ES2961965T3 - Composiciones adyuvantes y procedimientos relacionados - Google Patents

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Mary Ann Pfannenstiel
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Abstract

La presente divulgación proporciona una composición adyuvante que es adecuada para administración inyectable y transdérmica. La composición adyuvante generalmente comprende un lipófilo, un polímero de ácido acrílico o metacrílico, solución salina, colesterol, una saponina e hidróxido de sodio. También se proporciona una composición de vacuna que generalmente incluye la composición de vacuna de la presente divulgación y un antígeno. También se proporciona un método para vacunar animales y humanos utilizando la composición adyuvante de la presente divulgación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones adyuvantes y procedimientos relacionados
SECTOR DE LA INVENCIÓN
El sector de la presente invención se refiere a composiciones adyuvantes para su utilización en preparaciones biofarmacéuticas. Los adyuvantes son particularmente adecuados para su utilización con preparaciones biofarmacéuticas que se absorben a través de la piel o se inyectan en el receptor.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los adyuvantes tienen el potencial de determinar o, como mínimo, influir en el éxito o fracaso de las composiciones de vacunas. Adicionalmente, los adyuvantes a menudo determinan o aumentan el procedimiento de administración de un antígeno determinado. Todas las vías de administración de la vacuna se podrían beneficiar de una mayor eficacia y una formulación controlada, incluida la capacidad de utilizar menos antígeno y seguir recibiendo la misma o mejor respuesta inmunógena en el animal. La administración transdérmica tiene diversas ventajas en comparación con otras vías de administración, debido a la facilidad de administración y a la menor cantidad de estrés que se ejerce sobre el receptor. La administración transdérmica es ventajosa para los animales, incluidos los cerdos, debido a la capacidad del granjero de administrar fácilmente una vacuna a un gran grupo de animales con un estrés mínimo para el animal y el granjero. Los procedimientos de administración sin aguja o formas de inoculación distintas a la utilización de agujas se han convertido en una opción para la administración exitosa a grandes grupos de animales sin causarles un estrés excesivo. Esta vía de administración también es más humanitaria. La administración transdérmica también es ventajosa para niños y ancianos que habitualmente son resistentes a otros modos de administración de vacunas. Los procedimientos para la administración transdérmica están cada vez más disponibles; sin embargo, los adyuvantes adecuados para dicha administración no están ampliamente disponibles. Además, las composiciones adyuvantes que incorporan lecitina son comunes y estos adyuvantes no siempre son adecuados para todas las posibles vías de administración y para ciertos tipos de antígenos, cuando se utilizan en diferentes especies, incluidos los cerdos. Al igual que con otras vías de administración, la administración transdérmica se podría beneficiar de una eficacia mejorada y una formulación controlada, tal como se ha descrito anteriormente. Adicionalmente, todas las vías de administración, entre las que se incluyen las vacunas transdérmicas e inyectables (intravenosa (IV), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM) y subcutánea (SC)), se podrían beneficiar de una mejor aparición y duración de la inmunidad, así como de una formulación controlada. Lo que se necesita en la técnica son composiciones adyuvantes que se puedan formular para adaptarse al antígeno y la vía de administración y particularmente a aquellas vías de administración que no se utilizan de manera tan común debido a su eficacia, tales como la transdérmica. También se necesitan en la técnica composiciones adyuvantes adecuadas para animales que puedan utilizar formulaciones con componentes distintos a la lecitina. Finalmente, también se necesitan en la técnica composiciones con capacidad mejorada, tal como aparición y duración de la inmunidad, que no incorporen lecitina.
La Patente US 5961970 describe emulsiones submicrónicas como adyuvantes de vacunas. La Patente WO 2013/138334 describe composiciones adyuvantes y de vacunas. Antu K Dey et al, vol.30, n.° 17, págs. 2749-2759 describe composiciones de antígenos y adyuvantes para proporcionar inmunidad contra el VIH-1.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
La presente invención supera los problemas inherentes a la técnica anterior y da a conocer composiciones adyuvantes y composiciones de vacunas adecuadas para su utilización en animales, incluidos cerdos. La presente invención da a conocer adicionalmente procedimientos relacionados con dichas composiciones adyuvantes y de vacunas. Las composiciones adyuvantes de la presente invención también son especialmente adecuadas para su utilización con preparaciones farmacéuticas que se absorben a través de la dermis y mejoran aún más las preparaciones utilizadas en vías convencionales, tales como intravenosa (IV), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM) y subcutánea (SC). Los adyuvantes de la presente invención también son especialmente útiles en técnicas de administración sin aguja. Además, no incluyen lecitina.
Las composiciones adyuvantes de la presente invención son particularmente adecuadas para técnicas de administración sin aguja, tales como administración transdérmica, dado que permiten o mejoran la capacidad de antígenos, que normalmente tienen dificultades para ser absorbidos transdérmicamente, para absorberse a través de la piel del receptor. Esto tiene diversas ventajas en los animales, entre las que se incluye un menor estrés para el animal durante la vacunación. Con respecto a los seres humanos, esto resulta ventajoso en su utilización con niños y pacientes de edad avanzada que puedan resistirse a otros tipos de vías de administración. Las formulaciones de vacunas que permiten una rápida diseminación desde el sitio pero que tienen la capacidad de absorberse en las poblaciones de células circulantes tienen la ventaja de reducir los hematomas y el decomiso de la carne en el matadero. La presente invención proporciona una mejor utilización de las vías convencionales de vacunación debido a la composición de las composiciones adyuvantes. Las composiciones adyuvantes de la presente invención incluyen la utilización de un lipófilo que es un triglicérido de cadena media, siendo un lipófilo preferente una composición comercialmente conocida como LABRAFAC™ (Gattefossé, Lyon, Francia).
Las composiciones adyuvantes de la presente invención proporcionan, preferentemente, entre un 0,1 % y un 80 % más de absorción o reacción a los antígenos, como una composición inyectable cuando se administra con un antígeno o se combina con el mismo, y a través de la piel cuando se administra con un antígeno o se combina con el mismo. Más preferentemente, la absorción o reacción es, aproximadamente, del 1 % al 80 % mayor, en las que se prevén intervalos y valores tales como 1 % al 80 %, 5 % al 60 %, 10 % al 70 %, 2 % al 18 %, 20 % al 45 %, 5 % al 65 %, 0,1 % al 35 %, 0,5 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 27 %, 30 %, 32 %, 35 %, 37 %, 40 %, 42 %, 45 %, 47 %, 50 %, 52 %, 55 %, 58 %, 60 %, 62 %, 65 %, 67 %, 70 %, 72 %, 75 %, 78 % y el 80 %. Todos los valores de mayor absorción o reacción a los antígenos a través de la piel o como inyectables se comparan con otras composiciones adyuvantes combinadas o administradas con el mismo antígeno.
Cuando se combinan con un antígeno, tal como en una vacuna, las composiciones adyuvantes de la presente invención proporcionan una presentación mejorada de la porción antigénica de la vacuna al sistema inmunitario del receptor de la vacuna. Dicha presentación mejorada se compara con el mismo antígeno cuando se combina con una composición adyuvante que no forma parte de la presente invención. Preferentemente, la presentación mejorada permite la utilización de menos o cantidades menores de antígeno para conseguir el mismo nivel de reacción del sistema inmunitario. El nivel de reacción del sistema inmunitario se puede medir mediante la intensidad de la respuesta, medida por marcadores de respuesta inmunitaria entre los que se incluyen signos clínicos (tales como la reducción de la gravedad y la incidencia de los signos clínicos de la infección) y marcadores biológicos (tales como la serología), o se puede medir mediante la duración de la inmunidad o protección, o combinaciones de estos indicadores de reacción del sistema inmunitario. Aún más preferentemente, la presentación mejorada del antígeno permite la utilización del 95 % de la cantidad de antígeno, más preferentemente, el 90 %, aún más preferentemente, el 85 %, 80 %, 75 %, 60 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,09 %, 0,08 %, 0,07 %, 0,06 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,009, 0,008 %, 0,007 %, 0,006 %, 0,005 %, así como intervalos formados por dos miembros cualesquiera de este grupo, para conseguir el mismo nivel de reacción del sistema inmunitario que el mismo antígeno en combinación con un adyuvante diferente cuando se administra a un animal de la misma especie.
Una ventaja adicional de las composiciones adyuvantes de la presente invención y procedimientos relacionados es que no incluyen lecitina, ya que se ha demostrado que la lecitina no es útil para todos los tipos de antígenos. La composición adyuvante de la presente invención proporciona composiciones adyuvantes eficaces y procedimientos relacionados que no utilizan lecitina y se ha demostrado que proporcionan una respuesta inmunitaria mejorada para antígenos y/o animales para los que la lecitina no induce ni proporciona una respuesta inmunitaria contra o para los mismos.
La composición adyuvante de la presente invención comprende en general un triglicérido de cadena media, un polímero de ácido acrílico o metacrílico, colesterol y una saponina. Se ha demostrado que la composición adyuvante funciona para administración sin aguja, administración dérmica y otras vías de administración.
De manera ventajosa, la composición adyuvante de la presente invención no es virucida ni citotóxica, lo que significa que la composición adyuvante no degrada el antígeno, haciéndolo ineficaz para inducir una respuesta inmunitaria apropiada en un receptor. El adyuvante se puede utilizar para detectar antígenos in vitro. Preferentemente, la actividad virucida del adyuvante tiene una EID50 en cultivo de tejido cuando la concentración de lípidos es inferior al 5 % de lípidos. Los efectos citotóxicos en el cultivo celular varían según el cultivo celular utilizado, pero un intervalo seguro puede ser del 0,025 % al 5 %. Los intervalos preferentes son menos del 5 %, más preferentemente, menos del 4 %, aún más preferentemente, entre el 0,25 % y, aproximadamente, el 3 %, incluso aún más preferentemente, entre el 0,25 %, aproximadamente.
También se describe un procedimiento para preparar la composición adyuvante de la presente invención. El procedimiento incluye, preferentemente, las etapas de combinar los componentes de la composición adyuvante y añadir un agente neutralizante. La etapa de combinar los componentes de la composición adyuvante incluye preferentemente, como mínimo, una emulsión.
La presente invención da a conocer, además, una composición de vacuna que comprende la composición adyuvante de la presente invención y un antígeno. El antígeno puede ser cualquier antígeno adecuado para su utilización como composición o vacuna inmunógena. Preferentemente, la proporción del adyuvante de la presente invención respecto al antígeno es, aproximadamente, 1:20, 1:17, 1:15, 1:12, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1: 6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 y 1:1,5, siendo particularmente preferente 1:5.
Se describe también un procedimiento para vacunar a un animal o a un ser humano. Las etapas del procedimiento incluyen, preferentemente, administrar la composición de vacuna de la presente invención a un receptor que la necesite. La vacuna se puede administrar sin aguja o inyectarse. El receptor es preferentemente un ser humano o un animal, en el que el animal se selecciona entre, sin limitación, vacas, cerdos, caballos, perros, gatos, mulas, ovejas, monos, animales de compañía y otros mamíferos. La composición de vacuna se puede administrar mediante una variedad de procedimientos de administración sin aguja. Entre los procedimientos de administración sin aguja se incluyen, sin limitación, pistolas de vacunas, parches transdérmicos, aerosoles, procedimientos de administración mucosa, procedimientos de adhesión a la piel, proyectiles de partículas secas, proyectiles húmedos, pistolas de partículas de oro/inertes y pistolas neumáticas. Toda referencia a "comprender" o "que comprende" en la presente invención también proporcionará la base para un lenguaje de reivindicación "que consiste esencialmente en" o "que consiste en". Por ejemplo, si la presente invención establece que la composición comprende A y B, se entiende que la composición también puede consistir esencialmente en A y B, o incluso consistir en A y B y cada uno de estos casos se da a conocer completamente como si estuvieran específicamente escritos para cada parte de la presente invención. A cada uno de estos términos se le otorgará su significado habitual cuando se utilicen en el preámbulo de una reivindicación.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Diagrama de diseminación de la excreción orofaríngea de aves vacunadas y de control 2 días después de la exposición;
Figura 2: Diagrama de diseminación de la excreción orofaríngea de aves vacunadas y de control 2 días después de la exposición; y
Figura 3: Gráfico de supervivencia para los animales en la investigación descrita en el ejemplo 5.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La composición adyuvante de la presente invención comprende un triglicérido de cadena media, un polímero de ácido acrílico o metacrílico, colesterol y una saponina. En otras realizaciones, la composición adyuvante comprende además, como mínimo, uno de los siguientes: solución salina, inmunomoduladores, moléculas pequeñas, citocinas, alcohol e hidróxido de sodio.
El lipófilo es un triglicérido de cadena media. Preferentemente, el lipófilo se selecciona entre el grupo que consiste en triglicéridos EP de cadena media, triglicéridos NF de cadena media, triglicéridos JPE de ácidos grasos de cadena media, triglicéridos de caprílico/cáprico y combinaciones de los mismos. En una realización particularmente preferente, el lipófilo es LABRAFAC™ (Gattefossé, Lyon, Francia).
En una realización preferente, el lipófilo está presente en la composición adyuvante de la presente invención en una cantidad de, aproximadamente, el 0,01 % a, aproximadamente, el 5 % del volumen total de la composición, en la que se prevén cantidades entre las que se incluyen 0,1 % al 4,7 %, 0,2 % al 4,5 %, 0,3 al 4,4 %, 0,5 % al 4,3 %, 0,7 % al 4,2 %, 0,9 % al 4,1 %, 1 % al 4 %, 2 % al 4 %, 2 % al 5 %, 3 % al 5 %, el 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1,0 %, 1,1 %, 1,2 % 1,3 %, 1,4 % 1,5 %, 1,6 %, 1,7 %, 1,8 %, 1,9 %, 2 %, 2,2 %, 2,4 %, 2,6 %, 2,8 %, 3,0 %, 3,2 %, 3,4 %, 3,5 %, 3,8 %, 4 %, 4,2 %, 4,5 %, 4,8 % y el 5 % en volumen y todos los intervalos de dos puntos cualesquiera entre ellos. En una realización particularmente preferente, el lipófilo está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 1,8 % en volumen.
El polímero del compuesto de ácido acrílico o metacrílico se selecciona preferentemente entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivados alquenílicos. Entre los ejemplos de dichos compuestos se incluyen los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con polialqueniléteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, N° 2, junio de 1996). Los expertos en la materia también pueden consultar la Patente US 2,909,462, que describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene, como mínimo, 3 grupos hidroxilo, preferentemente, no más de 8, estando sustituidos los átomos de hidrógeno de, como mínimo, tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen, como mínimo, 2 átomos de carbono. Los radicales preferentes son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos insaturados etilénicamente. Los propios radicales insaturados pueden contener otros sustituyentes, tales como por ejemplo metilo. Los productos comercializados bajo el nombre CARBOPOL™; (BF Goodrich, Ohio, EE. UU.) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alil sacarosa o con alil pentaeritritol. Existe una variedad de productos CARBOPOL™ que serían adecuados para su utilización con la presente invención. Un producto particularmente preferente para su utilización es el polímero CARBOPOL™ 974P NF.
En una realización preferente, el polímero de ácido acrílico o metacrílico está presente en la composición adyuvante de la presente invención, preferentemente, en una cantidad de, aproximadamente, el 0,1 % a, aproximadamente, el 3,0 % en volumen, en la que se prevén valores tales como 0,1 % al 1 %, 0,1 % al 1,5 %, 0,5 % al 1 %, 0,5 % al 2 %, 0,5 % al 3 %, el 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 0,94 %, 0,95 %, 0,96 %, 0,97 %, 1,0 %, 1,1 %, 1,2 %, 1,3 %, 1,4 % 1,5 %, 1,6 %, 1,7 %, 1,8 %, 1,9 %, 2 %, 2,2 %, 2.4 %, 2,6 %, 2,8 % y el 3,0 %. En una realización particularmente preferente, el polímero de ácido acrílico o metacrílico está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 0,9 % en volumen.
El componente salino puede ser cualquier solución de cloruro de sodio y agua adecuada para su utilización en una composición adyuvante. Normalmente, solución salina se refiere a una solución del 0,90 % p/v de NaCl, aproximadamente, 300 mOsm/l o 9,0 g por litro; sin embargo, la solución salina para los fines de la presente invención no se limita a esta solución. En una realización particularmente preferente, la solución salina es solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio (Catálogo Cellgro N.° 21-CV). En una realización preferente, la solución salina está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 50 % al 98 % de la composición adyuvante de la presente invención en volumen, en la que se prevén cantidades tales como 60 % al 98 %, 70 % al 98 %, 80 % al 98 %, 90 % al 98 %, el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 91,1 %, 91,2 %, 91,3 %, 91,4 %, 91,5 %, 91,6 %, 91,7 %, 91,8 %, 91,9 %, 92 %, 92,1 %, 92,2 %, 92,3 %, 92,4 %, 92,5 %, 92,6 %, 92,7 %, 92,8 %, 92,9 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % y el 98 %. En una realización particularmente preferente, la solución salina está presente en la composición adyuvante de la presente invención en una cantidad de, aproximadamente, el 92 % en volumen.
El componente alcohólico se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en etanol, isopropanol, butanol y combinaciones de los mismos. En una realización preferente, se utiliza etanol. Preferentemente, el etanol es una solución del 90 % al 100 %; sin embargo, también se podrían utilizar soluciones de etanol del 10 % al 90 % para los fines de la presente invención.
En una realización preferente, el alcohol está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 0,01 % al 3 % de la composición adyuvante de la presente invención, en volumen, en la que se prevén valores tales como el 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 %, 0,1 %, 0,15 %, 0,2 %, 0,25 %, 0,3 %, 0,35 %, 0,4 %, 0,45 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1,0 %, 1,1 %, 1,2 % 1,3 %, 1,4 % 1.5 %, 1,6 %, 1,7 %, 1,8 %, 1,9 %, 2 %, 2,2 %, 2,4 %, 2,6 %, 2,8 % y el 3,0 %. Además, también se prevén intervalos que incorporen dos cualesquiera de los valores descritos. Por ejemplo, 0,01 % al 1 %, 0,01 % al 2 %, 0,3 % al 1 %, 0,3 % al 1,5 %, 0,03 % al 0,07 %, 0,05 % al 2,4 % y 1 % al 1,6 % están todos cubiertos por la presente invención. En una realización particularmente preferente, el alcohol está presente en la composición adyuvante de la presente invención en una cantidad de, aproximadamente, el 0,05 % en volumen. El alcohol es útil para solubilizar la saponina, preferentemente, la Quil A y gran parte o la mayoría (como mínimo, el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o más) se evapora dejando la concentración final del alcohol en el producto final muy baja.
Para los fines de la presente invención, la saponina puede ser cualquiera seleccionada entre la clase de saponinas. En general, las saponinas son una clase de compuestos químicos que se encuentran en particular en abundancia en diversas especies de plantas. Preferentemente, son glucósidos anfipáticos agrupados fenomenológicamente por la espuma similar a un jabón que se produce cuando se agitan en soluciones acuosas, y estructuralmente por tener uno o más restos de glucósido hidrófilos combinados con un derivado de triterpeno lipófilo. En una realización preferente, la saponina se purifica o semipurifica y se liofiliza. Preferentemente, la saponina es un extracto de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molia. De la manera más preferentemente, la saponina es Quil A.
En una realización preferente, la saponina está presente en la composición adyuvante de la presente invención en una cantidad de, aproximadamente, el 0,001 % a, aproximadamente, el 0,5 %, en la que se prevén valores tales como el 0,001 %, 0,002 %, 0,003 %, 0,004 %, 0,005 %, 0,006 %, 0,007 %, 0,008 %, 0,009 %, 0,01 %, 0,015 %, 0,02 %, 0,025 %, 0,03 %, 0,035 %, 0,04 %, 0,045 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 %, 0,1 %, 0,15 %, 0,2 %, 0,25 %, 0,3 %, 0,35 %, 0,4 %, 0,45 % y el 0,5 %. Además, también se prevén intervalos que incluyen dos valores discretos cualesquiera descritos anteriormente. Por ejemplo, la saponina puede estar presente en la composición adyuvante de la presente invención en una cantidad de, aproximadamente, el 0,003 % al 0,01 %, 0,003 % al 0,05 %, 0,01 % al 0,03 %, 0,1 % al 0,5 %, 0,07 % al 0,2 % y similares. En una realización particularmente preferente, la saponina está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 0,009 %.
La composición adyuvante de la presente invención incluye un esterol que es colesterol. Puede estar presente un esterol adicional. Cualquier esterol adicional funcionará para los fines de la presente invención, incluyendo los que se encuentran en plantas, animales y hongos. El esterol se toma preferentemente de una fuente vegetal; sin embargo, el esterol se puede seleccionar entre, sin limitación, fitoesteroles, zooesteroles, campesterol, sitosterol, estigmasterol, ergosterol y combinaciones de los mismos. El colesterol puede ser cualquier fuente de colesterol adecuada para su utilización en una composición adyuvante. El colesterol se deriva, preferentemente, de animales o plantas, de la manera más preferente, el colesterol se deriva de plantas.
