JP2004500375A - 生産型動物用の改良されたｄｎａワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】生産型動物用の改良されたＤＮＡワクチン。
【解決手段】生産型動物、特にウシおよびブタに関する病原体に対するＤＮＡワクチンであって、このＤＮＡ配列をンイビボ発現できるような条件下で対応する動物種の病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドと、［式１］で表される第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質とから成るＤＮＡワクチン（Ｒ_１は１２〜１８の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基、Ｒ_２は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基、Ｘはヒドロキシルまたはアミン基、脂質は好ましくはＤＭＲＩＥ）：
【式１】

Description

【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は生産型動物（ａｎｉｍａｕｘ ｄｅ ｒｅｎｔｅ）、特にウシおよびブタ用の改良されたＤＮＡワクチンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
予防接種にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を使用することは１９９０年代の始めから知られている（Ｗｏｌｆ．ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２４７，１４６５−１４６８）。この予防接種技術は免疫活性蛋白をコ−ドするＤＮＡまたはＲＮＡ分子によって対象細胞にインビボトランスフェクションとよばれる細胞免疫および液性免疫を誘導するものである。
ＤＮＡワクチンは予防注射される対象細胞で発現可能な少なくとも一種のプラスミドと、薬学的に許容されるビヒクルまたは佐薬とから成る。プラスミドのヌクレオチド配列は一つ以上の免疫原、例えば予防注射される対象で細胞免疫反応（Ｔリンパ球の可動化）および液性免疫応答を誘導する蛋白または糖蛋白をコードする（免疫原に対する抗体作成の刺激）（Ｄａｖｉｓ Ｈ．Ｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９９７． ８． ６３５−６４０）。
【０００３】
病原体に由来する全ての免疫原が予防注射した動物で最適な防御免疫応答を自然に誘導するのに十分に効果のある抗原であるというわけではない。従って、免疫応答を改善する必要がある。
ＤＮＡワクチンの投与経路は種々提案されている（腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、粘膜等の経路）。また、ＤＮＡの投与方法も種々提案されている。例えば、予防注射すべき対象の皮膚細胞中に深く入れるための特定な金粒子を被覆した投与方法（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９９２． ３５６． １５２−１５４）や、皮膚細胞および下部組織細胞を同時に移行させることができる液体ジェット注射器（Ｆｕｒｔｈ ｅｃ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ． １９９２． ２０５． ３６５−３６８）が提案されている。
【０００４】
ＤＮＡのインビボトランスフェクションで使われる化合物には下記のようなものがある：
Ａ　カチオン脂質
このカチオン脂質は下記の４つの亜群に分けられる：
１）　第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質、例えばＤＯＴＭＡ （ジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅの名称でＧｉｂｃｏが製造）、ＤＯＴＡＰ（トリメチル−２３−（オクタデシル−９−エンオイルオキシ）−ｌ−プロパンアンモニウム （Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ． ＦＥＤＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９７， ４０２． １０７−１１０）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２、３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム、ＷＯ−Ａ−９６３４１０９）、ＤＬＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル）−２、３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム（Ｆｅ１ｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｎ Ｙ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９８． ７７２． １２６−１３９）。
第四アンモニウム塩を含むこれらのカチオン脂質はＤＯＰＣ（ジオレオイル ホスファチジルコリン）またはＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン）のような追加の中性脂質と組み合わせることもできる（Ｊ．Ｐ． Ｂｅｈｒ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９Ｓ４． ５． ３８２−３６９）。
【０００５】
２）　リポアミン、例えばＤＯＧＳ（ジオクタデシル アミドグリシルスペルミン、Ｐｒｏｍｅｇａの名称でＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍが製造、Ａｂｄａｌｌａｂ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ． １９９５． ８５． １−７）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（ジメチルアミノエタン−カルバモイル−コレステロ−ル）、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジンスペルミジン−コレステロ−ル）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジン−トレン−コレステロール）（Ｖｉｇｎｅｒｏｎ． ｅｔ ａＪ。Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ。Ｓｄ。ＵＳＡ １９９６。９３。９６８２−９６８９）。
【０００６】
３）　第四アンモニウム塩およびリポアミンを含むカチオン脂質、例えばＤＯＳＰＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−２、３−ビス−（オレオイルオキシ）−１−プロパンイミジウム（ペンタヒドロクロライド）プロパンイミジウム五塩酸塩（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅの名でＧｉｂｃｏから市販）（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｆｏｃｕｓ １９９３． １５． ７３−７９）、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンアミニウム（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ．． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９６． ９３． ｌ２．４Ｓ４−ｌ１４￣９； Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７． ３．５． ８０１−８０３）
【０００７】
４）　アミジン塩を含む脂質、例えばＡＤＰＤＥ、ＡＤＯＤＥ（Ｒｕｙｓｓｃｈａｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｒｎｕｎ． １９９４． ２０３． Ｊ．６２２−１６２８）。
Ｂ　ポリマ−
例えばＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（活性化されたデンドリマー分子）（Ｑｉａｇｅｎの製品； Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｔａｂ． １９９８． ６４． １９３−１９７）
【０００８】
Ｃ／　生化学剤
例えば毒素、特にコレラトキシン。
これらの化合物はＤＮＡワクチンの製剤で使われ、結果もよいが、インビトロトランスフェクションでの知識はＤＮＡ予防接種には適用できず、最終目的の保護免疫反応が確実に得られるか否かは分からない。インビトロトランスフェクションを促進することが知られた化合物が負の免疫保護誘導効果を示すことも観測されている。ある種の化合物はトランスフェクション細胞に対して高投与量で中毒になる。
【０００９】
Ｅｔｃｈａｒｔの研究（Ｅｔｃｈａｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． １９９７． ７８． １５７７−１５８０）では、ＤＮＡワクチン投与で鼻腔内経路で行った場合にはＤＯＴＡＰの使用はアジュバント効果を示さがなかったが、経口投与ではアジュバント効果を示している。このＤＯＴＡＰをハツカネズミのインフルエンザウィルス・ヘムアグルチニン（ＨＡ）をコ−ドするＤＮＡワクチンの鼻腔経路投与で使用した場合（Ｂａｎ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７． １５．８１１−８１３）には、ＤＯＴＡＰの添加で免疫応答は抑制される。ハツカネズミの肝炎Ｓウィルス表面蛋白質（Ｓ）をコ−ドするＤＮＡワクチンを筋肉経路で投与する時にＤＣ−ＣｈｏｌまたはＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥを使用すると抗体応答を増加させることができるが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（またはＤＯＴＭＡ）の使用ではこの抗体応答は増加しない（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ． ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９７． ４０２． １０７−１１０）。
【００１０】
また、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥをハツカネズミのエイズウィルス（ＨＩＶ、Ｅｎｖ）蛋白に対するＤＮＡワクチンで使った場合、筋肉経路で投与の免疫応答が効果的であるのに対して、皮下または皮内経路の投与では免疫応答は増えなかった （Ｔｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ． ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏ． １９９７． １３． １４２１−１４２８）。
【００１１】
ある種のサイトカイン、特にインタ−ロイキンまたはインタ−フェロンの添加はＤＮＡワクチンによって誘発される免疫応答を高めることができる。各サイトカインはそれに特異的な反応および免疫応答を細胞応答または体液応答の方へ進ませる反応を誘発する（Ｐａｓｑｕｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｄ， １９９７． ７５． ３９７−４０１； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Μｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ． １９９９． １９． ７７−８４）。免疫状況が変化した場合、特にサイトカインを他の種、従って異なる免疫系に投与した場合には、一つの種で得られたサイトカインのアジュバント効果が他の種で必ずしも同じになるとは限らない。さらに、サイトカインの添加でアジュバント効果が生じないか、所望効果の逆になる（すなわち免疫応答の低下または阻害）ことさえある。
【００１２】
従って、ＧＭ−ＣＳＦと融合した免疫グロブリンの一つの鎖をコ−ドするＤＮＡワクチンは、この融合蛋白質をマウスへ直接投与した時に効果的であったとしても、免疫応答を増加させることはない。これはＦｖとサイトカインＩＬＬ−ｌｂｅｔａとから成る融合蛋白質の投与や、この融合蛋白質をコ−ドするＤＮＡワクチンの投与の場合と同じである （Ｈａｋｉｍ ｅｃ ａｌ． Μｍｍｕｎｏｌ， １９９６． １５７． ５５０３−５５１１）。サイトカインＩＬ−２と、融合されまたは融合されていない高次構造のＢ型肝炎ウイルス外膜蛋白とを同時発現するプラスミドの使用は体液性および細胞性免疫応答を増加させる （Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９７． ７２． １６９−７８）。
【００１３】
しかし、ヒト獲得性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ｌ）の糖蛋白ｇｐｌ２ＯとサイトカインＩＬ−２とをコ−ドするビシストロンプラスミドを使用した場合には、ｇｐｌ２Ｏだけをコ−ドするモノシストロンプラスミドを使用する場合よりも低い特定の抗ｇｐｌ２Ｏ免疫応答を導く（Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ． Μｍｍｕｎｏｌ １９９８． １６１． １３７５−１８８２）。一方が狂犬病ウィルスＧ糖蛋白をコードし、他方がネズミのＧＭ−ＣＳＦをコードする２つの発現ベクタ−をネズミに同時注入すると、ＢおよびＴリンパ球の活性が刺激されが、（ネズミのＧＭ−ＣＳＦの代わりに）ガンマ型インタ−フェロンをコ−ドするプラスミドを同時注入すると免疫応答は減少する （Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９５． ２． １２９−１３５）。
【００１４】
抗原レベルでのある種の変成、例えば抗原をコ−ドするヌクレオチド配列の一部の欠失や、抗原をコ−ドするヌクレオチド配列または翻訳されていない部位の上流側または下流側へのＤＮＡ断片の挿入でＤＮＡワクチンの有効性を増加でき、特に抗原の発現レベルすなわち効果を改良できることもある。
【００１５】
しかし、実際には抗原をコ−ドするヌクレオチド配列を変えると免疫学的活性の低下または損失になり易い。すなわち、狂犬病ウィルスのＧ抗原をコ−ドする遺伝子からの膜貫通領域の欠失は、変成された抗原をコ−ドするＤＮＡワクチンの経筋肉投与後のハツカネズミモデルの保護レベルを低下させる（Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌ． １９９５． ２０９。５６９）。ウシヘルペスウィルス（ＢＨＶ）のｇＤ糖蛋白をコ−ドする遺伝子から膜貫通領域を欠失させても抗体応答を増加させることができず、経筋で予防注射したウシ属の動物での部分的な保護しか得られた（ｖａｎ Ｄｒｕｎｅｎ Ｌｉｔｔｌｅ−ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｕｒｋ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． １９９８． ７９． ８３１−８３９）。体液性および細胞性免疫応答とそれによる保護は、エボラウィルスのＧＰ糖蛋白をコ−ドするＤＮＡまたはこのＧＰ糖蛋白の分泌物をコ−ドするＤＮＡワクチンを用いて免疫化した後に抗原投与したモルモットの場合でも同じである（Ｘｕ ｅｔ ａｉＬ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９８． ４． ３７−４２）
【００１６】
ヒトの組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（ｔＰＡ）のシグナル配列をマラリヤのＰｆ３３２抗原をコ−ドする遺伝子へ挿入したものを経筋肉路で予防注射したマウスでも抗体応答を増やすことができなかった（Ｈａｄｄａｄ ｅｔ ＦＥＭＳ １９９７， １８， １９３−２０２）。同様に、ｔＰＡ配列をネズミのロタウィルスＶＰ７抗原をコ−ドする遺伝子へ追加したものを経皮投与してもマウスの抗体応答を増やすことができないが、ＶＰ４抗原およびｔＰＡから成る融合蛋白質は上記の抗体応答を増加させることができる。しかし、効果的な保護は得られない（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８． ２５０． ２３０−２４０）。
【００１７】
以上の通り、抗原は必ずしも同じ構造をしていないので、ある抗原のヌクレオチド配列に行う改良を一般に他の抗原に直接置き代えることはできない。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＮＡ予防接種の有効性を増進させ、生産型動物、特に、ウシおよびブタに対する免疫応答および保護をより効果的にするＤＮＡ予防接種法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ−１）（ウシ鼻気管炎感染症（ＩＢＲ）ともよばれる）、ウシ呼吸系発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシ粘液症ウイルスまたはペスチウイルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）１型または２型（ウシ下痢ウイルスすなわちＢＶＤＶ−１およびＢＶＤＶ−２）、ウシパラインフルエンザ３型（ｂＰＩ−３）に対して効果的な改良された保護免疫応答を示すＤＮＡワクチンを工業的に製造することにある。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、ブタヘルペスウイルスまたはオーエスキー病ウイルス（仮性狂犬病ウイルスまたはＰＲＶ）、ブタ生殖器系および呼吸器系症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、雄ブタコレラウイルス（ＨＣＶ）、ブタのパルボウィルスからなる群の中から選択される少なくとも一つのワクチン価を有する効果的な保護免疫応答を導く改良されたＤＮＡワクチンを製造することににある。
【００２１】
本発明のさらに他の目的は、ＢＨＶ−１、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、ｂＰＩ−３および狂犬病ウイルスからなる群の中から選択される少なくとも一つのワクチン価を有する保護効果および免疫応答が得られる改良型のＤＮＡワクチンの製造にある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明の対象は、生産型動物、特にウシおよびブタに感染する少なくとも一種の病原体に対して効果的な保護が得られる改良型のＤＮＡワクチンにある。このＤＮＡワクチンは製剤法によるか、ＧＭ−ＣＳＦの添加によるか、抗原の最適化によるか、これらの組み合わせによって改良される。このＤＮＡワクチンの改良は、製剤によって改良するか、ＧＭ−ＣＳＦの添加によるか、抗原の最適化によるか、ＧＭ−ＣＳＦの添加と抗原の最適化によるのが好ましい。
【００２３】
本発明のＤＮＡワクチンは活性成分として遺伝子または遺伝子断片をコ−ドし、発現するプラスミドを含む。プラスミドとは生体内で発現される遺伝子およびその発現に必要な要素の配列から成るポリヌクレオチド配列から成るＤＮＡ転写単位を意味する。円形プラスミド形状が好ましく、ス−パ−コイルでもよい。直鎖形状も本発明の範囲内である。
【００２４】
各プラスミドは、宿主細胞において挿入される遺伝子の発現を確実にするプロモ−タを含み、これは一般に強い真核性プロモ−タ、特にヒトまたはネズミ起源または選択的にラットまたはモルモットのような他の生物起源のシトメガロウィルス早期プロモ−タＣＭＶ−ＩＥである。より一般的には、プロモ−タはウイルス細胞起源である。ＣＭＶ−ＩＥ以外のウイルスのプロモ−タとしては５Ｖ４０ウィルスの早期または後遺プロモ−タまたはＲｏｕｓ ＳａｒｃｏｍａウィルスのＬＴＲプロモ−タが挙げられる。また、遺伝子（例えば遺伝子へのプロモ−タ特性）が誘導されるウィルスからのプロモ−タでもよい。細胞のプロモ−タとして、デスミン・プロモ−タまたはアクチン・プロモ−タのようなサイトスケルトン遺伝子のプロモ−タを挙げることができる。複数の遺伝子が同じプラスミドに存在するときには、それらは同じ転写単位または二つの異なる単位に存在することができる。
【００２５】
最初の型式によれば、本発明のＤＮＡワクチンは下記式の第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質をアジュバントとして添加して作るのが好ましい：
【００２６】
【式２】

