BR112017010883B1 - Composições adjuvantes e de vacina - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÕES ADJUVANTES E MÉTODOS RELACIONADOS. A presente invenção refere-se a uma composição adjuvante que é adequada para administração injetável, bem como por via transdérmica. A composição adjuvante compreende geralmente um lipófilo, um polímero de ácido acrílico ou metacrílico, salina, colesterol, uma saponina e hidróxido de sódio. A invenção refere-se também a uma composição de vacina que inclui geralmente a composição de vacina da presente invenção e um antígeno. A invenção refere-se também a um método para vacinar animais e humanos utilizando a composição adjuvante da presente invenção.

Description

CAMPO DA DIVULGAÇÃO
[001] O campo da divulgação refere-se a composições adjuvants para uso em preparações biofarmacêuticas. Os adjuvantes são particu-larmente adequados para uso com preparações biofarmacêuticas que são absorvidas através da pele ou injetadas no receptor.
ANTECEDENTES
[002] Os adjuvantes têm o potencial de determinar ou pelo menos influenciar o sucesso ou a falha das composições de vacina. Adicionalmente, os adjuvantes frequentemente determinam ou aumentam o método de administração de um determinado antígeno. Todas as vias de administração de vacina poderiam beneficiar de eficácia aumentada e formulação controlada incluindo a capacidade de utilizar menos antí- geno e ainda receber a mesma ou melhor resposta imunogênica no animal. A administração transdérmica tem várias vantagens em comparação com outras vias de administração devido à facilidade de administração e a uma menor quantidade de estresse colocada em um receptor. Administração transdérmica é vantajosa para os animais, incluindo porcos, devido à capacidade do agricultor facilmente administrar uma vacina a um grande grupo de animais com o mínimo de estresse sobre o animal e o agricultor. Métodos de administração sem agulha ou formas de inoculação diferentes do uso de agulhas tornaram-se uma opção para a administração bem sucedida de grandes grupos de animais sem causar estresse excessivo sobre os animais. Esta via de administração é também mais humana. A administração transdérmica é também vantajosa para crianças e idosos que são rotineiramente resistentes a outros modos de administração de vacinas. Os métodos para administração transdérmica estão se tornando mais disponíveis; contudo, adjuvantes adequados para essa administração não são amplamente disponíveis. Além disso, as composições adjuvantes que incorporam lecitina são comuns e estes adjuvantes nem sempre são adequados para todas as vias de administração possíveis e para certos tipos de antíge- nos quando utilizados em diferentes espécies, incluindo porcos. Tal como com outras vias de administração, a administração transdérmica poderia beneficiar de uma eficácia melhorada e de uma formulação controlada como descrito acima. Além disso, todas as vias de administração, incluindo as vacinas transdérmicas e injetáveis (via intravenosa (IV), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM) e subcutânea (SC)) poderiam beneficiar de um melhor início da imunidade e da duração da imunidade, assim como formulação controlada. O que é necessário na técnica são as composições adjuvantes que podem ser formuladas para se adequarem ao antígeno e à via de administração e particularmente às vias de administração que não são tão vulgarmente utilizadas devido à eficácia, tal como transdérmica. As composições adjuvantes adequadas para animais que podem utilizar formulações com componentes diferentes da lecitina são também necessárias na técnica. Finalmente, composições com capacidade melhorada como início e duração da imunidade que não incorporam a lecitina também são necessários na técnica.
SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO
[003] A presente divulgação supera os problemas inerentes na téc nica anterior e prevê composições adjuvantes e composições de vacina adequadas para uso em animais, incluindo os porcos. A presente divulgação prevê adicionalmente métodos relacionados a tais composições adjuvantes e de vacina. As composições adjuvantes da presente divulgação também são especialmente adequadas para uso com preparações farmacêuticas que são absorvidas através da derme e aumentam ainda mais as preparações em rotas convencionais, como a intravenosa (IV), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM) e subcutânea (SC). Os adjuvantes da presente invenção são também especialmente úteis em técnicas de administração sem agulha. Além disso, em algumas formas preferidas, não incluem lecitina.
[004] As composições adjuvantes da presente descrição são par ticularmente adequadas para técnicas de administração sem agulha, tais como administração transdérmica, porque permitem ou aumentam a capacidade de antígenos que normalmente têm dificuldade de serem absorvidos transdérmicamente para serem absorvidos através da pele do receptor. Isto tem várias vantagens em animais, incluindo menos estresse sobre o animal para a vacinação. No que diz respeito aos seres humanos, isto é vantajoso em utilização com crianças e pacientes idosos que podem resistir a outros tipos de vias de administração. As formulações de vacina que permitem uma rápida disseminação a partir do local, mas têm capacidade para absorver as populações de células em circulação têm uma vantagem de reduzir contusões e condenação da carne no matadouro. A presente divulgação proporciona uma melhor utilização das vias convencionais de vacinação devido à composição das composições adjuvantes. As composições adjuvantes da presente descrição incluem geralmente a utilização de um lipófilo, sendo um lipó- filo preferido uma composição comercialmente conhecida como LA- BRAFAC® (Gattefossé, Lyon, França).
[005] As composições adjuvantes da presente divulgação proporcionam preferencialmente uma absorção ou reação a 0,1% a 80% superior aos antígenos, tanto como uma composição injetável quando administrada com ou combinada com um antígeno como através da pele quando administrada com ou combinada com um antígeno. Mais preferencialmente, a absorção ou reação é cerca de 1% a 80% superior, onde faixas e valores tais como 1% a 80%, 5% a 60%, 10% a 70%, 2% a 18%, 20% a 45%, 5% a 65%, 0,1% a 35%, 0,5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13% 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 27%, 30%, 32%, 35%, 37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 58%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 78% e 80% são previstas. Todos os valores de maior absorção ou reação aos antígenos através da pele ou como um injetável são quando comparados com outras composições adjuvantes combinadas com ou administradas com o mesmo antígeno.
[006] Quando combinadas com um antígeno, tal como em uma va cina, as composições adjuvantes da presente divulgação proporcionam uma apresentação melhorada da porção de antígeno da vacina para o sistema imunológico do receptor da vacina. Essa apresentação melhorada é em comparação com o mesmo antígeno quando combinada com uma composição adjuvante que não faz parte desta divulgação. Preferencialmente, a apresentação melhorada permite a utilização de quantidades menores ou mais baixas de antígeno para atingir o mesmo nível de reação do sistema imunológico. O nível de reação do sistema imu- nológico pode ser medido pela força da resposta, como medido por marcadores de resposta imune, incluindo sinais clínicos (tais como a redução da gravidade e incidência de sinais clínicos de infecção) e marcadores biológicos (tais como sorologia), ou pode ser medido pela duração de imunidade ou de proteção ou combinações destes indicadores de reação do sistema imunológico. Ainda mais preferencialmente, a apresentação melhorada do antígeno permite a utilização de 95% da quan-tidade de antígeno, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 85%, 80%, 75%, 60%, 65%, 60%, 55%, 50 %, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, bem como faixas formadas por quaisquer dois membros deste grupo, para atingir o mesmo nível de reação do sistema imunológico que o mesmo antígeno em combinação com um adjuvante diferente quando administrado a um animal da mesma espécie.
[007] Uma vantagem adicional das composições adjuvantes da presente divulgação e métodos relacionados são que não incluem lecitina, uma vez que a lecitina demonstrou não ser útil para todos os tipos de antígeno. A composição adjuvante da presente divulgação proporciona preferencialmente composições adjuvantes eficazes e métodos relacionados que não utilizam lecitina e demonstraram proporcionar uma resposta imune melhorada para antígenos e/ou animais que a lecitina não induz ou proporciona uma resposta imune contra ou para.
[008] A composição adjuvante da presente divulgação geralmente compreende um lipófilo, um polímero de ácido acrílico ou metacrílico, solução salina, colesterol, uma saponina e hidróxido de sódio. Verificou- se que a composição adjuvante funciona para administração sem agulha, administração dérmica e outras vias de administração.
[009] Vantajosamente, a composição adjuvante da presente descrição não é virucida nem citotóxica, o que significa que a composição adjuvante não degrada o antígeno, tornando-o ineficaz para induzir uma resposta imune apropriada em um receptor. O adjuvante pode ser utilizado para rastrear antígenos in vitro. De preferência, a atividade virucida do adjuvante tem uma cultura de tecidos EID50 quando a concentração de lipídeos é inferior a 5% de lipídeos. Os efeitos citotóxicos na cultura de células variam dependendo da cultura de células utilizada, mas uma faixa segura pode ser de 0,025% a 5%. As faixas preferidas são inferiores a 5%, mais preferencialmente inferiores a 4%, ainda mais preferencialmente entre 0,25% a cerca de 3%, mesmo ainda mais preferencialmente entre cerca de 0,25% e cerca de 2%.
[0010] É também proporcionado um método de preparação da composição adjuvante da presente divulgação. O método inclui, de preferência, as etapas de combinação dos componentes da composição adjuvante e adição de um agente neutralizante. A etapa de combinação dos componentes da composição adjuvante inclui de preferência pelo menos uma emulsão.
[0011] A presente divulgação proporciona ainda uma composição de vacina compreendendo a composição adjuvante da presente divulgação e um antígeno. O antígeno pode ser qualquer antígeno adequado para utilização como uma composição imunogênica ou vacina. Preferencialmente, a razão do adjuvante da presente divulgação para o antí- geno é de cerca de 1:20, 1:17, 1:15, 1:12, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 e 1:1,5 com 1:5 sendo particularmente preferido.
[0012] É também proporcionado um método de vacinação de um animal ou humano. As etapas do método preferencialmente incluem administrar a composição de vacina da presente divulgação a um receptor em necessidade da mesma. A vacina pode ser administrada por administração sem agulha ou injetada. O receptor é de preferência um ser humano ou animal, em que o animal é selecionado, mas não está limitado a vacas, porcos, cavalos, cães, gatos, mulas, ovelhas, macacos, animais de companhia e outros mamíferos. Em uma modalidade, a composição de vacina pode ser administrada através de uma variedade de métodos de administração sem agulha. Os métodos de administração sem agulha incluem, mas não estão limitados a, pistolas de vacina, emplastros transdérmicos, aerossóis, métodos de administração de mucosas, métodos de adesão de pele, projéteis de partículas secas, projéteis úmidos, pistolas de partículas de ouro/inerte e pistolas pneumáticas.
