JPH07504683A - Ｇｍ−ｃｓｆのワクチンアジュバントとしての利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＭ−Ｃ３Ｆのワクチンアジュバントとしての利用発明の分野 本発明は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）、特にヒト ＧＭ−Ｃ３Ｆの、ワクチンアジュバントとしての利用に関する。

発明の背景 自働免疫化とは、動物に免疫反応をもたらすためにその動物に抗原を投与するこ とである。微生物に対するワクチンとは、非免疫個体に接種された時に、その微 生物に対する自動免疫を授与するが疾病をもたらさない抗原調製物である。特異 性と記憶という二つの適応免疫システムの鍵となる要素は、その適応免疫システ ムが抗原に対して二回目に遭遇したときに非常により強い反応を増やすため、ワ クチン接種によって開発される。この二次性の免疫反応は、−成性の反応よりも 早（出現しより効果的である。ワクチン開発の原理は、抗原性を失うことな（無 害化するように微生物もしくはその毒（天然抗原）を変化させることである。

あるいは、問題となる生命体の抗原ポリペプチドを、遺伝子組み換え法または合 成化学によって生産し、有効なワクチンを生産することができる。

自働免疫化の過程においてしばしば遭遇する一つの問題は、ワクチンに使用され る抗原が、続く感染に対して防御を提供するために、または長期間に渡ってこの レベルを上げる能力を維持するために十分なレベルの抗体のタイターを生ずるの に十分な免疫原性を有していないことである。もう一つの問題は、そのワクチン が、バクテリアおよびウィルス感染に対する一次性の免疫防御である細胞性免疫 を誘導できないであろうということである。さらにもう一つの問題は、個々の患 者は免疫抑制状態にあるかもしれないということである。

より強い体液性および／または細胞性免疫を得るために、ワクチンをアジュバン トを含む製剤中で授与することが一般的である。アジュバントとは、抗原に対す る免疫反応を非特異的に増強する、もしくはアジュバントなしでは抗原に反応し ない個体を抗原に反応するようにさせる物質である。アジュバントは普通、抗原 と共に授与されるが、抗原投与の前または段に与えてもよい。哺乳類のワタチン 接種に適当なアジュバントは、アジュバント６５（ビーナツツオイル、マンニッ トモノオレイン酸エステル（ｍａｎｎｉｄｅ　ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）　、モノ ステアリン酸アルミニウムを含む）：フロインド（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ）完全ま たは不完全アジュバント：水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウム、みょうばん 等の無機物ゲル：ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジ メチルジオクタデシルアンモニウムプロミド、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’　 、　Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）−プロパンジアミン、メトキンへキサ デシルグリセロールおよびプルロニックポリオール等の界面活性剤；ピラン、硫 酸デキストラン、ポリＩＣ，ポリアクリル酸およびカルボポール等のポリアニオ ン：ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフツンン等のペプチド：お よびオイルエマルジゴンを含むが、これらには限定されない。抗原はまた、リポ ソームまたは池のマイクロキャリアーに取り込ませて投与することができる。

発明の要約 驚くべきことに、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）が効果的なワクチン アジュバントであることが発見された。

したがって、本発明は、ワクチン接種の必要な哺乳類に対して、有効量のＧＭ− ＣＳＦをワクチンと共に投与することを含む、ワクチンに対する哺乳類の免疫反 応を増強する方法を提供する。

好ましくは、処置される哺乳類はヒトであり、使用されるＧＭ−Ｃ３Ｆはヒトの アロタイプの一つである。好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦはワクチンの投与の１から １４日前または１から１４日後に、約０．１から１００μｇ／ｋｇ体重が投与さ れる。

本発明はさらに、有効量のＧＭ−Ｃ３Ｆ、天然、合成または組み換え体抗原およ び薬学的に受容しつるキャリアーを含む医薬組成物を提供する。

本発明はまた、その中に含まれるＧＭ−Ｃ３Ｆの医薬組成物を有する第一の容器 、およびその中に含まれるワクチンの医薬組成物を有する第二の容器を含む、ワ クチン中の抗原に対する哺乳類の免疫反応を増強するためのキットを提供する。