【００２７】
（ここで、
Ｒ_１は１２〜１８の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、
Ｒ_２は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、
Ｘはヒドロキシルまたはアミン基である）
【００２８】
上記脂質はＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２３− ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム、ＷＯ−Ａ−９６３４１０９）であるのが好ましく、さらに好ましくは、中性脂質、特にＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノ−ルアミン）と組み合わされて、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの形にするのが好ましい。
【００２９】
本発明の対象は、生産型動物、特にウシまたはブタに影響を及ぼす少なくとも一種の病原体に対するＤＮＡワクチンであって、対象動物種の病原体の免疫原をコ−ドする少なくとも一種のヌクレオチド配列を生体内で発現可能な条件で含む少なくとも一種のプラスミドと、第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質、特にＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＯＰＥと組み合わされたＤＭＲＩＥとからなるＤＮＡワクチンにある。
【００３０】
組換え型ベクタ−は上記アジュバントと使用直前に混合するのが好ましい。動物へ投与前、好ましくは１０〜６０分、特に３０分前に混合して錯体にするのが好ましい。
【００３１】
ＤＯＰＥが存在するときのＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥのモ比は９５：５〜５：９５、特に１：１である。プラスミド：ＤＭＲＩＥまたはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥアジュバントの重量比は５０：１〜１：１０、特に１０：１〜１：５、好ましくは１：１〜１：２である。
【００３２】
第２の型式に従う場合には、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ； 顆粒球マクロファ−ジ−コロニ−形成刺激因子、Ｃｌａｒｋ Ｓ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７． ２３０． １２２９； Ｇｒａｎｔ ＳＭ． ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇｓ １９９２． ５３． ５１６）をワクチンに加える。これは直接ＧＭ−ＣＳＦ蛋白をワクチン組成物に組み込むことで実行できる。また、ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列を発現可能な状態で発現ベクターに挿入することも好ましい。
【００３３】
発現ベクタ−としては、プラスミド、例えば主要な抗原をコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはその他のプラスミドの使用が好ましい。ＧＭ−ＣＳＦの選択は予防注射される動物種に従う。従って、ウシではウシＧＭ−ＣＳＦが使われ、ブタではブタＧＭ−ＣＳＦが使われる。
【００３４】
第３の型式に従う場合には、免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列が最適化された形にされる。最適化はヌクレオチド配列の任意の変成を意味する。特に、この変成は少なくとも、このヌクレオチド配列のより高い発現レベルによって、および／または、この抗原をコ−ドするメッセンジャ−ＲＮＡの安定性の増加によって、および／または、この抗原の細胞外の培地への誘発された分泌によって現れ、直接または間接的に免疫応答の増加が得られる。
【００３５】
本発明では所定の抗原の最適化を所定の抗原の膜貫通領域をコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失（欠失は完全な欠失または膜貫通領域がほぼまたは全く機能しなくなるのに十分な不完全な欠失を意味する）、および／または、ｔＰＡシグナルをコ−ドするヌクレオチド配列のフレーム内への追加、および／または、発現される遺伝子のスタビライジング・イントロンの上流側での挿入で行うのが好ましい（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｄ． １９９７． ４３． ２８５−２９２； Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ １９８６． ３． ２７９−２９２）。主要な抗原の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失は、先端を切り取った抗原の細胞外の培地への分泌を促進し、それらが免疫系の細胞と接触する可能性を増加させる。ｔＰＡシグナルをコ−ドするヌクレオチド配列の挿入はｔＰＡシグナルが加えられるメッセンジャ−ＲＮＡの翻訳を容易に行わせ、従って、このメッセンジャ−ＲＮＡの発現レベルが高くなり、従って、抗原の製造が増加する。ｔＰＡシグナルは合成される抗原の分泌も助ける。
【００３６】
シグナルペプチドをコードする他のヌクレオチド配列、特にミツバチに由来のメリテンシグナルペプチドのヌクレオチド配列を使用することもできる（ＳｉｓｋＷ．Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，７６６−７７５）。
【００３７】
所定の抗原をコ−ドする遺伝子へのスタビライジングイントロンの挿入はそのメッセンジャ−ＲＮＡの異常なスプライシングを避けて、後者の物理的完全性を維持させる。
【００３８】
ｔＰＡシグナルはヒト起源であるのが好ましい。ヒトｔＰＡシグナルのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スからアクセス番号ＮＭ０００９３０でアクセスできる。イントロンはウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩが好ましい（ｖａｎ Ｏｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７９． ２０６． ３３７−３４４）。このヌクレオチド配列はアクセス番号Ｖ００８８２でＧｅｎＰａｎｋデ−タベ−スからアクセスでき、イントロンＮｏ．２で示される。
【００３９】
本発明の対象は、ウシ鼻気管炎感染症（ＩＢＲ）に対してウシに効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のＤＮＡワクチンにある
ウシ鼻気管炎感染症ウィルスは、Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ族の構成メンバであるウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）である（Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３．３１−４２）。ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖蛋白をコ−ドするヌクレオチド配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スからアクセス番号ＡＪ００４８０１でアクセスできる。
【００４０】
本発明では、ＩＢＲに対するＤＮＡワクチンをＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥのアジュバントを含む製剤法によって改善するのが好ましい。これはウシＧＭ−ＣＳＦの追加（Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ 他 Ｍｏｌｅｃ．１９８８。２５．８４３−８５０）、または少なくとも一つのＩＢＲ抗原の最適化、またはウシのＧＭ−ＣＳＦの追加および少なくとも一種のＩＢＲ抗原の最適化と組み合わせることができる。
ウシＧＭ−ＣＳＦをコ−ドするヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スからアクセス番号Ｕ２２３８５でアクセスできる。
【００４１】
ウシＧＭ−ＣＳＦの追加は、ワクチン組成物へのウシＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの取込みによるか、好ましくはインビトロ発現ベクタ−（好ましくはプラスミド）にウシＧＭ−ＣＳＦをコ−ドするヌクレオチド配列を挿入することによって実行することができる。好ましくは、ウシＧＭ−ＣＳＦをコ−ドするヌクレオチド配列は、ＩＢＲ抗原をコ−ドする遺伝子が挿入してあるプラスミドとは異なる第２の発現プラスミド（例えば、ｐＬＦ１０３２、実施例１３）に挿入される。
【００４２】
ＩＢＲに由来する抗原の最適化は、ｇＢ糖蛋白および／またはｇＣ糖蛋白および／またはｇＤ糖蛋白の「シグナル」配列、特にヒト起源のｔＰＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００９３０）による置換、および／またはｇＢおよび／またはｇＣおよび／またはｇＤの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって行われる。これらの中の１つの糖蛋白の膜貫通領域をコードするＤＮＡ断片の欠失は隣接するＣ末端（糖蛋白の細胞質領域）を伴うのが好ましい。従って、本発明のＩＢＲを防ぐためのＤＮＡワクチンは、最適化されたＩＢＲ抗原の中の１つ（ｇＢ、ｇＣまたはｇＤ）か、２つまたは３つ（すなわち最適化されたｇＢ、最適化されたｇＣ、最適化されたｇＤ）をコ−ドし、発現できる。
【００４３】
本発明で使用可能なＢＨＶ−１抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および種々の構造の発現ベクターは添付の実施例およびフランス国特許Ａ１−２７５１２２９、特に、実施例７および８、および図３および図４に示されている。
【００４４】
本発明の好ましい実施例では、ＢＨＶ−１に対するＤＮＡワクチンはＤＭＲＩＥ‐ＤＯＰＥが配合され、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＨＶ−１のｇＢ抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばｐＰＢ２８１、実施例３．１．２）と、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＨＶ−１のｇＣ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミド（例えばｐＰＢ２９２、実施例３．２．２）と、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＨＶ−１のｇＤ抗原をコ−ドする第３の発現プラスミド（例えばｐＰＢ２８４、実施例３．３．２）とを含む。
【００４５】
一般に、ＢＨＶ−１だけでなく、膜貫通領域をコードする配列に隣接するＣ末端は保存できるが、膜貫通領域をコードする配列と一緒に欠失させる方が容易であることが多い。
【００４６】
本発明の別の対象はウシ呼吸系発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）に対してウシに効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のＤＮＡワクチンにある。
ＢＲＳＶはＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ族の構成メンバであるパラミキソウイルスである（Ｂａｋｅｒ．ｅｔ ａｌ．Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．Ｆｏｏｄ Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃｔ．１９９７．１３．４２５−４５４）。蛋白Ｆおよび蛋白Ｇをコ−ドするヌクレオチド配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スからそれぞれアクセス番号Ｙ１７９７０およびＵ３３５３９でアクセスできる。
【００４７】
ＢＲＳＶに対するＤＮＡワクチンは、本発明のアジュバント、特にＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＭＲＩＥ‐ＤＯＰＥを含む製剤にするのが好ましい。この配合はウシＧＭ−ＣＳＦの追加または少なくとも一つのＢＲＳＶ抗原の最適化またはウシＧＭ−ＣＳＦの追加および少なくとも一種のＢＲＳＶ抗原の最適化と組み合わせることができる。
ウシＧＭ−ＣＳＦの追加はＢＨＶ−１の場合と同様に行うことができる。
【００４８】
ＢＲＳＶに由来する抗原の最適化は、ＢＲＳＶの蛋白Ｆおよび／またはＢＲＳＶの糖蛋白Ｇの「シグナル」配列、特にヒトのｔＰＡによる置換、およびＦおよび／またはＧの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって行われる。いずれかの蛋白の膜貫通領域をコードするＤＮＡ断片の欠失は隣接するＣ末端を伴うのが好ましい。従って、本発明のＢＲＳＶを防ぐためのＤＮＡワクチンは、最適化されたＢＲＳＶ抗原の一方（ＦまたはＧ）または両方（ＦおよびＧ）をコ−ドし、発現できる。
【００４９】
本発明で使用可能なＢＲＳＶ抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および種々の発現ベクターの構造は、添付実施例およびフランス国特許Ａ１−２７５１２２９、特に、実施例９および１０、および図５および図６に示されている。
【００５０】
本発明の好ましい実施例では、ＢＲＳＶに対するＤＮＡワクチンはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを配合し、Ｆのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするＦのヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＲＳＶのＦ抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばｐＳＢ１１４、実施例４．１．３）と、Ｇのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＲＳＶのＧ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミド（例えばｐＳＢ１１０、実施例４．２．２）とを含む。
【００５１】
本発明の別の対象はＢＶＤＶウイルスに対してウシに効果的に保護免疫応答を導くことができる改良型のＤＮＡワクチンにある。
ＢＶＤＶウイルスはＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ族のぺスチウイルスである。ＢＶＤＶウイルスはウシに広く分布し、胎児奇形、流産または呼吸器系（粘膜病）および腸（ウシウイルス性下痢）の臨床的症状として現れる。
ＢＶＤＶウイルスは臨床的症状の重篤度によって区別することができ、現在２つのグループ、ＢＶＤＶ１型（不顕性または穏やかな症状）と、ＢＶＤＶ２型（急性の症状、出血、高い罹患率、高い死亡率）がある（Ｄｅａｎ Ｈ．Ｊ．およびＬｅｙｈ Ｒ．，１９９９，ワクチン、１７、１１１７−１１２４）。
ＢＶＤＶウイルスの型が特定されない場合は１型または２型とする。
【００５２】
ＢＶＤＶウイルスはポリ蛋白をコード化する単一の遺伝子からなるエンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ポリ蛋白は切断後、複数の十分に個別化した蛋白、特にＥ０蛋白（ｇｐ４８）およびＥ２蛋白（ｇｐ５３）（Ｖａｓｓｉｌｅｖ Ｖ．Ｂ．達、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１、４７１‐４７８）となる。
Ｅ０−Ｅ２ポリ蛋白をコ−ドするヌクレオチド配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スから、ＢＶＤＶ−１はアクセス番号Ｍ９６６８７で、ＢＶＤＶ−２はＡＦ１４５９６７でアクセスできる。
【００５３】
ＢＶＤＶに対するＤＮＡワクチンは、本発明のアジュバント、特にＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＭＲＩＥ‐ＤＯＰＥを含む製剤にするのが好ましい。この配合はウシＧＭ−ＣＳＦの追加または少なくとも一つのＢＶＤＶ抗原の最適化またはウシＧＭ−ＣＳＦの追加と少なくとも一種のＢＶＤＶ抗原の最適化と組み合わせることができる。
ウシのＧＭ−ＣＳＦの追加はＢＨＶ−１の場合と同様に行うことができる。
【００５４】
ＢＶＤＶ由来する抗原の最適化は、ＢＶＤＶのＥ０蛋白および／またはＢＶＤＶのＥ２蛋白をコードするヌクレオチド配列の上流側に「シグナル」配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列を追加、および／または、Ｅ２の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、Ｅ０および／またはＥ２をコードするヌクレオチド配列の上流側にイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩを挿入することで行われる。従って、本発明のＢＶＤＶに対するＤＮＡワクチンは最適化されたＢＶＤＶ抗原の一方（Ｅ０またはＥ２）または両方（Ｅ０およびＥ２）をコ−ドし、発現できる。
【００５５】
本発明で使用可能なＢＶＤＶ抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および種々の発現ベクターの構造は添付実施例およびフランス国特許Ａ１−２７５１２２９、特に、実施例１３、および図９に示されている。
【００５６】
本発明の好ましい実施例では、ＢＲＳＶに対するＤＮＡワクチンはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを配合し、Ｅ０の上流側にヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、Ｅ０の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩを挿入して最適化したＢＶＤＶのＥ０抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばｐＬＦ１０２９、実施例５．１．２、ｐＬＦ１０３１、実施例６．２．２）と、Ｅ２の上流側にヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、Ｅ２の膜貫通領域と隣接するＣ末端をコードするヌクレオチド配列の断片を欠失させ、Ｅ２の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩを挿入して最適化したＢＶＤＶのＥ２抗原をコ−ドする第２の発現プラスミド（例えばｐＬＦ１０２１、実施例５．２．２、ｐＬＦ１０２３、実施例６．１．２）とを含む。
【００５７】
好ましくは、プラスミドの混合物を作る。この混合物は異なる免疫原（Ｅ０またはＥ２）を発現するか、異なる型のＢＶＤＶ（ＢＶＤＶ−１またはＢＶＤＶ−２）から得られた少なくとも２種の発現プラスミドを含むことができる。特に、ＢＶＤＶ−１ Ｅ０、ＢＶＤＶ−１ Ｅ２、ＢＶＤＶ−２ Ｅ０、ＢＶＤＶ−２ Ｅ２の４つのプラスミドからなる混合物が有利である。
【００５８】
本発明の別の対象はパラインフルエンザウイルス３型（ｂＰＩ−３）に対してウシに効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のＤＮＡワクチンにある。
ｂＰＩ−３ウイルスはＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ族のパラミキソウイルスである（Ｔｓａｉ達、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，１９７５、１１、７８３−８０３）。
赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ蛋白（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｅ−ｎｅｕｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ＨＮ）およびｂＰＩ−３の融合蛋白（Ｆ）をコ−ドするヌクレオチド配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スからアクセス番号Ｕ３１６７１でアクセスできる。
【００５９】
ｂＰＩ−３に対するＤＮＡワクチンは本発明のアジュバント、特にＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＭＲＩＥ‐ＤＯＰＥを含む製剤にするのが好ましい。この配合はウシＧＭ−ＣＳＦの追加または少なくとも一つのｂＰＩ−３抗原の最適化またはウシのＧＭ−ＣＳＦの追加および少なくとも一種のｂＰＩ−３抗原の最適化と組み合わせることができる。
ウシＧＭ−ＣＳＦの追加はＢＨＶ−１の場合と同様に行うことができる。
【００６０】
ｂＰＩ−３に由来する抗原の最適化はｂＰＩ−３の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ蛋白（ＨＮ）および／またはｂＰＩ−３の融合蛋白（Ｆ）の「シグナル」配列の、特にヒト起源のｔＰＡのシグナル配列による置換、および／または、ＨＮおよび／またはＦの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、ＨＮおよび／またはＦをコードするヌクレオチド配列の上流側へのイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩの挿入によって行う。いずれかの蛋白の膜貫通領域をコードするＤＮＡ断片の欠失は隣接するＣ末端を伴うのが好ましい。従って、本発明のｂＰＩ−３に対するＤＮＡワクチンは最適化されたｂＰＩ−３抗原の一方（ＨＮまたはＦ）または両方（ＨＮおよびＦ）をコ−ドし、発現できる。
【００６１】
本発明で使用可能なｂＰＩ−３抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および種々の発現ベクターの構造は添付実施例およびフランス国特許Ａ１−２７５１２２９、特に、実施例１４および１５、および図１０および図１１に示されている。
【００６２】
本発明の好ましい実施例では、ｂＰＩ−３に対するＤＮＡワクチンはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥが配合され、ＨＮのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするＨＮのヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つＨＮの上流側へのウサギβグロビンのイントロンＩＩの挿入によって最適化したｂＰＩ−３のＨＮ抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばｐＬＦ１０２５、実施例７．１．２）と、Ｆのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、Ｆの膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失およびＦの上流側へのウサギβ−グロビンのイントロンＩＩの挿入によって最適化したｂＰＩ−３のＦ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミド（例えばｐＬＦ１０２７、実施例７．２．２）とを含む。
【００６３】
本発明の別の対象はブタヘルペスウイルス（ＰＲＶ）に対してブタに効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のＤＮＡワクチンにある。
ＰＲＶウイルスはＡｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ族のメンバーであり、オーエスキー病に関与している（Ｓａｗｉｔｚｋｙ、Ｄ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ，Ｓｕｐｐｌ．，１９９７、１３、２０１−２０６）。
ｇＢ、ｇＣ、ｇＤをコ−ドするヌクレオチド配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スからアクセス番号Ｍ１７３２１、ＡＦ１５８０９０、ＡＦ０８６７０２でアクセスできる。
【００６４】
ＰＲＶに対するＤＮＡワクチンは本発明のアジュバント、特にＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＭＲＩＥ‐ＤＯＰＥを含む製剤にするのが好ましい。この配合はブタＧＭ−ＣＳＦの追加（Ｉｎｕｍａｒｕ Ｓ．およびＴａｋａｍａｔｕ Ｈ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．、１９９５、７３，４７４−４７６）または少なくとも一つのＰＲＶ抗原の最適化またはブタのＧＭ−ＣＳＦの追加と少なくとも一種のＰＲＶ抗原の最適化と組み合わせることができる。
【００６５】
ブタのＧＭ−ＣＳＦの追加はワクチンの組成物へのブタＧＭ−ＣＳＦポリペプチドの取込みまたは好ましくはインビボ発現ベクタ−（好ましくはプラスミド）にブタのＧＭ−ＣＳＦをコ−ドするヌクレオチド配列への挿入で実行できる。好ましくは、ブタＧＭ−ＣＳＦをコ−ドするヌクレオチド配列はＰＲＶ抗原をコ−ドする遺伝子が挿入してあるプラスミドとは異なる第２の発現プラスミド（例えば、ｐＬＦ１０３３、実施例１４）に挿入される。
【００６６】
ＰＲＶに由来する抗原の最適化は、ｇＢ糖蛋白および／またはｇＣ糖蛋白および／またはｇＤ糖蛋白の「シグナル」配列、特にヒト起源のｔＰＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００９３０）による置換、および／またはｇＢおよび／またはｇＣおよび／またはｇＤの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって行われる。これらの中の１つの糖蛋白の膜貫通領域をコードするＤＮＡ断片の欠失は隣接するＣ末端（糖蛋白の細胞質領域）を伴うのが好ましい。従って、本発明のＰＲＶを防ぐためのＤＮＡワクチンは最適化されたＰＲＶ抗原の中の１つ（ｇＢ、ｇＣまたはｇＤ）、２つまたは３つ（すなわち最適化されたｇＢ、最適化されたｇＣ、最適化されたｇＤ）をコ−ドし、発現できる。
【００６７】
本発明で使用可能なＰＲＶ抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および種々の構造の発現ベクターは添付の実施例およびフランス国特許Ａ１−２７５１２２４、特に、実施例８および９、および図３および図５に示されている。
【００６８】
本発明の好ましい実施例ではＰＲＶに対するＤＮＡワクチンはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥが配合され、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＶのｇＢ抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばｐＰＢ１０２、実施例８．１．２）と、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＶのｇＣ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミド（例えばｐＰＢ１０４、実施例８．２．２）と、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＶのｇＤ抗原をコ−ドする第３の発現プラスミド（例えばｐＰＢ１０６、実施例８．３．２）とを含む。
【００６９】
本発明の別の対象はブタ生殖系呼吸系症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対してブタに効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のＤＮＡワクチンにある。
ＰＲＲＳＶはＡｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ族の構成メンバであるアルテリウイルスである（Ｍｕｒｔａｕｇｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５．１４０．１４５１−１４６０）。ＯＲＦ３、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６をコ−ドするヌクレオチド配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スからそれぞれアクセス番号Ｕ８７３９２でアクセスできる。
【００７０】
ＰＲＲＳＶに対するＤＮＡワクチンは本発明のアジュバント、特にＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＭＲＩＥ‐ＤＯＰＥを含む製剤にするのが好ましい。この配合はブタのＧＭ−ＣＳＦの追加または少なくとも一つのＰＲＲＳＶ抗原の最適化またはブタのＧＭ−ＣＳＦの追加と少なくとも一種のＰＲＲＳＶ抗原の最適化と組み合わせることができる。
ブタのＧＭ−ＣＳＦの追加はＰＲＶの場合と同様に行うことができる。
【００７１】
ＰＲＲＳＶに由来する抗原の最適化は、オープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３、ｇｐ４５または大きいエンベロープ糖蛋白）および／またはＯＲＦ５糖蛋白（ｇｐ２５またはエンベロープ糖蛋白Ｅ）および／またはＯＲＦ６糖蛋白（ｇｐ１８または膜蛋白）によってコード化された蛋白の「シグナル」配列、特にヒト起源のｔＰＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００９３０）による置換および／またはＯＲＦ３および／またはＯＲＦ５および／またはＯＲＦ６の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって行われる。それらの中の１つの糖蛋白の膜貫通領域をコードするＤＮＡ断片の欠失は隣接するＣ末端を伴うのが好ましい。従って、本発明のＰＲＲＳＶに対するＤＮＡワクチンは最適化されたＰＲＲＳＶ抗原の１つ（ＯＲＦ３またはＯＲＦ５またはＯＲＦ６）、２つまたは３つ（ＯＲＦ３およびＯＲＦ５およびＯＲＦ６）をコ−ドし、発現できる。
【００７２】
本発明で使用可能なＰＲＲＳＶ抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および種々の発現ベクターの構造は添付実施例およびフランス国特許Ａ１−２７５１２２４、特に、実施例１４〜１７、および図１４〜図１７に示されている。
【００７３】
本発明の好ましい実施例では、ＰＲＲＳＶに対するＤＮＡワクチンはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥが配合され、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３抗原をコードする発現プラスミド（例えばｐＬＦ１００９、実施例９．１．１、ｐＬＦ１０１５、実施例１０．１．１）と、ＯＲＦ５のシグナル配列をヒトｔＰＡシグナルペプチド配列で置換し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＲＳＶのＯＲＦ５抗原をコ−ドする第２の発現プラスミド（例えばｐＬＦ１０１２、実施例９．２．２、ｐＬＦ１０１８、実施例１０．２．２）と、ＯＲＦ６のシグナル配列をヒトｔＰＡシグナルペプチド配列で置換し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＲＳＶのＯＲＦ６抗原をコ−ドする第３の発現プラスミド（例えばｐＬＦ１０１４、実施例９．３．２、ｐＬＦ１０１６、実施例１０．３．２）とを含む。
【００７４】
好ましくは、プラスミドの混合物を作る。この混合物は互いに異なるを発現する免疫原（ＯＲＦ３またはＯＲＦ５またはＯＲＦ６）、および／または、異なる型のＰＲＲＳＶ（例えばＬｅｌｙｓｔａｄ等のヨーロッパ株、アメリカ株ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２）から得られた少なくとも２種の発現プラスミドを含むことができる。特に、ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ ＯＲＦ３、ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ ＯＲＦ５、ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ ＯＲＦ６、ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２ ＯＲＦ３、ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２ ＯＲＦ５ ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２ ＯＲＦ６の６つのプラスミドからなる混合物が有利である。
【００７５】
本発明の別の対象はブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）に対してブタに効果的な保護免疫応答を導くことができる改良型のＤＮＡワクチンにある。
ＳＩＶウイルスはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ族のインフルエンザウイルスＡ群である（Ｍｕｒｐｈｙ Ｂ．ＲおよびＷｅｂｓｔｅｒ Ｒ．Ｇ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ達編、Ｒａｖｅｎ出版社、ニューヨーク、１９９０）。
【００７６】
ＳＩＶ　Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２株の赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）蛋白をコ−ドするヌクレオチド配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデ−タベ−スからアクセス番号Ｋ００９９２、Ｕ８６１４５、Ｕ０７１４６、ＡＦ１５３２３８でアクセスできる。
【００７７】
ＳＩＶに対するＤＮＡワクチンは本発明のアジュバント、特にＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＭＲＩＥ‐ＤＯＰＥを含む製剤にするのが好ましい。この配合はブタのＧＭ−ＣＳＦの追加または少なくとも一つのＳＩＶ抗原の最適化またはブタのＧＭ−ＣＳＦの追加と少なくとも一種のＳＩＶ抗原の最適化と組み合わせることができる。
ブタのＧＭ−ＣＳＦの追加はＰＲＶの場合と同様に行うことができる。
【００７８】
ＳＩＶに由来する抗原の最適化はＳＩＶ赤血球凝集素（ＨＡ）および／またはＳＩＶノイラミニダーゼ（ＮＡ）蛋白の「シグナル」配列、特にヒト起源のｔＰＡによる置換、および／または、ＨＡおよび／またはＮＡの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／またはＨＡおよび／またはＮＡをコードするヌクレオチド配列の上流側へのイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩの挿入によって行われる。いずれかの蛋白の膜貫通領域をコードするＤＮＡ断片の欠失は隣接するＣ末端を伴うのが好ましい。従って、本発明のＳＩＶを防ぐためのＤＮＡワクチンは、最適化されたＳＩＶ抗原の１つ（ＨＡまたはＮＡ）または両方（ＨＡおよびＮＡ）をコ−ドし、発現できる。
【００７９】
本発明で使用可能なＳＩＶ抗原をコ−ドするヌクレオチド配列および種々の発現ベクターの構造は添付の実施例およびフランス国特許Ａ１−２７５１２２４、特に、ＳＩＶ株Ｈ１Ｎ１は実施例１０および１１、および図７および図９、ＳＩＶ株Ｈ３Ｎ２は実施例１２および１３、および図１１および図１３に示されている。
【００８０】
本発明の好ましい実施例では：ＳＩＶを防ぐためのＤＮＡワクチンはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥが配合され、ＨＡのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするＨＡのヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つＨＡの上流側へのウサギβグロビンのイントロンＩＩの挿入によって最適化したＳＩＶのＨＡ抗原をコ−ドする発現プラスミド（例えばｐＬＦ１００２、実施例１１．１．２、ｐＬＦ１００６、実施例１２．１．２）と、ＮＡのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、ＮＡの膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失およびＮＡの上流側へのウサギβ−グロビンのイントロンＩＩの挿入によって最適化したＳＩＶのＮＡ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミド（例えばｐＬＦ１００４、実施例１１．２．２、ｐＬＦ１００８、実施例１２．２．２）とを含む。
【００８１】
プラスミドの混合物を製造するのが有利である。この混合物は異なる免疫原（ＨＡまたはＮＡ）を発現するか、および／または異なる型のＳＩＶ株（例えばＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２）から得られた少なくとも２種の発現プラスミドを含むことができる。特に、ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ、ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１ ＮＡ、ＳＩＶ Ｈ３Ｎ２ ＨＡ、ＳＩＶ Ｈ３Ｎ２ ＮＡの４つのプラスミドからなる混合物が有利である。
【００８２】
以上、本発明を特定のＤＮＡワクチンに関して説明したが、本発明は上記動物種の他の病原体に対するＤＮＡワクチンにも適用可能なアジュバントの使用にも関するものである。
同じ観点から、本発明ワクチンは、一つの動物種で互いに組み合せる、および／または、同じ種の他の病原体に対するＤＮＡワクチンと組み合せることができる。この他の病原体としては特に狂犬病ウイルス、雄ブタコレラウイルスおよびブタのパルボウィルスが挙げられる。
【００８３】
本発明の狂犬病ウイルスに対する免疫原性製剤または改良されたＤＮＡワクチンは、狂犬病ウイルスの未変成Ｇ糖蛋白をコードするプラスミドと、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥとを含み、必要に応じてＧＭ−ＣＳＦの追加を含む。
本発明のブタパルボウィルスに対する免疫原性製剤または改良されたＤＮＡワクチンはブタパルボウィルスに由来の抗原（例えばＶＰ２蛋白、フランス国特許第２，７５１，２２４号の実施例１８および図１８）をコードするプラスミドと、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥとを含み、必要に応じてブタＧＭ−ＣＳＦの追加を含む（例えばｐＬＦ１０３３、実施例１４）。
本発明の雄ブタコレラウイルス（ＨＣＶ）に対する免疫原性製剤または改良されたＤＮＡワクチンはＨＣＶに由来の抗原（例えば上記特許の実施例１９および図１９のＥ１蛋白、または実施例２０および図２０のＥ２蛋白）をコードするプラスミドと、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥとを含み、必要に応じてブタＧＭ−ＣＳＦの追加を含む（例えばｐＬＦ１０３３、実施例１４）。
【００８４】
従って、本発明の他の対象はＢＨＶ−１、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、ｂＰＩ−３および狂犬病ウィルスからなる群の中から選択される少なくとも２種のウシの病原体に対してウシに効果的な保護を得ることができる改良型の多価ＤＮＡワクチンにある。
本発明の他の対象は、ＰＲＶウイルス、ＰＲＲＳＶウイルス、ＳＩＶウイルス、雄ブタコレラウイルス（ＨＣＶ）およびブタパルボウイルスからなる群の中から選択される少なくとも２種のブタの病原体からブタを効果的に保護することができる改良型の多価ＤＮＡワクチンにある。
【００８５】
多価のＤＮＡワクチンも本発明のアジュバント、特にＤＭＲＩＥ、好ましくはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥとの製剤法によって改良できる。これは上記のＧＭ−ＣＳＦの追加または上記の少なくとも一つの対象抗原の最適化またはＧＭ−ＣＳＦの追加と少なくとも一種の対象抗原の最適化と組み合わせることができる。
【００８６】
本発明で改良した多価ＤＮＡワクチンは、同じ動物種に感染する一つ以上の発現プラスミドを含み、このワクチンは第１の病原体の少なくとも一つの免疫原および少なくとも一つの他の病原体の少なくとも一つの免疫原をインビボ発現させる。これらの免疫原の少なくとも一つは下記の群の中から選択するのが好ましい：
【００８７】
ブタの場合、ＢＲＳＶのＦ、ＢＲＳＶのＧ、ＢＨＶ−１のｇＢ、ＢＨＶ−１のｇＣ、ＢＨＶ−１のｇＤ、ＢＶＤＶ−１のＥ０、ＢＶＤＶ−１のＥ２、ＢＶＤＶ−２のＥ０、ＢＶＤＶ−２のＥ２、ｂＰＩ−３のＦ、ｂＰＩ−３のＨＮ
ウシの場合、ＰＲＶのｇＢ、ＰＲＶのｇＣ、ＰＲＶのｇＤ、ＰＲＲＳＶ株ＬｅｌｙｓｔａｄのＯＲＦ３、ＰＲＲＳＶ株ＬｅｌｙｓｔａｄのＯＲＦ５、ＰＲＲＳＶ株ＬｅｌｙｓｔａｄのＯＲＦ６、ＰＲＲＳＶ株ＶＲ−２３３２のＯＲＦ３、ＰＲＲＳＶ株ＶＲ−２３３２のＯＲＦ５、ＰＲＲＳＶ株ＶＲ−２３３２のＯＲＦ６、ＳＩＶ株Ｈ１Ｎ１のＨＡ、ＳＩＶ株Ｈ１Ｎ１のＮＡ、ＳＩＶ株Ｈ３Ｎ２のＨＡ、ＳＩＶ株 Ｈ３Ｎ２のＮＡ。
【００８８】
本発明で改良された一価または多価のＤＮＡワクチンは少なくとも一つの従来のワクチン（不活化ワクチン、弱毒化された生ワクチン、サブユニットワクチン）または同じ動物種に感染する少なくとも１つの病原体に対するインビボ発現ベクタ−を使用した組換え型ワクチン（例えばポックスウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス）と組み合わせたり、これらワクチンのブースターとして使用することもできる。
【００８９】
当業者は上記のウシのワクチン価を含むプラスミドを作る方法についてはフランス国特許第Ａ１−２７５１２２９号を、ブタのワクチン価を含むプラスミドを作る方法についてはフランス国特許第Ａ１−２７５１２２４号を参照されたい。
本発明の他の対象は、農業用動物、特にウシまたはブタに予防注射をする方法にある。この予防接種方法は上記の一価または多価の改良型のＤＮＡワクチンの中の一つのワクチンの投与からなる。この予防接種方法は妊娠している雌の免疫受動輸送または幼若動物または成体動物に関する。この予防接種方法は改良型のＤＮＡワクチンの一回または複数回の投与から成る。
【００９０】
本発明のワクチンで使われるＤＮＡの量は各プラスミドで約１０μｇ〜約１０００μｇ、好ましくは約５０〜約５００μｇである。当業者は各予防接種プロトコルで用いるＤＮＡの有効量を正確に定義することができよう。
投与量は０．２〜５ｍｌの間、好ましくは１〜３ｍｌにすることができる。
【００９１】
本発明で改良されたＤＮＡワクチンは本発明の予防接種方法では従来技術のポリヌクレオチド予防接種で用いられている種々の投与経路および投与方法によって投与することができる。
本発明の好適な態様による本発明の改良型ＤＮＡワクチンの予防接種方法は、筋肉経路または皮下経路か、無針注射器を用いた皮内経路による投与である。
【００９２】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００９３】
【実施例】
各病原体に対して主要な抗原（天然形および変成形）をコ−ドする各遺伝子を真核性発現プラスミドの構築の対象とした。抗原の分泌形は膜貫通領域および細胞質領域をコ−ドする遺伝子断片の欠失によって得た。全てのケースで蛋白の膜貫通領域は対応する蛋白配列のヒドロパシプロフィル（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ６．５）を基に同定した。
【００９４】
実施例１
分子生物学方法
１．１ ウイルスゲノムＤＮＡの抽出
ウイルス懸濁液をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（最終濃度０．５％）の存在下でプロテナーゼＫ（最終濃度１００ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で２時間処理した。次いで、フェノール／クロロホルム混合物でウイルス性ＤＮＡを抽出した後、２倍量の無水エタノールで−２０℃で１６時間沈殿させ、４℃で１５分間１０，０００ｇで遠心分離した。ＤＮＡのペレットを乾燥させ、最少量の超滅菌水に取った。
【００９５】
１．２ ウイルスゲノムＲＮＡの単離
Ｐ．ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＮ．Ｓａｃｃｈｉの「グアニジニウムチオシアネート／フェノール−クロロホルム」法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７．１６２．１５６−１５９）を用いて各ウイルスのゲノムＲＮＡを抽出した。
【００９６】
１．３　分子生物学手法
プラスミドの構築は全てＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）に記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。本発明で使われる全ての制限断片は「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」キット（ＢＩＯｌＯｌ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて単離した。全ての構造物においてクロ−ニングされたＤＮＡ断片および発現ベクタ−はＳａｎｇｅｒ ｍｅｔｈｏｄ （ＳａｍＩＢＲｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）で配列決定した。
【００９７】
１．４　ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ
クロ−ニングされた遺伝子断片に特有のオリゴヌクレオチドを合成した。そのいくつかは５’末端に増殖断片のクロ−ニングを容易にする制限部位を有している。逆転写（ＲＴ）反応およびＰＣＲ法（ＰＣＲ）は標準的技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、１９８９）で行った。
【００９８】
１．５ プラスミドの大規模精製
ワクチン組成物に用いた精製プラスミドは塩化セシウム−エチジウムブロミド勾配方法で約１０ｍｇ数十倍の規模で製造した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。
【００９９】
実施例２
基礎となるプラスミドの構築
プラスミドｐＶＲｌＯｌ２（図１、ＷＯ−Ａ−９８０３１９９の実施例７の図１）から誘導した真核性発現プラスミドｐＶＲｌＯ２Ｏ （Ｃ．Ｊ． Ｌｕｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １９９７， １７５： ９５−９７）はヒト組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（ｔＰＡ）のシグナル配列のコ−ド相を含む。このプラスミドｐＶＲｌＯ２ＯをＢａｍＭＴ−ＲｇｌＩＩ消化し、複数のクロ−ニングサイトを含む配列（ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｃＩ、ＢｇｌＩＩ）を挿入することで変えて、下記オリゴヌクレオチドにした（以下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯは「配列番号」を意味する）：
【０１００】
【式３】