En una realización preferente, el colesterol está presente en la composición adyuvante de la presente invención en una cantidad de, aproximadamente, el 0,001 % a, aproximadamente, el 3 % en volumen, en la que se prevén valores tales como 0,005 % al 0,05 %, 0,008 % al 0,008 %, el 0,002 %, 0,003 %, 0,004 %, 0,005 %, 0,006 %, 0,007 %, 0,008 %, 0,009 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1,0 %, 1,1 %, 1,2 %, 1,3 %, 1.4 %, 1,5 %, 1,6 %, 1,7 %, 1,8 %, 1,9 %, 2 %, 2,2 %, 2,4 %, 2,6 %, 2,8 % y el 3,0 %. Además, también se prevén intervalos que incluyan dos cualesquiera de estos volúmenes. En una realización particularmente preferente, el colesterol está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 0,01 % en volumen.
La composición adyuvante de la presente invención comprende, preferentemente, un componente que neutraliza el pH de la composición hasta un pH de, aproximadamente, 6-8, más preferentemente, hasta un pH de 7. Se puede utilizar cualquier neutralizante convencional pero, preferentemente, el neutralizante se selecciona entre el grupo que consiste en hidróxido de sodio, hidróxido de potasio e hidróxido de amonio. En una realización particularmente preferente, el componente que neutraliza el pH de la solución es hidróxido de sodio.
En una realización preferente, el componente que neutraliza el pH de la composición adyuvante está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 0,1 % al 10 %, en la que se prevén valores tales como el 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 1,25 %, 1,5 %, 1,75 %, 2 %, 2,25 %, 2.5 %, 2,75 %, 3 %, 3,25 %, 3,5 %, 3,75 %, 4 %, 4,25 %, 4,5 %, 4,75 %, 5 %, 5,25 %, 5,5 %, 5,75 %, 6 %, 6,25 %, 6,5 %, 6,75 %, 7 %, 7,25 %, 7,5 %, 7,75 %, 8 %, 8,25 %, 8,5 %, 8,75 %, 9 %, 9,25 %, 9,5 %, 9,75 % y el 10 %. Adicionalmente, se prevé también cualquier intervalo que incorpore dos de estos valores, entre los que se incluyen, sin limitación, 2 % al 8 %, 2 % al 6 %, 3 % al 8 %, 4 % al 6 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6 %, 6,5 %, 7 %, 7,5 %, 8 %, 8,5 %, 9 % y 9,5 %. En una realización particularmente preferente, el componente que neutraliza el pH de la composición adyuvante está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 5 % en volumen.
En una realización adicional, la composición adyuvante de la presente invención comprende LABRAFAC™, CARBOPOL™, solución salina, colesterol, etanol, Quil-A e hidróxido de sodio. Aún en una realización adicional, la composición adyuvante de la presente invención comprende LABRAFAC™, CARBOPOL™ 974P, solución salina, colesterol de origen vegetal, etanol, Quil-A e hidróxido de sodio. En otra realización, la composición adyuvante de la presente invención comprende, aproximadamente, el 2 % de LABRAFAC™, en volumen, aproximadamente, el 1,0 % de CARBOPOL™, en volumen, aproximadamente, el 92 % de solución salina, en volumen, aproximadamente, el 0,01 % de colesterol, en volumen, aproximadamente, el 0,5 % de etanol, en volumen, aproximadamente, el 0,09 % de Quil-A, en volumen y, aproximadamente, el 5 % de hidróxido de sodio. Se describe también en el presente documento un procedimiento para preparar la composición adyuvante de la presente invención. En una forma del procedimiento, el procedimiento comprende, preferentemente, las etapas de combinar los componentes de la composición adyuvante, preferentemente mediante emulsión, y añadir una composición que neutralice el pH de la composición adyuvante.
En un ejemplo adicional, el procedimiento para preparar la composición adyuvante de la presente descripción comprende las etapas de mezclar un lipófilo, un polímero de ácido acrílico o metacrílico y una solución salina para formar una composición. Un ejemplo adicional de la presente invención da a conocer adicionalmente la etapa de realizar, como mínimo, una emulsión antes de ajustar el pH de la primera composición.
La presente invención también da a conocer una composición de vacuna. La composición de vacuna comprende la composición adyuvante de la presente invención y uno o más antígenos. La cantidad de composición adyuvante de la presente invención y la cantidad de antígeno, así como la tecnología de producción de antígeno, dependen del procedimiento de administración seleccionado. Los expertos en la materia podrán determinar la proporción apropiada para dichos procedimientos de administración. Preferentemente, la composición adyuvante está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 1 % al 30 %, en volumen, del volumen total de la composición de vacuna, en la que se prevén valores e intervalos tales como 1 % al 25 %, 1 % al 20 %, 1 % al 15 %, 15 % al 30 %, 10 % al 20 %, 10 % al 25 %, 10 % al 20 %, 15 % al 25 %, 20 % al 30 %, el 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % y el 30 %. En una realización particularmente preferente, la composición adyuvante está presente en una cantidad de, aproximadamente, el 20 % en volumen. En una realización alternativa, la proporción de la composición adyuvante de la presente invención respecto a la cantidad de antígeno en la composición de vacuna es tal como se ha dado a conocer anteriormente y, preferentemente, es 1:5.
Preferentemente, los adyuvantes de la presente invención son estables en almacenamiento solos o cuando se mezclan con uno o más antígenos. Preferentemente, la vida útil del adyuvante de la presente invención es estable durante, como mínimo, 4 meses, más preferentemente durante, como mínimo, 5 meses, más preferentemente durante, como mínimo, 6 meses, durante, como mínimo, 12 meses, durante, como mínimo, 18 meses, durante, como mínimo, 24 meses, durante, como mínimo, 36 meses en la que se prevén intervalos tales como 6-18 meses, 6-24 meses, 6-36, 12-24 meses, 12-36 meses, 18-24 meses y 18-36 meses. Preferentemente, los adyuvantes de la presente invención son estables durante estos períodos a temperatura ambiente. Preferentemente, el intervalo de temperatura es de, aproximadamente, 16-26 °C.
La presente descripción da a conocer adicionalmente un procedimiento para vacunar animales o seres humanos. Preferentemente, el procedimiento comprende la etapa de administrar la composición de vacuna de la presente invención a un receptor de la misma. De manera alternativa, el procedimiento de la presente descripción comprende las etapas de combinar el adyuvante de la presente invención con un antígeno para formar una composición y administrar la composición a un animal o ser humano que la necesite. Preferentemente, el antígeno es uno que se utiliza normalmente en una composición inmunógena o en una composición de vacuna y, preferentemente, es capaz de proporcionar una respuesta inmunitaria en el receptor. El receptor es, preferentemente, un ser humano o un animal. En un ejemplo en el que el receptor es un animal, preferentemente, el animal se selecciona entre el grupo que consiste en cerdos, vacas, caballos, perros, gatos, ovejas, mulas, monos, animales de compañía y otros mamíferos.
El antígeno, para los fines de la composición de vacuna de la presente invención, puede ser cualquier antígeno o combinación de antígenos adecuada para inducir una respuesta inmunógena en un receptor. El receptor puede ser un animal o un ser humano. El antígeno, para su utilización en la presente invención, puede ser cualquier antígeno deseado que quede dentro de la definición establecida anteriormente. Los antígenos están disponibles en el mercado o un experto en la materia es capaz de producirlos. En algunas formas preferentes, el resto antigénico que constituye la vacuna puede ser un microorganismo vivo modificado o muerto, o un producto natural purificado a partir de un microorganismo u otra célula, entre los que se incluyen, sin limitación, células tumorales, un producto sintético, una proteína, péptido, polisacárido o producto similar modificado genéticamente, o un alérgeno. El resto antigénico también puede ser una subunidad de una proteína, péptido, polisacárido o producto similar. El antígeno también puede ser los antígenos genéticos, es decir, el ADN o ARN que genera una respuesta inmunitaria. Entre los representantes de los antígenos que se pueden utilizar, según la presente invención, se incluyen, sin limitación, productos naturales, recombinantes o sintéticos derivados de virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos además de antígenos de enfermedades autoinmunitarias, hormonas o tumores, que se podrían utilizar en vacunas y alérgenos profilácticos o terapéuticos. Los productos víricos o bacterianos pueden ser componentes que el organismo produjo mediante escisión enzimática o pueden ser componentes del organismo que se produjeron mediante técnicas de ADN recombinante que son bien conocidas por los expertos en la materia. Debido a la naturaleza de la presente invención y su modo de administración, es muy concebible que la presente invención también funcione como un sistema de administración de medicamentos, tales como hormonas, antibióticos y antivíricos. Entre los ejemplos de antígenos adecuados para su utilización en la composición de vacuna de la presente invención se incluyen, sin limitación, antígenos derivados del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS,Porcine Reproductivo and Respiratory Syndrome); Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo);enteritis proliferativa porcina; virus de la diarrea vírica bovina (BVD,Bovine Viral Diarrhea);enfermedad de frontera, leptospirosis; brucelosis causada por bacterias del géneroBrucella; Clostridium;toxemia tetánica, causada por una neurotoxina específica producida porClostridium tetan; Salmonella spp; Escherichia col;viruela porcina; eperitrozoonosis; peste porcina clásica (CSF,Classical Swine Fever)o peste porcina africana (ASF,African Swine Fever);pasteurelosis neumónica y estreptocócica, causada porPasteurella multociday diversas especies de estreptococos, normalmente S.suis;meningitis estreptocócica; pseudorabia; virus de la gripe porcina; colitis espiroqueta, causada por la bacteriaBrachyspira pilosicol;disentería porcina, causada por la bacteriaBrachyspira hyodysentheriae;coronavirus; parvovirus porcino;Actinobacillus pleuroneumonia;enfermedad de Glassers, causada por la bacteriaHaemophilus parasuis(Hps); epidermitis exudativa, causada por la bacteriaStaphylococcus hyicus;erisipela porcina, causada por una bacteria,Erysipelothrix rhusiopathiae;eperitrozoonosis (Epe), causada por una bacteria llamadaEperythrozoonosis suis;encefalomiocarditis; virus del herpes; infección por citomegalovirus porcino (PCMV,Porcine Cytomegalovirus Infection),causada por un virus del herpes; virus de la encefalitis japonesa B (JE,Japanese B Encephalitis);diarrea epidémica porcina (PED,Porcine Epidemic Diarrhea),causada por un coronavirus; infección por el coronavirus respiratorio porcino (PRCV,Porcine Respiratory Corona Virus);rotavirus; rabia; enfermedad vesicular porcina (SVD,Swine Vesicular Disease);tuberculosis, causada porMycobacterium tuberculosis;virus del exantema vesicular del cerdo (VES,vesicular exanthema of swine);virus de la estomatitis vesicular (VS,Vesicular Stomatitis);y virus de la encefalomielitis equina del este (EEEV,Eastern equine encephalomyelitis viruses).Tal como entienden los expertos en la materia y la utilidad de la vacuna con cualquier tipo de antígeno, la presente invención contempla todas las variaciones del antígeno, incluyendo organismos completos, macromoléculas, subunidades, ácidos nucleicos, proteínas expresadas y combinaciones de los mismos.
