，每组分别肌肉注射含20微克猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗原和下述其中一种佐剂的组合物100微升进行免疫，所述佐剂为：50％注射用白油、0.5％盐酸左旋咪唑、1％盐酸左旋咪唑、2％盐酸左旋咪唑、1％盐酸左旋咪唑+0.5％甘油。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第7天在小白鼠左脚掌内注射20微克猪生殖呼吸综合征病毒抗原，右脚掌内注射生理盐水，于脚掌注射后0，24，36和72小时测定其脚掌厚度，结果如图9所示，表明利用不同浓度的盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑+甘油为佐剂，与传统的矿物油佐剂相比其迟发性免疫反应相当，但比注射生理盐水对照明显提高。
7、抗体效价的检测、不同佐剂的免疫组合物对小鼠T细胞特异性扩增的影响、免疫小鼠细胞因子的表达
实验分BALB/c小鼠(126只)和C57BL/6小鼠(126只)两大组，所用小鼠免疫抗原分别为口蹄疫(FMD)灭活病毒抗原146S和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原。每大组再分为1，2，3，4，5，6和7组共七个处理组，每组18只小鼠，其中9只免疫146S抗原，9只免疫猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒抗原，1组为对照组，只注射100微升含20微克小鼠免疫抗原的0.9％NaCl溶液；2组注射含20微克小鼠免疫抗原和50％注射用白油组合物100微升；3组肌肉注射含20微克小鼠免疫抗原和0.25％盐酸左旋咪唑组合物100微升；4组肌肉注射含20微克小鼠免疫抗原和0.5％盐酸左旋咪唑组合物100微升；5组肌肉注射含20微克小鼠免疫抗原和1％盐酸左旋咪唑组合物100微升；6组肌肉注射含20微克小鼠免疫抗原和2％盐酸左旋咪唑组合物100微升；7组肌肉注射含20微克小鼠免疫抗原和1％盐酸左旋咪唑+1％甘油组合物100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，每组取3只进行小白鼠抗口蹄疫抗体和猪生殖与呼吸综合征灭活病毒抗体效价的检测；每组再取3只小鼠测定以上组合物对T细胞特异性扩增的影响；对每组余下的3只小鼠用RT-PCR方法检测细胞因子、MHC、共刺激分子和SOCS的表达，具体方法如下：
于第一次免疫后第28、42、56、70和84天，分别从每组中取出3只小鼠的血清用ELISA法测定其血清IgG水平，检测方法与步骤1相同，结果如表2所示：
表2抗体效价结果
Figure G42274819150141000D000101
Figure G42274819150141000D000111
表中的*表示p＜0.05。
表2表明2％盐酸左旋咪唑组和1％盐酸左旋咪唑+1％甘油组合物组抗体滴度显著地高于注射用白油佐剂组，同时在1％盐酸左旋咪唑+1％甘油组合物组抗体延长时间最长。而其它浓度盐酸左旋咪唑组的抗体滴度与注射用白油组佐剂组相当。
于加强免疫后第7天每组分别取3只免疫146S抗原、3只免疫猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒抗原的小鼠，取脾脏T细胞测定其T细胞扩增活性，具体方法除刺激物为猪生殖与呼吸综合征病毒或146S抗原外，其它与步骤3相同，结果如图10-图13所示，表明用不同浓度的盐酸左旋咪唑作佐剂组与传统的注射用白油组佐剂组相比，T细胞扩增活性明显提高。图10-图13中的*表示p＜0.05。
于第二次免疫后第7天取脾脏，提取总RNA(TRIZOL，鼎国生物公司)，反转录为cDNA，反转录依照大连宝生物公司RNA RT-PCR操作指南，取纯化的1μg总RNA置250μL离心管中，然后依次加入相关试剂：4μl MgCl2，2μl 10×缓冲液，8.5μl DEPC水，2μl dNTP混合物，0.5μl RNase inhibitor，0.5μl M-MLV反转录酶(Promage)，0.5μL Oligo(dT)12引物；反应条件为42℃30min，99℃5min，5℃5min。用看家基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)为内源表达标准，将各组cDNA浓度调为一致，如图14所示(泳道1-7分别为1-7处理组)，然后取2μl的cDNA进行PCR扩增以下四种细胞因子基因：IL-2基因，IFN-γ基因，IL-4基因和IL-10基因。其中，反应所需引物和PCR反应条件如表3所示。(由于看家基因HPRT在体内恒定表达，以它为内源表达标准的模板对照)