【０１０１】
得られたベクターは大きさが約５１０５塩基対（ｂｐ）で、ｐＡＢｌ１Ｏ（図２）とよぶ。
下記オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲで対応するＤＮＡ断片を生産した後、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩをベクタ−ＰＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）でクロ−ニングする：
【０１０２】
【式４】

【０１０３】
鋳型としてはウサギの末しょう血細胞ゲノムＤＮＡを用いる。得られたプラスミドをｐＮＳ０５０とよぶことにする。
発現プラスミドｐＡＢ１１０は、組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（ｔＰＡ）のシグナルペプチドのＡＴＧの上流に位置するＳａｌＩ部位にウサギグロビン遺伝子のイントロンＩＩの配列を挿入して変成する。ウサギグロビン遺伝子のイントロンＩＩの配列を下記オリゴヌクレオチドを用いてプラスミドｐＮＳ０５０からポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で増す：
【０１０４】
【式５】

【０１０５】
ＰＣＲ産物（５７３塩基対またはｂｐ）をＳａｌＩで消化し、ＳａｌＩで予め直線化したプラスミドｐＡＢｌ１Ｏでクロ−ニングして約５６７８ｂｐのプラスミドｐＬＦ９９９を作る。
【０１０６】
実施例３
各種形態のウシヘルペス１型（ＢＨＶ−１）抗原をコ−ドするプラスミド
ＢＨＶ−１のＢ９０１株のｇＢ、ｇＣ、ｇＤ遺伝子を含むウイルスＤＮＡ断片を単離する。この単離はウイルスゲノムを種々の制限酵素で処理し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＢＨＶ−１のＳＴ株のｇＢ、ｇＣ、ｇＤ遺伝子断片に対応するプローブを用いてサザンブロット法によって分析して行う（Ｌｅｕｎｇ−Ｔａｃｋ Ｐ． ｅｔ． ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４，１９９，４０９−４２１）。ＢＨＶ−１コロラド株［Ｃｏｏｐｅｒ］（ＡＴＣＣ番号ＶＲ‐８６４）も使用できる。同定された断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ， Ｊｏｌｌａ，ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングし、３つの遺伝子をｐＶＲ１０１２発現ベクターでクロ−ニングするオリジンにする。
【０１０７】
３．１． ＢＨＶ−１ ｇＢの各種形態をコ−ドするプラスミド
３．１．１． ｐＰＢ２８０：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたｇＢ遺伝子（天然形）
ＢＨＶ−１ ｇＢの５’および３’部分を含む２つのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片をサザンブロット法で同定し、予めＸｈｏＩで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ、ＵＳＡ）でクローニングする。得られたプラスミドをそれぞれｐＢＰ１２８、ｐＢＰ１１７とよぶ。
ｇＢ遺伝子の５’断片を含むｐＢＰ１２８をＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化し、１７０８ｂｐの断片（Ａ断片）を得た。
ｇＢ遺伝子の３’断片を含むｐＢＰ１１７をＸｈｏＩとＳｔｕＩで消化し、１３４５ｂｐの断片を得た。この断片を予めＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＢＰ１２９とよぶ。このプラスミドをＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し、１４１３ｂｐのＤＮＡ断片（Ｂ断片）を得た。
ＡおよびＢ断片を予めＮｏｔＩとＢａｍＨＩで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクターにクローニングし、プラスミドｐＰＢ２７８（約６０６３ｂｐ）を作り、ＢＨＶ−１ ｇＢ遺伝子の再構築をする。
鋳型ｐＰＢ２７８ベクターを用いて下記のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応を行った：
【０１０８】
【式６】

【０１０９】
ＰＣＲ産物（１４６ｂｐ）を制限酵素ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで消化した。得られたプラスミド２７２８ｂｐの断片と予め消化したＰＣＲ断片とを、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで予め消化したベクターｐＶＲｌ０１２（実施例２）にリゲートして、約７７４２ｂｐのプラスミドｐＰＢ２８０を得た。
ＢＨＶ−１ ｇＢ遺伝子は９３３アミノ酸の蛋白をコードする。
【０１１０】
３．１．２．　ｐＰＢ２８１：ベクタ−ｐＶＲ１Ｏ１２でクロ−ニングしたｇＢ遺伝子（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
先端を切った形（膜貫通領域（ＴＭ）とカルボキシ末端（Ｃｔｅｒ）を欠失した形）のＢＨＶ−１ ｇＢ遺伝子は予めＳａｌＩとＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＶＲｌ０１２（実施例２）にリゲートして得た。両断片はプラスミドｐＰＢ２８０（実施例３．１．１）をＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩで消化した２２３４ｂｐの断片と、一対の下記のヌクレオチドによって得た５６ｂｐの断片である：
【０１１１】
【式７】

