CN111888468B - 一种免疫水佐剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物免疫技术领域，特别涉及一种免疫佐剂及其制备方法。本发明的免疫水佐剂，包括：丙烯酸聚合物、磷脂、霍乱毒素B亚单位和CpG‑ODN，还包括抗原稀释液。本发明的免疫水佐剂，不含有矿物油成分，避免了因油佐剂疫苗粘稠引起的注射部位肉芽肿，有效提高养殖户的经济效益；免疫增强效果好，不仅能够刺激体液免疫应答，还能够激发细胞免疫应答，单次注射即可；体内易吸收，毒副作用小，安全无残留，成本低，易产业化生产。

Description

一种免疫水佐剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物免疫技术领域，特别涉及一种免疫佐剂及其制备方法。
背景技术
接种疫苗是预防和治疗传染病的最具成本效益的方法，疫苗有效的免疫原性和安全性是该领域最重要的关注点。虽然传统疫苗，即经人工减毒、脱毒、灭活等方法制成的疫苗，通常具有更高的免疫原性，但这些疫苗不稳定且存在有限的回复毒力的潜在风险。与传统的疫苗相比，DNA疫苗、重组疫苗以及亚单位疫苗等新型疫苗相对安全。然而这些新型疫苗往往存在免疫原性较弱的情况，没有适当的佐剂很难成功作为疫苗，因此，迫切需要既安全又有强活性的佐剂来增强其免疫效果。
疫苗佐剂是一种先于或与抗原同时使用，自身不具备抗原特性的，但能够增强机体的非特异性免疫能力及抗原的免疫原性的物质。目前在兽医领域应用的佐剂主要包括盐类佐剂如氢氧化铝胶和磷酸铝等，微生物及微生物成分佐剂如脂多糖和霍乱毒素等，中药成分佐剂如蜂胶、生物碱、皂苷和植物油等，细胞因子佐剂如肿瘤坏死因子、淋巴毒素、干扰素和细胞白介素等，油乳佐剂如弗氏佐剂、白油佐剂和角鲨烯等，其它佐剂如脂质体、囊素肽和聚肌胞等。不同佐剂都有其优点和缺点，没有一种佐剂适用于所有抗原或动物，无法完全满足免疫需要。佐剂中添加了许多外源性物质，除了能够刺激机体产生所需要的免疫作用外，还可能引起一些副反应如局部炎症、残留、应激等，影响动物的安全。油乳佐剂是当前最常用的佐剂，它可以使单一或者多种抗原产生高滴度抗体且免疫周期较长，包被在油滴中的特异性抗原释放缓慢，能连续刺激机体产生特异性免疫应答；油滴能诱发机体局部产生炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖，增强体液和细胞免疫应答；特异性抗原包被在油滴中，避免被体液中的酶迅速分解，降低抗原分解速度，延长作用时间；油乳剂能将注射部位的特异性抗原经淋巴系统运送至全身的淋巴结和脾脏处，从而产生一种新刺激诱生抗体。其最主要的成分是油料。根据所用油料的区别可将油乳佐剂分成矿物油佐剂和非矿物油佐剂两种。矿物油佐剂是将矿物油、乳化剂(如Span-80、Tween-80)及稳定剂(如硬脂酸铝)按一定比例混合制备而成的，主要包括弗氏佐剂、白油司本佐剂和ISA206等，其特点是不稳定且粘稠，但在体内不能被代谢，毒副作用巨大。因此选择可代谢油取代传统的矿物油来制备更为安全、稳定、有效的新型免疫佐剂是目前佐剂研究的方向。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种新型的免疫水佐剂及其制备方法。该免疫水佐剂为水溶性佐剂，与常规油佐剂相比，不仅能够刺激体液免疫应答，还能够激发细胞免疫应答，而且安全无残留，易于注射，避免了因油佐剂疫苗粘稠引起的注射部位肉芽肿，有效提高养殖户的经济效益。
本发明的技术方案如下文所示。
本发明第一方面提供了一种免疫水佐剂，包括：丙烯酸聚合物、磷脂、霍乱毒素B亚单位和CpG-ODN。
根据本发明的一些实施方式，每100mL所述免疫水佐剂，包括：丙烯酸聚合物0.1～1g、磷脂2～10g、霍乱毒素B亚单位0.5～4mg和CpG-ODN 0.5～4mg。
根据本发明的一些实施方式，每100mL所述免疫水佐剂，包括：丙烯酸聚合物0.3～0.7g、磷脂4～7g、霍乱毒素B亚单位1～3mg和CpG-ODN 1～3mg。
根据本发明的一些实施方式，所述免疫水佐剂，还包括抗原稀释液。
根据本发明的一些实施方式，所述抗原稀释液为磷酸盐缓冲液、含吐温的磷酸盐缓冲液、含脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液或注射用水。优选地，所述抗原稀释液为磷酸盐缓冲液。
根据本发明的一些实施方式，所述丙烯酸聚合物为卡波姆。优选地，所述卡波姆选自卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941、卡波姆971、卡波姆974、卡波姆980和卡波姆981中的一种或多种。