[0013] Todas as referências a "compreende" ou "compreendendo" na presente divulgação devem também fornecer a base para uma linguagem de reivindicação como "consistindo essencialmente em" ou "consistindo em". Por exemplo, se a presente divulgação proporcionar que a composição compreende A e B, entende-se que a composição também pode consistir essencialmente em A e B, ou mesmo consistir em A e B e cada um destes é completamente divulgado como se eles fossem especificamente escritos para cada parte da divulgação. Cada um destes termos beneficiarão de seu significado habitual, quando usado no preâmbulo de uma reivindicação.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0014] Figura 1:Gráfico de dispersão de derramamento orofaríngeo de aves vacinadas e de controle aos 2 dias pós-desafio;
[0015] Fig. 2 Gráfico de dispersão de derramamento orofaríngeo de aves vacinadas e de controle aos 2 dias pós-desafio; e
[0016] Fig. 3:Gráfico de sobrevida para os animais na investigação delineada no Exemplo 5.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0017] A composição adjuvante da presente divulgação compre ende preferencialmente um lipófilo e um polímero de ácido acrílico ou metacrílico ou qualquer componente do tipo de partícula. Em outras mo-dalidades, a composição adjuvante compreende ainda pelo menos um dos seguintes:solução salina, imunomoduladores, moléculas pequenas, citocinas, esteróis incluindo colesterol, álcool, saponina e hidróxido de sódio.
[0018] O lipófilo pode ser qualquer lipófilo possuindo triglicerídeos de cadeia média. De preferência, o lipófilo é selecionado do grupo que consiste em triglicerídeos PE de cadeia média, triglicerídeos NF de cadeia média, triglicerídeos de ácidos graxos de cadeia média JPE, trigli- cerídeos caprílico/cáprico e combinações dos mesmos. Em uma modalidade particularmente preferida, o lipófilo é LABRAFAC® (Gattefossé, Lyon, França).
[0019] Em uma modalidade preferida, o lipófilo está presente na composição adjuvante da presente divulgação em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 5% do volume total da composição, em que quantidades compreendendo 0,1% a 4,7%, 0,2% a 4,5%, 0,3 a 4,4%, 0,5% a 4,3%, 0,7% a 4,2%, 0,9% a 4,1%, 1% a 4%, 2% a 4%, 2% a 5%,3% a 5%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2% 1,3%, 1,4% 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2% 2,2%, 2,4%, 2,6%, 2,8%, 3,0%, 3,2%, 3,4%, 3,5%, 3,8%, 4%, 4,2%, 4,5%, 4,8% e 5% em volume e todas as faixas de quaisquer dois pontos entre elas são previstas. Em uma modalidade particularmente preferida, o li- pófilo está presente em uma quantidade de cerca de 1,8% em volume.
[0020] O polímero do composto de ácido acrílico ou metacrílico é de preferência selecionado entre os polímeros de ácido acrílico ou meta- crílico e os copolímeros de anidrido maleico e derivado de alquenil. Exemplos de tais compostos incluem os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico que são reticulados, especialmente com polialquenil éteres de açúcares ou polialcoóis. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbômero (Phameuropa Vol. 8, N.° 2 de junho 1996). Os versados na técnica também podem se referir à Patente U.S. 2.909.462 que descreve tais polímeros acrílicos reticulados com um composto poli-hidro- xilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxil, de preferência não mais que 8, sendo os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxils substituídos por radicais alifáticos insaturados tendo pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são os que contêm de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinis, alis e outros grupos etilenicamente insatu- rados. Os radicais insaturados podem conter outros substituintes, tais como metil. Os produtos vendidos sob a designação CARBOPOL®; (BF Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. Eles são reticulados com uma alil-sacarose ou com alil-pentaeritritol. Há uma variedade de produtos de CARBOPOL® que seriam adequados para utilização com a presente divulgação. Um produto particularmente preferido para utilização é o Polímero CARBOPOL® 974P NF, em que "CARBOPOL® 974P NF" é o nome comercial de carboxipolimetileno.
[0021] Em uma modalidade preferida, o polímero de ácido acrílico ou metacrílico está preferencialmente presente na composição adjuvante da presente divulgação em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 3,0% em volume, em que valores, tais como 0,1% a 1%, 0,1% a 1,5%, 0,5% a 1%, 0,5% a 2%, 0,5% a 3%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 0,94%, 0,95%, 0,96%, 0,97%, 1,0%, 1,1%, 1,2% 1,3%, 1,4% 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2 %, 2,2%, 2,4%, 2,6%, 2,8% e 3,0% são previstos. Em uma modalidade particularmente preferida, o polímero de ácido acrílico ou metacrílico está presente em uma quantidade de cerca de 0,9% em volume.
[0022] A solução salina pode ser qualquer solução de cloreto de sódio e água adequada para utilização em uma composição adjuvante. Tipicamente, a solução salina refere-se a uma solução de 0,90% p/v de NaCl, cerca de 300 mOsm/L ou 9,0 g por litro, contudo, a solução salina para fins da presente divulgação não se limita a esta solução. Em uma modalidade particularmente preferida, a solução salina é a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem cálcio ou magnésio (No de catálogo Cellgro21-CV).
[0023] Em uma modalidade preferida, a solução salina está presente em uma quantidade de cerca de 50% a 98% da composição adjuvante da presente divulgação em volume, em que quantidades, tais como 60% a 98%, 70% a 98%, 80% a 98%, 90% a 98%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5%, 91,6%, 91,7%, 91,8%, 91,9%, 92%, 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5%, 92,6%, 92,7%, 92,8%, 92,9%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, e 98% são previstos. Em uma modalidade particularmente preferida, a solução salina está presente na composição adjuvante da presente divulgação em uma quantidade de cerca de 92% em volume.
[0024] O componente álcool é de preferência selecionado do grupo que consiste em etanol, isopropanol, butanol, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o etanol é utilizado. De preferência, o etanol é uma solução de 90% a 100%, no entanto, também podem ser utilizadas soluções de etanol de 10% a 90% para os fins da presente divulgação.
[0025] Em uma modalidade preferida, o álcool está presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a 3% da composição adjuvante da presente divulgação, em volume, em que valores, tais como 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05 %, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2% 1,3%, 1,4% 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2%, 2,2%, 2,4%, 2,6%, 2,8 % e 3,0% são previstos. Além disso, também se contemplam faixas que incorporam quaisquer dois dos valores descritos. Por exemplo, 0,01% a 1%, 0,01% a 2%, 0,3% a 1%, 0,3% a 1,5%, 0,03% a 0,07%, 0,05% a 2,4% e 1% a 1,6% estão todos abrangidos pela presente divulgação. Em uma modalidade particularmente preferida, o álcool está presente na composição adjuvante da presente divulgação em uma quantidade de cerca de 0,05% em volume. O álcool é útil para solubilizar a saponina, de preferência Quil A e muito ou a maioria (pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou mais) seca deixando a concentração final do álcool no produto final muito baixa.
[0026] A saponina para os fins da presente divulgação pode ser qualquer selecionada da classe das saponinas. Geralmente, as saponi- nas são uma classe de compostos químicos encontrados em particular abundância em várias espécies de plantas. De preferência, são glicosí- deos anfipáticos agrupados fenomenologicamente pela espuma de sabão que produzem quando agitados em soluções aquosas e estruturalmente por terem uma ou mais porções de glicosídeo hidrofílicas combinadas com um derivado de triterpeno lipofílico. Em uma modalidade preferida, a saponina é purificada ou semipurificada e liofilizada. De preferência, a saponina é um extrato do córtex da árvore sul-americana, Quillaja saponaria Molia. Mais preferencialmente, a saponina é Quil A.
[0027] Em uma modalidade preferida, a saponina está presente na composição adjuvante da presente divulgação em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, em que valores, tais como 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,035%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% e 0,5% são previstos. Além disso, as faixas incluindo quaisquer dois valores discretos descritos acima também são previstas. Por exemplo, a saponina pode estar presente na composição adjuvante da presente divulgação em uma quantidade de cerca de 0,003% a 0,01%, 0,003% a 0,05%, 0,01% a 0,03%, 0,1%, a 0,5%, 0,07% a 0,2% e semelhantes. Em uma modalidade particularmente preferida, a saponina está presente em uma quantidade de cerca de 0,009%.
[0028] A composição adjuvante da presente divulgação inclui de preferência um esterol. Qualquer esterol funcionará para os fins da presente divulgação, incluindo aqueles que ocorrem em plantas, animais e fungos. O esterol é preferencialmente tomado a partir de uma fonte vegetal, no entanto, o esterol pode ser selecionado de, mas não limitado a, fitoesteróis, zoosteróis, colesterol, campesterol, sitosterol, estigmas- terol, ergosterol e combinações dos mesmos. Em uma modalidade particularmente preferida, o esterol é um fitosterol, mais preferencialmente colesterol, preferencialmente de origem não animal. O colesterol pode ser qualquer fonte de colesterol adequada para uso em uma composição de adjuvante. O colesterol é derivado de preferência de animais ou plantas, mais de preferência, o colesterol é derivados de plantas.
[0029] Em uma modalidade preferida, o colesterol está presente na composição da divulgação presente em uma quantidade de adjuvante de cerca de 0,001% a cerca de 3% em volume, onde valores, tais como 0,005% a 0,05%, 0,008% a 0,008%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0. 005%,0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%,0,05%, 0,06%. 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%. 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2% 1,3%, 1,4% 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2%, 2,2%, 2,4%, 2,6%, 2,8 % e 3,0% são previstos. Além disso, as faixas incluindo quaisquer dois destes volumes são também previstas. Em uma modalidade particularmente preferida, o colesterol está presente em ma quantidade de cerca de 0,01% em volume.
[0030] A composição adjuvante da presente divulgação compre ende preferencialmente um componente que neutraliza o pH da composição a um pH de cerca de 6-8, mais preferencialmente um pH de 7. Qualquer neutralizante convencional pode ser utilizado, mas de preferência, o neutralizante é selecionado do grupo que consiste em hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e hidróxido de amônio. Em uma modalidade particularmente preferida, o componente que neutraliza o pH da solução é hidróxido de sódio.
[0031] Em uma modalidade preferida, o componente que neutraliza o pH da composição adjuvante está presente em uma quantidade de cerca de 0,1% a 10%, em que valores, tais como 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6% 2,75%, 2,5%, 2,75%, 3%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4%, 4,25%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,25%, 1,5%, 1,75%, 2%, 4,5%, 4,75%, 5%, 5,25%, 5,5%, 5,75%, 6%, 6,25%, 6,5%, 6,75%, 7%, 7,25%, 7,5%, 7,75%, 8%, 8,25%, 8,5 %, 8,75%, 9%, 9,25%, 9,5%, 9,75% e 10% são visualizados. Adicionalmente, também é contemplada qualquer faixa que incorpora dois destes valores incluindo, mas não se limitando a 2% a 8%, 2% a 6%, 3% a 8%, 4% a 6%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9% e 9,5%. Em uma modalidade particularmente preferida, o componente que neutraliza o pH da composição adjuvante está presente em uma quantidade de cerca de 5% em volume.
