PL215173B1 - Zestaw do przeprowadzania szczepienia przeciwko patogenowi bydła, zastosowanie czynnika patogennego bydła (BRSV) do wytwarzania szczepionki, szczepienie oraz inaktywowana szczepionka - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest zestaw do przeprowadzania szczepienia przeciwko patogenowi bydła, oparty na trybie postępowania podstawowe-przypominające, a także zastosowanie czynnika patogennego bydła, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV) do wytwarzania szczepionki, szczepienie oparte na trybie postępownia podstawowe-przypominające do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu BRSV (syncytialnemu wirusowi układu oddechowego bydła) oraz inaktywowana szczepionka zawierająca BRSV.

Tło wynalazku

Cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) są wykorzystywane do wytwarzania szczepionek (Wolf i wsp., Science 1990, 247:1465-1468). Ten typ szczepienia wywołuje odporność komórkową i humoralną po wprowadzeniu (przy użyciu transfekcji in vitro) cząsteczek DNA lub RNA, kodujących aktywne immunologicznie białka, do komórek poddawanego szczepieniu organizmu.

Szczepionka DNA, albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna, zawiera przynajmniej jeden plazmid, który może być eksprymowany (wyrażany) w komórce organizmu poddawanego szczepieniu lub inokulacji, a także dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub zaróbkę. Sekwencja nukleotydowa takiego plazmidu koduje między innymi jeden lub większą liczbę immunogenów, takich jak białka lub glikoproteiny zdolne do indukowania komórkowej odpowiedzi immunologicznej (mobilizacji limfocytów T) oraz humoralnej odpowiedzi immunologicznej (pobudzania produkcji przeciwciał rozpoznających swoiście immunogen) w komórkach organizmu poddawanego szczepieniu lub inokulacji (Davis H. L., Current Opinion Biotech. 1997, 8:635-640).

Immunogen lub immunogeny pochodzące od czynnika patogennego mogą nie być wystarczająco skuteczne w indukowaniu optymalnej lub ochronnej odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia poddawanego szczepieniu lub inokulacji. Dlatego też użyteczne mogą być zabiegi zmierzające do poprawienia odpowiedzi immunologicznej.

Proponowane są rozmaite drogi podawania szczepionek (podawanie dootrzewnowe, dożylne, domięśniowe, podskórne, śródskórne, dośluzówkowe, itp.). Proponowane są również różne sposoby podawania, na przykład przy użyciu cząstek złota opłaszczonych DNA i wprowadzanych do komórek skóry organizmu poddawanego szczepieniu (Tang i wsp., Nature 1992, 356:152-154) oraz strumieniowe iniektory hydrauliczne, umożliwiające transfekowanie zarówno komórek skóry, jak i komórek tkanek podskórnych (Furth i wsp., Analytical Bioch. 1992, 205:365-368).

W procesie transfekcji DNA in vitro stosuje się następujące związki chemiczne:

A) - lipidy kationowe.

B) - polimery, takie jak np. SuperFect^TM (cząsteczki aktywowanych dendrymerów, produkowanych przez Qiagen; Xu i wsp., Mol. Genet. Metab. 1998, 64:193-197), oraz

C) - czynniki biochemiczne, takie jak przykładowo toksyny, np. toksyny cholery.

Lipidy kationowe mogą być podzielone na cztery podgrupy.

1) Lipidy kationowe zawierające czteroskładnikowe sole amonowe, takie jak np. DOTMA (czyli dioleoilooksypropylotrimetyloamon, produkowany przez Gibco pod nazwą Lipofectine), DOTAP (trimetylo-2,3-(oktadeka-9-eneoilooksy)-1-propan amonu; Gregoriadis i wsp., FEBS Letters 1997, 402:107-110), DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu; WO-A-9634109), DLRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(dodecylooksy)-1-propan amonu; Feigner i wsp., Ann. N Y Acad. Sci. 1995, 772:126-139).

Te kationowe lipidy zawierające czteroskładnikowe sole amonowe mogą być użyte w połączeniu z dodatkowym neutralnym lipidem, takim jak DOPC (dioleoilofosfatydylocholina) lub DOPE (dioleoilofosfatydyloetanoloamina) (Behr J. P., Bioconjugate Chemistry 1994, 5:382- 389).

2) Lipoaminy, takie jak na przykład DOGS (dioktadecyloamidoglicylospermina, produkowana przez firmę Promega pod nazwą Transfectam; Abdallah i wsp., Biol. Cell. 1995, 85:1-7), DC-Chol (dimetyloaminoetano-karbamoilo-cholesterol; Gao i Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179:280-285), BGSC (bis-guanidyno-spermidyno-cholesterol), BGTC (bis-guanidyno-trencholesterol) (Vigneron i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:9682-9686).

3) Lipidy kationowe zawierające czteroskładnikowe sole amonowe oraz lipoaminy, takie jak na przykład DOSPA (pentahydrochlorek N,N-dimetylo-N-(2-(sperminokarboksyamido)etylo)-2,3-bis(dioleoilooksy)-1-propanoimidyny, oferowany przez Gibco pod nazwą LipofectAmine®; Hawley - Nelson i wsp., Focus 1993, 15:73-79), GAP-DLRIE (N-(3-aminopropylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(dodecylooksy)PL 215 173 B1

-1-propan amonu; Wheeler i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11454-11459; Norman i wsp., Vaccine 1997, 15:801-803). Oraz

4) Lipidy zawierające sole amidynowe, takie jak np. ADPED lub ADODE (Ruysschaert i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 203:1622-1628).