根据本发明的一些实施方式，所述磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化大豆磷脂和氢化卵磷脂中的一种或多种。优选地，所述磷脂为大豆磷脂，更优选地，所述大豆磷脂选自大豆磷脂PC45、大豆磷脂PC50、大豆磷脂PC60、大豆磷脂PC70、大豆磷脂PC80和大豆磷脂PC90中的一种或多种。
根据本发明的一些实施方式，所述霍乱毒素B亚单位和所述CpG-ODN的质量比为1：0.5～1.5；优选为1：1。
根据本发明的一些实施方式，所述CpG-ODN的核苷酸序列为GGTGCATCGATGCAGGGG。
根据本发明的一些实施方式，所述免疫水佐剂的粘度为0.5cP至100cP。符合兽医药典标准，粘度过高，增加注射难度，影响疫苗吸收。
本发明免疫水佐剂能增强抗原的免疫原性和功效。能被施予佐剂的机体所代谢，并且对施用对象无毒。
本发明又一方面还提供了上述免疫水佐剂的制备方法，包括以下步骤：
丙烯酸聚合物母液制备：将丙烯酸聚合物用抗原稀释液溶解，浸泡过夜，调整pH为7～8，充分混匀，灭菌后备用；
磷脂母液制备：将磷脂用无水乙醇溶解，过滤除菌后备用；
免疫水佐剂的制备：向丙烯酸聚合物母液中加入磷脂母液、霍乱毒素B亚单位和CpG-ODN，混匀后，继续加入抗原稀释液使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂。
根据本发明的一些实施方式，丙烯酸聚合物母液制备中，丙烯酸聚合物与抗原稀释液的质量体积比为1:50～120g/mL。
根据本发明的一些实施方式，磷脂母液制备中，磷脂与无水乙醇的质量体积比为1:0.5～2g/mL。
本发明另一方面还提供了一种免疫水佐剂疫苗，包括如上所述的免疫水佐剂和免疫量的抗原。
抗原一词指，包括完整的病毒或细菌(活的或灭活的)、其分离部分或其提取物，或是亚单位(如用重组技术生产的)例如，一种纯化的蛋白质、蛋白质-多糖、蛋白质-脂多糖、脂多糖等，当它对于动物的血液呈外源性时，便刺激免疫系统形成特异性调节物，如B细胞、T细胞或巨噬细胞。
抗原可以是例如病毒、细菌或寄生虫。如果需要的话，这些病原体可通过化学或物理手段致死。在本说明书中，致死意味着灭活，例如，通过遗传物质和/或其它致命性成分的改变使得对之有免疫力的病原体不再能复制而灭活。杀死病原体的适宜化学剂例如甲醛、戊二醛、β-丙醇酸内酯、吖丙啶及衍生物，或者是能与属于所说病原体的反应性种类发生双功能或多功能性反应的其它化合物。杀死病原体的物理剂例如UV辐射、丫-辐射、“热休克”和x-辐射。所述细菌的病原体例如是副猪嗜血菌、猪链球菌、猪霍乱沙门氏菌；所述病毒的病原体例如是猪流感病毒、猪生殖呼吸综合征病毒和猪环状病毒。
本发明疫苗的配方中将应用有效量的抗原，即所用抗原的量能引起接种动物产生特异性的和足够的免疫应答，以使得在随后暴露于所说免疫的病原过程中能产生保护作用。所需要的抗原有效量取决于经免疫而寻求预防的病原类型和所用抗原类型。确定所说的抗原用量是在本领域技术人员已知的范围的。
抗原可用本领域已知的方法生产、或是购自商业来源。
根据本发明的一些实施方式，优选地，所述抗原选自猪瘟病毒E2蛋白、猪圆环病毒Cap蛋白、猪流行性腹泻病毒S蛋白、猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白和口蹄疫病毒VPI蛋白中的一种或多种。更优选地，所述抗原为猪瘟病毒E2蛋白。
本发明制备的疫苗，可用于人、哺乳动物、禽类的免疫接种，接种途径可采用皮下、肌肉、口服喷雾剂或鼻内途径给药。
本发明包含上述免疫水佐剂的疫苗能在接种后很短的时间内诱导高度的保护性免疫应答。
本发明另一方面还提供了上述免疫水佐剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：
丙烯酸聚合物母液制备：将丙烯酸聚合物用抗原稀释液溶解，浸泡过夜，调整pH为7～8，充分混匀，灭菌后备用；
磷脂母液制备：将磷脂用无水乙醇溶解，过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：向丙烯酸聚合物母液中加入磷脂母液、霍乱毒素B亚单位和CpG-ODN，混匀后，加入用适量抗原稀释液溶解的抗原，之后继续加入抗原稀释液使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。
本发明还提供包括一个或多个无菌容器的试剂盒，所述一个或多个无菌容器含有如上所述免疫水佐剂的组分。单个组分可存在于分开的无菌容器中，或者两种或更多种的组分可存在于单一的容器中，任选地，所述试剂盒还包括含有所需抗原的容器。
在一些实施方式中，所述试剂盒还可包括一套适当的说明书(通常为书面说明书)。所述说明书涉及免疫水佐剂或免疫水佐剂疫苗的用途，包括关于用于免疫调节的剂量、给药方案和施用途径等信息。