[0032] Em uma outra modalidade da presente divulgação, a composição adjuvante compreende LABRAFAC®, colesterol e Quil-A. Em uma modalidade adicional, a composição adjuvante da presente invenção compreende LABRAFAC®, CARBOPOL®, solução salina, Colesterol, Etanol, Quil-A e Hidróxido de Sódio. Em ainda outra modalidade, a composição adjuvante da presente divulgação compreende LA- BRAFAC®, CARBOPOL® 974P, Solução salina, Colesterol derivado de vegetal, Etanol, Quil-A e Hidróxido de sódio. Em uma outra modalidade, a composição adjuvante da composição da presente divulgação compreende cerca de 2% de LABRAFAC®, em volume, cerca de 1,0% de CARBOPOL®, em volume, cerca de 92% de solução salina, em volume, cerca de 0,01% de colesterol, em volume, cerca de 0,5% de etanol, em volume, cerca de 0,09% de Quil-A, em volume e cerca de 5% de hidróxido de sódio.
[0033] É também proporcionado um método de preparação da composição adjuvante da presente divulgação. Em uma forma do método, o método compreende de preferência as etapas de combinação dos com-ponentes da composição adjuvante, preferencialmente por meio de emulsão, e adição de uma composição que neutraliza o pH da composição adjuvante.
[0034] Em uma outra modalidade da presente divulgação, o método para preparar a composição adjuvante da presente invenção compreende as etapas de misturar um lipófilo, polímero de ácido acrílico ou metacrílico e solução salina para formar uma composição. Uma outra modalidade da presente divulgação proporciona adicionalmente a fase de realização de pelo menos uma emulsão antes do pH da primeira composição ser ajustado.
[0035] A presente divulgação também proporciona uma composição de vacina. A composição de vacina compreende preferencialmente a composição adjuvante da presente divulgação e um antígeno(s). A quantidade da composição adjuvante da presente divulgação e a quantidade de antígeno, bem como a tecnologia de produção de antí- geno dependem do método de administração selecionado. Os versados na técnica serão capazes de determinar a razão apropriada para tais métodos de administração. De preferência, a composição adjuvante está presente em uma quantidade de cerca de 1% a 30%, em volume, do volume total da composição de vacina, em que valores e faixas, tais como 1% a 25%, 1% a 20%, 1 % a 15%, 15% a 30%, 10% a 20%, 10% a 25%, 15% a 25%, 20% a 30%, 2%, 3%, 4% 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% e 30% são previstos. Em uma modalidade particularmente preferida, a composição adjuvante está presente em uma quantidade de cerca de 20% em volume. Em uma modalidade alternativa, a razão da composição adjuvante da presente divulgação para a quantidade de antígeno na composição de vacina é tal como descrito acima, e de preferência 1:5.
[0036] De preferência, os adjuvantes da presente invenção são estáveis em validade sozinhos ou quando misturados com um ou mais antígenos. De preferência, a vida útil do adjuvante da presente invenção é estável durante pelo menos 4 meses, mais preferencialmente, durante pelo menos 5 meses, mais preferencialmente, durante pelo menos 6 meses, durante pelo menos 12 meses, durante pelo menos 18 meses e durante pelo menos 24 meses, durante pelo menos 36 meses, onde faixas, tais como 6-18 meses, 6-24 meses, 6-36, 12-24 meses, 12-36 meses, 18-24 meses e 18-36 meses são previstas. De preferência, os adjuvantes da presente invenção são estáveis em validade durante estas durações à temperatura ambiente. De preferência, a faixa de temperaturas é de cerca de 16-26°C.
[0037] A presente divulgação proporciona adicionalmente um método de vacinação de animais ou seres humanos. O método compreende de preferência a etapa de administrar a composição de vacina da presente divulgação a um receptor do mesmo. Alternativamente, o método da presente divulgação compreende as etapas de combinar o adjuvante da presente divulgação com um antígeno para formar uma composição e administrar a composição a um animal ou ser humano em necessidade da mesma. De preferência, o antígeno é geralmente utilizado em uma composição imunogênica ou composição da vacina e é preferencialmente capaz de fornecer uma resposta imune no receptor. O receptor é, de preferência, um ser humano ou animal. Em uma modalidade em que o receptor é um animal, o animal é de preferência selecionado do grupo que consiste em porcos, vacas, cavalos, cães, gatos, ovelhas, mulas, macacos, animais de companhia e outros mamíferos.
[0038] O antígeno, para efeitos da composição de vacina da presente divulgação pode ser qualquer antígeno ou combinação de antíge- nos adequados para induzir uma resposta imunogênica em um receptor. O receptor pode ser um animal ou um ser humano. O antígeno para uso nesta invenção pode ser qualquer antígeno desejado que esteja dentro da definição acima estabelecida. Os antígenos estão comercialmente disponíveis ou um versado na técnica é capaz de os produzir. Em algumas formas preferidas, a porção antigênica que constitui a vacina pode ser um micro-organismo vivo modificado ou morto, ou um produto natural purificado a partir de um micro-organismo ou outra célula incluindo, mas não se limitando a, células tumorais, um produto sintético, uma proteína geneticamente modificada, peptídeo, polissacarídeo ou produto similar, ou um alérgeno. A fração antigênica pode também ser uma subu- nidade de uma proteína, peptídeo, polissacarídeo ou produto similar. O antígeno pode também ser os antígenos genéticos, isto é, o DNA ou RNA que gera uma resposta imune. Representativos dos antígenos que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, produtos naturais, recombinantes ou sintéticos derivados de vírus, bactérias, fungos, parasitas e outros agentes infecciosos, além de doenças autoimunes, hormônios ou antígenos de tumor que podem ser utilizados em vacinas profiláticas ou terapêuticas e alér- genos. Os produtos virais ou bacterianos podem ser componentes que o organismo produziu por clivagem enzimática ou podem ser componentes do organismo que foram produzidos por técnicas de DNA recom- binante que são bem conhecidas para aqueles versados comuns na técnica. Devido à natureza da invenção e ao seu modo de administração, é muito concebível que a invenção também funcione como um sistema de administração para drogas, tais como hormônios, antibióticos e anti- virais. Exemplos de antígenos adequados para utilização na composição de vacina da presente divulgação,incluem, mas não estão limitados a antígenos derivados de Síndrome Respiratória e Reprodutiva Porcina (PRRS); Mycoplasma hyopneumoniae (M hyo); Enterite proliferativa porcina; Vírus da Diarreia Viral Bovina (BVD); Doença de fronteira, Lep- tospirose; Brucelose causada por bactérias do gênero Brucella; Clostridium; Toxemia do tétano, causada por uma neurotoxina específica produzida por Clostridium tetani; Salmonella spp; Escherichia coli; Pox suína; Eperitrozoonose; Peste Suína Clássica (CSF) ou Febre Suína Africana (ASF); Pasteurelose pneumática e Streptococci, causada por Pas- teurella multocida e várias espécies de estreptococos, tipicamente S. suis; Meningite estreptocócica; Pseudorabies; Vírus da Influenza Suína; colite espiroqueta, causada pela bactéria Brachyspira pilosicoli ; Disenteria suína, causada pela bactéria Brachyspira hyodysentheriae; Coro- navírus; Parvovirus porcino; Actinobacillus pleuropneumonia; Doença de Glassers, causada pela bactéria Haemophilus parasuis (Hps); Epider- mite exsudativa, causada pela bactéria Staphylococcus hyicus; Erisipela suína, causada por uma bactéria, Erysipelothrix rhusiopathiae; Eperitro- zoonose (Epe), causada por uma bactéria chamada Eperythrozoonosis suis; Encefalomiocardite; Vírus da Herpes; Infecção por citomegalovírus porcino (PCMV), causada um vírus herpes; Vírus da Encefalite B Japonesa (JE); Diarreia Epidêmica Porcina (PED), causada por um corona- vírus; Infecção porcina do vírus da corona respiratória (PRCV); Rotaví- rus; Raiva; Doença vesiculosa dos suínos (SVD); Tuberculose causada por Mycobacterium tuberculosis; Vírus de exantema vesicular de suínos (VES); Vírus da Estomatite Vesicular (VS); e vírus da encefalomielite equina oriental (EEEV). Conforme entendido pelos versados na técnica e a utilidade da vacina com qualquer tipo de antígeno, todas as variações do antígeno incluindo organismos inteiros, macromoléculas, subu- nidades, ácidos nucleicos, proteínas expressas e combinações dos mesmos são contempladas pela presente divulgação.
[0039] O método de vacinação da presente divulgação inclui de preferência a administração da composição compreendendo o adjuvante da presente divulgação e um antígeno, em que a administração é sem agulha ou através de injeção. Mais preferencialmente, o método de administração é selecionado do grupo que consiste em tópico, intramuscular, nasal, oral, transdérmico, mucoso e subcutâneo. A composição adjuvante da presente divulgação proporciona uma vantagem nos métodos de administração sem agulha, em que a administração utiliza a absorção pela pele de antígenos, portanto, em uma modalidade preferida, o método de administração é transdérmico ou mucoso. Em uma outra modalidade, a administração para fins do método da presente divulgação é através de um método de administração sem agulha, tal como uma pistola de vacina; no entanto, o método da presente divulgação não está limitado a esta modalidade. A presente invenção não se limita a pistolas de vacina, uma vez que qualquer método de administração sem agulha irá funcionar. Os métodos de administração sem agulha incluem, mas não estão limitados a, pistolas de vacina, emplastros transdérmicos, aerossóis, métodos de administração de mucosas, métodos de adesão de pele, projéteis de partículas secas, projéteis úmidos,pistolas de partículas de ouro/inerte e pistolas pneumáticas.
[0040] Além disso, a presente divulgação proporciona um método de administração de uma composição de vacina a um porco. O método inclui de preferência a etapa de combinar a composição adjuvante da presente divulgação com um antígeno e administrar a composição de vacina por via transdérmica a um porco em necessidade da mesma. Em uma modalidade particularmente preferida, o método inclui a etapa de administrar a composição de vacina da presente divulgação a um porco através da administração de uma pistola de vacina.
[0041] A composição adjuvante da presente divulgação é particularmente adequada para administração transdérmica porque permite que os antígenos que normalmente têm dificuldade de ser absorvidos trans- dérmicamente sejam absorvidos através da pele ou da derme do receptor. O adjuvante da presente divulgaçao proporciona preferencialmente uma absorção de antígenos de 0,001% a 80% superior através da pele, quando comparada com outras composições adjuvantes.
[0042] Deve ser entendido que cada limitação numérica maxima proporcionada no relatório descritivo inclui qualquer limitação numérica inferior como se fosse expressamente aqui escrita. Cada limitação numérica mínima proporcionada no relatório descritivo inclui todas as limitações mais altas como se estivessem expressamente escritas aqui. Cada faixa numérica proporcionada aqui inclui expressamente cada faixa numérica mais estreita que se encontra dentro da faixa numérica mais ampla, como se tal faixa numérica mais estreita fosse expressamente aqui escrita.