Niektóre z tych związków wykorzystywane są z zadowalającym skutkiem do wytwarzania szczepionek DNA. Wiedza z dziedziny transfekcji in vitro nie może być bezpośrednio wykorzystywana w przypadku szczepionek DNA, gdzie celem jest zapewnienie optymalnej i korzystnie ochronnej odpowiedzi immunologicznej. Obserwowano bowiem negatywne wyniki indukowania skutecznej odpowiedzi immunologicznej, np. ochronnej odpowiedzi immunologicznej, przy użyciu związków, o których wiadomo jest, że ułatwiają transfekcję in vitro. Ponadto niektóre związki chemiczne są w wysokich dawkach toksyczne wobec transfekowanych komórek.

W doświadczeniach wykonanych przez Etcharta (Etchart i wsp., J. Gen. Virol. 1997, 78:1577-1580) zastosowanie DOTAP nie prowadziło do uzyskania efektu adiuwanta podczas podawania szczepionki DNA drogą śródnosową, podczas gdy efekt taki uzyskano w przypadku drogi doustnej. DOTAP stosowano również w szczepionkach DNA kodujących hemaglutyninę (HA) wirusa grypy w modelu mysim, w którym stosowano podawanie śródnosowe (Bahn i wsp., Vaccine 1997, 15:811-813), jednak dodanie DOTAP hamowało w tym przypadku odpowiedź immunologiczną. Zastosowanie DC-Chol lub DOTAP/DOPE w szczepionkach DNA kodujących białko powierzchniowe (S) wirusa B zapalenia wątroby u myszy, z wykorzystaniem domięśniowej drogi podawania, umożliwiło zwiększenie odpowiedzi przez przeciwciała, podczas gdy użycie lipofektyny (lub DOTMA) nie zwiększyło tej odpowiedzi (Gregoriadis i wsp., FEBS Letters, 1997, 402:107-110). DC-Chol/DOPE stosowano również w szczepionkach DNA skierowanych przeciwko wirusowi HIV (przeciwko białku Env wirusa HIV) u myszy, u których po domięśniowym podaniu tej szczepionki wywołano skuteczniejszą odpowiedź immunologiczną, podczas gdy podawanie szczepionki drogą podskórną lub śródskómą nie prowadziło do zwiększenia tej odpowiedzi (Ishii i wsp., AIDS Res. Hum. Retro. 1997, 13:1421-1428). Wskazuje to wyraźnie, że wiele czynników, włącznie z drogą podawania, wpływa na skuteczność związku w zakresie zwiększania odpowiedzi immunologicznej.

Dodawanie pewnych cytokin, takich jak interleukiny lub interferony, może umożliwiać wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej indukowanej przez szczepionki DNA. Każda cytokina inicjuje reakcję, która jest specyficzna dla tej cytokiny i ukierunkowuje odpowiedź immunologiczną w większym lub mniejszym stopniu w stronę odpowiedzi komórkowej lub odpowiedzi humoralnej (Pasquini i wsp., Immunol. Cell. Biol. 1997, 75:397-401; Kim i wsp., J. Interferon Cytokine Res. 1999, 19:77-84). Efekty adiuwanta uzyskane dla cytokiny pochodzącej z danych gatunków nie muszą być koniecznie takie same, jeśli różny jest kontekst immunologiczny; przykładowo, jeśli cytokina z jednego gatunku jest podawana innemu gatunkowi, np. w heterologicznym systemie immunologicznym. Dodanie cytokiny może również nie prowadzić do uzyskania efektu adiuwanta lub też może nawet prowadzić do efektu odmiennego niż zamierzony, czyli do redukcji lub zahamowania odpowiedzi immunologicznej. Tak więc szczepionka DNA kodująca pojedynczy łańcuch immunoglobuliny w fuzji z GM-CSF nie zwiększa odpowiedzi immunologicznej, podczas gdy bezpośrednie podawanie tego białka fuzyjnego myszom jest skuteczne, podobnie jak podawanie białka fuzyjnego składającego się z Fv i cytokiny IL-1 β lub podawanie szczepionki DNA kodującej to właśnie białko fuzyjne (Hakim i wsp., J. Immunol. 1996, 157:5503-5511). Zastosowanie plazmidów umożliwiających koekspresję cytokiny IL-2 oraz białka płaszcza wirusa B zapalenia wątroby, w postaci fuzji lub w konfiguracji niefuzyjnej, prowadzi do wzrostu humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej (Chow i wsp., J. Virol. 1997, 71:169-178). Jednakże zastosowanie bicistronowego plazmidu, kodującego glikoproteinę gp120 wirusa HIV-1 oraz cytokinę IL-2, prowadziło do indukcji słabszej swoistej odpowiedzi immunologicznej przeciwko gp120, niż to miało miejsce w przypadku zastosowania monocistronowego plazmidu kodującego jedynie gp120 (Barouch i wsp., J. Immunol. 1998, 161:1875-1882). Jednoczesne wstrzyknięcie myszom dwóch wektorów ekspresyjnych, z których jeden kodował glikoproteinę G wirusa wścieklizny, a drugi mysie białko GM-CSF, stymulowało aktywność limfocytów B i T, podczas gdy wstrzyknięcie dodatkowo plazmidu kodującego interferon γ (zamiast mysiego białka GM-CSF) prowadzi do zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej (Xiang i wsp., Immunity 1995. 2:129-135). Tak więc to czy cytokina wzmacnia odpowiedź immunologiczną zależy od rozmaitych czynników.

Niektóre modyfikacje antygenów, takie jak delecje części sekwencji nukleotydowej kodującej antygen, insercje fragmentu DNA do sekwencji nukleotydowej kodującej antygen lub do nie ulegają4

PL 215 173 B1 cych translacji regionów ze strony 5” lub 3” genu, może również zwiększać wydajność szczepionek DNA, na przykład poprzez podwyższanie poziomu ekspresji antygenu lub jego prezentacji.