El procedimiento de vacunación de la presente descripción incluye, preferentemente, la administración de la composición que comprende el adyuvante de la presente invención y un antígeno, en el que la administración es sin aguja o mediante inyección. Más preferentemente, el procedimiento de administración se selecciona entre el grupo que consiste en tópico, intramuscular, nasal, oral, transdérmico, mucoso y subcutáneo. La composición adyuvante de la presente invención proporciona una ventaja en los procedimientos de administración sin aguja, en los que la administración utiliza la absorción cutánea de antígenos, por lo tanto, en una realización preferente, el procedimiento de administración es transdérmico o mucoso. En un ejemplo adicional, la administración para los fines del procedimiento de la presente invención se realiza mediante un procedimiento de administración sin aguja, tal como una pistola de vacunas; sin embargo, el procedimiento de la presente invención no queda limitado por este ejemplo. La presente invención no se limita a pistolas de vacunas, dado que cualquier procedimiento de administración sin aguja funcionará. Entre los procedimientos de administración sin aguja se incluyen, sin limitación, pistolas de vacunas, parches transdérmicos, aerosoles, procedimientos de administración mucosa, procedimientos de adhesión a la piel, proyectiles de partículas secas, proyectiles húmedos, pistolas de partículas de oro/inertes y pistolas neumáticas.
Además, la presente descripción da a conocer un procedimiento para administrar una composición de vacuna a un cerdo. El procedimiento incluye, preferentemente, la etapa de combinar la composición adyuvante de la presente invención con un antígeno y administrar la composición de vacuna mediante administración transdérmica a un cerdo que la necesite. En un ejemplo particularmente preferente, el procedimiento incluye la etapa de administrar la composición de vacuna de la presente invención a un cerdo mediante administración con pistola de vacunas.
La composición adyuvante de la presente invención es particularmente adecuada para la administración transdérmica, dado que permite que los antígenos que normalmente tienen dificultades para ser absorbidos por vía transdérmica se absorban a través de la piel o la dermis del receptor. Preferentemente, el adyuvante de la presente invención proporciona entre un 0,001 % y un 80 % más de absorción de antígenos a través de la piel, en comparación con otras composiciones adyuvantes.
Debe entenderse que cada limitación numérica máxima dada a conocer en la memoria descriptiva incluye cada limitación numérica inferior, como si estuviera expresamente escrita en el presente documento. Cada limitación numérica mínima dada a conocer en la memoria descriptiva incluye cada limitación superior, como si estuviera expresamente escrita en este documento. Cada intervalo numérico dado a conocer en el presente documento incluye expresamente cada intervalo numérico más estrecho que queda dentro del intervalo numérico más amplio, como si dicho intervalo numérico más estrecho estuviera escrito expresamente en el presente documento.
La composición y los procedimientos dados a conocer en la presente solicitud pueden comprender los elementos esenciales y las limitaciones de la presente invención descrita en el presente documento, así como cualquier ingrediente, componente, etapa o limitación opcional o adicional descrito en el presente documento o útil de otro modo en las composiciones y los procedimientos, tales como los descritos en el presente documento, consistir esencialmente en los mismos o consistir en los mismos.
EJEMPLOS EJEMPLO 1
Este ejemplo ilustra el procedimiento de producción de un adyuvante de ejemplo de los dados a conocer por la presente invención.
Materiales y procedimientos
Los materiales utilizados fueron los siguientes:
A. LABRAFAC™ Lipophile WL1349 (n.° de catálogo Gattefossé 3139)
B. Polímero CARBOPOL® 974P NF (n.° de catálogo de Lubrizol CBP974PNF)
C. Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio (n.° de catálogo Cellgro 21- 031-CV) o equivalente
D. Colesterol de origen vegetal (n.° de catálogo Avanti 700100P)
E. Etanol, solución al 100 % (n.° de catálogo Acros 61509-0010) o equivalente
F. Quil-A, (Saponina Quil-A purificada del catálogo Brenntag, liofilizada)
G. Hidróxido de sodio 5 N (n.° de catálogo VWR BDH3225-1) o equivalente
TABLA 1. Formulación de solución madre de adyuvante 06
Solución madre de colesterol
A continuación, se preparó una solución madre de colesterol añadiendo el colesterol a etanol. A continuación, se mezcló hasta que se disolvió. A continuación, la solución se filtró de forma estéril utilizando un filtro de 0,2 |om. A continuación, la solución se almacenó a 2-7 °C.
Solución madre de Quil-A
A continuación, se preparó una solución madre de Quil-A añadiendo saponina Quil-A a agua RO/DI en la que se mezcló hasta que se disolvió. A continuación, la solución se filtró de forma estéril utilizando un filtro de 0,2 |om. A continuación, la solución se almacenó a 2-7 °C. La solución madre se obtuvo al 4 % como solución madre 5x para Quil-A.
Preparación del adyuvante 06
Se preparó una dilución 1:5 a partir de la solución madre de Quil A, utilizando la solución madre de adyuvante 06, añadiendo 20 ml de Quil A a 80 ml de solución madre de adyuvante 06 y se mezcló mediante agitación. A continuación, se añadieron 56 ml de solución madre de colesterol a la solución madre de adyuvante 06 en masa. A continuación, se añadieron 100 ml de la dilución 1:5 de Quil A a la solución madre de adyuvante 06 en masa restante que ahora contenía 56 ml de la solución madre de colesterol. A continuación, se mezcló la mezcla de adyuvante durante, aproximadamente, 15 minutos. Mientras se mezclaba, el adyuvante se distribuyó asépticamente en frascos de PETG estériles de 60 ml en alícuotas de 50 ml. A continuación, se selló cada frasco con un tapón de rosca. A continuación, los frascos de adyuvante 06 se almacenaron durante no más de dos años a 2-7 °C.
Instrucciones de utilización
Se calculó la cantidad de adyuvante 06 para mezclar con el antígeno; utilizando 1 parte de adyuvante 06 con 4 partes de antígeno. Esto también se hizo en una proporción de 1:9. Sin embargo, se podría hacer fácilmente utilizando una proporción de 1:10 o 1:20.
El envase de adyuvante 06 se debe mezclar bien antes de su utilización. Se extrajo asépticamente una pequeña cantidad de adyuvante 06 con una jeringa estéril y una aguja de calibre 18 y, a continuación, se evacuó para eliminar todo el aire de la jeringa. A continuación, se introdujo de manera constante la cantidad deseada de adyuvante 06 en la jeringa. A continuación, se añadió el volumen medido de adyuvante 06 al antígeno y se mezcló a conciencia.
EJEMPLO 2
El propósito de este estudio fue determinar si dos formulaciones de adyuvantes diferentes, cada una de las cuales es una realización separada de la presente invención, se podrían probar en ratones cuando se diluyen a la concentración prevista para su utilización con vacunas.
Materiales y procedimientos
Se incluyeron también en el estudio dos vacunas deE. coliK99 inactivadas, una con adyuvante añadido y otra preparada en PBS, para determinar si la adición de un antígeno tendría un efecto diferente en los ratones en comparación con la misma formulación adyuvante probada sola.
Se inocularon ratones CF-1 hembras adultas de, aproximadamente, 6 semanas de edad con un peso promedio de 27 g con 0,5 ml de cada una de las cinco formulaciones de adyuvantes diferentes diluidas hasta una concentración final de 1x. También se inocularon ratones con 0,5 ml de cada vacuna deE. coliK99 inactivada. El adyuvante utilizado para preparar la vacuna deE. coliK99 inactivada con adyuvante añadido es la misma formulación que el número de catálogo 70X0106, que contiene la concentración más elevada de todos los ingredientes para esa formulación. Cada grupo de tratamiento consistía en ocho ratones inoculados mediante inyección subcutánea en la parte posterior del cuello o mediante inyección intraperitoneal. Todos los ratones se albergaron durante siete días después de la inoculación y se observó su salud.
Todos los ratones inoculados mediante inyección subcutánea en la parte posterior del cuello parecían estar sanos siete días después de la inoculación; sin embargo, tres de los ocho ratones que recibieron la vacuna deE. coliK99 inactivada con adyuvante añadido exhibieron lesiones en el lugar de la inyección el 7° día del estudio. Como mínimo, seis de los ocho ratones de cada grupo inoculados mediante inyección intraperitoneal murieron entre 24 y 48 horas después de la inoculación.
Animales
Sesenta y cuatro ratones CF-1 hembra procedentes de Charles River Laboratories tenían, aproximadamente, 6 semanas (44 días) de edad en el momento de la administración del artículo de prueba. Al recibirlos, los ratones pesaban una media de 19 gramos. Los ratones se pesaron nuevamente antes de la administración del artículo de prueba el día 0 y pesaron un promedio de 27 gramos.
Artículos de prueba
Adyuvantes
Catálogo VaxLiant 70X0005 - 5x, Lote 00003, Cad. 07oct15
Catálogo VaxLiant 70X0106 - 5x, Lote 00003, Cad. 07oct15
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS); Cellgro, catálogo: 21-031-CV Lote: 21031439 Cad.30sep16
Vacunas de E. coli K99 inactivada
Vacuna que contiene adyuvante C VaxLiant número de catálogo 708101,E. coliinactivada que expresa pili K99 - Lote K9928Dec12A
Vacuna que contiene PBS,E. coliinactivada que expresa pili K99 - Lote K9928Dec12B
Procedimientos
Cronograma del estudio
TABLA 2.r n r m i
Diseño del estudio
TABLA . Di ñ l i
Recepción, aclimatación y aleatorización de animales
Al recibirlos, se pesaron cinco ratones a la vez y cada ratón se colocó en una jaula separada. Este proceso se repitió hasta que se colocaron cuatro ratones por jaula.