[0043] A composição e os métodos divulgados no presente pedido podem compreender, consistir essencialmente em, ou consistir nos elementos essenciais e limitações da invenção aqui descrita, bem como quaisquer ingredientes, componentes, etapas ou limitações adicionais ou facultativas aqui descritas ou de outro modo úteis em composições e métodos, tais como os aqui descritos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[0044] Este exemplo ilustra o método de produção para um adjuvante exemplificativo daqueles proporcionados pela presente divulgação.
Materiais e Métodos
[0045] Os materiais utilizados foram os seguintes: A. Lipófilo LABRAFAC® WL1349 (Gattefossé N.° de catá- logo3139), em que o Lipófilo LABRAFAC® WL1349 é o nome comercial do triglicerídeo caprílico B. Polímero CARBOPOL® 974P NF (Lubrizol N.° de Catálogo CBP974PNF), em que "CARBOPOL® 974P NF" é o nome comercial de carboxipolimetileno C. Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem cálcio ou magnésio (Cellgro N.° de Catálogo21-031-CV) ou equivalente D. Colesterol, de origem vegetal, (Avanti N.° de Catá- logo700100 P) E. Etanol, solução a 100%, (Acros N.° de Catálogo61509- 0010) ou equivalente F. Quil-A, (Saponina Purificada Quil-A, Liofilizada do Catálogo Brenntag ) G. 5n de hidróxido de sódio, (VWR N.° de Catálogo BDH3225-1) ou equivalente TABELA 1. Formulação do Estoque de Adjuvante 06Estoque de cholesterol
[0046] Preparou-se então um estoque de colesterol adicionando o colesterol a etanol. Em seguida, misturou-se até dissolução. A solução foi então filtrada por esterilização utilizando um filtro de 0,2 μm. A solução foi então armazenada a 2-7°C.Estoque de Quil-A
[0047] Em seguida, preparou-se uma reserva Quil-A adicionando Quil-A Saponina à água RO/DI onde foi misturada até dissolução. A solução foi então filtrada por esterilização utilizando um filtro de 0,2 μm. E seguida, a solução foi então armazenada a 2-7°C. O estoque foi de um 4% como um estoque de 5x para Quil-A.
Preparação do Adjuvante 06
[0048] Preparou-se uma diluição 1:5 do estoque de Quil A, utilizando o material adjuvante 06, por adição de 20 mL de Quil A a 80 mL de material adjuvante 06 e misturou-se por turbilhão. Em seguida, adicionou-se 56 mL de estoque de colesterol ao volume de adjuvante 06. Em seguida, 100 mL da diluição 1:5 do Quil A foram adicionados ao restante volume de adjuvante 06 que agora continha 56 mL do estoque de colesterol. A mistura adjuvante foi então misturada durante aproximadamente 15 minutos. Enquanto estava sendo misturado, o adjuvante foi aliquotado assepticamente em garrafas PETG estéreis de 60 mL em alíquotas de 50 mL. Cada garrafa foi então selada com uma tampa superior de parafuso. As garrafas de Adjuvante 06 foram então armazenadas durante não mais que dois anos a 2-7°C.
Instruções de uso
[0049] A quantidade de Adjuvante 06 foi calculada para misturar com o antígeno; utilizando 1 parte de Adjuvante 06 com 4 partes de antígeno. Isto também foi feito em uma proporção de 1:9. No entanto, poderia ser feito facilmente usando uma proporção 1:10 ou 1:20.
[0050] O recipiente do adjuvante 06 deve ser cuidadosamente misturado antes do uso. Uma pequena quantidade de Adjuvante 06 foi preparada assepticamente com uma seringa estéril e uma agulha de calibre 18, e depois foi evacuada para remover todo o ar da seringa. A quantidade desejada de Adjuvante 06 foi então puxada de modo constante para dentro da seringa. O volume medido de Adjuvante 06 foi então adicionado ao antígeno e misturado cuidadosamente.
EXEMPLO 2
[0051] O objetivo deste estudo foi determinar se duas formulações adjuvantes diferentes, cada uma das modalidades separadas da presente divulgação, poderiam ser testadas em camundongos quando diluídas para a concentração pretendida para utilização com vacinas. Materiais e Métodos
[0052] Dua vacinas de K99 E. coli mortas vaccines, um adjuvante e um preparado em PBS foram também incluídos no estudo para determinar se a adição de um antígeno teria um efeito diferente nos camundongos em comparação com a mesma formulação adjuvante testada sozinha.
[0053] Camundongos CF-1 de fêmeas adultas com aproximadamente 6 semanas de idade com um peso médio de 27 g foram inoculados com 0,5 ml de cada uma das cinco formulações adjuvantes diferentes diluídas até uma concentração final 1x. Os camundongos foram também inoculados com 0,5 ml de cada vacina de E. coli K99 morta. O adjuvante utilizado para preparar a vacina adjuvante de E. coli K99 morta é a mesma formulação que o número de catálogo 70X0106, que contém a maior concentração de todos os ingredientes para essa formulação. Cada grupo de tratamento consistia em oito camundongos inoculados por injeção subcutânea na parte posterior do pescoço ou por injeção intraperitoneal. Todos os camundongos foram alojados durante sete dias após a inoculação e observados para a saúde.
[0054] Todos os camundongos inoculados por injeção subcutânea na parte de trás do pescoço pareciam estar saudáveis sete dias após a inoculação, no entanto três dos oito camundongos que receberam a vacina adjuvante de E. coli K99 morta apresentaram lesões no local da injeção no dia 7 do estudo. Pelo menos seis dos oito camundongos em cada grupo inoculado por injeção intraperitoneal morreram entre 24 e 48 horas após a inoculação.
Animais
[0055] Sessenta e quatro camundongos CF-1 fêmeas provenientes de Charles River Laboratories tinham aproximadamente 6 semanas (44 dias) de idade no momento da administração do artigo de teste. Após a recepção os camundongos pesaram uma média de 19 gramas. Os camundongos foram pesados novamente antes da administração de artigo de teste no dia 0 e pesavam uma média de 27 gramas. Artigos de teste Adjuvantes Catálogo VaxLiant 70X0005 - 5x, Lote 00003, Exp. 15Oct07 Catálogo VaxLiant 70X0106 - 5x, Lote 00003, Exp. 15Oct07 Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS); Cellgro, catálogo:21-031-CV Lote:21031439 Exp. 30Sep16, em que "Catálogo VaxLiant 70X0005" contém um triglicerídeo caprílico ou cáprico (triglicerídeo de cadeia média) combinado com carbômero ou carboxipolimetileno (nome comercial do Carbopol), e "Catálogo VaxLiant 70X0106" contém triglicerídeo caprílico ou cáprico (triglicerí- deo de cadeia média) combinado com carbômero ou carboxipolimeti- leno (nome comercial do Carbopol), e uma saponina da árvore sul-americana Quillaja saponaria Molina, cujo nome usual é Quil A, e um colesterol derivado de plantas.
Vacinas E. coli K99 mortas
[0056] Vacina contendo Adjuvante C VaxLiant Número de Catálogo 708101, E. coli morta expressando K99 pili - Lote K9928Dec12A
[0057] Vacina contendo PBS, E. coli morta expressando K99 pili - Lote K9928Dec12B Métodos Cronograma de Estudo TABELA 2. Cronograma de Estudo Projeto do Estudo TABELA 3. Projeto do Estudo 1 SC-Injeção subcutânea na parte de trás do pescoço; IP = Injeção intraperitoneal
Recepção animal, aclimatação e aleatorização
[0058] Após a recepção, os camundongos foram pesados cinco de cada vez, e cada camundongo foi colocado em uma gaiola separada. Este processo foi repetido até haver quatro camundongos alojados por gaiola.
[0059] Observações diárias de saúde foram realizadas durante o período de aclimatação de sete dias.
[0060] Gaiolas 1 - 16 foram aleatoriamente atribuídas aos grupos de tratamento T01 - T08, desenhando dois números de gaiola a partirde um recipiente e atribuindo-os ao grupo T01. Os dois números de gaiolas seguintes foram atribuídos ao grupo T02 e assim por diante até que todas as gaiolas foram atribuídas a um grupo de tratamento. Ver Tabela 4 para os números de gaiolas atribuídos a cada grupo de tratamento.TABELA 4. Número de gaiolas atribuído a cada grupo de tratamento
Preparação de artigo de teste
[0061] Toda preparação de artigo de teste foi realizada em condi ções assépticas no dia da administração.
Preparação de adjuvante
[0062] Deixou-se aquecer a garrafa do material adjuvante 5x apro priado até à temperatura ambiente e depois inverteu-se um mínimo de 30 vezes para misturar. O adjuvante apropriado foi diluído 1:5 com DPBS (4 partes de DPBS + 1 parte de adjuvante) e misturado por inversão de um mínimo de 30 vezes. O artigo de teste preparado foi aliquo- tado para dois tubos de transporte estéreis separados de 5ml e rotulados para os grupos de tratamento adequado.
Vacinas de K99 mortas
[0063] A vacina de K99 morta + PBS foi preparada em 28Dec12 e armazenada a 2-7oC antes do uso neste estudo. As garrafas de vacina foram deixadas aquecer até temperatura ambiente e depois invertidas para misturar antes de o material ter sido removido diretamente do frasco da vacina para inocular os grupos de tratamento apropriados.
Administração de tratamentos
[0064] Os camundongos foram examinados quanto à saúde antes da administração dos artigos de teste. Foram administradas duas gaiolas de camundongos, oito camundongos no total, com 0,5 ml de cada artigo de teste. A injeção subcutânea (SC) foi administrada na parte posterior do pescoço utilizando uma agulha de 25g, 5/8" ou 25g, 1" com seringa de 3 mL. A injeção intraperitoneal (IP) foi administrada utilizando uma agulha de 25 g, 5/8" com uma seringa de 3 ml. Registou-se a totalidade da administração e do tempo de tratamento.
Pesos
[0065] Os camundongos foram pesados utilizando uma balança de bancada após a recepção em grupos de 5 e o peso médio desse grupo foi determinado.
[0066] Imediatamente antes do Dia 0 (administração do artigo de teste) o peso por camundongo foi determinado utilizando o mesmo saldo após a recepção. Cada gaiola foi pesada. O valor registrado para essa gaiola foi dividido pelo número de camundongos nessa gaiola (4). O valor relatado foi a média da gaiola.
Observações de Saúde
[0067] As observações de saúde dos camundongos foram realizadas pelo menos uma vez por dia até o dia 7 do estudo. Todas as observações de saúde foram registradas.
[0068] Os camundongos foram observados para a saúde aproxima damente 82 - 89 minutos após o último artigo de teste ter sido administrado para as observações do dia 0.