Jednak w praktyce manipulacje przeprowadzane na sekwencjach nukleotydowych kodujących antygen mogą prowadzić do redukcji lub utraty wyjściowej aktywności immunologicznej. Tak więc delecja domeny przezbłonowej wprowadzona do genu kodującego antygen G wirusa wścieklizny prowadziła do redukcji poziomu ochrony indukowanej w modelu mysim po domięśniowym podaniu szczepionki DNA kodującej zmodyfikowany antygen (Xiang i wsp., Virol. 1995, 209:569). Delecja domeny przezbłonowej w genie kodującym glikoproteinę gD bydlęcego wirusa opryszczki (BHV - ang. bovine herpes virus) nie była w stanie doprowadzić do wzrostu odpowiedzi przeciwciałowej i indukowała jedynie częściową ochronę u bydła szczepionego przy użyciu drogi domięśniowej (van Drunen Little-van den Hurk i wsp., J. Gen. Virol. 1998, 79:831-839). Humoralne i komórkowe odpowiedzi immunologiczne oraz uzyskany efekt ochronny były identyczne u świnek morskich testowanych po immunizacji z użyciem albo szczepionki DNA kodującej glikoproteinę GP wirusa Ebola albo też szczepionki DNA kodującej tę samą glikoproteinę GP w postaci ulegającej sekrecji (Xu i wsp., Nature Medicine 1998, 4:37-42).

Wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA - ang. tissue plasminogen activator) do genu kodującego antygen Pf332 malarii nie prowadziło do wzrostu odpowiedzi przeciwciałowej u myszy szczepionych przy użyciu domięśniowej drogi podawania (Haddad i wsp., FEMS 1997, 18:193-202). Dodanie (z zachowaniem ramki odczytu) sekwencji tPA do genu kodującego antygen VP7 mysiego rotawirusa również nie prowadziło do wzrostu odpowiedzi przeciwciałowej u myszy szczepionych przy użyciu śródskórnej drogi podawania, podczas gdy białko fuzyjne obejmujące antygen VP4 oraz tPA pozwoliło na otrzymanie takiego wzrostu, jednak bez indukcji skutecznej ochrony (Choi i wsp., Virology 1998, 250:230-240).

Zgodnie z powyższym, to czy modyfikacja sekwencji nukleotydowej będzie użyteczna zależy od wielu czynników, a modyfikacje dotyczące sekwencji nukleotydowej jednego antygenu nie mogą być automatycznie przenoszone do innego antygenu, ponieważ nie zawsze charakteryzują się takim samym układem strukturalnym.

Ponadto, pożądane byłoby wzmocnienie lub usprawnienie sposobów szczepienia lub immunizacji, na przykład szczepienia lub immunizacji bydła; i pożądane byłoby też dostarczenie sposobów szczepienia lub immunizacji opartych na trybie podawania podstawowe-przypominające, a także szczepionek albo kompozycji immunologicznych lub immunogennych, takich jak szczepionki DNA albo oparte na DNA kompozycje immunogenne lub immunologiczne, które mogłyby być wykorzystane w tych sposobach.

Cele i streszczenie wynalazku

Zostało wykazane, że szczepienie lub immunizacja przy użyciu DNA, przeprowadzane na zwierzętach, które mogą być poddane szczepieniu lub immunizacji przy użyciu DNA, np. na ssakach, ptakach, gadach, a korzystnie na bydle (np. krowach, cielętach, bykach, rogaciźnie, bizonach, itp.) mogą być ulepszone poprzez zastosowanie odpowiedniej procedury szczepienia lub immunizacji, np. poprzez podawanie jednej lub większej liczby szczepionek DNA albo opartych na DNA kompozycji immunologicznych lub immunogennych jako „wstępnej” dawki, a następnie podanie jednej lub większej liczby podjednostek (np. preparatu albo preparatów antygenu, immunogenu lub epitopu - „podjednostek” patogenu), i/lub inaktywowanego patogenu i/lub szczepionki zawierającej osłabiony patogen lub kompozycji immunologicznych lub immunogennych i/lub rekombinowanego lub modyfikowanego wektora, np. wirusowego, bakteryjnego lub drożdżowego, szczepionki lub kompozycji immunogennej lub immunologicznej (które zawierają wektor ulegający ekspresji in vivo, np. modyfikowany lub rekombinowany wirusowy, bakteryjny, drożdżowy lub inny wektor ekspresyjny).

Szczepienie oparte na trybie postępowania podstawowe-przypominające (podawaniu podstawowym i podawaniu przypominającym) według wynalazku, może być zastosowane u zwierząt w każdym wieku, korzystnie u zwierząt młodych (np. zwierząt, które wykazują wykrywalny poziom matczynych przeciwciał i/lub karmione są wciąż piersią, np. młode cielęta - cielęta, które mają wykrywalny poziom matczynych przeciwciał i/lub karmione są mlekiem matki), u zwierząt przed okresem dorosłości (zwierząt, które są starsze od młodych zwierząt, ale nie osiągnęły jeszcze dojrzałości lub dorosłości lub wieku reprodukcyjnego), u zwierząt dorosłych (np. u zwierząt, które są w wieku reprodukcyjnym lub poreprodukcyjnym), a korzystne jest także stosowanie procedury obejmującej podawanie podstawowe i przypominające u samic w ciąży, lub też u samic przed porodem lub przed inseminacją.