発明の詳細な説明 本明細書に引用される参考文献の教示をすべて、本明細書の一部としてここに引 用する。

本発明によれば、我々は驚（べきことに、ワクチンと共に有効量のＧＭ−Ｃ５Ｆ を投与することにより、哺乳類、特にヒトのワクチンに対する免疫反応を効果的 に増強しうろことを発見した。本明細書において使用される「と共に」という用 語は、Ｇ１１−Ｃ３Ｆをワクチンの投与と同時、前もってまたは後に投与するこ とを指す。

本明細書において使用されるｒＧＭ−Ｃ３ＦＪは、（ａ）Ｌｅｅら（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾、８２・４３６０（１９８５））に記載される成熟型（す なわちシグナル配列を欠く）ヒトＧＭ−ＣＳＦの配列と実質的に同一なアミノ酸 配列を有する、および、（ｂ）天然型ＧＭ−Ｃ３Ｆに共通の生物活性を有する蛋 白質を意味する。

アミノ酸の実質的な同一性とは、配列が同一であるか、または生物活性を実質的 に損なわない一つ以上のアミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）によって異なって いることを意味する。ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの間では、塩基配列およびアミノ酸のへ テロジエナイティーが観察されている。たとえば、ヒトＧＭ−ＣＳＦのＮ末端に 関して第１００位のアミノ酸の位置で、スレオニンとイソロイシンの両方が観察 されている。また、Ｓｃｈｒｉｍｓｈｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４７ ：１９５　（１９８７））は、第８０位のメチオニン残基がイソロイシン残基に よって置換されているヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの変異体を報告している。

マウスおよびテナガザル（わずかに３つのメチオニンを有する）およびラット等 の他種のＧＭ−Ｃ３Ｆもまた本発明の意図するものである。原核生物の発現シス テムで生産される組み換え体ＧＭ−ＣＳＦはまた、当該技術分野において良（知 られるように、追加のＮ末端メチオニン残基を有しうる。糖化されているか（す なわち、天然資源由来または真核生物発現システム由来）、または糖化されてい ない（すなわち、原核生物発現システム由来または化学合成）のどちらであろう が、実質的な同一性の要求に合致するいかなるＧＭ−Ｃ３Ｆも含まれる。

本発明において使用されるＧＭ−Ｃ３Ｆは、天然資源から得ることができる（米 国特許Ｎｏ、　４．４３８．０３２　：　Ｇａ５５ｏｎら、同上ＨＢｕｒｇｅｓ ｓら、同上ＨＳｐａｒｒｏｗら、同上：Ｗｕら、同上）。天然に存在するＧＭ− Ｃ３Ｆと実質的に同一のアミノ酸配列および活性を有するＧＭ−Ｃ３Ｆを本発明 において用いることができる。ＧＭ−Ｃ３Ｆの相補鎖ＤＮ＾（ｃＤＮ＾）は、多 くの研究室、例えばＧｏｕｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ、’３０９；７６３　（１９８ ３）　（マウス）ＨＬｅｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 、８２：４３６０　（１９８５）　（ヒト）；Ｗｏ口ｇら、５ｃｉｅｎｃｅ、２ ２８：８１０　（１９８５）　（、ヒトおよびテナガザル）　ＨＣａｎｔｒｅｌ ｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８２＋６２５０　（１９８５）　（ヒト）によりクローンされ塩基配 列が決定された。

ＧＭ−ＣＳＦはまた、Ｉｍｍｕｎｅｘ、　Ｉｎｃ、（Ｓｅａｔｔｌｅ、　Ｗａｓ ｈｉｎｇｔｏｎ）　、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−ＰｌｏｕｇｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 　（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）およびＧｅｎｚｙｍｅ　 Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　（Ｂｏｓ狽盾氏B ＭＡ）から得ることができる。

アジュバント活性は、さもなければワクチンに対してまったく反応しないであろ う個体の免疫反応の発達による、免疫を介する防御の有意な増加によって明らか に示される。体液性免疫の増強は、その抗原に対する抗体のタイターの有意な増 加によって典型的に示される。

ワクチンと共にＧＭ−ＣＳＦを投与することを提供する本発明の方法は、以下の 優位性を有する。ＧＭ−ＣＳＦの存在下ではより少ない抗原が少なくとも通常の 量のワクチンの投与で達成されるのに匹敵する免疫反応を引き出すであろうこと により、投与されるワクチンの全体の抗原負荷を減少することができる。本発明 にしたがってＧＭ−Ｃ３Ｆを投与することにより、ワクチン接種毎により少ない 抗原が必要とされるため、現在使用されているいくつかのワクチンにともなう望 ましくない副作用の可能性を減少することができる。