表3.HPRT，IL-2，IFN-γ，IL-4和IL-10的引物序列及PCR反应参数
  目的基因   引物   反应条件
  HPRT   5′GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG3′GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT   94℃30sec，60℃30sec and72℃40sec
  IL-2   5′TCCACTTCAAGCTCTACAG3′GAGTCAAATCCAGAACATGCC   94℃30sec，55℃30sec and72℃40sec
  IFN-γ   5′CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG3′CTCATGGAATGCATCCTTTTTCG   94℃30sec，58℃30sec and72℃40sec
  IL-4   5′GAAAGAGACCTTGACACAGCTG3′GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG   94℃30sec，54℃30sec and72℃40sec
  IL-10   5′CCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATG3′TGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA   94℃30sec，56℃30sec and72℃40sec
电泳检测PCR产物结果如图15所示(泳道1-7分别为1-7处理组)，将电泳图用Bio-Rad Image软件(Quantity One 4.2.0)分析作图，结果如图16-图18所示，表明0.5％或0.25％盐酸左旋咪唑佐剂组免疫后可以产生高水平的IL-2和IFN-γ(Th1型免疫反应)，而低水平的IL-4(Th2型免疫反应)和IL-10(免疫抑制因子)。相反，2％盐酸左旋咪唑佐剂组免疫后产生高水平的IL-4和IL-10，但低水平的IL-2和IFN-γ。而在注射用白油组佐剂组产生低水平的Th1和Th2细胞因子。但是却产生了高水平的IL-10。说明注射用白油组佐剂组不仅未能激活T细胞，反而产生了抑制T细胞水平的IL-10。
以上一段合成的2μl cDNA为模板PCR扩增MHCI、MHCII、CD40、CD80、CD86、SOCS1和SOCS3基因。引物序列及PCR反应条件如表4所示，电泳检测结果如图19所示(泳道1-7分别为1-7处理组)，将电泳图用Bio-Rad Image软件(QuantityOne 4.2.0)分析作图，结果如图19-图26所示，表明盐酸左旋咪唑佐剂组免疫后可以产生高水平的MHC-I和MHC-II。相反，MHC-I和MHC-II表达在注射用白油组佐剂组为最低。由于MHC分子在免疫T细胞激活过程中起到重要作用，而白油组佐剂在此过程中同样未能起到作用。另外一类共刺激分子CD40，CD80，和CD86在0.5％盐酸左旋咪唑组合物组免疫后产生了高水平的表达，说明0.5％盐酸左旋咪唑在增强T细胞免疫中，效果较好。而白油组佐剂组最差。由于SOCS1和SOCS3都为T细胞免疫抑制分子，在实验中证明白油组佐剂组免疫后产生了高水平SOCS1和SOCS3的表达，进一步说明，注射用白油组佐剂抑制T细胞激活。
表4MHC、共刺激分子和SOCS的引物序列及PCR反应参数
目的基因 引物 PCR反应参数   基因长度(bp)
MHCI   5’TGGAACGGCAGACCTAGACT 3’GCTGAAGACTGACCTCAGGG   94℃40sec，60℃30secand 72℃40sec 402
MHCII   5’AACAAGGAGAAGACGGCTCA3’CGGGTTCTGCTCTAATGC 94℃40sec，60℃30secand 72℃40sec 319
CD40   5’ACTCAGGCGAATTCTCAGC3’CCAGGGATGACAGACGGTA 94℃40sec，60℃30secand 72℃40sec 252
CD80   5’AGTGGCTTTTGCTCTTTGGA 3’GATTCTGGTCCCGTTGAGAA   94℃40sec，60℃30secand 72℃40sec 362