Se realizaron observaciones de salud diarias durante el período de aclimatación de siete días.
Las jaulas 1 - 16 se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento T01 - T08 extrayendo dos números de jaula de un contenedor y asignándolos al grupo T01. Los siguientes dos números de jaula sorteados se asignaron al grupo T02 y así sucesivamente hasta que todas las jaulas fueron asignadas a un grupo de tratamiento. Consúltese la tabla 4 para conocer los números de jaula asignados a cada grupo de tratamiento.
TABLA 4. N m r l i n r r mi n
Preparación del artículo de prueba
Toda la preparación del artículo de prueba se realizó asépticamente el día de la administración.
Preparación del adyuvante
Se dejó que el frasco de la solución madre de adyuvante 5x apropiada se calentara hasta temperatura ambiente y, a continuación, se invirtió un mínimo de 30 veces para su mezcla. El adyuvante apropiado se diluyó 1:5 con DPBS (4 partes de DPBS 1 parte de adyuvante) y se mezcló invirtiendo un mínimo de 30 veces. El artículo de prueba preparado se dividió en alícuotas en dos tubos de transporte estériles de 5 ml separados y se etiquetó para los grupos de tratamiento apropiados.
Vacunas de K99 inactivada
La vacuna de K99 inactivada PBS se preparó el 28 de diciembre de 2012 y se almacenó a 2-7 °C antes de su utilización en el presente estudio. Se dejó que los frascos de vacuna alcanzaran temperatura ambiente y, a continuación, se invirtieron para mezclarlos antes de retirar el material directamente del vial de vacuna para inocular los grupos de tratamiento apropiados.
Administración del tratamiento
Se examinó la salud de los ratones antes de la administración de los artículos de prueba. A dos jaulas de ratones, ocho ratones en total, se les administraron 0,5 ml de cada artículo de prueba. La inyección subcutánea (SC) se administró en la parte posterior del cuello utilizando una aguja de 25g, 5/8" o 25g, 1" con una jeringa de 3 ml. La inyección intraperitoneal (IP) se administró utilizando una aguja 25g, 5/8" con una jeringa de 3 ml. Se registró toda la administración del tratamiento y el tiempo.
Pesos
Los ratones se pesaron utilizando una balanza de mesa al recibirlos en grupos de 5 y se determinó el peso promedio de ese grupo.
Justo antes del día 0 (administración del artículo de prueba), se determinó el peso por ratón utilizando la misma balanza que al recibirlo. Se pesó cada jaula. El valor registrado para esa jaula se dividió por el número de ratones en esa jaula (4). El valor notificado fue el promedio de la jaula.
Observaciones de salud
Se realizaron observaciones de la salud de los ratones, como mínimo, una vez al día hasta el 7° día del estudio. Se registraron todas las observaciones de salud.
Se observó la salud de los ratones, aproximadamente, entre 82 y 89 minutos después de que se les administró el último artículo de prueba para las observaciones del día 0.
Criterios mesurables
La variable principal o resultado fue la presencia/ausencia de acontecimientos adversos durante el estudio de 7 días atribuibles al artículo de prueba. Esta variable se determinó para cada adyuvante y vía de administración. Se registraron dos observaciones:
Acontecimientos adversos en el lugar de la inyección: se registraron las lesiones observadas durante los 7 días de vida en el lugar de la inyección.
Mortalidad: se registró la mortalidad si se descubría un ratón muerto o se sacrificaba debido a morbilidad. Resultados y conclusiones
El peso promedio de todos los ratones en el momento de la administración del artículo de prueba fue de 26,87 g.
Observaciones de salud
Ninguno de los ratones inoculados mediante inyección SC con ninguno de los adyuvantes o la vacuna K99 inactivada PBS demostró una reacción adversa durante el período de estudio de 7 días. Como mínimo, seis de los ocho ratones de cada grupo inoculados mediante inyección IP con cualquiera de los adyuvantes murieron entre 24 y 48 horas después de la inoculación. Sólo los ratones inoculados mediante inyección IP con la vacuna K99 inactivada PBS permanecieron sanos durante el período de estudio de 7 días. La tabla 5 muestra los ratones que murieron durante el estudio.
TABLA . R m n l m r r n r n l i
Discusión
Basándose en los resultados de este estudio, parece que las vacunas preparadas con cualquiera de las cinco formulaciones de adyuvantes probadas en este estudio se pueden someter a pruebas de seguridad satisfactorias en ratones según la norma 9CFR 113.33 si el producto final se administró mediante inyección SC en la parte posterior del cuello.
Es posible que se desarrolle una lesión en el lugar de la inyección cuando el adyuvante combinado con un antígeno se administra por esta vía; sin embargo, es poco probable que la lesión dé como resultado una prueba de seguridad insatisfactoria ya que no se observaron otras reacciones adversas.
Sin embargo, en este estudio no se examinaron las reacciones adversas en el lugar de la inyección causadas por la adición de múltiples antígenos.
Se tuvo cuidado para garantizar que los ratones tuvieran un peso superior al predeterminado de 22 g, pero que no tuvieran más de 7 semanas de edad.
Como mínimo, seis de los ocho ratones de cada grupo inoculados mediante inyección IP con adyuvante no sobrevivieron más de 48 horas después de la inoculación. Esto indica que los adyuvantes son tóxicos para los ratones cuando se administran de esta manera. Sólo hay un componente común entre las diversas formulaciones de adyuvantes, lo que sugiere que este componente puede ser responsable de la toxicidad observada. La toxicidad de los adyuvantes cuando se administran mediante inyección IP está respaldada por la falta de reacciones adversas en los ratones inoculados de la misma manera con la vacuna deE. coliK99 inactivada preparada en PBS.
Conclusiones
Las vacunas con adyuvante añadido preparadas con formulaciones de adyuvante de VaxLiant, LLC representadas por los números de catálogo 70X0005 y 70X0106 pueden tener resultados satisfactorios de seguridad en ratones cuando se prueban según la norma 9CFR 113.33, si se administran mediante inyección subcutánea en la parte posterior del cuello.
Basándose en los resultados del presente estudio, todas las formulaciones de adyuvantes diluidas hasta la concentración final 1x parecen ser capaces de producir un resultado satisfactorio en las pruebas de seguridad en ratones cuando se administran mediante inyección subcutánea en la parte posterior del cuello. Sin embargo, son posibles reacciones adversas en el lugar de la inyección cuando, como mínimo, una de las formulaciones de adyuvante se prueba con un antígeno. Se recomienda que los procedimientos realizados con productos finales de vacunas preparados con cualquiera de las dos formulaciones de adyuvantes probadas en el presente estudio se realicen mediante administración mediante inyección subcutánea en la parte posterior del cuello.
EJEMPLO 3
Este ejemplo ilustra la eficacia de las composiciones adyuvantes reivindicadas con una vacuna de ADN H5 contra la gripe aviar.
Materiales y procedimientos
Para este estudio, se utilizaron 160 pollos machos y hembras libres de patógenos. El diseño del estudio fue el que se muestra a continuación en la tabla 6.
TABLA .
TABLA 7. r n r m l i
Procedimientos de estudio
Aleatorización y aclimatación
Se registraron observaciones diarias de salud de los pollos en todas las aves del estudio durante la fase de aclimatación. Las aves se aclimatarán durante un mínimo de tres días. Las observaciones clínicas se realizaron diariamente y se registraron.
Vía de administración
A todas las aves se les administraron los artículos de prueba mediante inyección intramuscular en los lados izquierdo y derecho de la pechuga.
Administración del artículo de prueba: días 0 y 14
El día 0, las aves fueron examinadas para determinar su salud y apariencia normales y se inscribieron en el estudio. Una jaula representará un grupo de tratamiento.
Las diez aves del T01 no fueron inoculadas para que sirvieran como control negativo. Diez aves en cada uno de los grupos de tratamiento restantes (T05-T16) fueron inoculadas con el artículo de prueba apropiado mediante inyección intramuscular el día 0 y el 14° día del estudio.
Extracción y prueba de muestras
Se extrajo sangre de cada ave el 14° día (antes de la administración de refuerzo de los artículos de prueba el 14° día) y el 28° día según los procedimientos del sitio. Se dejó que la sangre coagulara y, a continuación, se centrifugó para recoger el suero. A continuación, el suero se almacenó a -18 ± 5 °C hasta el análisis si la prueba no se iba a realizar dentro de las 48 horas posteriores a la extracción y/o después de que se haya analizado el suero. A continuación, se analizó el nivel de seroconversión en el suero mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI,Hemagglutination Inhibition Assay).
Observaciones de salud y acontecimientos adversos
Después de la administración de los artículos de prueba, se registraron observaciones clínicas, como mínimo, una vez al día hasta el final del estudio (28° día). Se registraron todas las observaciones clínicas.
Evaluación de resultados/Análisis de datos
Se analizó la seroconversión mediante HAI en muestras de suero utilizando el procedimiento BBL SOP LP-054. A continuación, se determinó el título de HAI para cada muestra de suero en cada grupo de tratamiento. A continuación, se compararon los títulos de HAI de las aves inoculadas con 1,00X (20 %) de adyuvante con los títulos de las aves inoculadas con 0,50X (10 %) y 0,25X (5 %) de cada formulación de adyuvante para determinar qué concentración de cada adyuvante es más eficaz.
Preparación del artículo de prueba
Los artículos de prueba se prepararon el día de la administración y se transportaron al sitio clínico.
La preparación de los artículos de prueba se realizó en cabinas de bioseguridad utilizando técnicas asépticas. Las formulaciones finales de todos los artículos de prueba se incubaron a temperatura ambiente durante 30 ± 5 minutos antes de la administración a las aves.
Artículos de prueba
Número de lote de ADN del plásmido AIV H5 DNA130414TKWI; de pureza y calidad probadas.
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS); Cellgro, catálogo: 21-031-CV Lote: 21031439.
TABLA . I nifi in l l i n m r vn
TABLA . Frml i n l rí l r r r r mi n
Precipitación de CaCl: concentración final de:
ADN plasmídico: 75 |xg/ml
Cloruro de calcio: 2.68 mM
Fosfato de sodio: 2.68 mM
Citrato de sodio: 0,669 mM
Resultados y conclusiones
TABLA 1. R l l i r nvrin
Este estudio demostró que los adyuvantes de la presente invención son eficaces con la utilización de vacunas basadas en ADN.
EJEMPLO 4
Este estudio ilustra la estabilidad de los adyuvantes de la presente invención durante 18 meses.