ワクチン接種に対してあまり反応しないあるタイプの個体の免疫反応は、ワクチ ンと共にＧＭ−Ｃ３Ｆを投与することにより増強される。本発明の方法により恩 恵を受けるべき個体のタイプは、（１）免疫反応が傷害されているタイプ、（２ ）正常に見えるにもかかわらずあるワクチンに対して反応しない個体、ならびに （３）放射線照射および化学療法等の免疫を抑制する治療を受けている個体を含 む。

このように我々は、（１）ワクチン中に存在する抗原に対する哺乳類における効 果的な一次免疫反応を増強する、（２）ワクチン中の抗原にさらされた哺乳類に おける効果的な抗体レベルを増強する、および（３）　ＧＭ−Ｃ３Ｆの投与なし にはその哺乳類による免疫反応が充分に強くまたは充分に早く病気を防ぐことが できない場合に、ワクチン中に存在する抗原に対する哺乳類における一次免疫反 応を増強するための効果的な方法を発見した。

本発明にしたがって使用されることが意図されるワクチンには、自動免疫化に使 用されるバクテリアワクチン、トキソイドワクチン（非活性化毒）およびウィル スワクチンまたはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではな い。例えばごＩｍｍｕｎｉｚｉｎｇ　Ａｇｅｎｔｓ″ｉｎ　Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ■ １４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　１９９０　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ 、の７５章、１４２６ページから１４４１ページおよび、米国食品医薬品局（Ｆ ｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって認可され Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、　４６ｔｈ　Ｅｄ、 　１９９２の２０８ページから２０９ページ（産物分類インデックス）に記載さ れている抗毒素、トキソイド、ワクチンおよび生ワクチンを参照のこと。適当な バクテリアワクチンは、以下のような疾患の本体または状態に対するバクテリア ワクチンを含む：コレラ、百日ぜき、ペスト、腸チフス、髄膜炎、肺炎、Ｈ，１ ｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプＢ１らい病、りん病、グループＢ髄膜炎菌、グループ Ｂ連鎖状球菌、グラム陰性敗血症、大腸菌敗血症および緑膿菌。

適当なトキソイドは、ジフテリア毒、ボッリヌス毒および破傷風両前を含む。適 当なウィルスワクチンは、以下のような疾患の本体または状態に対する生または 非活性化ワクチンを含む：小児マヒ、風疹、黄熱、耳下腺炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝 炎およびインフルエンザ。

適当な「多種抗原」は、ジフテリアおよび破傷風トキソイド、ジフテリア、百日 ぜきおよび破傷風トキソイドの三重抗原（例えばＣｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ。

５ｖｉｆｔｅｖａｔｅｒ、　ＰＡ　１８３７０から入手可能）を含む。異なった 国々で使用される広範囲のウィルス株および細胞基質、および様々な免疫スケジ ュールは、Ｗｈｉｔｅ、　Ｄ。

０、、　ａｎｄ　Ｆｅｎｎｅｒ　Ｆ、、　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　 ３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　（＾ｃａｄｅｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ@１９８６）に 開示されている。

さらに、典型的にはＧＭ−Ｃ３Ｆは、弱い（すなわちレベル、程度および、また は期間の点で減少した防御を提供する）と考えられる動物またはヒトワクチンに よって与えられる防御を増強するために使用される。そのようなワクチンの例と しては、ボルデテラ細菌ワクチン、大腸菌細菌ワクチン、ヘモフィルス細菌ワク チン、レプトスピラ細菌ワクチン、モラクセラ細菌ワクチン、パスツレラ細菌ワ クチン、ビブリオ細菌ワクチン、肺炎ワクチン、およびＢ型肝炎、＾＆Ｂインフ ルエンザ、牛呼吸病ワクチン、感染性牛鼻気管炎、バラインフルエンザ−３、呼 吸器シンシヂウムウイルス、牛ウィルス性下痢ワクチン、馬インフルエンザワク チン、猫白血病ワクチン、猫呼吸病ワクチン、鼻気管炎カリチ肺炎ウィルス、イ ヌパロポウイルスワクチン、伝染性胃腸炎ワクチン、仮性狂犬病ワクチンおよび 狂犬病ワクチン等の弱毒化生または死滅ウィルス産物または組み換え体抗原性ウ ィルス産物がある。