Critérios mensuráveis
[0069] A variável primária ou resultado foi a presença/ausência de eventos adversos durante o estudo de 7 dias atribuível ao artigo de teste. Esta variável foi determinada para cada adjuvante e via de administração.
Foram observadas duas observações:
[0070] Eventos adversos no local de injeção: As lesões observadas durante o estágio de 7 dias de vida no local da injeção foram registradas.
[0071] Mortalidade: A mortalidade foi registrada se um camundongo foi encontrado morto ou foi abatido devido à morbidade.
Resultados e conclusões:
[0072] O peso médio de todos os camundongos no momento da ad ministração do artigo de teste era de 26,87 g.
Observações de Saúde
[0073] Nenhum dos camundongos inoculados via injeção SC com qualquer dos adjuvantes ou a vacina K99 morta + PBS demonstrou uma reação adversa durante o período de estudo de 7 dias. Pelo menos seis dos oito camundongos em cada grupo inoculado via injeção IP com qualquer dos adjuvantes morreram dentro de 24 a 48 horas após a inoculação. Apenas os camundongos inoculados via injecção IP com a vacina K99 morta + PBS permaneceram saudáveis durante o período de estudo de 7 dias. A Tabela 5 mostra os camundongos que morreram durante o estudo.TABELA 5. Sumário de mortes de camundongo durante o estudo* Os camundongos estavam saudáveis ao longo do estudo, mas desenvolveram lesões no local da injeção no dia 7.
Discussão
[0074] Com base nos resultados deste estudo, parece que as vaci nas preparadas com qualquer uma das cinco formulações adjuvantes testadas neste estudo podem ser submetidas a testes de segurança de camundongo satisfatórios através de 9CFR 113. 33 se o produto final for administrado via injeção SC na parte posterior do pescoço.
[0075] O desenvolvimento de uma lesão no local da injeção pode ser possível quando o adjuvante combinado com um antígeno é administrado através desta via, no entanto, é improvável que a lesão resulte em um teste de segurança insatisfatório, uma vez que não foram observadas outras reações adversas.
[0076] No entanto, as reações adversas no local da injeção causadas pela adição de múltiplos antígenos não foram examinadas neste estudo.
[0077] Foi tomado cuidado para assegurar que os camundongos estivessem acima do peso predeterminado de 22 g, mas não mais de 7 semanas de idade.
[0078] Pelo menos seis dos oito camundongos em cada grupo inocu lado via injeção IP com adjuvante não sobreviveram mais de 48 horas após a inoculação. Isto indica que os adjuvantes são tóxicos para os camundongos quando administrados desta maneira. Existe apenas um componente comum entre as várias formulações adjuvantes, sugerindo que este componente pode ser responsável pela toxicidade observada. A toxicidade dos adjuvantes quando administrada via injeção IP é suportada pela ausência de reações adversas nos camundongos inoculados da mesma maneira com a vacina de E. coli K99 morta preparada em PBS.
Conclusões
[0079] As vacinas adjuvantes preparadas com formulações adju vantes VaxLiant, LLC representadas pelos números de catálogo 70X0005 e 70X0106 podem ser capazes de obter resultados satisfatórios de segurança do camundongo quando testadas por 9CFR 113. 33 se administradas por injeção subcutânea na parte de trás do pescoço.
[0080] Com base nos resultados deste estudo, todas as formula ções adjuvantes diluídas para a concentração final 1x parecem ser capazes de produzir um resultado satisfatório no teste de segurança em camundongos quando administradas por injeção subcutânea na parte de trás do pescoço. Contudo, são possíveis reações adversas no local de injeção quando pelo menos uma das formulações adjuvantes é testada com um antígeno. Recomenda-se que os procedimentos realizados nos produtos finais da vacina preparados com qualquer uma das duas formulações adjuvantes testadas neste estudo sejam conduzidos por administração via injeção subcutânea na parte de trás do pescoço. EXEMPLO 3
[0081] Este exemplo ilustra a eficácia das composições adjuvants reivindicadas com uma vacina de DNA H5 contra a gripe aviária.
Materiais e Métodos
[0082] Foram utilizados 160 frangos livres de patógenos, machos e fêmeas, para este estudo. O Projeto do Estudo foi o seguinte na Tabela 6 abaixo.TABELA 6. Para este estudo, a designação do grupo de trai amen to (TG) identifica os frangos e o artigo de teste. 2 IM - Injeção intramuscular. 3 Cada frango será inoculado com 0,2 ml de volume no músculo da mama esquerda e 0,2 ml de volume no músculo da mama direita. TABELA 7. Cronograma do estudo
Métodos do Estudo Aleatorização e Aclimação
[0083] As observações diárias de saúde para os frangos foram registradas em todas as aves estudadas durante a fase de aclimatação. As aves serão aclimatadas por um mínimo de três dias. As observações clínicas foram realizadas diariamente e registradas.
Rota de Administração
[0084] Todas as aves foram administradas com os artigos de teste por injeção intramuscular nos lados esquerdo e direito da mama.
Administração do artigo de teste - Dias 0 e 14
[0085] No dia 0, as aves foram examinadas quanto à sua saúde e aparência normais e foram incluídas no estudo. Uma gaiola representará um grupo de tratamento.
[0086] As dez aves em T01 não foram inoculadas para servir como controle negativo. As dez aves em cada um dos grupos de tratamento restantes (T05-T16) foram inoculadas com o artigo de teste apropriado por injeção intramuscular no dia 0 e dia 14 do estudo.
Coleta e teste de amostras
[0087] O sangue foi coletado de cada ave no dia 14 (antes da administração de reforço do dia 14 de artigos de teste) e dia 28 de acordo com os procedimentos do local. Deixou-se coagular o sangue e depois centrifugou-se para coletar o soro. O soro foi então armazenado a -18 ± 5oC até ser testado se o teste não fosse ocorrer dentro de 48 horas da coleta e/ou após o soro ter sido testado. O soro foi então ensaiado quanto ao nível de soroconversão através do Ensaio de Inibição de Hemaglutinação (HAI).
Observações de Saúde e Eventos Adversos
[0088] Após a administração dos artigos de teste, as observações clínicas foram registradas pelo menos uma vez por dia até ao final do estudo (dia 28). Todas as observações clínicas foram registradas.
Avaliação dos resultados / análise de dados
[0089] As amostras de soro foram ensaiadas quanto à soroconver-são através de HAI utilizando BBL SOP LP-054. Determinou-se então o título de HAI para cada amostra de soro em cada grupo de tratamento. Os títulos de HAI das aves inoculadas com adjuvante de 1,00X (20%) foram então comparados com os títulos das aves inoculadas com 0,50X (10%) e 0,25X (5%) de cada formulação adjuvante para determinar qual concentração de cada adjuvante é mais eficaz
Preparação de artigo de teste
[0090] Os artigos de teste foram preparados no dia da administração e transportados para o local clínico.
[0091] A preparação dos artigos de teste foi realizada em armários de biossegurança utilizando técnicas assépticas. As formulações finais de todos os artigos de teste foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 ± 5 minutos antes da administração às aves.
Artigos de teste
[0092] Número de Lote do DNA do Plasmídeo AIV H5 DNA130414TKWI; Testado para pureza e qualidade.
[0093] Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS); Cellgro, catálogo:21-031-CV Lote:21031439.TABELA 8. Identificação do estoque de adjuvante2 Referência para BBL SOP QAU-053-01 Anexo II, Sumário de Teste de Lote (LTS) 3Cada estoque de adjuvante de 5,00X foi testado quanto à pureza e ao pH. Todos os artigos de teste serão tratados assepticamente durante a preparação; os artigos de teste finais não passarão por novos testes TABELA 9. Formulação de Artigo de Teste para cada Grupo de Trata-mento As concentrações d e estoque de adjuvante são 5,00 x. A concentração de 1,00X (20%) dos adjuvantes é considerada a concentração padrão. 2 TBD = A ser determinado; no formato de:NBHO2502 (designação do grupo de tratamento) (data de preparação); o dia 0 e o dia 14 serão diferenciados pela data de preparação. Precipitação de CaCl: Concentração final de: DNA de plasmídeos: 75ug/mL Cloreto de Cálcio: 2,68 mM Fosfato de sódio: 2,68 mM Citrato de sódio: 0,669 mM Resultados e conclusões: TABELA 10. Resultados dos estudos de soroconversão
[0094] Este estudo mostrou que os adjuvantes da presente inven ção são eficazes com a utilização de vacinas à base de DNA.
EXEMPLO 4.
[0095] Este estudo ilustra a estabilidade dos adjuvantes da presente invenção ao longo de 18 meses.
Materiais e Métodos Artigos de teste Preparação de artigos de teste de estabilidade
[0096] Duas formulações adjuvantes diferentes foram combinadas com BSA para uma concentração alvo de 50 ug de BSA (albumina de soro bovino)/dose. Todos os artigos de teste preparados foram aliquuo- tados assepticamente em frascos de vidro esterilizados com rolhas de borracha e fechados crimpados.
[0097] O artigo de teste PBO/frio foi preparado aliquotando solução salina tamponada com fosfato comercial (PBS) em frascos como descrito e armazenado à temperatura refrigerada. Os artigos de ensaio BSA/PBS/RT e BSA/PBS/frio foram preparados adicionando 4 partes de BSA e 1 parte de PBS para uma concentração alvo de 500 ug/ml (dose de 50 ug/0,1 mL) e armazenados a temperaturas ambiente ou refrigerados. Os artigos de ensaio BSA/Adj01/RT e BSA/Adj01/frio foram preparados adicionando 4 partes de BSA e 1 parte de Adjuvante 01 para uma concentração alvo de 500 ug/ml (dose de 50 ug/0,1 mL) e armazenados a temperaturas ambiente ou refrigerados. Os artigos de ensaio BSA/Adj06/RT e BSA/Adj06/frio foram preparados por adição de 4 partes de BSA e 1 parte de Adjuvante 06 para uma concentração alvo de 500 ug/ml (dose de 50 ug/0,1 mL) e armazenados a temperaturas ambiente ou refrigerados.
Métodos do Estudo Aclimatação
[0098] As observações diárias de saúde foram registradas em todos os animais do estudo durante a fase de aclimatação. Os animais foram aclimatados durante um período mínimo de seis dias.
Colocação em procedimentos de teste
[0099] Os camundongos foram cortados na orelha para identifica ção. Os camundongos foram colocados em gaiolas de estudo colocando cinco ratos por gaiola. Os camundongos também foram pesados durante o teste de 6 meses.
Administração de tratamentos
[00100] Os camundongosn foram examinados quanto à saúde e aparência normais e foram incluídos no estudo. Os camundongos foram mantidos de acordo com o grupo de tratamento com duas gaiolas contendo cinco camundongos, cada um representando um grupo de tratamento. A exceção foi para os camundongos que receberam o placebo (PBO) que consistiu em uma gaiola contendo cinco camundongos.