【０１１２】
得られた７１５４ｂｐのプラスミドをｐＰＢ２８１とよぶ。ＢＨＶ−１の先端を切ったｇＢ遺伝子は７５９アミノ酸の蛋白をコードする。
【０１１３】
３．１．３．　ｐＰＢ１１５：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたｇＢ遺伝子（ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＢ遺伝子は下記プライマを用いて鋳型ｐＰＢ２８１（実施例３．１．２）からＰＣＲ反応で増した：
【０１１４】
【式８】

【０１１５】
増殖産物（２０８８ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）でクロ−ニングして７１５４ｂｐのプラスミドｐＳＢ１１５を作る。ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＢ遺伝子はＢＨＶ−１ ｇＢ 糖蛋白の細胞外領域を含む７２９アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１１６】
３．２．　ＢＨＶ−１ ｇＣの各種形をコ−ドするプラスミド
３．２．１．　ｐＰＢ２６４：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたｇＣ遺伝子（天然形）
完全なＢＨＶ−１ ｇＣ遺伝子を含む３．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をサザンブロット法で同定し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクターでクローニングする。得られたプラスミドをｐＰＢ２８７とよぶ。
このプラスミドｐＰＢ２８７をＮｃｏＩ−ＢｓｓＳＩで消化し、１４９２ｂｐの消化断片を得た。この断片を下記のオリゴヌクレオチド対で得られた合成ＤＮＡ断片を用いて予めＮｃｏＩとＸｂａＩで処理したプラスミドｐＬｉｔｍｕｓ ２８（ニューイングランド研究所、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）にリゲートし、中間プラスミドｐＰＢ２９０を得た：
【０１１７】
【式９】

【０１１８】
ｐＰＢ２９０をＰｓｔＩとＸｂａＩで消化して得られた１５５４ｂｐの断片を予めＰｓｔＩとＸｂａＩで消化したベクターｐＶＲｌ０１２（実施例２）でクローニングして、約６４２７ｂｐのプラスミドｐＰＢ２６４を得た。ＢＨＶ−１ ｇＣ遺伝子は５０８アミノ酸の蛋白をコードする。
【０１１９】
３．２．２．　ｐＰＢ２９２：ベクタ−ｐＶＲ１Ｏ１２でクロ−ニングしたｇＣ遺伝子（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
先端を切った形のＢＨＶ−１ ｇＣ遺伝子は下記の３つのＤＮＡ断片を予めＰｓｔＩとＸｂａＩで消化したプラスミドｐＶＲｌ０１２（実施例２）にリゲートして得た
（ａ）　ｐＰＢ２６４（実施例３．２．１）をＰｓｔＩ−ＸｈｏＩで消化した１０３５ｂｐの断片
（ｂ）　ｐＰＢ２６４をＸｈｏＩ−ＢａｎＩで消化した３５０ｂｐの断片および
（ｃ）　下記オリゴヌクレオチドＰＢ５１３、ＰＢ５１４を用いて得た４３ｂｐの合成断片：
【０１２０】
【式１０】

【０１２１】
得られた６３０５ｂｐのプラスミドをｐＰＢ２９２とよぶ。ＢＨＶ−１の先端を切ったｇＣ遺伝子は４６６アミノ酸の蛋白をコードする。
【０１２２】
３．２．３．　ｐＳＢ１１６：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたｇＣ遺伝子（ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＣ遺伝子を下記のプライマを用いて鋳型ｐＰＢ２９２（実施例３．２．２）からＰＣＲ反応で増した：
【０１２３】
【式１１】

【０１２４】
増殖産物（１３６２ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）でクロ−ニングして６４０４ｂｐのプラスミドｐＳＢ１１６を作る。
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＣ遺伝子はＢＨＶ−１ ｇＣ 糖蛋白の細胞外領域を含む４７９アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１２５】
３．３．　ＢＨＶ−１ ｇＤの各種形をコ−ドするプラスミド
３．３．１．　ｐＰＢ１４８：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたｇＤ遺伝子（天然形）
ＢＨＶ−１ ｇＤ遺伝子を含む５ｋｂのＸｈｏＩ− ＸｈｏＩ断片をサザンブロット法によって同定し、予めＸｈｏＩ で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋ベクターでクローニングし、プラスミドをｐＰＢ１４７を得た。
このプラスミドｐＰＢ１４７をＮｄｅＩ−ＢｓｒＢＩで消化した３２５ｂｐの断片と、ＮｄｅＩ−ＳｔｙＩで消化した９４３ｂｐの断片とを得た。これらの断片を予めＥｃｏＲＶとＸｂａＩで処理したベクターｐＶＲ１０１２（実施例２）にリゲートし、約６１７１ｂｐのプラスミドｐＰＢ１４８を得た。ＢＨＶ−１ ｇＤ遺伝子は４１７アミノ酸の蛋白をコードする。
【０１２６】
３．３．２．　ｐＰＢ２８４：ベクタ−ｐＶＲ１Ｏ１２でクロ−ニングしたｇＤ遺伝子（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
先端を切った形のＢＨＶ−１ ｇＤ遺伝子は予めＰｓｔＩとＸｂａＩで消化したＢＨＶ−１ウイルスのＢ９０１株のゲノムＤＮＡで下記のプライマー対を用いてＰＣＲ増殖して得られた断片から得た：
【０１２７】
【式１２】

【０１２８】
このＰＣＲ断片を予めＰｓｔＩとＸｂａＩで消化したｐＶＲ１０１２（実施例２）でクローニングし、約５９４３ｂｐのプラスミドｐＰＢ２８４を得た。ＢＨＶ−１の先端を切ったｇＤ遺伝子は３５５アミノ酸の蛋白をコードする。
【０１２９】
３．３．３．　ｐＳＢ１１７：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたｇＤ遺伝子（ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＤ遺伝子を下記のプライマを用いて鋳型ｐＰＢ２８４（実施例３．３．２）からＰＣＲ反応で増殖させた：
【０１３０】
【式１３】

【０１３１】
増殖産物（１０２９ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）でクロ−ニングして約６０７１ｂｐのプラスミドｐＳＢ１１７を作る。
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＤ遺伝子は、ＢＨＶ−１ ｇＤ 糖蛋白の細胞外領域を含む３６８アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１３２】
実施例４
各種形状のウシ呼吸系発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）抗原をコ−ドするプラスミド
ＢＲＳＶウイルスのＦおよびＧ抗原をコードする遺伝子はＳｎｏｏｋ株のウイルス性ＲＮＡからＰＴ−ＰＣＲで得た（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２、３３、１７０−１８２）。ＢＲＳＶ Ａ ５１９０８株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７９４）も使用できる。
【０１３３】
４．１　ＢＲＳＶ−Ｆの各種形をコ−ドするプラスミド
４．１．１．　ｐＳＢ１０７：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＦ遺伝子（天然形）
ＢＲＳＶ のＳｎｏｏｋ株のＦ遺伝子をウイルス性ＲＮＡを鋳型として下記プライマとを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応で増した：
【０１３４】
【式１４】

【０１３５】
増殖産物（１７３９ｂｐ）を酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化し、予めＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクロ−ニングして約６５８３ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０７を作る。
ＢＲＳＶ ウイルスのＦ遺伝子は５７４アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１３６】
４．１．２．　ｐＳＢ１０８：ベクタ−ｐＶＲ１Ｏ１２でクロ−ニングしたＦ遺伝子（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
先端を切った形のＢＲＳＶ のＳｎｏｏｋ株のＦ遺伝子は鋳型としてのウイルス性ＲＮＡと下記のプライマとを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応で増した：
【０１３７】
【式１５】

【０１３８】
増殖産物（１５８１ｂｐ）を酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化し、予めＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクロ−ニングして約６４３０ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０８を作る。
先端を切った形のＦ遺伝子は、ＢＲＳＶ のＦ糖蛋白の細胞外領域を含む５２３アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１３９】
４．１．３．　ｐＳＢ１１４：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたＦ遺伝子（ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＦ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＲＮＡと下記のプライマとを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応で増殖させた：
【０１４０】
【式１６】

【０１４１】
増殖産物（１５１６ｂｐ）を酵素ＰｍｌＩとＢｇｌＩＩで消化し、予めＰｍｌＩとＢｇｌＩＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）でクローニングして約６５７２ｂｐのプラスミドｐＳＢ１１４を作る。
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＦ遺伝子はＢＲＳＶ のＦ糖蛋白の細胞外領域を含む５３５アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１４２】
４．２　ＢＲＳＶ−Ｇの各種形をコ−ドするプラスミド
ＢＲＳＶ Ｇ蛋白（糖蛋白ＩＩ型）の場合は、シグナル配列と膜貫通配列とが区別できないので、膜貫通領域を欠失するときは細胞外領域に対応する配列の上流にシグナル配列を追加する。
ＢＲＳＶ Ｇ蛋白をコードする遺伝子の先端を切った形を含むプラスミドの構築にはプラスミドｐＡＢ１１０（実施例２）を用いる。
【０１４３】
４．２．１．　ｐＳＢ１０９：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＧ遺伝子（天然形）
ＢＲＳＶ のＳｎｏｏｋ株のＧ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＲＮＡと下記のプライマとを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応で増殖させた：
【０１４４】
【式１７】

【０１４５】
増殖産物（７８４ｂｐ）を酵素ＳａｌＩとＸｂａＩで消化し、予めＳａｌＩとＸｂａＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクロ−ニングして約５６６１ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０９を作る。
ＢＲＳＶ ウイルスのＧ遺伝子は２５７アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１４６】
４．２．２．　ｐＳＢ１１０：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたＧ遺伝子（ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
ＢＲＳＶ Ｓｎｏｏｋ株のｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＧ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＲＮＡと下記のプライマとを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応で増殖させた：
【０１４７】
【式１８】

【０１４８】
増殖産物（６６６ｂｐ）を酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化し、予めＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）でクローニングして約５６６０ｂｐのプラスミドｐＳＢ１１０を作る。
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＧ遺伝子はＢＲＳＶ のＧ糖蛋白の細胞外領域を含む２１８アミノ酸の糖蛋白をコードするが、組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ（ｔＰＡ）のシグナル配列が先行する。
【０１４９】
実施例５
各種形態のウシウイルス性下痢ウイルス１型（ＢＶＤ−１）抗原をコ−ドするプラスミド
Ｅ０（４８ｋＤａまたはｇｐ４８の糖蛋白）およびＥ２（ｇｐ５３）抗原をコードする遺伝子はＯｓｌｏｓｓ株のウイルス性ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得た（Ｌ．Ｄｅ Ｍｏｅｒｌｏｏｚｅ達、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３，７４、１４３３−１４３８、Ａ．Ｒｅｎａｒｄ達、Ａｎｎ．Ｒｅｃｈ．Ｖｅｔ．１９８７、１８，１２１−１２５）。ＮＡＤＬ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５３４）またはＮｅｗ Ｙｏｒｋ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５２４）も使用できる。
【０１５０】
５．１　ＢＶＤＶ１型のＯｓｌｏｓｓ株のＥ０の各種形をコ−ドするプラスミド
５．１．１．　ｐＬＦ１０２８：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＥ０遺伝子（天然形）
Ｏｓｌｏｓｓ株のＥ０の遺伝子の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をプライマーＬＦ０５１を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０１５１】
【式１９】

【０１５２】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＢａｍＨＩで消化して得られた約７６５ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＢａｍＨＩで消化して得られた４８６６ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２８（約５６３６ｂｐ）を作る。ＢＶＤＶ−１のＥ０遺伝子は２５２アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
オリゴヌクレオチドＬＦ０５０の配列にＡＴＧコドンを挿入して対応する組換えＥ０ポリペプチドの翻訳を開始できるようにする。
【０１５３】
５．１．２．　ｐＬＦ１０２９：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＥ０遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ０）
Ｅ０遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０２８（実施例５．１．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０１５４】
【式２０】

【０１５５】
ＰＣＲ産物をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた７７０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた５６４２ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２９（約６４１７ｂｐ）を作る。
ＢＶＤＶ−１のＯｓｌｏｓｓ株の変成されたＥ０遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ０）は２８３アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０１５６】
５．２　ＢＶＤＶ１型のＯｓｌｏｓｓ株のＥ２の各種形をコ−ドするプラスミド
５．２．１．　ｐＬＦ１０２８２０：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＥ２遺伝子（天然形）
Ｏｓｌｏｓｓ株のＥ２の遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０４０を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０１５７】
【式２１】

【０１５８】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた１２３５ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた４８６０ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２０（約６１００ｂｐ）を作る。
ＢＶＤＶ−１のＯｓｌｏｓｓ株のＥ２遺伝子は４０９アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
オリゴヌクレオチドＬＦ０３９の配列にＡＴＧコドンを挿入して対応する組換えＥ２ポリペプチドの翻訳を開始できるようにする。
【０１５９】
５．２．２．　ｐＬＦ１０２１：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＥ２遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ２　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＥ２遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０２０（実施例５．２．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０１６０】
【式２２】

【０１６１】
ＰＣＲ産物をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた１１３２ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた５６４２ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２１（約６７７９ｂｐ）を作る。
ＢＶＤＶ−１のＯｓｌｏｓｓ株の変成されたＥ２遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ２　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は４０４アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０１６２】
実施例６
各種形状のウシウイルス性下痢ウイルス２型（ＢＶＤＶ−２）抗原をコ−ドするプラスミド
ＢＶＤＶ２型のＥ２抗原（ｇｐ５３）をコードする遺伝子は株８９０のウイルス性ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得た（Ｊ．Ｆ．ＲｉｄｐａｔｈおよびＳ．Ｒ．Ｂｏｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５、２１２，３６−４６）。ケベック農業漁業食料省のＡｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ研究所から入手可能な株Ｑ１４０も使用できる（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ達、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９６，２１７，３５６−３６１）。株１３７３および株２９６も使用できる（Ｊ．Ｆ．Ｒｉｄｐａｔｈ、ＢＶＤＢ研究プロジェクト、国立動物疾病センター、Ｄａｙｔｏｎ ＡｖｅｎｕＥ２３００、ＵＳＡ）。
【０１６３】
６．１　株８９０の２型のＥ２の各種形をコ−ドするプラスミド
６．１．１．　ｐＬＦ１０２２：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＥ２遺伝子（天然形）
株８９０のＥ２の遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０４４を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０１６４】
【式２３】