本発明にしたがって投与されるＧＭ−Ｃ３Ｆの効果的な量に関して本明細書にお いて使用される「有効量」という用語は、ワクチンがＧＭ−ＣＳＦなしで投与さ れるよりも感染物質からの増加した防御を提供するのに充分な抗体レベルの増加 をもたらすＧＭ−ＣＳＦの量を意味する。しかしながら、有意な抗体レベルの増 加は比較的小さいかもしれないことに注意しなければならない。投与されるＧＭ −Ｃ３Ｆの有効量は、体重ｋｇあたり０．１から５００μｇのＧＭ−Ｃ３Ｆであ る。さらに好ましくは、投与される有効量は体重ｋｇあたり１μｇから１００μ ｇであり、最も好ましくは５から５０μｇのＧＭ−ＣＳＦである。

投与の量、頻度および期間は、特異的な抗体タイターのレベル、誘導される抗体 のクラス、ワクチンのタイプ、ならびに患者の年齢および一般生理状態等の因子 に依存して変化する。ＧＭ−Ｃ５Ｆは、ワクチン投与の前、同時または後に投与 することができる。好ましくは、ＧＭ−Ｃ３ＦのｍｍＩがワクチン投与の１から １４日前に患者に投与される。最も好ましくは、ＧＭ−Ｃ５Ｆはワクチン投与の ２４時間前または後に投与される。

Ｇ１１−ＣＳＦはワクチンと混合して投与してもよいが、通常はワクチンとは別 に投与される。ＧＭ−ＣＳＦをワクチンと混合する場合には、投与される組成物 は、ある病原体または抗原に特異的な反応を引き出すのに有効な免疫原、薬学的 に受容しつるワクチンのキャリアーおよび免疫を増強しつる量のＧＭ−ＣＳＦを 含有する。ＧＭ−ＣＳＦの投与は、皮下、静脈内、腸管内、筋向、または他のい かなる受容可能な方法１こよっても行うことができる。好ましくは、ＧＭ−Ｃ３ Ｆは、ワクチンの投与前に、ワクチンが投与される部位と同一の部位に投与され る。上記の投薬形式によって意図される製剤および医薬組成物は、一般に薬学的 に受容しうる賦形剤および添加物と共に、一般的な技術により調製することがで きる。他のアジュバントを、ワクチンと共にまたはワクチンとＧＭ−Ｃ３Ｆと共 に投与してもよい。

らし、ワクチンを一定の期間にわたって？ｘ数回投与する場合には、後のワクチ ンのｔα与毎に追加のＧＭ−Ｃ３Ｆを共に投与しうる。ワクチンの後の投与毎に 共に投与されるＧＭ−Ｃ３Ｆの量は、最−刀のワクチンと共に投与されるＧＭ− Ｃ３Ｆの量より多いか、同じかまたは少なくてもよい。ワクチンの後の投与毎に 共に投与されるＧ１１−Ｃ３Ｆの量は、最初のワクチンの投与後の患者の抗体反 応に依存するであろう。

投与される６ト０Ｆの溶液は、凍結乾燥した粉末から再構成され、さらに防腐剤 緩衝液、分散剤等を含むことができる。好ましくは、ＧＭ−Ｃ５Ｆは、通常皮下 投与に使用される等張媒体、例えば防腐剤を含まない滅菌水で再構成される。

薬物のより長い血清半減期をもたらすようなＧＭ−Ｃ３Ｆの徐放製剤を投与する こともできる。そのような製剤の例は以下のとおりである。

製剤！ 成分 凍結乾燥ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１０−１０−１Ｏ００酢酸亜鉛　４．０ｍｇ 硫酸プロタミン　２．５ｍｇ 水酸化ナトリウム　０．６ｍｇ 注射水（充分量）　１ｍｌ 製剤１にしたがってＧＭ−Ｃ３Ｆの徐放調製物を製造するためには、凍結乾燥し たＧトＣ３Ｆを一部の注射水に溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．２ に調整する。硫酸プロタミンを加えて混合物を撹拌し、次に酢酸亜鉛を加えて混 合物を再び撹拌する。残りの注射水で全溶液を最終体積に合わせる。好ましくは 、水酸化ナトリウム、硫酸プロタミンおよび酢酸亜鉛は濃度の高い水溶液（例え ば、プロタミンなら２５ｍｇ／ｍｌの水溶液を１００μｌ）として加える。