PL 215 173 B1

Procedura oparta na podawaniu podstawowym i podawaniu przypominającym (tryb postępowania podstawowe-przypominające) jest szczególnie korzystna w przypadku młodych zwierząt, np. u młodych cieląt, ponieważ pozwala wówczas na przeprowadzenie szczepienia lub immunizacji w młodym wieku. Pierwsze podanie szczepionki w tym trybie podawania może być na przykład wykonane u młodego zwierzęcia w wieku, w którym owe zwierzę posiada matczyne przeciwciała. Inną zaletą tego trybu podawania jest to, że zapewnia on zwiększony poziom bezpieczeństwa dla samic w ciąży, np. krów, obecnych w tym samym miejscu, w pobliżu młodych osobników lub innych samic w ciąży, np. w tym samym gospodarstwie hodowlanym lub na tym samym obszarze wypasania.

Wynalazek dotyczy więc zestawu do przeprowadzania szczepienia przeciwko patogenowi bydła opartego na trybie postępowania podstawowe-przypominające, który zawiera:

(a) pierwszą szczepionkę podstawową, przy czym pierwsza szczepionka podstawowa obejmuje szczepionkę DNA zawierającą cząsteczkę/cząsteczki kwasu nukleinowego kodującą i wyrażającą in vivo u bydła przynajmniej jeden immunogen z patogenu bydła, przy czym immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła), lubjego epitop lub ich kombinację, i (b) drugą szczepionkę przypominającą, która to druga szczepionka przypominająca przeciwko patogenowi bydła jest inna niż pierwsza szczepionka podstawowa, ale zawiera lub wyraża przynajmniej jeden immunogen patogenu bydła, który jest tym samym immunogenem patogenu bydła jak wyrażany w pierwszej szczepionce podstawowej, przy czym drugą szczepionkę przypominającą stanowi inaktywowany patogen, którym to patogenem jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV);

przy czym (a) i (b) są w oddzielnych pojemnikach, ewentualnie zaopatrzonch w indstrukcje o sposobie podawania lub zastosowaniu; oraz przy czym patogenem bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV).

W korzystnym zestawie (a) i (b) są w oddzielnych pojemnikach w tym samym opakowaniu. W korzystnym zestawie szczepionka DNA zawiera (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu (DMRIE).

Wynalazek niniejszy dostarcza więc zestaw do przeprowadzania szczepienia, opartego na trybie postępowania podstawowe-przypominające, stosowanego korzystnie u bydła i skierowanego przeciwko patogenowi bydła, przy czym zestaw ten może być wykorzystywany u młodych zwierząt, np. u młodych cieląt, u których przykładowo szczepienie podstawowe może być wykonane w okresie, w którym posiadają one matczyne przeciwciała skierowane przeciwko bydlęcemu patogenowi, natomiast podawanie przypominające przeprowadzane jest korzystnie w okresie kiedy poziom matczynych przeciwciał ulega redukcji lub zanika, np. w okresie następującym po okresie karmienia mlekiem matki.

Patogen bydlęcy, przeciwko któremu zastosowana może być procedura oparta na trybie postępowania podstawowe-przypominające, obejmuje: wirus BRSV (ang. bovine respiratory syncytial virus), wirus bydlęcej grypy rzekomej typu 3 (bPI-3, ang. - bovine parainfluenza virus type 3), bydlęcy wirus opryszczki typu 1 (BHV-1, ang. bovine herpes virus type 1) (wywołujący zakaźny nieżyt nosa i tchawicy u bydła), wirus choroby śluzówkowej oraz bydlęcy pestiwirus typu 1 lub typu 2 (wirus bydlęcej biegunki wirusowej, BVDV-1 oraz BVDV-2). Stąd szczepienie oparte na trybie postępowania podstawowe-przypominające, wykorzystywane jest w praktyce przeciwko wirusowi BRSV.

Wynalazek ten przewiduje zastosowanie zestawu do przeprowadzenia szczepienia przeciwko patogenowi bydła, opartego na trybie postępowania podstawowe-przypominające, zawierającego pierwszą szczepionkę podstawową obejmującą szczepionkę DNA oraz drugą szczepionkę przypominającą, który to zestaw może być użyty do szczepienia opartego na trybie postępowania podstawowe-przypominające opisanym w opisie wynalazku, i który może umożliwiać otrzymanie ulepszonej lub korzystnie skutecznej i/lub ochronnej odpowiedzi immunologicznej u bydła, przy czym obejmuje on przynajmniej jeden czynnik immunogenny wirusa BRSV zgodny z wynalazkiem, przykładowo obejmuje przynajmniej jeden plazmid zawierający i eksprymujący cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą przynajmniej jeden immunogen, antygen lub epitop pochodzący z wirusa BRSV.

Zgodnie z powyższym, wynalazek ten obejmuje także zestaw przeznaczony do podawania podstawowego i przypominającego, zawierający zasadniczo podstawową szczepionkę oraz drugą szczepionkę przypominającą, zawarte w oddzielnych pojemnikach, ewentualnie zaopatrzonych w instrukcje o sposobie podawania lub zastosowaniu.

Wynalazek dotyczy również zastosowania czynnika patogennego bydła, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV) do wytwarzania szcze6

PL 215 173 B1 pionki podstawowej DNA obejmującej plazmid zawierający i wyrażający in vivo u bydła co najmniej jeden immunogen tego czynnika patogennego bydła, którym to immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub jego epitop lub ich kombinacja, i do wytwarzania drugiej szczepionki zawierającej ten czynnik patogenny bydła w formie inaktywowanej, przy czym czynnikiem patogennym bydła jest wirus układu oddechowego bydła (BRSV), w którym szczepionka podstawowa jest przeznaczona do podawania bydlęciu jako pierwsza, a inaktywowana szczepionka jest podawana po szczepionce podstawowej DNA temu samemu bydlęciu w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu immunogenowi.