[00101] No momento do dia 0, independentemente das "condições de armazenamento", um frasco de cada grupo de tratamento foi asseptica- mente dividido em três alíquotas. Uma alíquota foi administrada aos ca-mundongos imediatamente (Dia 0). A segunda alíquota foi armazenada a 2-7°C até ser administrada aos camundongos no Dia 14 e não foi consi-derada como uma amostra de "estabilidade". A terceira alíquota foi man-tida a 2-7°C como uma amostra de retenção e também não considerada uma amostra de "estabilidade". Todos os artigos de teste foram adminis-trados a camundongos subcutaneamente dorsal entre os ombros.
Observações de Saúde e Eventos Adversos
[00102] As observações clínicas incluindo eventos adversos foram registradas diariamente até a conclusão do estudo.
Rota de Administração
[00103] A todos os camundongos será administrado o artigo de teste via injeção subcutânea, dorsal entre os ombros.
Coleta de amostras de pré-seleção - Dia -4 - 0 (Apenas camundongos de linha de base)
[00104] O sangue foi coletado e reunido a partir dos camundongos de linha de base (os camundongos não utilizados no estudo) uma vez entre os dias -4 e 0 para obter o soro pré-seleção. Não mais do que 10% do volume total de sangue com base no peso médio dos camundongos foi coletado neste momento. Deixou-se coagular o sangue e depois centrifugou-se para coletar o soro. O soro foi combinado e armazenado a 2-7°C ou -18 ± 5°C até ser testado via ELISA para assegurar que os ca-mundongos a serem utilizados no estudo fossem soronegativos à BSA. TABELA 11. Descrições do grupo de tratamento TABELA 12. Resumo dos Artigos de Teste de Estabilidade 1O volume remanescente de cada alíquota utilizada para inocular nos dias 0 e 14 será destruído no dia da utilização. A alíquota de retenção remanescente será retida. TABELA 13. Identificação do estoque de adjuvante 3Cada adjuvante de 5,0X foi testado quanto à pureza e ao pH. Todos os artigos de teste serão tratados assepticamente durante a preparação; os artigos de teste finais não passarão por novos testes. TABELA 14. Descrições de artigo de teste de estabilidade 1 500 ug/ml de estoque de BSA, 50 ug de BSA/dose 2 Marcador para cada grupo de tratamento TABELA 15. Descrições de artigos de teste frescos TABELA 15. (Continuação) 1 500 ug/m de estoque de BSA, 50 ug de BSA/dose 2 Marcador para cada grupo de tratamento 3 Temperatura de armazenamento dos componentes usados para preparar artigos de teste frescos 5 5x Estoques de adjuvante armazenados no mesmo local de armazenamento e temperatura que as amostras de estabilidade armazenadas a 18-27°C TABELA 16: Projeto de Estudo Clínico 1 Para este estudo, a designação do grupo de tratamento (TG) identificará os camundongos e o artigo de teste 2 Os camundongos serão inoculados por via subcutânea injetada dorsal, entre os ombros 3 Camundongos adicionais NÃO inoculados com o artigo de teste; usados para obter amostras de sangue de linha de base 4 O estudo de 18 meses terminou no dia 14 TABELA 17:Projeto do Estudo * O estudo d e 18 meses foi terminado no dia 14 sem administração de reforço
Administração de tratamentos - Dia 0
[00105] Os camundongos foram examinados quanto à saúde e aparência normais e foram incluídos no estudo. Cada gaiola representava um grupo de tratamento.
[00106] Um frasco de cada preparação de grupo de tratamento foi assepticamente dividido em três alíquotas. Uma alíquota foi administrada aos camundongos imediatamente (Dia 0). Uma alíquota foi armazenada a 2-7°C até ser administrada aos camundongos no Dia 14. A última alíquota foi mantida a 2-7°C como uma amostra de retenção. Todas as preparações do grupo de tratamento (para cada TG) foram administradas a camundongos subcutaneamente dorsal entre os ombros de acordo com o Projeto de Estudo.
Coleta de Amostras - Dia 1 - 28 (Apenas camundongos de linha de base)
[00107] O sangue foi coletado e reunido a partir dos camundongos de linha de base (os camundongos não utilizados no estudo) conforme necessário entre os dias 1 e 28. Não mais de 10% do volume total de sangue com base no peso médio dos camundongos foram coletados dentro de um período de 3-4 semanas. Deixou-se coagular o sangue e depois centrifugou-se para coletar o soro. O soro foi então reunido e armazenado a 2-7°C ou -18 ± 5°C até ser utilizado como controle negativo no ELISA.
Coleta e teste de amostras
[00108] O sangue foi coletado de cada animal inoculado nos dias 13 e 28. Não mais de 10% do volume total de sangue com base no peso médio dos camundongos foram coletados dentro de um período de 3-4 semanas. Deixou-se coagular o sangue e depois centrifugou-se para coletar o soro. O soro foi então armazenado a 2-7°C ou -18 ± 5°C até ser testado. O soro foi então ensaiado quanto ao nível de soroconversão via ELISA.
Administração de tratamentos - Dia 14
[00109] Todas as preparações do grupo de tratamento (para cada TG) foram administradas a camundongos via injeção subctânea dorsal entre os ombros de acordo com o Projeto de Estudo.
Observações de Saúde e Eventos Adversos
[00110] As observações clínicas foram registradas diariamente após a administração do artigo de teste, como indicado no cronograma do estudo.
[00111] É possível que os camundongos demonstrem algumas reações adversas durante o estudo, tais como reações no local da injeção, que podem incluir o seguinte: abscesso (coleção de acúmulo de pus dentro do tecido do corpo), edema <1,5 - 1,5 cm de diâmetro, alopecia (queda de cabelo), eritema (vermelhidão excessiva do local), granuloma (nódulo duro palpável), sangramento ou úlcera (ferida na pele). A observação de qualquer reação adversa foi documentada.
Avaliação de Análise / Análise de Dados
[00112] As amostras de soro foram ensaiadas para soroconversão via ELISA utilizando BBL SOP AN-084. Determinou-se o nível de produção de anticorpos em cada amostra de soro para cada grupo de tratamento. A produção de anticorpos nos camundongos administrados com Adjuvant + BSA foi comparada com a produção de anticorpos em camundongos administrados com o controle positivo de BSA. A produção de anticorpos em camundongos administrados nas várias formulações adjuvantes foi comparada. A produção de anticorpos nos camundongos aos quais foram administrados artigos de ensaio que tinham sido armazenados para análise de estabilidade foi comparada com os camundongos tratados com artigos de teste preparados frescos no dia 0 deste estudo.
[00113] Os níveis de produção de anticorpos em camundongos inoculados neste estudo foram comparados com os níveis de anticorpos produzidos no primeiro estudo de estabilidade conduzido.
[00114] A estatística descritiva será utilizada quando apropriado para determinar a eficácia de todos os grupos de tratamento em comparação com o controle negativo. As medidas geométricas e a significância estatística serão determinadas pela realização do teste t de Student de duas caudas ou outro método apropriado. Resultados e conclusões: TABELA 18 - Estudo de estabilidade in vivo até 6 meses 1 Coleta de sangue ainda não concluída (agendada para 24Jul14) 2 * 89,6 ou 124,1 MPa (13.000 ou 18.000 psi) utilizados no microfluidiza- dor quando se prepara o adjuvante 3 'Sim' = amostra sobre estabilidade; 'Não' = Amostra fresca preparada no dia 0 de 6 meses TABELA 19. Estabilidade do camundongo GMT Valores derivados de ELISA Resultados BSA+ENABL 06 sobre Estabilidade até 6 meses TABELA 20. Estabilidade do camundongo GMT Valores derivados de ELISA Resultados BSA+Adjuvante 06 sobre Estabilidade até 18 meses * Normalizado para o respectivo BSA somente valor GMT TABELA 21: Dados do sangue coletado 1 # Camundongos Soroconvertidos / # Camundongos tratados 2 Um valor de 10 utilizado para nenhuma soroconversão 3 Média geométrica BSA/Adj06 + Média geométrica BSA/PBS 4 Não realizado TABELA 22: Dados no ponto de tempo = 6 meses 1 # Camundongos Soroconvertidos / # Camundongos tratados 2 Um valor de 10 utilizado para nenhuma soroconversão 3 Média geométrica BSA/Adj06 + Média geométrica BSA/PBS TABELA 23. Dados no ponto de tempo = 18 meses 1 # Camundongos Soroconvertidos / # Camundongos tratados 2 Um valor de 10 utilizado para nenhuma soroconversão 3 Média geométrica BSA/Adj06 + Média geométrica BSA/PBS TABELA 24. Médias geométricas aos 6 meses TABELA 25. Médias geométricas = 18 meses
[00115] Os dados mostram que os adjuvantes da presente invenção eram estáveis durante um período de 18 meses. Como pode ser visto a partir dos dados, todas as amostras de adjuvante 06 eram estáveis após 18 meses. Estes dados mostram que os adjuvantes da presente invenção têm estabilidade de validade à temperatura ambiente durante pelo menos 18 meses. Isto permite a facilidade de transporte, armazenamento e a utilização do adjuvante não montado ou montado com antígeno.
EXEMPLO 5 Material e métodos
[00116] Foram vacinados 70 pintinhos de postura de um dia de idade com 0,2 ml da vacina de DNA administrada subcutaneamente ou com 0,2 ml de PBS. A vacina de DNA era uma cadeia principal de plasmídeo de vacina de DNA eucariótico contendo o gene HA de GyrFalcon/Wa- shington/41088-6/2014. Um total de 60 pintinhos foi administrado com a vacina de DNA e 10 pintinhos foram utilizados como controle. Duas semanas após a vacinação original, 20 pintinhos foram reforçados com 0,2 ml de vacina de DNA, e 20 pintinhos foram vacinados com 0,2 ml da vacina morta de genética reversa GyrFalcon/Washington/41088-6/2014 administrada com um adjuvante. O desafio foi realizado quando as aves tinham 4 semanas de idade (2 a 4 semanas após a última vacinação) com A/Turquia/Minnesota/ 12582/2015 (H5N2) em uma dose de 4 06,5/EID50 administrado em uma dose de 0,5 ml pela via coanal de inoculação. O vírus de desafio era de um surto recente e a dose de desafio foi concebida para dar 1000 doses letais de frango50 como um desafio rigoroso.
[00117] Determinação da secreção viral. As amostras de esfregaço orofaríngeo de frangos foram suspensas em 2 ml de caldo de infusão de coração cerebral estéril (BHI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contendo antibiótico/antimicótico 1X (Mediatech, Herndon, VA) e congelado a -70°C até extração de RNA. O RNA viral total de 250 ul de amostra foi adicionado a Trizol e após a adição de clorofórmio, a fase aquosa foi utilizada com o Kit de Isolamento de RNA Viral MagMAX-96 AI/ND (Am- bion, Inc.,Austin, TX). O procedimento para isolamento de RNA foi realizado utilizando o sistema de processamento de partículas magnéticas KingFisher (Thermo Scientific, Waltham, MA).