製剤２ 成分 凍結乾燥ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１１０−１Ｏ０ｈｃ再構成のための注射水　０．２ｍｌ ジオクチルナトリウムスルホスクンネート　ｌｏｇエマルション用ビーナツツオ イル　２ＩＩｌｌゲル用ビーナツツオイル　２Ｑｌｌ モノステアリン酸アルミニウム　５０ｍｇ袈削２にしたがってＧＭ−Ｃ３Ｆの徐 放調製物を製造するためには、モノステアリン酸アルミニウムをゲル用ビーナツ ツオイルに混合し、公知の方法にしたがってゲルを形成するために温度を上昇さ せる。

ジオクチルナトリウムスルホスクシネートを注射水に溶解する。凍結乾燥したＧ Ｍ−Ｃ３Ｆを、ジオクチルナトリウムスルポスクシネート溶液で再構成し、得ら れる溶液をエマルジョン用ビーナツツオイル中に移してポルテックスにより混合 する。

得られるエマルジョンを前に調製したゲル化したビーナツツオイル中に混ぜて、 ポルテックスにより混合する。

對に良 成分 凍結乾燥ＧＭ−Ｃ５Ｆ　１０−１０−１Ｏ００酢酸銅　０．２ｍｇ 燐酸二ナトリウム　２．２７ｍｇ 燐酸−ナトリウム　０．５５ｍｇ 水酸化ナトリウム　０．５＋ｃｇ 注射水（充分量）　１ｍｌ 製剤３にしたがってＧＭ−Ｃ３Ｆの徐放調製物を製造するためには、燐酸−ナト リウムおよび燐酸二ナトリウムを一部の注射水に溶解する。次に凍結乾燥ＧＭ− Ｃ５Ｆをこの溶液に溶解し、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．８に調整する。

次に酢酸銅を加え、溶液を撹拌する。残りの注射水でこの溶液を最終体積に合わ せる。好ましくは、水酸化ナトリウムおよび硫酸鋼は１度の高い水溶液（例えば 、硫酸銅なら２ｍｇ／ｍｌの水溶液を１００μｌ）として加える。

別の徐放製剤 ＧＭ−Ｃ３Ｆの別の徐放製剤は、ポリアンヒドリド、ポリホスファジン、コラー ゲン、アルギネート、ポリ　（メタクリレート）、ゼラチン、ポリ　（ヒドロキ シブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、エチレンビニルアセテートまたはポ リラクチドグリコリド等のポリマーを使用して調製したＧＭ−Ｃ３Ｆの微小カプ セルまたはマイクロスフェア−を使って調製することができる。

ＧＭ−Ｃ３Ｆの徐放製剤はまた、ポリエチレングリコール、デキストランポリ（ アミノ酸）および池の同様なポリマーを使用してＧＭ−Ｃ３Ｆの（ヒ学コンツユ ゲートとじて調製することができる。

ワクチンの免疫反応を増強するＧＭ−Ｃ３Ｆの効果は、以下の非限定的ヒト臨床 データによって例証されるが、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならな い。

実施例１ 組み換え体ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは、Ｂ型肝炎ワクチンに反応しなかった透析患者の 組み換え体Ｂ型肝炎ワクチンの効果を増強することが示された。

本実験の目的は、ＧＭ−Ｃ３Ｆと肝炎ワクチンの同時投与が、以前肝炎ワクチン 接種に反応しなかった腎疾患を持つ患者に対する免疫反応を回復しうるかどうか を決定することであった。

少なくとも３回のＢ型肝炎ワクチンの接種の試みにおいて、Ｂ型肝炎ウィルス表 面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗体タイターから判断して反応しなかった１５人 の透析患者をＧｌｊ−ＣＳＦで処置した。６人の患者は、患者の体重ｋｇあたり ０．５μｇのＧＭ−Ｃ８Ｆ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、　Ｋｅｎｉｌｗ ｏｒｔｈ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、　ＵＳＡによって大腸菌発現システムで生 産されたもの）を皮下に投与され、５人の患者は、患者の体重ｋｇあたり５μｇ のＧＭ−Ｃ３Ｆを投与され、４人の患者は、患者の体重ｋｇあたり１０μｇのＧ Ｍ−Ｃ３Ｆを投与され、そして投与部位に印をつけた。ＧＭ−Ｃ３Ｆの投与後２ ４時間において、患者はそれぞれ、ＧＭ−Ｃ３Ｆを投与された場所と同じところ に４０μｇのＢ型肝炎ワクチン、ＨＢｖａｘ（登録商標）　（Ｍｅｒｃｋ、　５ ｈａｒｐ　ａｎｄ　Ｄｏｈｍｅ、Ｇｍｂｈ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｆｅｄｅ ｒａｌ　Ｒｅｐｕｂｌｉ■ ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ）を投与された。ワクチン投与の４週間後、患者から血液 サンプルを採取し、サンプルを抗Ｂ型肝炎抗体の存在について調べた。結果は以 下の表に示す。