W korzystnym zastosowaniu szczepionka podstawowa DNA jest przeznaczona do indukowania u bydła odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu immunogenowi (immunogenom), korzystniej odpowiedzią immunologiczną przeciwko immunogenowi (immunogenom) jest odpowiedź komórkowa angażująca pamięć limfocytów T eksprymujących interferon gamma+ dla wyrażanego immunogenu.

W równie korzystnym zastosowaniu szczepionka podstawowa DNA jest przeznaczona do podawania młodemu bydłu od ocielenia do 12 tygodnia włącznie.

W korzystnym zastosowaniu druga szczepionka jest przeznaczona do podawania od 2 tygodni do 5 miesięcy po podaniu szczepionki podstawowej DNA.

W takim zastosowaniu korzystne jest gdy bydłem jest młode ciele które ma matczyne przeciwciała skierowane przeciwko temu patogenowi bydła.

Ponadto korzystne jest zastosowanie w którym szczepionka DNA zawiera (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu (DMRIE).

Wynalazek dotyczy również zastosowania czynnika patogennego bydła, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV) do wytwarzania inaktywowanej szczepionki do szczepienia przeciw temu czynnikowi patogennemu bydła, przy czym bydło było wcześniej immunizowane szczepionką DNA wyrażająca in vivo co najmniej jeden immunogen tego samego czynnika patogennego, którym to immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub jego epitop lub ich kombinacja, i u bydła wytworzyła się specyficzna odpowiedź immunologiczna na szczepionkę podstawową DNA.

W zastosowaniu odpowiedzią immunologiczną korzystnie jest odpowiedź komórkowa angażująca pamięć limfocytów T eksprymujących interferon gamma+ dla wyrażanego immunogenu.

W zastosowanie inaktywowana szczepionka korzystnie jest przeznaczona do podawania od 2 tygodni do 5 miesięcy po podaniu bydlęciu szczepionki DNA.

W korzystnym zastosowaniu bydłem jest młode ciele które ma matczyne przeciwciała skierowane przeciwko temu patogenowi bydła.

W takim zastosowaniu szczepionka DNA korzystnie zawiera (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu (DMRIE).

Wynalazek dotyczy również szczepienia opartego na trybie postępowania podstawowe-przypominające do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu BRSV (syncytialnemu wirusowi układu oddechowego bydła), w którym szczepionka podstawowa DNA obejmuje plazmid zawierający i wyrażający in vivo u bydła, co najmniej jeden immunogen czynnika patogennego bydła, przy czym czynnikiem patogennym bydła jest BRSV, a immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub jego epitop lub ich kombinacja, i przy czym szczepionka przypominająca zawiera czynnik patogenny bydła w formie inaktywowanej, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV), oraz przy czym szczepionka podstawowa DNA jest przeznaczona do podawania bydlęciu jako pierwsza, a inaktywowana szczepionka jest przeznaczona do podawania po szczepionce podstawowej DNA i dla tego samego bydlęcia dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu immunogenowi.

Wynalazek dotyczy również inaktywowanej szczepionki do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu BRSV, przy czym inaktywowana szczepionka obejmuje czynnik patogenny bydła, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV), w której czynnik patogenny jest inaktywowany, przy czym inaktywowana szczepionka jest przeznaczona do podawania bydlęciu, które uprzednio było immunizowane szczepionką DNA wyrażająca in vivo co najmniej jeden immunogen tego samego czynnika patogennego, przy czym immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wiruPL 215 173 B1 sa układu oddechowego bydła) lub jego epitop lub ich kombinacja, i u bydlęcia wytworzyła się specyficzna odpowiedź immunologiczna na podstawową szczepionkę DNA.

Opisane rozwiązania pozwalają na prowadzenie sposobu immunizacji lub szczepienia bydła opartego na trybie postępowania podstawowe-przypominające (np. krów, byków, cieląt), skierowanego przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi bydlęcemu, który to sposób obejmuje podawanie bydłu podstawowej szczepionki DNA albo opartej na DNA kompozycji immunologicznej lub immunogennej, zawierającej cząsteczkę lub cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące i eksprymujące in vivo immunogen, antygen lub epitop pochodzący z patogenu, a następnie podawanie przypominającej szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej, która prezentuje systemowi immunologicznemu ten sam immunogen, antygen lub epitop. Przypominająca szczepionka albo kompozycja immunogenna lub immunologiczna jest korzystnie odmienna od szczepionki DNA albo opartej na DNA kompozycji immunogennej lub immunologicznej. Przykładowo, przypominająca szczepionka albo kompozycja immunogenna lub immunologiczna może zawierać inaktywowany patogen i/lub osłabiony patogen i/lub podjednostkę (korzystnie antygen, immunogen i/lub epitop eksprymowany przez szczepionkę DNA albo opartą na DNA kompozycję immunogenną lub immunologiczną) i/lub rekombinowany lub modyfikowany wektor, np. wirus. Rekombinowany lub modyfikowany wektor jest korzystnie wektorem przeznaczonym do ekspresji in vivo, na przykład modyfikowanym lub rekombinowanym wektorem bakteryjnym, drożdżowym lub wirusowym, na przykład wirusem grypy, adenowirusem, wirusem opryszczki, zawierającym cząsteczkę lub cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące i eksprymujące in vivo immunogen, antygen lub epitop pochodzący z patogenu eksprymowanego przez szczepionkę DNA albo opartą na DNA kompozycję immunogenną lub immunologiczną. Podawanie przypominające jest korzystnie przeprowadzane przy użyciu inaktywowanej szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej, lub przy użyciu szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej zawierającej rekombinowany, żywy wektor wirusowy, np. rekombinowany wirus ospy, zawierający cząsteczkę lub cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące i eksprymujące in vivo immunogen, antygen lub epitop pochodzący z patogenu eksprymowanego przez szczepionkę DNA albo opartą na DNA kompozycję immunogenną lub immunologiczną. Tak więc korzystne jest, aby podawanie przypominające obejmowało immunogen, antygen lub epitop eksprymowany przez szczepionkę DNA albo opartą na DNA kompozycję immunogenną lub immunologiczną, albo też umożliwiało ekspresję in vivo tego samego immunogenu, antygenu lub epitopu, eksprymowanego przez szczepionkę DNA albo opartą na DNA kompozycję immunogenną lub immunologiczną.