[00118] Realizou-se RT-PCR quantitativo em tempo real (RRT-PCR) utilizando iniciadores e sondas específicas para o gene da matriz da gripe aviária tipo A (2). Utilizou-se o kit RT-PCR AgPath-ID (Invitrogen, Carlsbad, CA) com oito μl da amostra de RNA e adicionou-se água livre de nuclease para se obter um volume final de 25 μl. A reação de transcrição inversa consistiu em um ciclo de 30 min. a 50°C, seguido por 15 min. a 95°C. Quarenta ciclos de desnaturação 1s a 94°C, seguidos por recozimento durante 20s a 60°C foram realizados na reação de PCR. Ambas as reações foram realizadas em uma máquina de PCR em tempo real Smart Cycler II (Cepheid, Sunnyvale, CA). O EID50s do vírus a partir das amostras de esfregaço foram extrapolados a partir dos limites de ciclo utilizando curvas padrão geradas a partir das quantidades conhecidas de RNA dos vírus de desafio utilizados (1). Os limites de detecção de cada execução de RRT-PCR foram calculados com base na curva padrão, estabelecendo os valores de limite de ciclo iguais ao número de ciclos executados. Para fins estatísticos, amostras que eram RRT-PCR-negativas neste estudo foram atribuídas com um valor limite de ciclo de 1 ciclo abaixo do ponto de detecção mais baixo na curva padrão.
[00119] Foi então realizado um teste de inibição da hemaglutinação (HI). Os títulos de anticorpos de inibição de hemaglutinação contra AIV foram determinados utilizando o teste HI (3). O antígeno inativado de beta-propiolactona homóloga (Ag) foi diluído em PBS para se obter uma concentração de quatro unidades de HA. O Ag homólogo refere-se ao vírus H5N8 de A/gyrfalcon/Washington/41088-6/2014 que é o mesmo gene de hemaglutinina usado na vacina RP exceto que o gene RP foi modificado para ter um local de clivagem de baixa patogenicidade que não afeta a antigenicidade do vírus. Adicionaram-se cinquenta microli- tros de Ag por poço de uma placa de 96 poços, em que o soro de teste era duplamente diluído em série. As placas foram incubadas durante 15 min. à temperatura ambiente antes de 0,5% de glóbulos vermelhos de frango serem adicionados a cada poço. As placas foram agitadas durante 15 s, e incubadas durante 45 min. à temperatura ambiente. Os resultados foram interpretados como o recíproco do último poço que tinha inibição completa da atividade hemaglutinante. Para fins estatísticos, um título recíproco de 4 foi considerado o menor resultado positivo. Resultados e conclusões:
[00120] As aves vacinadas e de controle foram desafiadas com A/Turquia/Minnesota/12582/2015 (H5N2) 2 ou 4 semanas após a última vacinação. Todas as aves de controle apresentaram doença clínica grave ou morte aos 3 dias após o desafio com um tempo de morte médio (MDT) de 2,1 dias e as aves com doença clínica grave foram eutanasi- adas e registradas como mortas no dia seguinte como exigido pelos protocolos IACUC ( Figura 1).
[00121] A sorologia foi realizada em sangue colhido no dia do desafio, 4 semanas de idade e 2 ou 4 semanas após a vacinação. Nenhuma das aves de controle ou das aves de DNA único vacinadas tinham títulos de anticorpos HI detectáveis. Das aves vacinadas, 7 de 20 aves tinham títulos de anticorpos detectáveis variando de 4 a 32 no grupo duas vezes vacinado com DNA e 19 de 20 aves tinham títulos no grupo DNA/RG. O título médio geométrico para as aves que foram soroconvertidas foi 8,8 (23,14) e 16,6 (24,05) respectivamente. (Tabela 26)
[00122] Derramamento viral pós-desafio. Todas as aves de controle morreram ou foram sacrificadas no dia 3 após a o desafio, mas todas as aves, mortas ou vivas, foram esfregadas orofaringicamente no dia 2. Todas as aves vacinadas foram esfregadas ao dia 2 e todas as aves restantes foram amostradas no dia 4 pós-desafio. As aves de controle no dia 2 estavam derramando 107,1/EID50 com todas as aves derramando títulos semelhantes de vírus. As aves vacinadas com DNA único no dia 2 estavam derramando 106,6/EID50, o grupo vacinado em dobro com DNA estava derramando 105,4/EID50 logs de vírus e o grupo vacinado com DNA/RG estava derramando 102,9/EID50 logs de vírus, respectivamente (Figura 1). A quantidade de derramamento de vírus foi estatisticamente diferente (P = <0,001) entre os controles e o grupo vacinado duas vezes com DNA e as aves vacinadas com DNA/RG no dia 2 utilizando o Teste de Soma de Rank de Mann-Whitney.
[00123] A abordagem de vacina de reforço primário da vacina de DNA a um dia de idade e um reforço às 2 semanas foi eficaz em 95% contra o desafio enquanto que o grupo de tratamento que recebeu a vacina de DNA de 2 doses proporcionou proteção em 55% das aves vacinadas. A correlação foi extremamente alta que as aves que soro- converteram no teste HI com pelo menos um título de 4 sobreviveram o desafio e tiveram redução de derramamento. Estes resultados indicam que a vacina de DNA pode ser utilizada em ensaios de vacinação isolados ou em combinação.TABELA 26. Títulos de inibição de hemaglutinação por ave individual vacinada.
[00124] Títulos de inibição de hemaglutinação por ave individual vacinada. Os títulos HI positivos mínimos foram 4, de modo que os títulos medidos de 2 foram convertidos a 0 para o cálculo. Para os títulos de médias geométricas, as aves com títulos negativos não foram incluídas no cálculo.
EXEMPLO 6
[00125] Estudo de eficácia para a avaliação sorológica de adjuvante combinado com a vacina de DNA da presente divulgação em perus
[00126] O objetivo deste estudo foi estabelecer uma expectativa razoável de eficácia para uma vacina de DNA de alta patologia da gripe aviária (HPAI) usando os adjuvantes da presente divulgação. Isto foi obtido avaliando a capacidade da vacina de provocar uma resposta imune em perus. Para este fim, um DNA de plasmídeo contendo um gene modificado para o vírus da gripe aviária de alta via, A/gryfalcon/ WA/41088-6/2014 H5N8, a proteína de hemaglutinina (HA) foi combinada com adjuvantes VaxLiant e administrada através das vias subcu-tânea e intranasal.
[00127] O plasmídeo modificado, NTC8685-eRNA41H-KP307984. 1-HA-modificado codifica o gene HA da cepa A/gyrfalcon/Washington/ 41088-6/2014 (H5N8) do vírus da gripe aviária (AIV) de alta patogeni- cidade (HP). A sequência H5 foi modificada para alterar o síto de clivagem multibásico HP (PLRERRRKRGLF) para um sítio de clivagem monobásico. O gene H5 modificado foi produzido sinteticamente, clo- nado no vetor de expressão eucariótico otimizado NTC8685- eRNA41H, e o construto foi transformado na cepa de E. coli NTC4862.
[00128] A eficácia foi medida testando a soroconversão para o vírus inativado contendo o gene HA não modificado utilizando um ensaio de inibição da hemaglutinação.
Materiais e Métodos
[00129] ENABL 1 e 0,5X ENABL® 5 com pHA DNA (IVP 1 e 2) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) com DNA pHA (MPC), foi administrado subcutaneamente (SC) em cada ave, em que "ENABL® 5" é o nome comercial do Catálogo VaxLiant 70X0005. Cada grupo de tratamento IVP incluiu um mínimo de 22 aves e o grupo MPC 10 aves, foram inoculados no Dia 0. Os pássaros foram observados para a saúde geral para todo o estudo. Todas as aves foram inoculadas no dia de estudo 0. O sangue foi coletado cerca de 2 semanas após cada inoculação e testado para soroconversão.TABELA 27. Descrição de estudo1 SC - subcutâneo na base do pescoço; IN – intranasal TABELA 28. Artigos de teste TABELA 29. Cronograma do estudo
[00130] Via de administração. Aos pássaros foram administrados os artigos de teste quer por injeção subcutânea na parte de trás do pescoço, quer por via intranasal, escorrendo para as narinas. O Artigo de Teste foi administrado nos Dias 0 e 14. As aves em T01 receberam PBS via SC e representam MPC-1. As aves restantes foram inoculadas como descrito no Projeto de Estudo. No dia 14, as aves nos grupos T01, 02 receberam o produto e este foi o reforço. As aves dos grupos T03 não receberam um reforço.
[00131] Coleta e teste de amostras. O sangue foi colhido de cada ave nos grupos T01, 02 antes do dia da administração de reforço dos artigos de teste e no final do estudo de acordo com os procedimentos do local. As aves dos grupos T03 foram sangradas no dia 21 e no final do estudo. Deixou-se coagular o sangue e depois centrifugou-se para coletar o soro. O soro foi armazenado a 2-7 ou -18 ± 5oCO soro foi ensaiado quanto ao nível de soroconversão através da inibição de 4-8 unidades de hemaglutinação do vírus, A/gyrfalcon/WA/41088-6/2014 H5N8 BEI por BBL SOP LP-054.
[00132] Avaliação de Resultados / Análise de Dados. O soro foi ensaiado quanto ao nível de soroconversão através da inibição da hema- glutinação do vírus, A/gyrfalcon/WA/41088-6/2014 H5N8 BEI intacto, que continha o gene HA não modificado, por SOP LP-054 de BBL. O título de inibição da hemaglutinação (HAI) foi determinado para cada amostra de soro em cada grupo de tratamento. Resumidamente, diluições em série do soro foram incubadas com 4-8 unidades de hemaglu- tinina e finalmente adicionadas a glóbulos vermelhos de galinha. O título HAI foi relatado como o log inverso da última diluição onde há 100% de inibição da hemaglutinação viral específica em todas as repetições. Os títulos de HAI nas aves administradas com as várias formulações adjuvantes foram comparados.TABELA 30. Resultados. Eficácia de perusTABELA 30 Continuação
[00133] Os resultados indicam que os perus podem ser vacinados com a combinação DNA/adjuvante HPAI a um dia de idade. Além disso, as aves soroconvertidas seriam protegidas contra desafio homólogo com regime de duas doses quando administrado SC com a formulação testada neste estudo.