！≧ユ ＧＭ−Ｃ３Ｆの用ｆｉｔ　（μｇ／ｋｇ　ｖｔ、　）　）ｌＢｓＡｇに対する抗 体タイター　本単位／　ｌ　ｉ　ｔｅｒｏ、５０ ０、５　７１０ ５・０　２６００ 本　１単位は、標準ＥＬＩＳＡで最大反応の半分の反応をもたらす血清希釈率の 逆数として定義される。

上記に示されたデータに見られように、ＧＭ−Ｃ３Ｆは、Ｂ型肝炎ワクチンと共 に使用される効果的なアジュバントであった。

書漫準昭 組み換え体ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは、老齢患者におけるインフルエンザウィルスワク チンの効果を増強することが示された。

汎流行性（インフルエンザ＾）および流行性（インフルエンザ＾とＢ）の間に生 ずるヒトインフルエンザウィルスは、慢性疾患を有している老齢者のみならず、 明らかに健康な老齢者においても重大で過度な疾病率および死亡率を引き起こす 。

インフルエンザワクチンは、疾病率と死亡率の両方を減少させる恩恵を提供する ことが示されているため、インフルエンザワクチンは、インフルエンザ関連の合 併症を生ずる危険性が高い患者に強く推奨されており、危険性が高い患者にワク チン接種を行う努力に毎年多大な財源が費やされている。

しかしながら、大規模な免疫プログラムにも関わらず、インフルエンザは老齢者 において病気と死の重大な原因の一つとして留まっている。２がら３回の標準ワ クチン投与または最初の投与ｉ１１ケ月でのブースター投与等のいくつかの方法 は、老齢者のインフルエンザワクチンに対する免疫反応を改善することはないこ とが示されている。

したがって、インフルエンザワクチンへの免疫反応が組み換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆの 投与によって増強されるかどうかを決定するために、二重盲検でブラシーポを対 照とした用量上昇治験が行われた。組み換え体ＧＭ−ＣＳＦ　（Ｓｃｈｅｒｉｎ ｇ−Ｐｌｏｕｇｈ。

Ｋｅｎｉｌｖｏｒｔｈ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、　ＵＳＡによって大腸菌発現 システムで生産されたもの）の５つの異ナル用量、すなわちｏ、２５．０．５． １．２．５．５．ｃｚｇ／ｋｇを、プラシーポとの比較において試験した。６０ 人の健康な老齢被験者が対象となった。対象者は、フランス類１９９２−１９９ ３の三種が混合されたインフルエンザワクチン（＾／シンカポール／６／８６［ １’１ｌＮ１］、＾／北東京／３５３／８９［Ｈ３Ｎ２］およびＢ／／形／１６ ／８８）　（Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｖａｃｃｉｎ刀B Ｍａｒｎｅｓ−１ａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）を片方の腕に筋肉内 投与される直前に、組み換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆまたはプランーボを他方の腕に皮下 投与された。特異的な血球凝集素阻害（ＥＩＡＩ）抗体の３つのインフルエンザ ウィルス株に対するタイターを、ワクチン投与前、ワクチン投与後１，３および ６週間において決定した。インフルエンザワクチンと共にプラシーボ投与された １５人の患者の内の一人も、３つ全ての株のインフルエンザワクチンに対する同 時血清転換を示さながったが、２．５および５μｇ／ｋｇの組み換え体ＧＭ−Ｃ ３Ｆを投与された９人の患者の内、５人（５６％）および３人（３３％）が３つ 全ての株に対して血清転換した。