Terminy „kompozycja immunogenna” oraz „kompozycja immunologiczna” i „kompozycja immunogenna lub immunologiczna” odnoszą się do każdej kompozycji, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciwko docelowemu patogenowi; przykładowo wywołuje odpowiedź immunologiczną przeciwko docelowemu patogenowi po podaniu lub wstrzyknięciu zwierzęciu (bydłu). Terminy „kompozycja szczepionkowa” oraz „szczepionka” odnoszą się do dowolnej kompozycji, która indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną, skierowaną przeciwko docelowemu patogenowi, lub która skutecznie chroni przed patogenem; przykładowo, wywołuje ochronną odpowiedź immunologiczną przeciwko docelowemu patogenowi lub dostarcza skutecznej ochrony przed patogenem po podaniu lub wstrzyknięciu bydłu. Ponadto, choć w tekście używa się określenia „immunogen, antygen lub epitop”, to immunogen może być antygenem lub epitopem antygenu.

Termin „podawanie podstawowe i przypominające albo tryb postępowania podstawowe-przypominające” odnosi się do kolejnego podawania dwóch różnych typów szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej, posiadających przynajmniej jeden wspólny immunogen, antygen lub epitop. Podawanie podstawowe jest podawaniem pierwszego typu szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej, i może obejmować jedno, dwa lub większą liczbę podań. Podawanie przypominające jest podawaniem drugiego typu szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej, i może obejmować jedno, dwa lub większą liczbę podań, np. może obejmować lub składać się zasadniczo z corocznych podawań.

Przewiduje się więc podawanie bydłu szczepionki podstawowej, zawierającej szczepionkę DNA albo opartą na DNA kompozycję immunogenną lub immunologiczną skierowaną przeciwko patogenowi bydlęcemu, obejmującą przynajmniej jeden plazmid, który zawiera i eksprymuje w komórce bydlęcego gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą immunogen, antygen lub epitop bydlęcego patogenu, a następnie podawanie kompozycji przypominającej, zawierającej bydlęcy patogen w formie inaktywowanej, lub bydlęcy patogen w formie osłabionej, lub immunogen, antygen albo epitop eksprymowany przez szczepionkę DNA albo opartą na DNA kompozycję immunogenną lub immunolo8

PL 215 173 B1 giczną, lub rekombinowany albo modyfikowany wektor, np. wirus, taki jak rekombinowany lub modyfikowany wirus opryszczki, adenowirus lub wirus ospy (korzystnie wirus ospy, taki jak wirus ospy krowiej, ospy kanarków lub ospy drobiu), obejmujący i eksprymujący w komórce bydlęcego gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą immunogen, antygen lub epitop bydlęcego patogenu, eksprymowane przez szczepionkę DNA albo opartą na DNA kompozycję immunogenną lub immunologiczną. Bydlęcym patogenem może być BRSV, bPI-3, BHV-1 lub BVDV.

Szczepionka DNA albo kompozycja immunogenna może zawierać lipid kationowy, obejmujący czteroskładnikową sól amonową, wyrażoną wzorem ch₃ r_x- o - ch₂- ch- ch₂- n⁺— R₂- X ^0Ri CH₃ w którym R1 jest nasyconym lub nienasyconym liniowym rodnikiem alifatycznym, zawierającym od 12 do 18 atomów węgla, R2 jest rodnikiem alifatycznym zawierającym 2 lub 3 atomy węgla, a X jest grupą karboksylową lub aminową. Korzystnie, związkiem tym jest DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu). Związek ten może być połączony z neutralnym lipidem, takim jak DOPE (dioleoilo-fosfatydylo-etanoloamina). Gdy związkiem tym jest DMRIE, a neutralnym lipidem jest DOPE, po połączeniu tworzą one DMRIE-DOPE.

Alternatywnie lub dodatkowo, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna mogą zawierać bydlęce białko GM-CSF, albo też wektor ekspresyjny, zawierający i eksprymujący w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową, kodującą bydlęce białko GM-CSF. Wektor ekspresyjny, który zawiera i eksprymuje bydlęcy gen GM-CSF, może być plazmidem lub rekombinowanym albo modyfikowanym wektorem, np. rekombinowanym lub modyfikowanym wirusem, bakterią lub drożdżem. Plazmid w szczepionce DNA lub w opartej na DNA kompozycji immunogennej, eksprymujący immunogen, antygen lub epitop bydlęcego patogenu, może również eksprymować bydlęce białko GM-CSF.

Co więcej, dodatkowo lub alternatywnie, sekwencja nukleotydowa zawarta w szczepionce DNA albo w opartej na DNA kompozycji immunogennej i kodująca immunogen, antygen lub epitop bydlęcego patogenu może zawierać delecję części genu kodującej domenę przezbłonową.