Materiales y procedimientos
Artículos de prueba
Preparación de artículos de prueba de estabilidad
Se combinaron dos formulaciones de adyuvante diferentes con BSA para una concentración objetivo de 50 |xg de BSA (albúmina sérica bovina)/dosis. Todos los artículos de prueba preparados se dividieron asépticamente en alícuotas en viales de vidrio estériles con tapones de goma y se cerraron mediante prensado.
El artículo de prueba PBO/cold se preparó poniendo alícuotas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) comercial en viales tal como se ha descrito y se almacenó a temperatura refrigerada. Los artículos de prueba BSA/PBS/RT y BSA/PBS/cold se prepararon añadiendo 4 partes de BSA y 1 parte de PBS para una concentración objetivo de 500 |xg/ml (dosis de 50 |xg/0,1 ml) y se almacenaron a temperatura ambiente o refrigerada. Los artículos de prueba BSA/Adj01/RT y BSA/Adj01/cold se prepararon añadiendo 4 partes de BSA y 1 parte de adyuvante 01 para una concentración objetivo de 500 |xg/ml (dosis de 50 |xg/0,1 ml) y se almacenaron a temperatura ambiente o refrigerada. Los artículos de prueba BSA/Adj06/RT y BSA/Adj06/cold se prepararon añadiendo 4 partes de BSA y 1 parte de adyuvante 06 para una concentración objetivo de 500 |xg/ml (dosis de 50 |xg/0,1 ml) y se almacenaron a temperatura ambiente o refrigerada.
Procedimientos de estudio
Aclimatación
Se registraron observaciones de salud diarias en todos los animales del estudio durante la fase de aclimatación. Los animales fueron aclimatados durante un mínimo de seis días.
Colocación en los procedimientos de prueba
A los ratones se les hicieron muescas en las orejas para identificarlos. Los ratones se colocaron en jaulas de estudio colocando cinco ratones por jaula. Los ratones también se pesaron durante los 6 meses de prueba. Administración del tratamiento
Se examinó a los ratones para determinar su salud y apariencia normales y se inscribieron en el estudio. Los ratones se mantuvieron según el grupo de tratamiento con dos jaulas que contenían cinco ratones, cada una de las cuales representaba un grupo de tratamiento. La excepción fue para los ratones que recibieron el placebo (PBO), que consistía en una jaula que contenía cinco ratones.
En el punto temporal del día 0, independientemente de las "condiciones de almacenamiento", se dividió asépticamente un vial de cada grupo de tratamiento en tres alícuotas. Se administró una alícuota a los ratones inmediatamente (día 0). La segunda alícuota se almacenó a 2-7 °C hasta que se administró a los ratones el 14° día y no se consideró como una muestra de "estabilidad". La tercera alícuota se mantuvo a 2-7 °C como muestra de retención y tampoco se consideró una muestra de "estabilidad". Todos los artículos de prueba se administraron a ratones por vía subcutánea dorsalmente entre los hombros.
Observaciones de salud y acontecimientos adversos
Las observaciones clínicas, incluidos los acontecimientos adversos, se registraron diariamente hasta la finalización del estudio.
Vía de administración
A todos los ratones se les administrará el artículo de prueba mediante inyección subcutánea, dorsalmente entre los hombros.
Extracción de muestras previas al cribado - Día -4 - 0 (solo ratones de referencia)
Se extrajo y se reunió sangre de los ratones de referencia (los ratones no utilizados en el estudio) una vez entre los días -4 y 0 para obtener suero previo al cribado. En este momento no se recogió más del 10 % del volumen sanguíneo total basado en el peso promedio de los ratones. Se dejó que la sangre coagulara y, a continuación, se centrifugó para recoger el suero. El suero se combinó y se almacenó a 2-7 °C o -18 ± 5 °C hasta que se analizó mediante ELISA para garantizar que los ratones que se utilizarían en el estudio fueran seronegativos a BSA.
TABLA 11. D ri i n r r mi n
TABLA 12. R m n rí l r r ili
TABLA 1. I nifi in l l in m r vn
TABLA 14. D ri i n rí l r ili
TABLA 1. D ri i n rí l r fr
TABLA 1: Di ñ l i líni
TABLA 17: Di ñ l i
Administración del tratamiento - día 0
Se examinó a los ratones para determinar su salud y apariencia normales y se inscribieron en el estudio. Cada jaula representaba un grupo de tratamiento.
Se dividió asépticamente un vial de cada preparación de grupo de tratamiento en tres alícuotas. Se administró una alícuota a los ratones inmediatamente (día 0). Se almacenó una alícuota a 2-7 °C hasta que se administró a los ratones el 14° día. La última alícuota se mantuvo a 2-7 °C como muestra de retención. Todas las preparaciones del grupo de tratamiento (para cada GT) se administraron a ratones por vía subcutánea dorsalmente entre los hombros de acuerdo con el diseño del estudio.
Extracción de muestras: días 1° a 28° (solo ratones de referencia)
Se extrajo y se reunió sangre de los ratones de referencia (los ratones no utilizados en el estudio) según fuera necesario entre los días 1° y 28°. No se extrajo más del 10 % del volumen sanguíneo total, basado en el peso promedio de los ratones en un período de 3 a 4 semanas. Se dejó que la sangre coagulara y, a continuación, se centrifugó para recoger el suero. A continuación, se reunió el suero y se almacenó a 2-7 °C o -18±5 °C hasta su utilización como control negativo en el ELISA.
Extracción y prueba de muestras
Se extrajo sangre de cada animal inoculado los días 13° y 28°. No se extrajo más del 10 % del volumen sanguíneo total basado en el peso promedio de los ratones en un período de 3 a 4 semanas. Se dejó que la sangre coagulara y, a continuación, se centrifugó para recoger el suero. A continuación, el suero se almacenó a 2-7 °C o -18±5 °C hasta que se analizó. A continuación, se analizó el nivel de seroconversión en suero mediante ELISA.
Administración del tratamiento - 14° día
Todas las preparaciones del grupo de tratamiento (para cada GT) se administraron a ratones mediante inyección subcutánea, dorsalmente entre los hombros de acuerdo con el diseño del estudio.
Observaciones de salud y acontecimientos adversos
Las observaciones clínicas se registraron diariamente después de la administración del artículo de prueba, tal como se indica en el cronograma del estudio.
Es posible que los ratones demuestren algunas reacciones adversas durante el estudio, tales como reacciones en el lugar de la inyección, entre las que se pueden incluir las siguientes: absceso (acumulación de pus acumulada dentro del tejido del cuerpo), hinchazón <1,5 - 1,5 cm de diámetro, alopecia (pérdida de cabello), eritema (enrojecimiento excesivo del sitio), granuloma (nódulo duro palpable), sangrado o úlcera (dolor en la piel). Se documentó la observación de cualquier reacción adversa.
Evaluación del análisis/análisis de datos
Se analizó la serconversión de las muestras de suero mediante ELISA utilizando el procedimiento BBL SOP AN-084. Se determinó el nivel de producción de anticuerpos en cada muestra de suero para cada grupo de tratamiento. La producción de anticuerpos en los ratones a los que se les administró adyuvante bSa se comparó con la producción de anticuerpos en los ratones a los que se les administró el control positivo de BSA. Se comparó la producción de anticuerpos en ratones a los que se les administraron las diversas formulaciones de adyuvantes. La producción de anticuerpos en los ratones a los que se les administraron artículos de prueba que se habían almacenado para el análisis de estabilidad se comparó con los ratones a los que se les administraron artículos de prueba preparados frescos el día 0 de este estudio.
Los niveles de producción de anticuerpos en ratones inoculados en este estudio se compararon con los niveles de anticuerpos producidos en el primer estudio de estabilidad realizado.
Se utilizarán estadísticas descriptivas cuando sea apropiado para determinar la efectividad de todos los grupos de tratamiento en comparación con el control negativo. Los medias geométricas y la significación estadística se determinarán realizando la prueba de la t de Student bilateral u otro procedimiento apropiado. Resultados y conclusiones
TABLA 1 - E i ili in viv r n m
�� TABLA 21: D rir l nr xrí
TABLA 22: D n l n m r l = m
TABLA 24. M i m ri l m
TABLA 2 . M i m ri = 1 m
Los datos muestran que los adyuvantes de la presente invención fueron estables durante un período de 18 meses. Tal como se puede observar en los datos, todas las muestras de adyuvante 06 se mantuvieron estables después de 18 meses. Estos datos muestran que los adyuvantes de la presente invención tienen estabilidad en almacenamiento a temperatura ambiente durante, como mínimo, 18 meses. Esto permite la facilidad de envío, almacenamiento y utilización del adyuvante ya sea sin ensamblar o ensamblado con antígeno.
EJEMPLO 5
Material y procedimientos
Se vacunaron setenta polluelas ponedoras con un día de edad con 0,2 ml de la vacuna de ADN administrada por vía subcutánea o con 0,2 ml de PBS. La vacuna de ADN era un esqueleto de plásmido de vacuna de ADN eucariota que contenía el gen HA de GyrFalcon/Washington/41088-6/2014. Se administró la vacuna de ADN a un total de 60 polluelas y se utilizaron 10 polluelas como controles. Dos semanas después de la vacunación original, 20 polluelas recibieron un refuerzo con 0,2 ml de vacuna de ADN y 20 polluelas fueron vacunadas con 0,2 ml de la vacuna de genética inversa GyrFalcon/Washington/41088-6/2014 administrada con un adyuvante. La provocación se realizó cuando las aves tenían 4 semanas de edad (de 2 a 4 semanas después de la última vacunación) con A/Turkey/Minnesota/12582/2015 (H5N2) a una dosis de 10<6,5>/EID50 administrada en una dosis de 0,5 ml por la vía de inoculación de las coanas. El virus de provocación provenía de un brote reciente y la dosis de provocación fue diseñada para administrar una dosis letaÍ<50>de 1.000 pollos como una provocación estricta.
Determinación de la diseminación vírica. Se suspendieron muestras de frotis orofaríngeos de pollos en 2 ml de caldo de infusión cerebro-corazón (BHI,brain heart infusión)estéril (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) que contenía 1X antibiótico/antimicótico (Mediatech, Herndon, Virginia) y se congelaron a -70 °C hasta que se obtuvo la extracción de ARN. Se añadió ARN vírico total a partir de 250 |j.l muestra a Trizol y después de añadir cloroformo, la fase acuosa se utilizó con el kit de aislamiento de ARN vírico MagMAX-96 AI/ND (Ambion, Inc., Austin, Texas). El procedimiento para el aislamiento de ARN se llevó a cabo utilizando el sistema de procesamiento de partículas magnéticas KingFisher (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts).