  CD86   5’GTCTGGAGAATGCTGTGCAA 3’GCTCAGACCTGCCAAAGTTC   94℃40sec，60℃30secand 72℃40sec 467
SOCS1   5’GAGCCCTCCTCGTCCTCGTCT3’GATGCGCTGGCGACACAG 94℃40sec，64℃30sec and 72℃40sec 480
目的基因 引物 PCR反应参数   基因长度(bp)
SOCS3   5’GCGCCACTTCTTCACGTTG3’TGATCCAGGAACTCCCGAATG 94℃40sec，59℃30sec and 72℃40sec 432
二、牛抗口蹄疫抗体的检测
将6个月龄的公牛，分为五组，每组2只，第一组为对照组，不注射任何物质；第二组肌肉注射含50微克146S抗原和50％注射用白油的组合物100微升；第三组肌肉注射含50微克146S抗原和5％左旋咪唑的组合物100微升；第四组肌肉注射含50微克VP1蛋白和50％注射用白油的组合物100微升；第五组肌肉注射含50微克VP1蛋白和5％左旋咪唑的组合物100微升。在第14天再以同等剂量加强免疫一次。第二次免疫后第14天取血清测定其抗体滴度，结果如表5所示：
表5牛抗口蹄疫抗体滴度
  免疫组   IgG滴度
  正常牛   0
  50％注射用白油+146S抗原   160
  5％左旋咪唑+146S抗原   320
  50％注射用白油+VP1蛋白   40
  5％左旋咪唑+VP1蛋白   80
表5表明，用左旋咪唑作为牛抗口蹄疫疫苗的佐剂比传统的矿物油作佐剂抗体滴度有明显提高。
三、鸡免疫实验
下述步骤中将购自于北京生物制品厂的Lasota新城疫病毒抗原经甲醛灭活后作为免疫用的Lasota新城疫病毒抗原。
1、鸡抗新城疫抗体时效的检测：
将SPF鸡，分为六组，每组六只，第一组为空白对照组，只注射100微升0.9％的NaCl水溶液；第二组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原，2％盐酸左旋咪唑和0.1％双十八烷基二甲基溴化铵的组合物100微升；第三组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原，2％盐酸左旋咪唑和0.5％双十八烷基二甲基溴化铵的组合物100微升；第四组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原，2％盐酸左旋咪唑和1％双十八烷基二甲基溴化铵的组合物100微升；第五组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原，2％盐酸左旋咪唑和2％皂素的组合物100微升；第六组肌肉注射鸡抗新城疫的注射用白油佐剂商品苗(含50％的注射用白油，北京生物制品厂购买)100微升。在第14天再以同等剂量加强免疫一次，第二次免疫后第14天取血清测定其抗体血凝价，结果如表6所示：
表6鸡抗新城疫抗体滴度
组别   二免后14天的血凝抑制效价
  生理盐水   2<sup>2.2</sup>
  Lasota+2％盐酸左旋咪唑+0.1％双十八烷基二甲基溴化铵   2<sup>4.6</sup>
  Lasota+2％盐酸左旋咪唑+0.5％双十八烷基二甲基溴化铵   2<sup>5.8</sup>
  Lasota+2％盐酸左旋咪唑+1％双十八烷基二甲基溴化铵   2<sup>5.4</sup>
  Lasota+2％盐酸左旋咪唑+2％皂素   2<sup>6</sup>
  新城疫Lasota病毒注射用白油佐剂商品苗   2<sup>6.2</sup>
表6表明，用盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑+双十八烷基二甲基溴化铵、盐酸左旋咪唑+皂素作为鸡抗新城疫疫苗的佐剂，与传统的矿物油佐剂相比抗体滴度相似。
其中，鸡抗体血凝抑制效价(HI)检测方法如下：在微量凝集板上两排孔中，都从第1-12孔或根据抗血清效价需的孔数，每孔加进0.025ml生理盐水；第1排第1孔分别加进未知血清0.025ml，依次倍量稀释到最后一孔，每孔加进含有4个凝集单位的已知病毒液。第2排第1孔分别加进PBS 0.025ml，依次倍量稀释到最后一孔，每孔加进含有4个凝集单位的已知病毒液。震荡混匀，室温下30min后，能被未知血清抑制，判断为血清中的HI滴度。
2、鸡抗新城疫抗体时效的检测