【０１６５】
ＰＣＲ産物をＸｂａＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた約１２４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＸｂａＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた４８９１ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２２（約６１３６ｂｐ）を作る。
ＢＶＤＶ−２の株８９０のＥ２遺伝子は４１０アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
オリゴヌクレオチドＬＦ０４３の配列にＡＴＧコドンを挿入して対応する組換えＥ２ポリペプチドの翻訳を開始できるようにする。
【０１６６】
６．１．２．　ｐＬＦ１０２３：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＥ２遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ２　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＥ２遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０２２（実施例６．１．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０１６７】
【式２４】

【０１６８】
ＰＣＲ産物をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた約１１４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた５６４２ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２３（約６７８７ｂｐ）を作る。
ＢＶＤＶ−１の株８９０の変成されたＥ２遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ２　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は４０５アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０１６９】
６．２　２型の株８９０のＥ０の各種形をコ−ドするプラスミド
６．２．１．　ｐＬＦ１０３０：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＥ０遺伝子（天然形）
株８９０のＥ０の遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０６５を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０１７０】
【式２５】

【０１７１】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＢａｍＨＩで消化して得られた約７６８ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＢａｍＨＩで消化して得られた４８６６ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０３０（約５６３９ｂｐ）を作る。
ＢＶＤＶ−２の株８９０のＥ０遺伝子は２５３アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
オリゴヌクレオチドＬＦ０６４の配列にＡＴＧコドンを挿入して対応する組換えＥ０ポリペプチドの翻訳を開始できるようにする。
【０１７２】
６．２．２．　ｐＬＦ１０３１：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＥ０遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ０形）
Ｅ０遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０３０（実施例６．２．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０１７３】
【式２６】

【０１７４】
ＰＣＲ産物をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた５６４２ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２３（約６４１７ｂｐ）を作る。
ＢＶＤＶ−２の株８９０の変成されたＥ０遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ０）は２８３アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０１７５】
実施例７
各種形状のウシパラインフルエンザウイルス３型（ｂＰＩ−３）抗原をコ−ドするプラスミド
赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ蛋白（ＨＮ）およびｂＰＩ−３ウイルスの融合蛋白（Ｆ）をコ−ドする遺伝子はＲｅｉｎｓｉｎｇｅｒ ＳＦ−４株のウイルス性ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得た（ＡＴＣＣから番号ＶＲ−２８１で入手可能）。
【０１７６】
７．１　 ｂＰＩ−３ ＳＦ−４株のＨＮの各種形をコ−ドするプラスミド
７．１．１．　ｐＬＦ１０２４：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＨＮ遺伝子（天然形）
株ＳＦ−４のＨＮ遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０４８を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０１７７】
【式２７】

【０１７８】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＥｃｏＲＶで消化して得られた約１７２６ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＥｃｏＲＶで消化して得られた４８９６ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２４（約６６１９ｂｐ）を作る。
ｂＰＩ−３ ＳＦ−４株のＨＮ遺伝子は５７２アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０１７９】
７．１．２．　ｐＬＦ１０２５：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＨＮ遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ２Δ［ＴＭ］形）
膜貫通領域を欠失したＨＮ遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０２４（実施例７．１．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０１８０】
【式２８】

【０１８１】
ＰＣＲ産物をＮｏｔＩとＥｃｏＲＶで消化して得られた約１５６６ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＮｏｔＩとＥｃｏＲＶで消化して得られた５６６３ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２５（約７２２９ｂｐ）を作る。
ｂＰＩ−３ ＳＦ−４株の変成されたＨＮ遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｅ２　Δ［ＴＭ］）は５４８アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０１８２】
７．２　 ｂＰＩ−３ ＳＦ−４株のＦの各種形をコ−ドするプラスミド
７．２．１．　ｐＬＦ１０２６：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＦ遺伝子（天然形）
ＳＦ−４株のＦ遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０６１を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０１８３】
【式２９】

【０１８４】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた約１６２８ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた４８６０ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２６（約６４８８ｂｐ）を作る。
ＰＰＩ−３ Ｆ遺伝子は５５０アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０１８５】
７．２．２．　ｐＬＦ１０２７：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＦ遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｆ　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
膜貫通領域とＣ末端とを欠失したＦ遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０２６（実施例７．２．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０１８６】
【式３０】

【０１８７】
ＰＣＲ産物をＮｏｔＩとＥｃｏＲＶで消化して得られた約１４３４ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＮｏｔＩとＥｃｏＲＶで消化して得られた５６６３ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０２７（約７０９７ｂｐ）を作る。
変成されたｂＰＩ−３ Ｆ遺伝子（β−グロビン ｔＰＡ−Ｆ　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は５０４アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０１８８】
実施例８
各種形態の仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）抗原をコ−ドするプラスミド
ＰＲＣ糖蛋白ｇＢ、ｇＣ、ｇＤをコ−ドする遺伝子はＮＩＡ３株のウイルス性ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得た（Ｍ．Ｒｉｖｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６６． ３４２４−３４３４、Ａ．Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ達、Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，１９７３，４３，Ｎｏ．９）。ＰＲＶ ＮＩＡ３株の変異株も使用できる。この株は米国特許第４，６８０，１７６号に記載されており、国立微生物培養収集（ＣＮＣＭ）、フランス国、パリのパスツール研究所に 寄託番号Ｉ−３５１およびＩ−３５２で寄託されている。
【０１８９】
８．１　 ＰＲＶ−ｇＢの各種形をコ−ドするプラスミド
８．１．１．　ｐＳＢ１０１：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたｇＢ遺伝子（天然形）
ＰＲＶ ＮＩＡ３株のｇＢ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＤＮＡと下記のプライマとを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０１９０】
【式３１】

【０１９１】
増殖産物（２７６６ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクロ−ニングして約７６３１ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０１を作る。
ＰＲＶ ｇＢ遺伝子は９１３アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１９２】
８．１．２．　ｐＳＢ１０２：ベクタ−ｐＶＲ１０１２でクロ−ニングしたｇＢ遺伝子（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
先端を切った形のＰＲＶのｇＢ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＤＮＡと下記のプライマとを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０１９３】
【式３２】

【０１９４】
増殖産物（２２６２ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩ で消化し、予めＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクローニングして約７１４２ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０２を作る。
先端を切った形（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）のｇＢ遺伝子はＰＲＶ ｇＢ 糖蛋白の細胞外領域を含む７５０アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１９５】
８．１．３．　ｐＮＳ００９：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたｇＢ遺伝子（ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
ＰＲＶ ＮＩＡ３株のｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のｇＢ遺伝子を鋳型ｐＳＢ１０１（実施例８．１．１）から下記のプライマを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０１９６】
【式３３】

【０１９７】
増殖産物（２０８８ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）でクローニングして約７１２７ｂｐのプラスミドｐＮＳ００９を作る。
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のｇＢ遺伝子はＰＲＶ ｇＢ糖蛋白の細胞外領域を含む７２０アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０１９８】
８．２　 ＰＲＶ−ｇＣの各種形をコ−ドするプラスミド
８．２．１．　ｐＳＢ１０３：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたｇＣ遺伝子（天然形）
ＰＲＶ ＮＩＡ３株のｇＣ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＤＮＡと下記のプライマとを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０１９９】
【式３４】

【０２００】
増殖産物（１４５２ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクロ−ニングして約６３２３ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０３を作る。
ＰＲＶ ｇＣ遺伝子は４７９アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０２０１】
８．２．２．　ｐＳＢ１０４：ベクタ−ｐＶＲ１０１２でクロ−ニングしたｇＢ遺伝子（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
先端を切った形のＰＲＶのｇＣ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＤＮＡと下記のプライマとを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０２０２】
【式３５】

【０２０３】
増殖産物（１３３２ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクローニングして約６２０６ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０４を作る。
先端を切った形（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）のｇＣ遺伝子はＰＲＶ ｇＣ 糖蛋白の細胞外領域を含む４４０アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０２０４】
８．２．３．　ｐＮＳ０１２：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたｇＣ遺伝子（ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
ＰＲＶ ＮＩＡ３株のｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のｇＣ遺伝子を鋳型ｐＳＢ１０３（実施例８．２．１）から下記のプライマを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０２０５】
【式３６】

【０２０６】
増殖産物（１２７０ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）でクローニングして約６３１１ｂｐのプラスミドｐＮＳ０１２を作る。
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のｇＣ遺伝子はＰＲＶ ｇＣ糖蛋白の細胞外領域を含む４４８アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０２０７】
８．３　 ＰＲＶ−ｇＤ各種形をコ−ドするプラスミド
８．３．１．　ｐＳＢ１０５：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたｇＤ遺伝子（天然形）
ＰＲＶ ＮＩＡ３株のｇＤ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＤＮＡと下記のプライマとを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０２０８】
【式３７】

【０２０９】
増殖産物（１２２７ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクロ−ニングして約６１０４ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０５を作る。
ＰＲＶ ｇＤ遺伝子は４０４アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０２１０】
８．３．２．　ｐＳＢ１０６：ベクタ−ｐＶＲ１０１２でクロ−ニングしたｇＢ遺伝子（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
先端を切った形のＰＲＶのｇＤ遺伝子を鋳型としてのウイルス性ＤＮＡと下記のプライマとを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０２１１】
【式３８】

【０２１２】
増殖産物（１０７７ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化したベクタ−ｐＶＲ１０１２（実施例２）でクローニングして約５９５７ｂｐのプラスミドｐＳＢ１０６を作る。
先端を切った形（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）のｇＤ遺伝子はＰＲＶ ｇＤ 糖蛋白の細胞外領域を含む３５５アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０２１３】
８．３．３．　ｐＰＢ２３８：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたｇＤ遺伝子（ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形）
ＰＲＶ ＮＩＡ３株のｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のｇＤ遺伝子を鋳型ｐＳＢ１０５（実施例８．３．１）から下記のプライマを用いてＰＣＲ反応で増殖させた：
【０２１４】
【式３９】

【０２１５】
増殖産物（１０１５ｂｐ）を酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、予めＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）でクローニングして約６０５６ｂｐのプラスミドｐＰＢ２３８を作る。
ｔＰＡΔ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のｇＤ遺伝子はＰＲＶ ｇＤ糖蛋白の細胞外領域を含む３６３アミノ酸の糖蛋白をコードする。
【０２１６】
実施例９
各種形状のブタ生殖系呼吸系症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のＬｅｌｙｓｔａｄ株の抗原をコ−ドするプラスミド
ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ３，ＯＲＦ４，ＯＲＦ６蛋白をコードする遺伝子はＬｅｌｙｓｔａｄ株のウイルス性ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得た（Ｊ．Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９３，１９、６２−７２、ＷＯ−Ａ−９２−２１３７５、国立微生物培養収集（ＣＮＣＭ）、フランス国、パリのパスツール研究所に１９９１年６月５日に寄託番号Ｉ−１１０２で寄託されている）。
【０２１７】
９．１　ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ３の各種形をコ−ドするプラスミド
９．１．１．　ｐＬＦ１００９：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＯＲＦ３遺伝子（天然形）
Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ３遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０２８を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２１８】
【式４０】

【０２１９】
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩＩで消化して得られた８０２ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩＩで消化して得られた４８７９ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００９（約５６８１ｂｐ）を作る。ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ３遺伝子は２６５アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２２０】
９．２　ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ５の各種形をコ−ドするプラスミド
９．２．１．　ｐＬＦ１０１１：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＯＲＦ５遺伝子（天然形）
Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ５遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０２０を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２２１】
【式４１】

【０２２２】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＸｂａＩで消化して得られた８０２ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＸｂａＩで消化して得られた４８７９ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０１１（約５６８１ｂｐ）を作る。
ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ５遺伝子は２０１アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２２３】
９．２．２　 ｐＬＦ１０１２：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたＯＲＦ５遺伝子（先端を切った形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＯＲＦ５遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０１１（実施例９．２．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０２２４】
【式４２】

【０２２５】
ＰＣＲ産物を酵素ＢａｍＨＩで消化して得られた４３２ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＡＢ１１０（実施例２）をＢａｍＨＩで消化して得られた５１０５断片とリゲートして約５５３７ｂｐのプラスミドｐＬＦ１０１２を作る。
変成されたＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ５遺伝子（ｔＰＡ　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は１６８アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２２６】
９．３　ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ６の各種形をコ−ドするプラスミド
９．３．１．　ｐＬＦ１０１３：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングかたＯＲＦ６遺伝子（天然形）
Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ６遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０２４を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２２７】
【式４３】

【０２２８】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＸｂａＩで消化して得られた５２８ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＸｂａＩで消化して得られた４８８１ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０１３（約５４０９ｂｐ）を作る。
ＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ６遺伝子は１７３アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２２９】
９．３．２　 ｐＬＦ１０１４：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたＯＲＦ６遺伝子（先端を切った形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＯＲＦ６遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０１３（実施例９．３．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０２３０】
【式４４】

【０２３１】
ＰＣＲ産物を酵素ＢａｍＨＩで消化して得られた３９０ｂｐのＤＮＡ断片を、ベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）をＢａｍＨＩで消化して得られた５１０５ｂｐの断片とリゲートして約５４９５ｂｐのプラスミドｐＬＦ１０１４を作る。
変成されたＰＲＲＳＶ Ｌｅｌｙｓｔａｄ株のＯＲＦ６遺伝子（ｔＰＡ　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は１５４アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２３２】
実施例１０
各種形態のブタ生殖系呼吸系症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のアメリカ株ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２の抗原をコ−ドするプラスミド
ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ３，ＯＲＦ４，ＯＲＦ６蛋白をコードする遺伝子はアメリカ株のウイルス性ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得た（Ｊ．Ｍｕｒｔａｕｇｈ達、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５．１４０．１４５１−１４６０、ＡＴＣＣ に番号ＶＲ−２３３２で保管されている）。
【０２３３】
１０．１　ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ３の各種形をコ−ドするプラスミド
１０．１．１．　ｐＬＦ１０１５：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＯＲＦ３遺伝子（天然形）
ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ３遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０３８を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２３４】
【式４５】