Se realizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real (RRT-PCR) utilizando cebadores y sondas específicas para el gen de la matriz de la gripe aviar de tipo A (2). Se utilizó el kit AgPath-ID RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, California) con ocho |j.l de la muestra de ARN y se añadió agua libre de nucleasas para obtener un volumen final de 25 |jL La reacción de transcripción inversa consistió en un ciclo de 30 minutos a 50 °C, seguido de 15 minutos a 95 °C. En la reacción de PCR se llevaron a cabo cuarenta ciclos de desnaturalización de 1 s a 94 °C, seguidos de hibridación durante 20 s a 60 °C. Ambas reacciones se llevaron a cabo en una máquina de PCR en tiempo real Smart Cycler II (Cepheid, Sunnyvale, California). Las EID<50>del virus de las muestras de frotis se extrapolaron a partir de los umbrales del ciclo mediante la utilización de curvas patrón generadas a partir de las cantidades conocidas de ARN de los virus de provocación utilizados (1). Los límites de detección de cada ejecución de RRT-PCR se calcularon en función de la curva patrón, estableciendo los valores umbral del ciclo iguales al número de ciclos ejecutados. Para fines estadísticos, a las muestras que fueron negativas para RRT-PCR en este estudio, se les asignó un valor umbral de ciclo de 1 ciclo por debajo del punto de detección más bajo en la curva patrón.
A continuación, se realizó una prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI). Se determinaron los títulos de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación contra el AIV utilizando la prueba HI (3). El antígeno homólogo inactivado con beta-propiolactona (Ag) se diluyó en PBS para obtener una concentración de cuatro unidades de HA. El Ag homólogo se refiere al virus A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014 H5N8, que es el mismo gen de hemaglutinina que se utiliza en la vacuna R<p>, excepto que el gen RP fue modificado para tener un sitio de escisión de baja patogenicidad que no afecta la antigenicidad del virus. Se añadieron cincuenta microlitros de Ag por pocillo de una placa de 96 pocillos, en la que el suero de prueba se diluyó dos veces en serie. Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de añadir a cada pocillo un 0,5 % de glóbulos rojos de pollo. Las placas se agitaron durante 15 s y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los resultados se interpretaron como el recíproco del último pocillo que tuvo una inhibición completa de la actividad hemaglutinante. Para fines estadísticos, un título recíproco de 4 se consideró el resultado positivo más bajo.
Resultados y conclusiones
Las aves vacunadas y las de control fueron expuestas a A/Turkey/Minnesota/12582/2015 (H5N2) 2 o 4 semanas después de la última vacunación. Todas las aves de control mostraron enfermedad clínica grave o muerte 3 días después de la provocación con un tiempo medio de muerte (MDT,Mean Death Time)de 2,1 días, y las aves con enfermedad clínica grave fueron sacrificadas y registradas como muertas al día siguiente, según lo exigen los protocolos de IACUC (figura 1).
La serología se realizó en sangre extraída el día de la exposición, a las 4 semanas de edad y 2 o 4 semanas después de la vacunación. Ninguna de las aves de control o las aves vacunadas con ADN único tenían títulos de anticuerpos HI detectables. De las aves vacunadas, 7 de 20 aves tenían títulos de anticuerpos detectables que oscilaban entre 4 y 32 en el grupo vacunado dos veces con ADN y 19 de 20 aves tenían títulos en el grupo de ADN/RG. La media geométrica del título para las aves que se seroconvirtieron fue 8,8 (2<3,14>) y 16,6 (2<4,05>) respectivamente. (tabla 26)
Diseminación vírica después de la provocación. Todas las aves de control murieron o fueron sacrificadas el 3° día después de la provocación, aunque todas las aves, vivas o muertas, fueron sometidas a frotis orofaríngeos el 2° día. Se tomaron muestras de todas las aves vacunadas el 2° día y de todas las aves restantes se tomaron muestras el 4° día después de la provocación. Las aves de control excretaron el 2° día 10<7,1>/EID<50>y todas las aves excretaron títulos similares de virus. Las aves vacunadas con ADN único en el 2° día excretaron 10<6,6>/EID<50>, el grupo vacunado dos veces con ADN excretó 10<5,4>/EID<50>logs de virus y el grupo vacunado con ADN/RG excretó 10<2,9>/EID<50>logs de virus, respectivamente (figura 1). La cantidad de eliminación de virus fue estadísticamente diferente (P = <0,001) entre los controles y el grupo vacunado dos veces con ADN y las aves vacunadas con ADN/RG el 2° día utilizando la prueba de suma de intervalos de Mann-Whitney.
El enfoque de vacuna de refuerzo primario de la vacuna de ADN al día de edad y un refuerzo a las 2 semanas tuvo un 95 % de eficacia contra la provocación, mientras que el grupo de tratamiento que recibió la vacuna de ADN de 2 dosis proporcionó protección en el 55 % de las aves vacunadas. La correlación fue extremadamente elevada: las aves que se seroconvirtieron en la prueba HI con, como mínimo, un título de 4, sobrevivieron a la provocación y tuvieron una reducción de la excreción. Estos resultados indican que la vacuna de ADN se puede utilizar en ensayos de vacunación independientes o combinados.
TABLA 26 Tí l inhi i i n l h m l in i n r^ v v n in ividualmente.
Títulos de inhibición de la hemaglutinación por ave vacunada individualmente. Los títulos de HI positivos mínimos fueron 4, por lo que los títulos medidos de 2 se convirtieron a 0 para el cálculo. Para los títulos de medias geométricas, las aves con títulos negativos no se incluyeron en el cálculo.
EJEMPLO 6
Estudio de eficacia para la evaluación serológica del adyuvante combinado de vacuna de ADN de la presente invención en pavos
El propósito de este estudio fue establecer una expectativa razonable de eficacia para una vacuna de ADN contra la gripe aviar de alta patología (HPAI,High Pathology Avian Influenza)utilizando los adyuvantes de la presente invención. Esto se consiguió evaluando la capacidad de la vacuna para provocar una respuesta inmunitaria en pavos. Para este fin, se combinó un ADN plasmídico que contenía un gen modificado para la proteína hemaglutinina (HA) del virus de la gripe aviar de vía alta, A/gryfalcon/WA/41088-6/2014 H5N8, con adyuvantes VaxLiant y se administró por las vías subcutánea e intranasal.
El plásmido modificado, NTC8685-eRNA41H-KP307984.1-HA-Modified codifica el gen HA de la cepa A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014 (H5N8) del virus de la gripe aviar (AIV,Avian Influenza Virus)altamente patógeno (HP,highly pathogenic).La secuencia H5 se modificó para cambiar el sitio de escisión multibásico de HP (PLRERRRKRGLF) a un sitio de escisión monobásico. El gen H5 modificado se produjo sintéticamente, se clonó en el vector de expresión eucariótico optimizado NTC8685-eRNA41H y la construcción se transformó en la cepa NTC4862 deE. coli.
La eficacia se midió mediante pruebas de seroconversión al virus inactivado que contenía el gen HA no modificado utilizando un ensayo de inhibición de la hemaglutinación.
Materiales y procedimientos
Se administró ENABL 1 y ENABL™ 50,5X con ADN de pHA (IVP 1 y 2) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) con ADN de pHA (MPC), por vía subcutánea (SC) a cada ave. Cada grupo de tratamiento con IVP, que incluyó un mínimo de 22 aves, y el grupo MPC, 10 aves, se inocularon el día 0. Se observó la salud general de las aves durante todo el estudio. Todas las aves se inocularon el día 0 del estudio. Se extrajo sangre, aproximadamente, 2 semanas después de cada inoculación y se analizó su seroconversión.
TABLA 27. D ri i n l^ i
TABLA 2 . Arí l r
TABLA 29. Crono rama del estudio
Vía de administración. A las aves se les administraron los artículos de prueba mediante inyección subcutánea en la parte posterior del cuello o por vía intranasal en las fosas nasales. El artículo de prueba se administró los días 0 y 14°. Las aves en T01 recibieron PBS a través de la vía SC y representan el MPC-1. Las aves restantes se inocularon tal como se describe en el diseño del estudio. El 14° día, las aves de los grupos T01, 02 recibieron producto y este fue el refuerzo. Las aves del grupo T03 no recibieron ningún refuerzo.
Extracción y prueba de muestras. Se extrajo sangre de cada ave en los grupos T01, 02 antes del día de la administración de refuerzo de los artículos de prueba y al final del estudio, de acuerdo con los procedimientos del sitio. Se extrajo sangre a las aves del grupo T03 el 21° día y al final del estudio. Se dejó que la sangre coagulara y, a continuación, se centrifugó para recoger el suero. El suero se almacenó a 2-7 o -18 ± 5 °C. Se analizó el nivel de seroconversión en suero mediante la inhibición de 4-8 unidades de hemaglutinación del virus, A/gyrfalcon/WA/41088-6/2014 H5N8 BEI según el procedimiento BBL SOP LP-054.
Evaluación de resultados/Análisis de datos. Se analizó el nivel de seroconversión en suero mediante la inhibición de la hemaglutinación del virus, A/gyrfalcon/WA/41088-6/2014 H5N8 BEI inact, que contenía el gen HA no modificado, según el procedimiento BBL SOP LP-054. Se determinó el título de inhibición de la hemaglutinación (HAI) para cada muestra de suero en cada grupo de tratamiento. En resumen, se incubaron diluciones en serie del suero con 4-8 unidades de hemaglutinina y finalmente se añadieron a glóbulos rojos de pollo. Se notificó el título de HAI como el registro inverso de la última dilución en la que hay un 100 % de inhibición de la hemaglutinación vírica específica en todas las réplicas. Se compararon los títulos de HAI en las aves a las que se les administraron las diversas formulaciones de adyuvante.
TABLA R l . Efi i n v
Los resultados indican que los pavos se pueden vacunar con la combinación de ADN de HPAI y adyuvante con un día de edad. Además, las aves que se seroconvierten estarían protegidas contra la exposición homóloga con un régimen de dos dosis cuando se les administra SC con la formulación probada en este estudio.