Co więcej, również, dodatkowo lub alternatywnie, plazmid zawarty w szczepionce DNA lub w opartej na DNA kompozycji immunogennej może dodatkowo zawierać i eksprymować w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową, kodującą heterologiczną sekwencję sygnałową białka tPA, np. sekwencję sygnałową ludzkiego tPA, i/lub stabilizujący intron, np. intron II króliczego genu β-globiny.

Gdy patogenem bydlęcym jest wirus BRSV; immunogenem może być wówczas na przykład białko F lub białko G lub białko N wirusa BRSV. Gdy immunogenem jest białko F lub białko G wirusa BRSV, korzystnie jest ono zmodyfikowane poprzez zastąpienie sekwencji sygnałowej białka F i/lub G wirusa BRSV sekwencją sygnałową ludzkiego białka TPA, i/lub poprzez delecję domeny przezbłonowej i/lub końca cytoplazmatycznego. Sekwencja kodująca białko F może również zawierać delecję nukleotydów poprzedzających sekwencję kodującą domenę przezbłonową i odpowiadających aminokwasom od 1 do 92.

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna mogą więc obejmować pierwszy plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotyd o wą kodującą białko F wirusa BRSV, zmodyfikowaną poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka F wirusa BRSV sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA oraz poprzez delecję domeny przezbłonowej wraz z przylegającą częścią C-końcową (końcem cytoplazmatycznym), a opcjonalnie także poprzez delecję opisanego powyżej regionu poprzedzającego domenę przezbłonową, a także drugi plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą białko N wirusa BRSV i/lub białko G wirusa BRSV, zmodyfikowaną poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka G wirusa BRSV sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA oraz poprzez

PL 215 173 B1 delecję domeny przezbłonowej wraz z przylegającą częścią C-końcową (końcem cytoplazmatycznym); i w którym obecny jest lipid kationowy, np. DMRIE, a także lipid neutralny, np. DOPE (przez co np. kompozycja immunogenna zawiera kompleks DMRIE-DOPE). Taka szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna może ponadto obejmować bydlęce białko GM-CSF lub wektor ekspresyjny (np. plazmid), który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą bydlęce białko GM-CSF. Dodatkowo lub alternatywnie, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna zawierać mogą plazmid, który eksprymuje wszystkie te „zoptymalizowane” immunogeny BRSV, a korzystnie obejmują także kationowy lipid, np. DMRIE, oraz lipid neutralny, np. DOPE (przez co np. kompozycja immunogenna zawiera kompleks DMRIE-DOPE); a ponadto taka szczepionka DNA lub oparta na DNA kompozycja immunogenna może także obejmować bydlęce białko GM-CSF lub wektor ekspresyjny (np. plazmid), który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą bydlęce białko GM-CSF.

Opisano także, że bydlęcym patogenem może być wirus BHV-1, a immunogenem może być białko gB wirusa BHV-1 i/lub białko gC wirusa BHV-1 i/lub białko gD wirusa BHV-1. Immunogenem może być białko gB wirusa BHV-1, zmodyfikowane poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka gB wirusa BHV-1 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA i/lub poprzez delecję domeny przezbłonowej, i/lub białko gC wirusa BHV-1, zmodyfikowane poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka gC wirusa BHV-1 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA i/lub poprzez delecję domeny przezbłonowej, i/lub białko gD wirusa BHV-1, zmodyfikowane poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka gD wirusa BHV-1 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA i/lub poprzez delecję domeny przezbłonowej.

Szczepionka DNA lub oparta na DNA kompozycja immunogenna mogą więc obejmować pierwszy plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą białko gB wirusa BHV-1, zmodyfikowaną poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka gB wirusa BHV-1 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA oraz poprzez delecję domeny przezbłonowej wraz z przylegającą częścią C-końcową; a także drugi plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą białko gC wirusa BHV-1, zmodyfikowaną poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka gC wirusa BHV-1 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA oraz poprzez delecję domeny przezbłonowej wraz z przylegającą częścią C-końcową; oraz trzeci plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą białko gD wirusa BHV-1, zmodyfikowaną poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka gD wirusa BHV-1 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA oraz poprzez delecję domeny przezbłonowej wraz z przylegającą częścią C-końcową; i w którym obecny jest lipid kationowy, np. DMRIE, a także lipid neutralny, np. DOPE (przez co np. kompozycja immunogenna zawiera kompleks DMRIE-DOPE). Taka szczepionka DNA lub oparta na DNA kompozycja immunogenna może ponadto obejmować bydlęce białko GM-CSF lub wektor ekspresyjny (np. plazmid), który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą bydlęce białko GM-CSF. Dodatkowo lub alternatywnie, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna zawierać mogą plazmid, który eksprymuje wszystkie te „zoptymalizowane” immunogeny BHV-1, a korzystnie obejmują także kationowy lipid, np. DMRIE, oraz lipid neutralny, np. DOPE (przez co np. kompozycja immunogenna zawiera kompleks DMRIE-DOPE); a ponadto taka szczepionka DNA lub oparta na DNA kompozycja immunogenna może także obejmować bydlęce białko GM-CSF lub wektor ekspresyjny (np. plazmid), który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą bydlęce białko GM-CSF.

W praktyce niniejszego przedstawiono także, że bydlęcym patogenem może być wirus BVDV, a immunogenem może być białko E0 (gp48), i/lub białko E2 (gp53). Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunologiczna może więc obejmować sekwencję nukleotydową kodującą białko E0 i/lub białko E2 wirusa BVDV. Immunogenem może być białko E0 wirusa BVDV, zmodyfikowane poprzez wstawienie do kwasu nukleinowego sekwencji kodującej sekwencję sygnałową, np. sekwencję sygnałową ludzkiego białka tPA, i/lub poprzez wstawienie intronu, takiego jak intron II króliczej β-globiny; i/lub białko E2 wirusa BVDV, zmodyfikowane poprzez wstawienie do kwasu nukleinowego sekwencji kodującej sekwencję sygnałową, np. sekwencję sygnałową ludzkiego białka tPA, i/lub zmodyfikowane poprzez delecję sekwencji kodującej domenę przezbłonową białka E2, i/lub poprzez wstawienie intronu, takiego jak intron II króliczej β-globiny.