【０２３５】
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶとＸｂａＩで消化して得られた７６９ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＥｃｏＲＶとＸｂａＩで消化して得られた４９００ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０１５（約５６６９ｂｐ）を作る。
ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ３遺伝子は２５４アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２３６】
１０．２　ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ５の各種形をコ−ドするプラスミド
１０．２．１．　ｐＬＦ１０１７：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＯＲＦ５遺伝子（天然形）
ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ５遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０３０を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２３７】
【式４６】

【０２３８】
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化して得られた６０７ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化して得られた４８７９ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０１７（約５４８６ｂｐ）を作る。
ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ５遺伝子は２００アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２３９】
１０．２．２　 ｐＬＦ１０１８：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたＯＲＦ５遺伝子（先端を切った形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＯＲＦ５遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０１７（実施例１０．２．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０２４０】
【式４７】

【０２４１】
ＰＣＲ産物を酵素ＢａｍＨＩで消化して得られた４２６ｂｐの ＤＮＡ断片を、予めＢａｍＨＩで消化したベクタ−ｐＡＢ１１０（実施例２）をＢａｍＨＩで消化して得られた５１０５ｂｐの断片とリゲートして約５５３１ｂｐのプラスミドｐＬＦ１０１８を作る。
変成されたＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ５遺伝子（ｔＰＡ　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は１６６アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２４２】
１０．３　ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ６の各種形をコ−ドするプラスミド
１０．３．１．　ｐＬＦ１０１９：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＯＲＦ６遺伝子（天然形）
ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ６遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０３４を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２４３】
【式４８】

【０２４４】
ＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＸｂａＩで消化して得られた５２７ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＰｓｔＩとＸｂａＩで消化して得られた４８７１ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０１９（約５３９８ｂｐ）を作る。
ＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ６遺伝子は１７４アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２４５】
１０．３．２　 ｐＬＦ１０１６：ベクタ−ｐＡＢ１１０でクロ−ニングしたＯＲＦ６遺伝子（先端を切った形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＯＲＦ６遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１０１９（実施例１０．３．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０２４６】
【式４９】

【０２４７】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化して得られた３９０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＡＢ１１０（実施例２）をＢａｍＨＩで消化して得られた５１０５ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０１６（約５４５９ｂｐ）を作る。
変成されたＰＲＲＳＶ ＶＲ−２３３２株のＯＲＦ６遺伝子（ｔＰＡ　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は１５４アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２４８】
実施例１１
各種形状のブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）のＨ１Ｎ１株の抗原をコ−ドするプラスミド
ブタインフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１型の赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする遺伝子は「ＳＷ」Ｈ１Ｎ１株のウイルス性ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得た。株はケベックの大学、」Ｌａｖａｌ、カナダ国のＡｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ研究所のＶｉｒｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能である（Ｄ．Ｓ．Ａｒｏｍａ達、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、１９９７年、１４、２５１−２５４）。Ｇ．Ｗ．Ｂｏｔｈ達、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８３、８０，６９９６−７０００も参照されたい。
【０２４９】
１１．１　ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１株のＨＡの各種形をコ−ドするプラスミド
１１．１．１．　ｐＬＦ１００１：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＨＡ遺伝子（天然形）
Ｈ１Ｎ１株のＨＡ遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ００４を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２５０】
【式５０】

【０２５１】
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化して得られた１７０５ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化して得られた４８７９ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００１（約６５８４ｂｐ）を作る。
ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１株のＨＡ遺伝子は５６６アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２５２】
１１．１．２　 ｐＬＦ１００２ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＨＡ遺伝子（変成された形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＨＡ遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１００１（実施例１１．１．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０２５３】
【式５１】

【０２５４】
ＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化して得られた１５１５ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＮｏｔＩで消化して得られた５６７８ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００２（７１９３ｂｐ）を作る。
変成されたＳＩＶ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ遺伝子（ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩ ｔＰＡ、　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は５３０アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２５５】
１１．２　ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１株のＮＡの各種形をコ−ドするプラスミド
１１．２．１．　ｐＬＦ１００３：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＮＡ遺伝子（天然形）
Ｈ１Ｎ１株のＮＡ遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ００８を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２５６】
【式５２】

【０２５７】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＸｂａＩで消化して得られた１４１６ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＸｂａＩで消化して得られた４８８１ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００３（約６２９７ｂｐ）を作る。
ＳＩＶ Ｈ１Ｎ１株のＮＡ遺伝子は４６９アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２５８】
１１．２．２　 ｐＬＦ１００４：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＮＡ遺伝子（変成された形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＮＡ遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１００３からＰＣＲ反応で合成した：
【０２５９】
【式５３】

【０２６０】
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化して得られた１２０７ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＥｃｏＲＩで消化して得られた５６７８ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００４（６８８５ｂｐ）を作る。
変成されたＳＩＶ Ｈ１Ｎ１ ＮＡ遺伝子（ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩ ｔＰＡ、　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は４３１アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２６１】
実施例１２
各種形状のブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）のＨ３Ｎ２株の抗原をコ−ドするプラスミド
ブタインフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２型のＨＡおよびＮＡ抗原をコードする遺伝子は世界保健機構（ＷＨＯ）参照の「Ｃｏｔｅｓ ｄｕ Ｎｏｒｄ １９８７」（ｃｄｎ８７）株のウイルス性ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲで得た。株は国立インフルエンザレファレンスセンター、Ｖｉｒｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、フランス国、６９００８、リヨン、ロックフェラー通りから入手可能である。
【０２６２】
１２．１　ＳＩＶ Ｈ３Ｎ２株のＨＡの各種形をコ−ドするプラスミド
１２．１．１．　ｐＬＦ１００５：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＨＡ遺伝子（天然形）
Ｈ３Ｎ２株のＨＡ遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０１２を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２６３】
【式５４】

【０２６４】
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶとＳａｌＩで消化して得られた１７０９ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＥｃｏＲＶとＳａｌＩで消化して得られた４８９３ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００５（約６６０２ｂｐ）を作る。
ＳＩＶ Ｈ３Ｎ２株のＨＡ遺伝子は５６６アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２６５】
１２．１．２　 ｐＬＦ１００６：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＨＡ遺伝子（変成された形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＨＡ遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１００５（実施例１２．１．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０２６６】
【式５５】

【０２６７】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化して得られた１５４２ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＢａｍＨＩで消化して得られた５６７８ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００６（約７２２０ｂｐ）を作る。
変成されたＳＩＶ Ｈ３Ｎ２ ＨＡ遺伝子（ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩ ｔＰＡ、　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は５３８アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２６８】
１２．２　ＳＩＶ Ｈ３Ｎ２株のＮＡの各種形をコ−ドするプラスミド
１２．２．１．　ｐＬＦ１００７：ベクタ−ｐＶＲｌＯ１２でクロ−ニングしたＮＡ遺伝子（天然形）
Ｈ３Ｎ２株のＮＡ遺伝子のｃＤＮＡをプライマーＬＦ０１６を用いて対応するウイルス性ＲＮＡから合成し、下記オリゴヌクレオチドの組を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２６９】
【式５６】

【０２７０】
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶとＸｂａＩで消化して得られた１４１４ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＥｃｏＲＶとＸｂａＩで消化して得られた４９９０ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００７（約６３１４ｂｐ）を作る。
ＳＩＶ Ｈ３Ｎ２株のＮＡ遺伝子は４６９アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２７１】
１２．２．２　 ｐＬＦ１００８：ベクタ−ｐＬＦ９９９でクローニングしたＮＡ遺伝子（変成された形）
膜貫通領域とカルボキシ末端とを欠失したＮＡ遺伝子を下記オリゴヌクレオチドの組を用いて鋳型ｐＬＦ１００５（実施例１２．２．１）からＰＣＲ反応で合成した：
【０２７２】
【式５７】

【０２７３】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化して得られた１２２１ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＬＦ９９９（実施例２）をＢａｍＨＩで消化して得られた５６７８ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１００８（約６８９９ｂｐ）を作る。
変成されたＳＩＶ Ｈ３Ｎ２ ＮＡ遺伝子（ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩ ｔＰＡ、　Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］）は４３１アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２７４】
実施例１３
ウシＧＭ−ＣＳＦをコ−ドするプラスミド
ウシのＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のｃＤＮＡをウシ血液の単核化細胞からプライマーＬＦ０６５を用いて合成し、下記のヌクレオチド対を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２７５】
【式５８】

【０２７６】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた４３７ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた４８６０ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０３２（約５２９７ｂｐ）を作る。
ウシＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は１４３アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２７７】
実施例１４：ブタＧＭ−ＣＳＦをコ−ドするプラスミド
ブタのＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のｃＤＮＡをブタ血液の単核化した細胞からプライマーＬＦ０６７を用いて合成し、下記のヌクレオチド対を用いてＰＣＲ反応で増殖した：
【０２７８】
【式５９】

【０２７９】
ＰＣＲ産物をＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた４４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＶＲｌＯｌ２（実施例２）をＳａｌＩとＢｇｌＩＩで消化して得られた４８６０ｂｐの断片とリゲートしてプラスミドｐＬＦ１０３３（約５３００ｂｐ）を作る。
ブタＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は１４４アミノ酸の蛋白をコ−ドする。
【０２８０】
実施例１５
プラスミドワクチン製剤
実施例３〜１４のプラスミドを含んだＤＮＡ溶液をＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９）に記載の方法でエタノ−ル沈殿で濃縮する。ＤＮＡペレットは、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．９％ ＮａＣｌ溶液に取る。適量の無菌のＨ_２０を用いたＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの生理食塩水で取り、０．７５ｍＭ ＤＮＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を調製する。
【０２８１】
プラスミドＤＮＡ−脂質錯体製剤は、０．７５ｍＭ ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を０．９％ ＮａＣｌの１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液とを同部に希釈して作る。気泡を避けるために、カチオン脂質溶液を含んむ小びんの内壁に沿って２６Ｇ針を用いてＤＮＡ溶液を少しずつ導入する。二つの溶液が混合したら穏やかに振盪をする。０．３７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥおよび５００μｇ／ｍｌのプラスミドから成る最終組成物を得る。
【０２８２】
上記の全ての操作で使う全ての溶液は室温であるのが望ましい。ＤＮＡ／ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ錯体生成は動物を免疫する３０分前に室温で行う。
【０２８３】
実施例１６
ＢＨＶ−１に対するウシの免疫
１２頭のウシを無作為に４頭ずつ３グループに分ける。
グループ１は対照動物グループとする。
グループ２の動物にはワクチンプラスミドｐＰＢ２８１（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＢ、実施例３．１．２をコードする）と、ｐＰＢ２９２（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＣ、実施例３．２．２）と、ｐＰＢ２８４（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＢＨＶ−１ ｇＤ、実施例３．３．２）との混合物を投与する。
グループ３の動物にはグループ２と同じ混合物に実施例１５に記載のＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを配合したものを投与する。
各ウシに針付きの注射器で筋肉経路で１０ｍｌの注射を２１日間隔で２回行う。各免疫化で使われるプラスミドの全量はワクチンで１５００μｇである。
当業者は必要なプラスミド投与量に応じて容量または濃度を調節することができる。
ＢＨＶ−１、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ抗原を発現するワクチンプラスミドの２種の混合物によって誘導される血清反応を最初の予防接種後３５日間モニターする。
結果は［表１］に示してある。
【０２８４】
【表１】

【０２８５】
実施例１７
ＰＲＶに対するブタの免疫
生後約７週の１５頭のウシを無作為に５頭ずつ３グループに分ける。
グループ１は対照動物グループとする。
グループ２の動物にはワクチンプラスミドｐＮＳ００９（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＰＲＶ ｇＢ、実施例８．１．３をコードする）と、ｐＮＳ０１２（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＰＲＶ ｇＣ、実施例８．２．３）と、ｐＰＢ２３８（Δ［ＴＭ−Ｃｔｅｒ］形のＰＲＶ ｇＤ、実施例８．３．３）との混合物を投与する。
グループ４の動物にはグループ３と同じ混合物に実施例１５に記載のＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを最終ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ濃度が０．０５３５ｍＭになるように配合したものを投与する。
各予防接種プロトコルに必要な３５０μｇのプラスミドを混合し、最終容量を１４ｍｌにする。
各ブタに針付き注射器で筋肉経路で２ｍｌの注射を２１日間隔で２回行う。
ブタにＰＲＶ ＮＩＡ３株抗原ウイルスの２ｍｌ溶液をＤ３５の鼻腔内経路で各鼻孔につき１ｍｌの量かつ１ｍｌ当たり１０^７．７６ＣＣＩＤ_５０の力価で抗原投与する。
各ブタの体重（ｋｇ）を最初の予防接種後４２日間モニターする。
抗原投与直後７日間の各ブタの体重増加比（Ｇ７）を計算する。これは７日目の体重（Ｄ７）と抗原投与日の体重（Ｄ０）との差を抗原投与日の体重で割ったものであり、一日当たりのパーセンテージで表す。
（Ｄ７の体重−Ｄ０の体重）×１００／（Ｄ０．７の体重）
ΔＧ７は接種したブタと対照ブタの体重増加比の平均値の差である。
結果は［表２］に示してある。
【０２８６】
【表２】