将SPF鸡，分为六组，每组六只，第一组为阴性对照组，只注射100微升0.9％的NaCl水溶液；第二组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原的水溶液100微升；第三组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原和2％左旋咪唑的免疫组合物100微升；第四组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原和4％左旋咪唑的免疫组合物100微升；第五组肌肉注射鸡抗新城疫的注射用白油佐剂商品苗(含50％的注射用白油，北京生物制品厂购买)100微升，第六组肌肉注射4％左旋咪唑100微升。在第14天再以同等剂量加强免疫一次，第二次免疫后第28、60天取血清测定其抗体血凝价，结果如表7所示：
表7鸡抗新城疫抗体时效的检测结果
  实验组   28天血   60天血凝价
  生理盐水   2<sup>1</sup>   2<sup>1</sup>
  Lasota灭活病毒   2<sup>3.7</sup>   2<sup>2</sup>
  Lasota灭活病毒+2％左旋咪唑   2<sup>4.7</sup>   2<sup>4</sup>
  Lasota灭活病毒+4％左旋咪唑   2<sup>4</sup>   2<sup>4</sup>
  Lasota灭活病毒的油佐剂商品苗   2<sup>6.9</sup>   2<sup>4</sup>
  4％左旋咪唑   2<sup>1</sup>   2<sup>1</sup>
表7表明，用左旋咪唑作为鸡抗新城疫疫苗的佐剂，与传统的矿物油佐剂相比抗体滴度在时效上下降不明显。
3、鸡新城疫免疫后T细胞的检测
将SPF鸡，分为六组，每组六只，第一组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原，2％盐酸左旋咪唑和0.5％双十八烷基二甲基溴化铵的组合物100微升；第二组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原，2％盐酸左旋咪唑和2％皂素的组合物100微升；第三组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原；第四组肌肉注射含2％盐酸左旋咪唑和0.5％双十八烷基二甲基溴化铵的组合物100微升；第五组肌肉注射含2％盐酸左旋咪唑和2％皂素的组合物100微升；第六组肌肉注射鸡抗新城疫的注射用白油佐剂商品苗(含50％的注射用白油，北京生物制品厂购买)100微升。第一次免疫后第14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾脏T细胞测定其T细胞扩增活性，具体方法为：在无菌条件下，取脾制成单个细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，然后用PBS液洗三次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×106个/ml，将每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中一份加入100μl Con A至终浓度为5μg/ml，一份加入相应的特异性抗原(Lasota灭活病毒抗原)作为刺激物至终浓度为2μg/ml，一份加入100μl BSA至终浓度为2μg/ml作为无关抗原，另一份不加刺激物，24小时后，每孔加入100μl MTT至终浓度为5mg/ml，48h后，每孔加入100μl SDS-DMSO(20％SDS溶于50％DMSO，pH2.0)，使其完全溶解，孵育4h后，在酶标仪上读取570nm处的OD值，计算刺激指数SI。结果如图27所示，表明利用2％盐酸左旋咪唑和0.5％双十八烷基二甲基溴化铵或2％盐酸左旋咪唑和2％皂素的组合物作为Lasota灭活病毒疫苗的佐剂，与其相应的油佐剂疫苗相比，T细胞扩增活性明显提高于其油佐剂灭活疫苗。图27中纵坐标为SI刺激指数，横轴上，1表示ConA刺激组为阳性对照；2表示第一组免疫后的T细胞扩增活性；3表示第二组免疫后的T细胞扩增活性；4表示第三组免疫后的T细胞扩增活性；5表示第四组免疫后的T细胞扩增活性；6表示第五组免疫后的T细胞扩增活性；7表示第六组免疫后的T细胞扩增活性。
4、鸡新城疫攻毒保护实验