EXEMPLO 7:
[00134] As fórmulas adjuvantes da presente divulgação a serem testadas como os produtos veterinários de investigação (IVPs) neste estudo de perus foram ENABL® 1 e 6 formuladas com um DNA de plas- mídeo (pHA) contendo um gene de hemaglutinina modificada (HA) de um organismo altamente patogênico (HP) do vírus da gripe aviária AIV cepa A/ Washington/41088-6/2014 (H5N8). A sequência H5 foi modificada para alterar o sítio de clivagem multibásico HP (PLRERRRKRGLF) (SEQ ID NO. 1) a um sítio de clivagem monobásico. O gene H5 modificado foi produzido sinteticamente, clonado no vetor de expressão euca- riótico otimizado NTC8685-eRNA41H. O mesmo pHA foi misturado com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para servir como controle do placebo correspondente ao estudo (MPC).
[00135] O objetivo deste estudo foi estabelecer um tempo de retirada da vacina de DNA de 21 dias para perus inoculados com ENABL® 1 e ENABL® 6, em que "ENABL® 6" é o nome comercial do Catálogo VaxLi- ant 70X0006 e "ENABL® 1" contém os mesmos componentes do ENABL 6, mas o ácido caprílico (Labrafac) é substituído por lecitina.
Materiais e Métodos Projeto do Estudo
[00136] ENABL 1 e ENABL® 6 com pHA DNA (IVP 1 e 2) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) com DNA pHA (MPC), foi administrado subcutaneamente (SC) em cada ave. Cada grupo de tratamento consistiu em um mínimo de 10 aves inoculadas no Dia 0. Os pássaros foram observados para a saúde geral por vinte e um dias. Foram realizadas observações específicas do local nos dias 1 a 7, 14 e 21. Todas as aves que foram eutanasiadas devido à morbidade ou encontradas mortas após o Dia 0 de Estudo e antes do Dia 21 foram necropsiadas para determinar se a morte era um resultado de IVP ou MPC. Todas as aves restantes no dia 21 tiveram patologia e exames histológicos graves. O projeto do estudo está resumido na Tabela 31. TABELA 31. Descrição de estudo* Cada prod uto será identificado pelo número do lote atribuído. Uma dose de 0,2 mL dos produtos finais será administrada subcutaneamente no pescoço.
[00137] Os artigos de teste são descritos abaixo. Antes do uso no estudo foram designados artigo de teste de A a C, e identificados como tal durante o estudo para manter cegueira adequada. TABELA 32. DNA pHA, contendo ENABL® 1 (O produto veterinário in- vestigacional # 1) TABELA 33. pHA DNA, contendo ENABL® 6 (O Produto Veterinário Investigacional # 2) TABELA 34. pHA DNA PBS (O Controle de Placebo Combinado) TABELA 35. Cronograma d o estudo
Administração de tratamento - Dia 0
[00138] A avaliação da saúde, as observações clínicas e as observações propostas no local da injeção foram registradas no dia do tratamento. Cada pássaro foi injetado uma vez no espaço subcutâneo na parte média da parte posterior do pescoço com o produto designado. A dose foi de 0,2 mL por local.
Observações Clínicas, Observações no Local de Injeção e Eventos Adversos
[00139] Todas as aves foram observadas diariamente para o estado de saúde geral após a administração do artigo de teste, como indicado no cronograma do estudo. Os sinais clínicos foram classificados de acordo com os termos padronizados de baixo nível desenvolvidos pelo Dicionário Veterinário para as Atividades Regulatórias de Medicamentos (VEDDRA).
[00140] Os locais de injeção foram palpados, observados e registrados nos dias 1 a 7 e dia 14. No dia 21 ocorreu uma palpação e um exame finais do local da injeção de todos os locais injetados imediatamente antes da eutanásia e necrópsia.
Coleta das Amostras
[00141] Para a coleta de dados histológicos, coletou-se amostras de tecido dos locais de injeção e do tecido circundante. O patologista examinou o local da injeção para lesões graves relacionadas com anomalias no local da injeção.
Injeção no local de exame e pontuação
[00142] O local da injeção foi palpado e os resultados registrados. A pele foi incisada e o tecido subjacente examinado. Uma pontuação para o local da injeção foi atribuída durante a necrópsia pelo patologista, com base na presença de qualquer drenagem, abscesso, edema, hemorragia ou necrose. A manifestação mais grave em qualquer local de injeção determinada determinou a pontuação do local da injeção única atribuída pelo patologista ao local da injeção. No caso de mais de uma manifestação ser observada em um único local de injeção, as outras manifestações (menores e não pontuais) foram registradas, mas esses achados menos graves não reduziram a pontuação atribuída com base na manifestação mais grave.
Pontuação histológica no local de injeção
[00143] Cada tecido coletada foi examinado quanto a evidência histológica de reações no local. Quanto aos achados graves de necropsia, o grau MAIS SEVERO foi atribuído ao local da injeção e utilizado como pontuação histológica para o local.
Resultados e conclusões:
[00144] Para cada grupo de tratamento 14 aves sobreviveram à colocação inicial e período de estudo que preencheram os critérios de inclusão no estudo devido ao estado de saúde no momento da aclimatação. Os resultados das observações no local e da histopatologia grave na necrópsia são apresentados na tabela seguinte.TABELA 36. Resultados de Observações e Histopatologia grave1Número de animais com edema visível no final do período de observação de 21 dias 2Número de animais com resposta inflamatória perceptível na necróp- sia, leve a moderada. 3Número de animais com resposta fisiológica observável apenas mi-croscopicamente na necrópsia
[00145] Observações do local. Nenhuma das aves inoculadas com placebo foi pontuada para quaisquer respostas anormais, quer na observação do local quer no nível de necrópsia, todas as aves obtiveram resultados negativos para qualquer tipo de manifestações clínicas relacionadas com a vacina ou patologia relacionada com lesões. Para o grupo de tratamento T01 e T02 apenas 3 de 14 aves (6 aves no total) demonstraram algum edema no local de inoculação que poderia ser palpado no final do período de 21 dias. As aves restantes (22 aves) eram normais.
[00146] Necrópsia. Na necrópsia, as observações gerais de patologia grave para o grupo T01 indicaram que 6 das 14 aves não tinham nenhum tipo de lesão ou patologia associada com o local da injeção aos 21 dias, das 8 aves restantes apenas duas aves tiveram resposta inflamatória mais severa, as restantes foram moderadas a leves. Os resultados histológicos gerais indicaram que 7 de 14 aves não apresentaram infiltração visível indicativa de inflamação ou resposta imunológica aos 21 dias. Das 7 aves restantes, as observações foram moderadas. Nenhuma das aves apresentou contusões visíveis ou ferimentos relacionados com hemorragia no local da injeção.
[00147] As observações gerais de patologia grave para o grupo de tratamento T03, 7 de 14 aves não tiveram nenhum tipo de lesão ou patologia associada com o local da injeção aos 21 dias, sendo que as 7 aves que permaneceram apresentaram respostas mais leves. Os resultados histológicos gerais indicaram que 3 de 14 aves não apresentaram infiltração visível indicativa de inflamação ou resposta imunológica aos 21 dias, enquanto as restantes 11 aves indicaram alguma infiltração moderada a leve indicativa de resposta imune ou inflamação.
[00148] Os adjuvantes testados aqui apresentaram muito poucas reações no local visíveis durante a observação de 21 dias, os animais permaneceram saudáveis e não apresentaram qualquer desconforto. Somente na necrópsia, qualquer patologia pode ser vista por um patologista treinado, que também foram evidentes nas seções de histologia através de exame microscópico. Nenhuma das reações observadas em 21 dias (fim de estudo) na necrópsia por patologia grave teria sido considerada grave o suficiente para romper a linha de abate para processamento de aves. Todas as lesões que poderiam ser pontuadas após a necropsia eram leves a moderadas e pareciam estar se resolvendo indicando que dentro do tempo (vários dias) o tecido retornaria à aparência normal. Estes resultados indicam que o adjuvante seria considerado para aprovação de segurança de retirada de 21 dias, que é o menor tempo permitido pelo USDA para o uso de um adjuvante com uma formulação de vacina.

Claims (16)

1. Composição de adjuvante, caracterizada pelo fato de que compreende: um triglicerídeo de cadeia média, um polímero de ácido acrílico ou metacrílico; colesterol; e uma saponina, em que a saponina compreende Quil-A; em que a composição adjuvante é isenta de lecitina, e é formulada para administração por uma via de administração diferente da administração intraperitoneal.
2. Composição de adjuvante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o triglicerídeo de cadeia média é selecionado a partir do grupo que consiste em triglicerídeos de cadeia média EP, triglicerídeos de cadeia média NF, triglicerídeo de ácido graxo de cadeia média JPE, triglicerídeo caprílico/cáprico e combinações dos mesmos.
3. Composição de adjuvante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polímero de ácido acrílico ou meta- crílico é um carbômero.
4. Composição adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que: (i) o triglicerídeo de cadeia média compreende triglicerídeo caprílico; ou (ii) o polímero de ácido acrílico ou metacrílico compreende carboxipolimetileno.
5. Composição adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição adjuvante compreende ainda pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em solução salina, álcool, hidróxido de sódio e qualquer combinação dos mesmos.
6. Composição de adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o colesterol é colesterol derivado de vegetal.
7. Composição de adjuvante, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que o álcool é etanol.
8. Composição de adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o triglicerídeo de cadeia média está presente em uma quantidade de 0,01% a 5% em volume; em que o polímero de ácido acrílico ou metacrílico está presente em uma quantidade de 0,1% a 3% em volume; em que o colesterol está presente em uma quantidade de 0,001% a 3% em volume; ou em que a saponina está presente em uma quantidade de 0,001% a 0,5% em volume.
9. Composição de adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada pelo fato de que o álcool está presente em uma quantidade de 0,01% a 3% em volume.
10. Composição de adjuvante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que é formulada para uma via de administração selecionada a partir do grupo que consiste em sem agulha, transdérmico, intravenoso, intramuscular e subcutâneo.
11. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende:a composição de adjuvante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um antígeno.
12. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que: (i) o antígeno é selecionado do grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, um polissacarídeo e uma subunidade de qualquer um deles; (ii) o antígeno é uma sequência de ácido nucleico; ou (iii) o antígeno é uma combinação de qualquer um em (i) e (ii).
13. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que o antígeno é uma sequência de DNA modificada que codifica uma fração antigênica.
14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA modificada compreende ainda uma estrutura de plasmídeo de vacina eucariótica.
15. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que o antígeno é um produto derivado de um antígeno selecionado do grupo que consiste em um antígeno aviário, um antígeno porcino, um antígeno bovino, um an- tígeno humano, um antígeno canino, um antígeno felino, um antígeno símio, um antígeno caprino e um antígeno equino.
16. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de que é formulada para uma via de administração selecionada a partir do grupo que consiste em sem agulha, transdérmica, intravenosa, intramuscular e subcutânea.
BR112017010883-6A 2014-11-26 2015-11-27 Composições adjuvantes e de vacina BR112017010883B1 (pt)

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