【０２８７】
本発明は上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載の本発明の精神を逸脱しない限り、種々の変形例を含むものである。
添付の配列リストは下記を表す：
配列番号１：オリゴヌクレオチドＰＢ３２６
配列番号２：オリゴヌクレオチドＰＢ３２９
配列番号３：オリゴヌクレオチドＳＢ０９０
配列番号４：オリゴヌクレオチドＳＢ０９１
配列番号５：オリゴヌクレオチドＬＦ００１
配列番号６：オリゴヌクレオチドＬＦＯＯ２
配列番号７：オリゴヌクレオチドＰＢ２３４
配列番号８：オリゴヌクレオチドＰＢ２３５
配列番号９：オリゴヌクレオチドＰＢ５１１
配列番号１０：オリゴヌクレオチドＰＢ５１２
配列番号１１：オリゴヌクレオチドＳＢ２２１
配列番号１２：オリゴヌクレオチドＳＢ２２２
配列番号１３：オリゴヌクレオチドＰＢ５０７
配列番号１４：オリゴヌクレオチドＰＢ５０８
配列番号１５：オリゴヌクレオチドＰＢ５１３
配列番号１６：オリゴヌクレオチドＰＢ５１４
配列番号１７：オリゴヌクレオチドＳＢ２２３
配列番号１８：オリゴヌクレオチドＳＢ２２４
配列番号１９：オリゴヌクレオチドＰＢ４９７
配列番号２０：オリゴヌクレオチドＰＢ４９８
配列番号２１：オリゴヌクレオチドＳＢ２２５
配列番号２２：オリゴヌクレオチドＳＢ２２６
配列番号２３：オリゴヌクレオチドＳＢ２１Ｏ
配列番号２４：オリゴヌクレオチドＳＢ２１１
配列番号２５：オリゴヌクレオチドＳＢ２１２
配列番号２６：オリゴヌクレオチドＳＢ２２０
配列番号２７：オリゴヌクレオチドＳＢ２１３
配列番号２８：オリゴヌクレオチドＳＢ２１４
配列番号２９：オリゴヌクレオチドＳＢ２１５
配列番号３０：オリゴヌクレオチドＳＢ２１６
配列番号３１：オリゴヌクレオチドＬＦＯ５Ｏ
配列番号３２：オリゴヌクレオチドＬＦＯ５１
配列番号３３：オリゴヌクレオチドＬＦ０５２
配列番号３４：オリゴヌクレオチドＬＦ０５３
配列番号３５：オリゴヌクレオチドＬＦ０３９
配列番号３６：オリゴヌクレオチドＬＦＯ４Ｏ
配列番号３７：オリゴヌクレオチドＬＦＯ４１
配列番号３８：オリゴヌクレオチドＬＦ０４２
配列番号３９：オリゴヌクレオチドＬＦ０４３
配列番号４０：オリゴヌクレオチドＬＦ０４４
配列番号４１：オリゴヌクレオチドＬＦ０４５
配列番号４２：オリゴヌクレオチドＬＦ０４６
配列番号４３：オリゴヌクレオチドＬＦ０６４
配列番号４４：オリゴヌクレオチドＬＦ０６５
配列番号４５：オリゴヌクレオチドＬＦ０６６
配列番号４６：オリゴヌクレオチドＬＦ０６７
配列番号４７：オリゴヌクレオチドＬＦ０４７
配列番号４８：オリゴヌクレオチドＬＦ０４８
配列番号４９：オリゴヌクレオチドＬＦ０５８
配列番号５０：オリゴヌクレオチドＬＦ０５９
配列番号５１：オリゴヌクレオチドＬＦＯ６Ｏ
配列番号５２：オリゴヌクレオチドＬＦ０６１
配列番号５３：オリゴヌクレオチドＬＦ０６２
配列番号５４：オリゴヌクレオチドＬＦ０６３
配列番号５５：オリゴヌクレオチドＳＢ２Ｏ１
配列番号５６：オリゴヌクレオチドＳＢ２０２
配列番号５７：オリゴヌクレオチドＳＢ２０３
配列番号５８：オリゴヌクレオチドＳＢ２１７
配列番号５９：オリゴヌクレオチドＳＢ２０４
配列番号６０：オリゴヌクレオチドＳＢ２０５
配列番号６１：オリゴヌクレオチドＳＢ２０６
配列番号６２：オリゴヌクレオチドＳＢ２１８
配列番号６３：オリゴヌクレオチドＳＢ２０７
配列番号６４：オリゴヌクレオチドＳＢ２０８
配列番号６５：オリゴヌクレオチドＳＢ２０９
配列番号６６：オリゴヌクレオチドＳＢ２１９
配列番号６７：オリゴヌクレオチドＬＦ０２７
配列番号６８：オリゴヌクレオチドＬＦ０２８
配列番号６９：オリゴヌクレオチドＬＦ０１９
配列番号７０：オリゴヌクレオチドＬＦＯ２Ｏ
配列番号７１：オリゴヌクレオチドＬＦＯ２１
配列番号７２：オリゴヌクレオチドＬＦ０２２
配列番号７３：オリゴヌクレオチドＬＦ０２３
配列番号７４：オリゴヌクレオチドＬＦ０２４
配列番号７５：オリゴヌクレオチドＬＦ０２５
配列番号７６：オリゴヌクレオチドＬＦ０２６
配列番号７７：オリゴヌクレオチドＬＦ０３７
配列番号７８：オリゴヌクレオチドＬＦ０３８
配列番号７９：オリゴヌクレオチドＬＦ０２９
配列番号８０：オリゴヌクレオチドＬＦＯ３Ｏ
配列番号８１：オリゴヌクレオチドＬＦＯ３１
配列番号８２：オリゴヌクレオチドＬＦ０３２
配列番号８３：オリゴヌクレオチドＬＦ０３３
配列番号８４：オリゴヌクレオチドＬＦ０３４
配列番号８５：オリゴヌクレオチドＬＦ０３５
配列番号８６：オリゴヌクレオチドＬＦ０３６
配列番号８７：オリゴヌクレオチドＬＦＯＯ３
配列番号８８：オリゴヌクレオチドＬＦＯＯ４
配列番号８９：オリゴヌクレオチドＬＦＯＯ５
配列番号９０：オリゴヌクレオチドＬＦＯＯ６
配列番号９１：オリゴヌクレオチドＬＦＯＯ７
配列番号９２：オリゴヌクレオチドＬＦＯＯ８
配列番号９３：オリゴヌクレオチドＬＦＯＯ９
配列番号９４：オリゴヌクレオチドＬＦＯ１Ｏ
配列番号９５：オリゴヌクレオチドＬＦＯ１１
配列番号９６：オリゴヌクレオチドＬＦＯ１２
配列番号９７：オリゴヌクレオチドＬＦＯ１３
配列番号９８：オリゴヌクレオチドＬＦＯ１４
配列番号９９：オリゴヌクレオチドＬＦ０１５
配列番号１００：オリゴヌクレオチドＬＦＯ１６
配列番号１０１：オリゴヌクレオチドＬＦＯ１７
配列番号１０２：オリゴヌクレオチドＬＦＯ１８
配列番号１０３：オリゴヌクレオチドＬＦ０５４
配列番号１０４：オリゴヌクレオチドＬＦ０５５
配列番号１０５：オリゴヌクレオチドＬＦ０５６
配列番号１０６：オリゴヌクレオチドＬＦ０５７
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＶＲ１０１２の図
【図２】プラスミドｐＡＢ１１０の図

Claims (40)

1. 生産型動物、特にウシおよびブタに関する病原体に対するＤＮＡワクチンであって、このＤＮＡ配列を生体内で発現できるような条件下で、上記動物種の病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドと、下記の［式１］で表される第四アンモニウム塩を含むカチオン脂質とから成ることを特徴とするＤＮＡワクチン：
   【式１】

   

   （ここで、
   Ｒ_１は１２〜１８の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖脂肪族基を表し、
   Ｒ_２は２〜３の炭素原子を有する他の脂肪族基を表し、
   Ｘはヒドロキシルまたはアミン基である）
   この脂質はＤＭＲＩＥであるのが好ましい。
2. ＤＯＰＥをさらに含む請求項１に記載のワクチン。
3. 上記動物種のＧＭ−ＣＳＦ蛋白をさらに含む請求項１または２に記載のワクチン。
4. 上記動物種のＧＭ−ＣＳＦ蛋白をコ−ドする遺伝子を含む発現ベクタ−を、それが生体内で発現できる条件下でさらに含む請求項１または２に記載のワクチン。
5. 発現ベクタ−がプラスミドである請求項４に記載のワクチン。
6. 病原体免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列が、膜貫通領域をコ−ドする部分が欠失している遺伝子の配列である請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
7. 病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列がヘテロなシグナル配列、好ましくはｔＰＡをコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドをさらに含む請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
8. 病原体の免疫原をコ−ドするヌクレオチド配列を含むプラスミドがスタビライザ−イントロンを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン。
9. イントロンがウサギβグロビン遺伝子のイントロンＩＩである請求項７に記載のワクチン。
10. ＢＨＶ−１ヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
11. ｇＢ糖蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ｇＢの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したｇＢ遺伝子配列を含む請求項１０に記載のワクチン。
12. ｇＣ糖蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりに、シグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ｇＣの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したｇＣ遺伝子配列を含む請求項１０に記載のワクチン。
13. ｇＤ糖蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりに、シグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ｇＤの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したｇＤ遺伝子配列を含む請求項１０に記載のワクチン。
14. ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＨＶ−１のｇＢ抗原をコ−ドする発現プラスミドと、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＨＶ−１のｇＣ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミドと、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＨＶ−１のｇＤ抗原をコ−ドする第３の発現プラスミドとを含む請求項１０に記載のワクチン。
15. ＢＲＳＶのヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
16. ＢＲＳＶのＦ蛋白のシグナル配列をヒト起源のｔＰＡのシグナル配列で置換、および／または、Ｆの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたＢＲＳＶのＦ遺伝子の配列を含む請求項１５に記載のワクチン。
17. ＢＲＳＶのＧ蛋白のシグナル配列をヒト起源のｔＰＡのシグナル配列で置換、および／または、Ｇの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化されたＢＲＳＶのＧ遺伝子の配列を含む請求項１５に記載のワクチン。
18. ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと、Ｆのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするＦのヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＲＳＶのＦ抗原をコ−ドする発現プラスミドと、Ｇのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＢＲＳＶのＧ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミドとを含む請求項１５に記載のワクチン。
19. ＢＶＤＶヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
20. Ｅ０蛋白をコードするヌクレオチド配列の上流側にシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列を追加、および／または、Ｅ０をコードするヌクレオチド配列の上流側にイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩを挿入して最適化したＢＶＤＶのＥ０遺伝子配列を含む請求項１９に記載のワクチン。
21. Ｅ２蛋白をコードするヌクレオチド配列の上流側にシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列を追加、および／または、Ｅ２の膜貫通領域をコードするＤＮＡ断片を欠失、および／または、Ｅ２をコードするヌクレオチド配列の上流側にイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩを挿入して最適化したＥ２遺伝子配列を含む請求項１９に記載のワクチン。
22. ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと、Ｅ０の上流側にヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、Ｅ０の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩを挿入して最適化したＢＶＤＶのＥ０抗原をコ−ドする発現プラスミドと、Ｅ２の上流側にヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、Ｅ２の膜貫通領域をコードするヌクレオチド配列の断片を欠失させ、Ｅ２の上流側にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩを挿入して最適化したＢＶＤＶのＥ２抗原をコ−ドする第２の発現プラスミドとを含む請求項１９に記載のワクチン。
23. ｂＰＩ−３のヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
24. ＨＮのシグナル配列のシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡのシグナル配列による置換、および／または、ＨＮの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、ＨＮ遺伝子の上流側へのイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩの挿入によって最適化したｂＰＩ−３のＨＮ遺伝子配列を含む請求項２３に記載のワクチン。
25. Ｆのシグナル配列のシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡのシグナル配列による置換、および／または、Ｆの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、Ｆ遺伝子の上流側へのイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩの挿入によって最適化したｂＰＩ−３のＦ遺伝子配列を含む請求項２３に記載のワクチン。
26. ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと、ＨＮのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするＨＮのヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つＨＮの上流側へのウサギβグロビンのイントロンＩＩの挿入によって最適化したｂＰＩ−３のＨＮ抗原をコ−ドする発現プラスミドと、Ｆのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失およびＦの上流側へのウサギβ−グロビンのイントロンＩＩの挿入によって最適化したｂＰＩ−３のＦ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミドとを含む請求項２３に記載のワクチン。
27. ＰＲＶヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
28. ｇＢ糖蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ｇＢの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したｇＢ遺伝子配列を含む請求項２７に記載のワクチン。
29. ｇＣ糖蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ｇＣの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したｇＣ遺伝子配列を含む請求項２７に記載のワクチン。
30. ｇＤ糖蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ｇＤの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したｇＤ遺伝子配列を含む請求項２７に記載のワクチン。
31. ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＶのｇＢ抗原をコ−ドする発現プラスミドと、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＶのｇＣ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミドと、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＶのｇＤ抗原をコ−ドする第３の発現プラスミドとを含む請求項２７に記載のワクチン。
32. ＰＲＲＳＶヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
33. ＣＯＬ３でコードされた蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ＣＯＬ３の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したＣＯＬ３遺伝子配列を含む請求項３２に記載のワクチン。
34. ＣＯＬ５でコードされた蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ＣＯＬ５の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したＣＯＬ５遺伝子配列を含む請求項３２に記載のワクチン。
35. ＣＯＬ６でコードされた蛋白のシグナルペプチドの配列の代わりにシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡシグナル配列によって最適化するか、および／または、ＣＯＬ６の膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失によって最適化したＣＯＬ６遺伝子配列を含む請求項３２に記載のワクチン。
36. ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと、ＰＲＲＳＶのＣＯＬ３抗原をコードする発現プラスミドと、ＣＯＬ５のシグナル配列をヒトｔＰＡシグナルペプチド配列で置換し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＲＳＶのＣＯＬ５抗原をコ−ドする第２の発現プラスミドと、ＣＯＬ６のシグナル配列をヒトｔＰＡシグナルペプチド配列で置換し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片を欠失させて最適化したＰＲＲＳＶのＣＯＬ６抗原をコ−ドする第３の発現プラスミドとを含む請求項３２に記載のワクチン。
37. ＳＩＶヌクレオチド配列を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
38. ＨＡのシグナル配列のシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡのシグナル配列による置換、および／または、ＨＡの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、ＨＡをコードするヌクレオチド配列の上流側へのイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩの挿入によって最適化したＨＡ遺伝子配列を含む請求項３７に記載のワクチン。
39. ＮＡのシグナル配列のシグナル配列、特にヒト起源のｔＰＡのシグナル配列による置換、および／または、ＮＡの膜貫通領域をコ−ドするＤＮＡ断片の欠失、および／または、ＮＡをコードするヌクレオチド配列の上流側へのイントロン、特にウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩの挿入によって最適化したＮＡ遺伝子配列を含む請求項３７に記載のワクチン。
40. ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと、ＨＡのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするＨＡのヌクレオチド配列の断片を欠失させ且つＨＡの上流側へのウサギβグロビンのイントロンＩＩの挿入によって最適化したＳＩＶのＨＡ抗原をコ−ドする発現プラスミドと、ＮＡのシグナル配列の代わりにヒトｔＰＡのシグナル配列を挿入し、ＮＡの膜貫通領域と隣接するＣ末端とをコ−ドするヌクレオチド配列の断片の欠失およびＮＡの上流側へのウサギβ−グロビンのイントロンＩＩの挿入によって最適化したＳＩＶのＮＡ抗原をコ−ドする第２の発現プラスミドとを含む請求項３７に記載のワクチン。

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