将SPF鸡，分为六组，每组四只，第一组为阴性对照组，只注射100微升0.9％的NaCl水溶液；第二组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原和1％磷酸左旋咪唑的免疫组合物100微升；第三组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原和2％磷酸左旋咪唑的免疫组合物100微升；第四组肌肉注射含20微克Lasota新城疫病毒抗原和4％磷酸左旋咪唑的免疫组合物100微升；第五组肌肉注射鸡抗新城疫白油佐剂的商品苗(含50％的注射用白油，北京生物制品厂购买)100微升，第六组肌肉注射4％磷酸左旋咪唑100微升。在第14天再以同等剂量加强免疫一次，第二次免疫后第14天取血清测定其抗体血凝价并用1000个半致死量的新城疫Lasota毒株0.2ml(即稀释2×10-9病毒)对鸡进行攻毒，攻毒7天后统计结果，如表8所示：
表8鸡新城疫攻毒保护实验结果
免疫剂量   二免后14天血凝价   二免后14天攻毒后保护率
  生理盐水   2<sup>1</sup>   1/4(25％)
  Lasota+1％磷酸左旋咪唑   2<sup>6.5</sup>   4/4(100％)
  Lasota+2％磷酸左旋咪唑   2<sup>7</sup>   4/4(100％)
  Lasota+4％磷酸左旋咪唑   2<sup>5.5</sup>   4/4(100％)
  鸡抗新城疫的注射用白油佐剂商品苗   2<sup>4.5</sup>   2/4(50％)
  4％磷酸左旋咪唑   2<sup>2</sup>   1/4(25％)
表8表明，用磷酸左旋咪唑作为鸡抗新城疫疫苗的佐剂比传统的矿物油佐剂保护率高，都为100％，而白油佐剂商品苗只为50％。其中，保护率＝(成活数/总数)×100％。
5、鸡抗禽流感H5N1抗体时效的检测
将SPF鸡，分为三组，每组6只，第一组为阴性对照组，只注射100微升生理盐水；第二组肌肉注射灭活禽流感病毒H5N1疫苗(含50％的注射用白油，购自于哈尔滨兽医研究所)100微升；第三组肌肉注射含5微克除去乳剂的灭活禽流感病毒H5N1疫苗和5％盐酸左旋咪唑的组合物100微升。在第21天再以同等剂量加强免疫一次。第一次和第二次免疫后第7天取血清测定其抗体滴度，结果如表9所示：
表9抗禽流感H5N1抗体滴度的时效变化
Figure G42274819150141000D000171
表9表明，用盐酸左旋咪唑作为禽流感病毒H5N1疫苗的佐剂与传统矿物油作佐剂的抗体滴度相似。
6、禽流感H5N1攻毒保护实验
禽流感病毒H5N1经甲醛灭活后，分成两份，一份与5％注射用白油乳化后制成传统的矿物油油疫苗；另一份与5％的盐酸左旋咪唑为佐剂混合后制成疫苗。将SPF鸡，分为三组(每组10只鸡)，第一组肌肉注射100微升上述禽流感病毒H5N1矿物油疫苗；第二组肌肉注射含5微克灭活禽流感病毒H5N1抗原和5％盐酸左旋咪唑的组合物100微升；第三组为对照组，注射100微升5％盐酸左旋咪唑。70天后，用100倍的病毒半致死量的禽流感病毒即0.1毫升2×10-9稀释的病毒对鸡进行攻毒，结果如表10所示：
表10禽流感H5N1攻毒保护实验结果
  组别   免疫后70天攻毒保护率
  禽流感病毒H5N1矿物油疫苗   6/10(60％)
  5％盐酸左旋咪唑疫苗   9/10(90％)
  5％盐酸左旋咪唑   0/10(0％)
表10表明，用盐酸左旋咪唑作为鸡抗禽流感H5N1疫苗的佐剂比传统的矿物油佐剂保护率高。
工业应用
本发明的免疫佐剂能够有效地提高蛋白质疫苗，核酸疫苗，多肽疫苗和灭活疫苗激发机体完全免疫反应的能力，增强机体T细胞的免疫效果，延长保护期；本发明免疫佐剂的制备方法简单无需复杂的设备和操作步骤，易于实施，在医学领域中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。

Claims (1)

1.一种蛋白质疫苗的免疫佐剂，是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与双十八烷基二甲基溴化铵组成的组合物；所述左旋咪唑衍生物为盐酸左旋咪唑或磷酸左旋咪唑；其中，所述蛋白质疫苗为牛口蹄疫O型灭活疫苗；所述双十八烷基二甲基溴化铵与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为1∶1。
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