EJEMPLO 7
Las fórmulas adyuvantes de la presente invención que se probarán como productos veterinarios en investigación (IVP,investigational veterínary producís)en este estudio con pavos fueron ENABL® 1 y 6 formuladas con un ADN plasmídico (pHA) que contiene un gen de hemaglutinina (HA) modificado de un virus altamente patógeno (HP) de la gripe aviar (AIV) de la cepa A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014 (H5N8). La secuencia H5 se modificó para cambiar el sitio de escisión multibásico de HP (PLRERRRKRGLF) (SeQ ID NO. 1) a un sitio de escisión monobásico. El gen H5 modificado se produjo sintéticamente y se clonó en el vector de expresión eucariótico optimizado NTC8685-eRNA41 H. El mismo pHA se mezcló con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para que sirviera como control de placebo paralelo (MPC,matched placebo control)del estudio.
El propósito de este estudio fue establecer un tiempo de retiro de la vacuna de ADN de 21 días para pavos inoculados con ENABL® 1 y ENABL® 6.
Materiales y procedimientos
Diseño del estudio
Se administró ENABL 1 y ENABL™ 6 con ADN de pHA (IVP 1 y 2) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) con ADN de pHA (MPC), por vía subcutánea (SC) a cada ave. Cada grupo de tratamiento estuvo formado por un mínimo de 10 aves inoculadas el día 0. Se observó la salud general de las aves durante veintiún días. Se realizaron observaciones específicas del sitio los días 1° al 7°, 14° y 21°. A todas las aves que fueron sacrificadas debido a morbilidad o se había encontrado muertas después del día 0 del estudio y antes del 21° día se les realizó una necropsia para determinar si la muerte fue resultado del IVP o MPC. Todas las aves restantes el 21° día tuvieron patología macroscópica y exámenes histológicos. El diseño del estudio se resume en la tabla 31.
TABLA 1. D ri i n l i
Los artículos de prueba se describen a continuación. Antes de su utilización en el estudio, se les designó como artículo de prueba del A al C y se identificaron como tales durante el estudio para mantener un enmascaramiento adecuado.
TABLA 2. ADN HA ni n ENABL 1 Pr v rinri n inv i i n n.° 1
TABLA . ADN HA ni n ENABL Pr v rinri n inv i i n n.° 2
TABLA 4. ADN HA PB nrl l rll
TABLA . r n r m l i
Administración del tratamiento - Día 0
Se registró la evaluación de la salud, las observaciones clínicas y las observaciones del lugar de inyección propuesto el día del tratamiento. Se inyectó el producto designado a cada ave una vez en el espacio subcutáneo en la parte media de la nuca. La dosis fue de 0,2 ml por lugar.
Observaciones clínicas, observaciones en el lugar de la inyección y acontecimientos adversos
Se observó diariamente el estado de salud general de todas las aves después de la administración del artículo de prueba, tal como se indica en el cronograma del estudio. Los signos clínicos se clasificaron según términos estandarizados de bajo nivel desarrollados por el Diccionario veterinario para actividades reguladoras de medicamentos (VEDDRA,Veterinary Dictionary for Drug Regulatory Activities).
Los lugares de inyección se palparon, observaron y registraron los días 1° a 7° y el 14° día. El 21° día se realizó una palpación final del lugar de inyección y un examen de todos los lugares inyectados justo antes de la eutanasia y la necropsia.
Extracción de muestras
Para la recopilación de datos histológicos, se extrajeron muestras de tejido de los lugares de inyección y del tejido circundante. El patólogo examinó el lugar de inyección en busca de lesiones macroscópicas relacionadas con anomalías en el lugar de la inyección.
Examen y puntuación del lugar de inyección
Se palpó el lugar de inyección y se registraron los descubrimientos. Se hizo una incisión en la piel y se examinó el tejido subyacente. El patólogo asignó una puntuación para el lugar de inyección durante la necropsia, en función de la presencia de cualquier tracto de drenaje, absceso, edema, hemorragia o necrosis. La manifestación más grave en cualquier lugar de inyección dado, determinó la puntuación del lugar de inyección única asignada por el patólogo al lugar de inyección. En el caso de que se observara más de una manifestación en un solo lugar de inyección, se registraron las otras manifestaciones (inferiores y que no determinan la puntuación), pero estos descubrimientos menos graves no redujeron la puntuación asignada, según la manifestación más grave.
Puntuación histológica del lugar de inyección
Cada tejido extraído se examinó en busca de evidencia histológica de reacciones en el sitio. En cuanto a los descubrimientos macroscópicos de la necropsia, se asignó el grado MÁS GRAVE al sitio de la inyección y se utilizó como puntuación histológica para el sitio.
Resultados y conclusiones
Para cada grupo de tratamiento, 14 aves sobrevivieron a la colocación inicial y al período de estudio que cumplieron con los criterios de inclusión en el estudio, debido al estado de salud en el momento de la aclimatación. Los resultados de las observaciones del sitio y la histopatología macroscópica en la necropsia se proporcionan en la siguiente tabla.
TABLA . R l rv i n l í m r i hi l í
Observaciones del sitio. Ninguna de las aves inoculadas con placebo recibió una puntuación por respuestas anormales, ya sea en el nivel de observación del sitio o de necropsia, todas las aves obtuvieron una puntuación negativa en cualquier tipo de manifestación clínica de la vacuna o patología relacionada con la lesión. Para los grupos de tratamiento T01 y T02, sólo 3 de 14 aves (6 aves en total) demostraron cierta hinchazón en el sitio de inoculación que pudo palparse al final del período de 21 días. Las aves restantes (22 aves) fueron normales.
Necropsia. En la necropsia, las observaciones generales de patología macroscópica para el grupo T01 indicaron que 6 de 14 aves no tenían ningún tipo de lesión o patología asociada con el lugar de inyección a los 21 días, de las 8 aves restantes solo dos tuvieron una respuesta inflamatoria más grave, las restantes fueron de moderada a leve. Los resultados histológicos generales indicaron que 7 de 14 aves no tenían infiltración visible indicativa de inflamación o respuesta inmunitaria a los 21 días. De las 7 aves restantes, las observaciones fueron moderadas. Ninguna de las aves tenía hematomas visibles o lesiones relacionadas con hemorragias en el lugar de inyección.
En las observaciones generales de patología macroscópica para el grupo de tratamiento T03, 7 de 14 aves no tenían ningún tipo de lesión o patología asociada con el lugar de inyección a los 21 días, las 7 aves restantes tuvieron en su mayoría respuestas leves. Los resultados histológicos generales indicaron que 3 de 14 aves no tenían infiltración visible indicativa de inflamación o respuesta inmunitaria a los 21 días, mientras que las 11 aves restantes indicaron alguna infiltración leve a moderada indicativa de respuesta inmunitaria o inflamación.
Los adyuvantes probados en el presente ejemplo mostraron muy pocas reacciones en el sitio visibles durante los 21 días de observación, los animales permanecieron sanos y no sufrieron ninguna molestia. Sólo en la necropsia se pudo ver alguna patología por parte de un patólogo capacitado, que también fue evidente en las secciones de histología del examen microscópico. Ninguna de las reacciones observadas a los 21 días (final del estudio) en la necropsia por patología grave se habría considerado lo suficientemente grave como para interrumpir la línea de sacrificio para el procesamiento de aves. Todas las lesiones que pudieron puntuarse en la necropsia fueron de leves a moderadas y parecieron resolverse por sí solas, lo que indica que dentro de un tiempo (varios días) el tejido volvería a su apariencia normal. Estos resultados indican que el adyuvante se consideraría para la aprobación de seguridad de retiro de 21 días, que es el tiempo más bajo permitido por el USDA para la utilización de un adyuvante con una formulación de vacuna.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Composición de vacuna que comprende:
una composición adyuvante que comprende un triglicérido de cadena media, un polímero de ácido acrílico o metacrílico, colesterol y una saponina; y
un antígeno, en la que el adyuvante no comprende lecitina.
2. Composición adyuvante que comprende:
un triglicérido de cadena media; y
un polímero de ácido acrílico o metacrílico;
colesterol; y
una saponina, en la que el adyuvante no comprende lecitina.
3. Composición de vacuna o adyuvante, según las reivindicaciones 1 o 2, en la que el triglicérido de cadena media se selecciona entre el grupo que consiste en triglicéridos EP de cadena media, triglicéridos NF de cadena media, triglicéridos JPE de ácidos grasos de cadena media, triglicéridos de caprílico/cáprico y combinaciones de los mismos.
4. Composición de vacuna o adyuvante, según las reivindicaciones 1 o 2, en la que el polímero de ácido acrílico o metacrílico es un carbómero.
5. Composición de vacuna o adyuvante, según las reivindicaciones 1 o 2, en la que la composición adyuvante comprende además, como mínimo, un componente seleccionado entre el grupo que consiste en solución salina, alcohol, hidróxido de sodio y cualquier combinación de los mismos.
6. Composición de vacuna o adyuvante, según la reivindicación 5, en la que: i) el colesterol es colesterol de origen vegetal, o ii) el alcohol es etanol, o iii) la saponina es Quil-A.
7. Composición de vacuna o adyuvante, según las reivindicaciones 1 o 2, en la que el triglicérido de cadena media está presente en una cantidad del 0,01 % al 5 % en volumen; o en la que el polímero de ácido acrílico o metacrílico está presente en una cantidad del 0,1 % al 3 % en volumen.
8. Composición de vacuna o adyuvante, según la reivindicación 5, en la que: i) el colesterol está presente en una cantidad del 0,001 % al 3 % en volumen; ii) el alcohol está presente en una cantidad del 0,01 % al 3 % en volumen; o iii) la saponina está presente en una cantidad del 0,001 % al 0,5 % en volumen.
9. Vacuna, según la reivindicación 1, en la que: i) el antígeno se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína, un péptido, un polisacárido y una subunidad de cualquiera de los mismos; ii) en la que el antígeno es una secuencia de ácido nucleico o iii) en la que el antígeno es una combinación de cualquiera en i) y ii).
10. Vacuna, según la reivindicación 1, en la que el antígeno es un producto vírico o bacteriano producido mediante técnicas de ADN recombinante.
11. Vacuna, según la reivindicación 1, en la que el antígeno se selecciona entre el grupo que consiste en un antígeno aviar y un antígeno porcino.
12. Composición de vacuna o adyuvante, según las reivindicaciones 1 o 2, formulada para una vía de administración seleccionada entre el grupo que consiste en administración sin aguja, transdérmica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular y subcutánea.
13. Composición de vacuna, según la reivindicación 1, para su utilización en un procedimiento para vacunar a un animal que comprende las etapas de administrar la composición de vacuna a un animal que la necesita.
14. Composición de vacuna, según la reivindicación 1, en la que el antígeno es un producto derivado a partir de virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos, antígenos de enfermedades autoinmunitarias, hormonas, alérgenos o antígenos tumorales adecuados para su utilización en vacunas profilácticas o terapéuticas.
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