本发明的有益效果：
本发明的丙烯酸聚合物尤其是卡波姆，稳定性好，注射动物体后可缓慢释放抗原蛋白。大豆磷脂是植物性乳化剂，亲水性，无刺激、无毒副作用，帮助抗原吸收。CTB和CpG能够增强卡波姆的效果，进一步激活免疫细胞。本发明的免疫水佐剂，不含有矿物油成分，避免了因油佐剂疫苗粘稠引起的注射部位肉芽肿，有效提高养殖户的经济效益。免疫增强效果好，不仅能够刺激体液免疫应答，还能够激发细胞免疫应答，单次注射即可。体内易吸收，毒副作用小，安全无残留，成本低，易产业化生产。
附图说明
图1为不同疫苗的抗体效价图；
图2为不同疫苗在不同时间的抗体效价图；
图3为不同疫苗的抗体效价图；
图4为兔体热保护试验结果图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
试剂来源：
卡波姆：杭州卡波卡进出口有限公司；
大豆磷脂：西安晋湘药用辅料有限公司；
佐剂201：法国赛比克公司；
猪瘟兔化弱毒疫苗：四川海林格生物制药有限公司；
CpG-ODN：自行设计，由华大基因合成，核苷酸序列为：GGTGCATCGATGCAGGGG；
CTB，霍乱毒素B：购自Sigma公司，货号：C9903-5MG。
缩略词：
PBS：磷酸盐缓冲液；CpG-ODN：含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核糖核苷酸；BSA：牛血清白蛋白；CTB：霍乱毒素B亚单位。
实施例中所用卡波姆为卡波姆974。
实施例1疫苗安全性试验
第一组：BSA为抗原的免疫水佐剂疫苗
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
大豆磷脂母液制备：将3g大豆磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入大豆磷脂母液混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
第二组：
将“免疫水佐剂疫苗的制备”步骤中的“高速匀浆混合”用“高压均质”工艺替换，其它步骤和参数同第一组。
第三组：
将弗氏完全佐剂与BSA混合制备的疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
第四组：
将佐剂201与BSA混合制备的疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
实验动物：6～8周龄的SPF Bal/c小鼠，随机分为4组，每组3只。
试验过程：向每组小鼠皮下注射对应的疫苗100μL，每天观察小鼠的健康表现及存活情况，28天后采血测BSA抗体效价。
各组疫苗的安全性评价如表1所示。可以看出，采用高速匀浆工艺的疫苗、弗氏完全佐剂制备的疫苗和剂201制备的疫苗，安全性好，所有小鼠健康状况良好。而采用高压均质工艺制备的疫苗，小鼠出现消瘦、死亡，说明本发明的免疫水佐剂制备疫苗的时候应采用高速匀浆工艺而非高压均质工艺。
表1各组疫苗的安全性评价
组别 死亡数 存活数
第一组 0 3
第二组 2 1
第三组 0 3
第四组 0 3
实施例2疫苗效价实验
试验分组：
A组：不加任何佐剂，直接将BSA用PBS稀释至300μg/mL。
B组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
大豆磷脂母液制备：将3g大豆磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入大豆磷脂母液和1mg CTB和1mg CpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
C组：
以50mL为例
大豆磷脂母液制备：将3g大豆磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，将大豆磷脂母液和1mg CTB和1mg CpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
D组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入1mg CTB和1mgCpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
E组：实施例1第四组制备得到的疫苗。
实验动物：6～8周龄的SPF Bal/c小鼠，随机分为5组，每组3只。
试验过程：向每组小鼠皮下注射对应的疫苗100μL，20天后采血测BSA抗体效价。
结果如图1所示，为不同疫苗的抗体效价，可以看出，A组因为不含任何佐剂，效价最低；对于本发明的疫苗，效价最高，但佐剂中去掉卡波姆或大豆磷脂都会造成效价的大幅度降低。