使用されたプロトコールを、以下により詳細に記述する。

材料および方法 患者の選択　患者は健康な老齢者で両性を含み、少な（とも６５才であった。ボ ランティアは、病歴および、完全な血球細胞数計測、生化学、尿検査および血清 検査を含む試験室検査により資格審査された。対象者は、Ａ−ＨＩＮＩおよびＢ インフルエンザで１．４０以下の血球凝集素阻害（ＩＩＡＩ）抗体のタイターを 、およびフランス類１９９２−１９９３インフルエンザワクチン中に含まれるＡ −Ｈ３Ｎ２インフルエンザ株で１・８０以下のタイターを持っていなければなら ながった。激しいがまたは不安定な慢性の疾患または悪性腫瘍を持つ対象者、抗 癌剤または免疫抑制薬を服用している対象者、試験室検査による審査で重大な異 常な結果を示した対象者、卵に対するアレルギーを持つ対象者、過去６ケ月間に インフルエンザ様の病歴がある対象者、または試料採取の際に急性の病気であっ た対象者は、治験から除外された。

治験デザイン　治験は、二重盲検、ブラシーボ対照、用量設定試験として設計し た。

薬物投与およびワクチン接種　この治験に参加した６０人の対象者は、１２人毎 に５つのグループに分けられた。各グループは単回の０．２５．０．５．１．２ ．５．５μｇ／ｋｇの用量の組み換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆまたはブラシーポを投与さ れた。全ての対象者は、＾／シンカポール／６／８６［ＨＩＮ１］、＾／北東京 ／３５３／８９［Ｈ３Ｎ２］およびＢ／／形／１５／３３　（ＰａｓｔｅｕｒＶ ａｃｃｉｎｓ、　Ｍａｒｎｅｓ−１ａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）か らのＨＡｓを各１５μｇを含む、ライセンスを与えられた１９９２−１９９３三 種サブピリオン（ｔｒｉｖａｌｅｎｔ　５ｕｂｖｉｒｉｏｎ）ワクチン０、５０ ＋１を左腕の三角筋の範囲に筋肉的投与された直後に、組み換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆ またはブラシーボを右腕の三角筋の範囲に皮下投与された。

試料採取　血清およびウィルス培養のための咽喉綿棒は、治験の開始前、ワクチ ン接種後１．３および６週間用に各対象者から得た。

血清抗体　インフルエンザワクンンがボール［ＮＨＩＮｌ］、Ａ／北京［Ｈ３Ｎ ２］およびＢ／／形ウィルス抗体に対するｌｌＡｌ抗体は、標準的な血球凝集素 阻害アッセイによって血清試料中で測定した。６週目までに採取された血清の予 備的な解析の結果は、同一の試薬を使用して、同一日に全ての試料を試験して得 た。最初の希釈は１：２０であった。■＝２０以下の１１＾Ｉ抗体のタイターは 、「検出不能」なタイターと定義した。

統計解析　抗体タイターに従った成功は、２つの異なった方法において定義され たニ ー　血清転換（Ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）　：　６週目における、投与前 に対する１（ＡＩ抗体ダイターの４倍の増加 −白消防１ａ１１１　（Ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）　：投与前より高く、 かつ、少なくとも６週目においてｌ・４０に等しいＩＡＩ抗体タイターこれらの 定義に基づいた成功の数は、フィソノヤーの検定法（Ｆｉｓｈｅｒ’　ｓ　ｅｘ ａｃｔｔｅｓｔ）を使用して解析した。異なる用量群のブラシーポ群は一緒にま とめた。

結果 対象者の特性　本試験に参加した６０人金石の健康老齢ボランティアは、６週目 の評価を終了した。表３は、投与前のｌｌＡｌ抗体タイターを示す。はとんどの 対象者は、投与前の■ＡＩ抗体タイターが防御レベルより低い、すなわち１：４ ０以下であった。投与前タイターの分布は、はとんどの患者が検出限界以下の抗 体タイターであった０、５μｇ／ｋｇ投与群を例外として、全ての処置群で同等 であった。