实施例3疫苗在不同时间的抗体效价
A组：实施例2中的B组制备得到的疫苗。
B组：实施例1第四组制备得到的疫苗。
实验动物：6～8周龄的SPF Bal/c小鼠，随机分为2组，每组4只。
试验过程：向每组小鼠皮下注射对应的疫苗100μL，分别在7天、14天和21天采血测BSA抗体效价。
结果如图2所示，为不同疫苗在不同时间的抗体效价图。可以看出，本发明的免疫水佐剂制备的疫苗抗体效价明显高于市售佐剂201制备的疫苗；并且本发明的疫苗，抗体产生时间早，维持时间长。
实施例4免疫增强剂CTB和CpG增强活性验证实验
A组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
卵磷脂母液制备：将3g卵磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入卵磷脂母液混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
B组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
卵磷脂母液制备：将3g卵磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入卵磷脂母液和1mg CpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
C组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
卵磷脂母液制备：将3g卵磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入卵磷脂母液和1mg CTB，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
D组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
卵磷脂母液制备：将3g卵磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入卵磷脂母液和1mg CTB和1mg CpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
实验动物：6～8周龄的SPF Bal/c小鼠，随机分为4组，每组3只。
试验过程：向每组小鼠皮下注射对应的疫苗100μL，20天后采血测BSA抗体效价。
结果如图3所示，为不同疫苗的抗体效价，可以看出，A组因为只含卡波姆和卵磷脂，效价最低；B组和C组相对于本发明(D组)的疫苗，分别缺少CTB和CpG-ODN成分，从效价上看，缺少CTB成分影响更大。
实施例5
A组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
卵磷脂母液制备：将3g卵磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入卵磷脂母液和2mg CTB和2mg CpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
B组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
卵磷脂母液制备：将4g卵磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入卵磷脂母液和2mg CTB和2mg CpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
C组：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
卵磷脂母液制备：将5g卵磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入卵磷脂母液和2mg CTB和2mg CpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的BSA，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
D组：
将佐剂201与BSA混合制备的疫苗。BSA最终浓度300μg/mL。
实验动物：6～8周龄的SPF Bal/c小鼠，随机分为4组，每组3只。
试验过程：向每组小鼠皮下注射对应的疫苗100μL，20天后采血测BSA抗体效价。
经测试，A组效价为112000，B组效价为16000，C组效价为32000，D组效价为24000。说明，卵磷脂的用量对于效价存在一定的影响，但本发明的佐剂的效果整体好于市售佐剂201的效果。
实施例6猪瘟疫苗的兔体热保护试验
疫苗1(E2-4-1)：
以50mL为例
卡波姆母液制备：将0.25g卡波姆用20mL PBS溶解，4℃浸泡过夜，调整pH为7～8，磁力搅拌器充分混匀，使卡波姆变为凝胶，120℃，20min高压灭菌，灭菌后备用；
大豆磷脂母液制备：将3g大豆磷脂用3mL无水乙醇溶解，用0.22μm过滤器过滤除菌后备用；
免疫水佐剂疫苗的制备：在搅拌状态下，向卡波姆母液中逐滴加入大豆磷脂母液和1mg CTB和1mg CpG-ODN，混匀后，加入用适量PBS溶解的猪瘟病毒E2蛋白的4号蛋白，之后继续加入PBS至50mL，使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂疫苗。抗原最终浓度300μg/mL。
疫苗2(E2-4-2)：同疫苗1的制备，为疫苗1的平行对照。
对照1(Con-1)：生理盐水。
对照2(Con-2)：生理盐水。
实验动物：新西兰大白兔，每只1.5公斤，随机分为2组，每组2只。
试验过程：向每组兔子皮下注射对应的疫苗100μL或生理盐水。30天后攻毒，即，每只兔耳缘静脉注射1毫升、病毒含量为8000头份的猪瘟兔化弱毒疫苗。
体温记录：攻毒前2天和攻毒后2天，每天测2次体温。攻毒48小时后每隔6小时测一次体温，126小时体温测试结束。
结果如图4所示，为兔体热保护试验结果。与对照组相比，猪瘟E2蛋白作为抗原制备的疫苗免疫家兔一个月后攻猪瘟兔化弱毒，体温曲线没有明显上升，表明本发明佐剂可以帮助E2蛋白刺激兔体产生良好的免疫反应。
本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。

Claims (11)

1.一种免疫水佐剂，其特征在于，每100 mL所述免疫水佐剂由卡波姆0.3~0.7 g、磷脂4~7 g、霍乱毒素B亚单位1~3 mg、CpG-ODN 1~3 mg和抗原稀释液组成，其中磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化大豆磷脂和氢化卵磷脂中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的免疫水佐剂，其特征在于，所述抗原稀释液为磷酸盐缓冲液、含吐温的磷酸盐缓冲液、含脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液或注射用水。
3.根据权利要求2所述的免疫水佐剂，其特征在于，所述抗原稀释液为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1至3任一项所述的免疫水佐剂，其特征在于，所述卡波姆选自卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941、卡波姆971、卡波姆974、卡波姆980和卡波姆981中的一种或多种。
5.根据权利要求1至3任一项所述的免疫水佐剂，其特征在于，所述磷脂为大豆磷脂。
6.根据权利要求5所述的免疫水佐剂，其特征在于，所述大豆磷脂选自大豆磷脂PC45、大豆磷脂PC50、大豆磷脂PC60、大豆磷脂PC70、大豆磷脂PC80和大豆磷脂PC90中的一种或多种。
7.根据权利要求1至3任一项所述的免疫水佐剂，其特征在于，所述霍乱毒素B亚单位和所述CpG-ODN的质量比为1:0.5~1.5。
8.权利要求1至7任一项所述的免疫水佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
卡波姆母液制备：将卡波姆用抗原稀释液溶解，浸泡过夜，调整pH为7~8，充分混匀，灭菌后备用；
磷脂母液制备：将磷脂用无水乙醇溶解，过滤除菌后备用；
免疫水佐剂的制备：向卡波姆母液中加入磷脂母液、霍乱毒素B亚单位和CpG-ODN，混匀后，继续加入抗原稀释液使各组分在所需范围内，高速匀浆混合，得到免疫水佐剂。
9.一种免疫水佐剂疫苗，其特征在于，包括权利要求1至7任一项所述的免疫水佐剂和免疫量的抗原。
10.根据权利要求9所述的免疫水佐剂疫苗，其特征在于，所述抗原选自猪瘟病毒E2蛋白、猪圆环病毒Cap蛋白、猪流行性腹泻病毒S蛋白、猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白和口蹄疫病毒VPI蛋白中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的免疫水佐剂疫苗，其特征在于，所述抗原为猪瘟病毒E2蛋白。
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