免疫反応　表４は、ＧＭ−ＣＳＦまたはブラシーポおよびインフルエンザワクチ ンを投与後６週において、３つ全ての株に対して血清転換を起こした患者の数を 示す。

結果はまた、各株毎に分けて示される。

インフルエンザワクチンと共にプラシーボを投与された１５人の対象者の内では 、−人も３つ全てのインフルエンザウィルス株に対して同時に血清転換すること はなかったが、２．５μｇ／ｋｇの組み換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆで処置された９人の 内５人（５６％）、５μｇ／ｋｇの組み換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆで処置された９人の 内３人（３３％）が３つ全ての株に対して血清転換した。さらに、各インフルエ ンザ株に分けて調べた時の結果では、２．５と５μｇ／ｋｇの組み換え体ＧＭ− ＣＳＦでの血清転換率は一貫してブラシーポ群（１３％から２０％の範囲）で観 察されたよりも高かった（４４％から６７％）。興味深いことに、最も低い用量 群（０，２５μｇ／ｋｇ）で観察された血清転換率は、０．５または１ａｇ１ｋ ｇ群で観察された率より高かった。

表５に示すごと（、この結果の結論は、”血清防御”を成功の定義として使用し た場合にも変わらない。予期されたように、血清防御は血清転換より達成するこ とが容易であるため、血清防御率は全ての処置群において血清転換率より高い。

ここでもまた、組み換え体ＧＭ−Ｃ３Ｆで処置された患者はプラシーポで処置さ れた患者よりもインフルエンザワクチンに対する免疫反応率で高い値を示した。

事実、２．５μｇ／ｋｇで処置された患者９人の内の５人（５６％）、５μｇ／ ｋｇで処置された患者９人の内の３人（３３％）が３つ全ての株に対して防御さ れた一方、ブラシーポで処置された１５人の内の１人（７％）のみが３つ全ての 株に対して血清防御した。

平成　７年　１月　９日− 特５′［庁長官　高　島　章　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９３１０６２９８ ２、発明の名称 ＧＭ−Ｃ３Ｆのワクチンアジュバントとしての利用３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名称　シエリング・コーポレーション ４、代理人 住　所　東車都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 （１）請求の範囲を以下の通りに補正する。

［１，ワクチンに対する哺乳類の免疫反応を増強する方法であって、ワクチン接 種を必要とする哺乳類に対して、有効量のＧＩ［−Ｃ５Ｆをワクチンと共に投与 することを含む方法。

２、　有効量のＧ１１−Ｃ３Ｆおよびワクチンを含む医薬組成物。

３、ワクチン中の抗原に対する哺乳類の免疫反応を増強するためのキットであっ て、ＧＭ−Ｃ５Ｆおよびそのための薬学的に受容しうるキャリアーの医薬組成物 の容器、およびワクチンおよびそのための薬学的に受容しうるキャリアーの医薬 組成物の容器を含むキット。Ｊ 以上 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ、　ＣＡ。

ＣＺ、ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、 ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　スタパク、エリオツドアメリカ合衆国ニューシャーシー州０７ ００６゜ウェスト・コールドウェル、ウッドランド・ロード　１１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ワクチンに対する哺乳類の免疫反応を増強する方法であって、ワクチン接種 を必要とする哺乳類に対して、有効量のＧＭ−ＣＳＦをワクチンと共に投与する ことを含む方法。
2. ２．ワクチンがＢ型肝炎ワクチンおよびインフルエンザワクチンからなる群より 選択される、請求項１記載の方法。
3. ３．投与されるＧＭ−ＣＳＦが徐放製剤内に含まれる、請求項１記載の方法。
4. ４．ワクチンに対する哺乳類の免疫反応を増強するためのＧＭ−ＣＳＦの使用。
5. ５．ワクチンに対する免疫反応を増強するための薬剤の製造のためのＧＭ−ＣＳ Ｆの使用。
6. ６．ワクチンが、Ｂ型肝炎ワクチンおよびインフルエンザワクチンからなる群よ り選択される、請求項４または５に記載の使用。
7. ７．ＧＭ−ＣＳＦが徐放製剤中に含まれる、請求項４または５に記載の使用。
8. ８．有効量のＧＭ−ＣＳＦおよびワクチンを含む医薬組成物。
9. ９．ＧＭ−ＣＳＦが徐放製剤内に含まれる、請求項８記載の医薬組成物。
10. １０．ワクチン中の抗原に対する哺乳類の免疫反応を増強するためのキットであ って、ＧＭ−ＣＳＦおよびそのための薬学的に受容しうるキャリアーの医薬組成 物の容器、およびワクチンおよびそのための薬学的に受容しうるキャリアーの医 薬組成物の容器を含むキット。
11. １１．ＧＭ−ＣＳＦが徐放製剤内に含まれる、請求項１０記載のキット。