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna mogą więc obejmować pierwszy plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydo10

PL 215 173 B1 wą kodującą białko E0 wirusa BVDV, zmodyfikowaną poprzez włączenie sekwencji sygnałowej ludzkiego białka tPA oraz intronu II króliczej β-globiny; a także drugi plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą białko E2 wirusa BVDV, zmodyfikowaną poprzez włączenie sekwencji sygnałowej ludzkiego białka tPA oraz intronu II króliczej β-globiny, a także poprzez delecję domeny przezbłonowej i końca cytoplazmatycznego; i w którym obecny jest lipid kationowy, np. DMRIE, a także lipid neutralny, np. DOPE (przez co np. kompozycja immunogenna zawiera kompleks DMRIE-DOPE). Taka szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna może ponadto obejmować bydlęce białko GM-CSF lub wektor ekspresyjny (np. plazmid), który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą bydlęce białko GM-CSF. Dodatkowo lub alternatywnie, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna zawierać mogą plazmid, który eksprymuje wszystkie te „zoptymalizowane” immunogeny BVDV, a korzystnie obejmują także kationowy lipid. np. DMRIE, oraz lipid neutralny, np. DOPE (przez co np. kompozycja immunogenna zawiera kompleks DMRIE-DOPE); a ponadto taka szczepionka DNA lub oparta na DNA kompozycja immunogenna może także obejmować bydlęce białko GM-CSF lub wektor ekspresyjny (np. plazmid), który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą bydlęce białko GM-CSF. Ponieważ istnieją różne typy wirusa BVDV, a mianowicie BVDV-1 oraz BVDV-2, białka E0 oraz E2 mogą pochodzić z jednego z nich lub z obu typów wirusa BVDV. Tak więc wynalazek przewiduje zastosowanie mieszaniny plazmidów. Mieszanina taka może zawierać przynajmniej dwa plazmidy ekspresyjne, z których każdy eksprymuje różny immunogen (E0 lub E2) i/lub każdy z tych immunogenów pochodzi z różnego typu wirusa BVDV (BVDV-1 lub BVDV-2), czego przykładem może być mieszanina utworzona z czterech plazmidów, eksprymujących odpowiednio białko E0 wirusa BVDV-1, białko E2 wirusa BVDV-1, białko E0 wirusa BVDV-2 oraz białko E2 wirusa BVDV-2.

W praktyce niniejszego wynalazku, bydlęcym patogenem może być wirus bPI-3; a immunogenem może być przykładowo białko F lub białko HN wirusa bPI-3. Jeszcze korzystniej, immunogenem jest białko F lub białko HN wirusa bPI-3, zmodyfikowane poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej białka F lub białka HN wirusa bPI-3 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA, i/lub poprzez delecję domeny przezbłonowej i/lub cytoplazmatycznego końca, i/lub poprzez wstawienie intronu do cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego białko, np. intronu II króliczej β-globiny.

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna mogą więc obejmować pierwszy plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą białko F wirusa bPI-3, zmodyfikowaną poprzez wstawienie intronu II króliczej β-globiny, podstawienie sekwencji sygnałowej białka F wirusa bPI-3 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA, oraz poprzez delecję domeny przezbłonowej i końca cytoplazmatycznego; a także drugi plazmid, który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą białko HN wirusa bPI-3, zmodyfikowaną poprzez wstawienie intronu II króliczej β-globiny, podstawienie sekwencji sygnałowej białka HN wirusa bPI-3 sekwencją sygnałową ludzkiego białka tPA, oraz poprzez delecję domeny przezbłonowej i końca cytoplazmatycznego; i w którym obecny jest lipid kationowy, np. DMRIE, a także lipid neutralny, np. DOPE (przez co np. kompozycja immunogenna zawiera kompleks DMRIE-DOPE). Taka szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna może ponadto obejmować bydlęce białko GM-CSF lub wektor ekspresyjny (np. plazmid), który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą bydlęce białko GM-CSF. Dodatkowo lub alternatywnie, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna zawierać mogą plazmid, który eksprymuje wszystkie te „zoptymalizowane'' immunogeny bPI-3, a korzystnie obejmują także kationowy lipid, np. DMRIE, oraz lipid neutralny, np. DOPE (przez co np. kompozycja immunogenna zawiera kompleks DMRIE-DOPE); a ponadto taka szczepionka DNA lub oparta na DNA kompozycja immunogenna może także obejmować bydlęce białko GM-CSF lub wektor ekspresyjny (np. plazmid), który zawiera i eksprymuje w bydlęcej komórce gospodarza sekwencję nukleotydową kodującą bydlęce białko GM-CSF.

Ogólnie rzecz biorąc, plazmidy DNA przeznaczone do szczepionek DNA albo opartych na DNA kompozycjach immunogennych lub immunologicznych, a także szczepionki DNA albo oparte na DNA kompozycje immunogenne lub immunologiczne, zastosowane w etapie „szczepienia podstawowego” opisywanych tu zastosowań czy zestawu do przeprowadzania szczepienia przeciwko patogenowi bydła, opartego na trybie postępowania podstawowe-przypominające, mogą obejmować te, które zawarte są w patencie USA Nr 6,376,473 oraz we wnioskach patentowych USANr 10/085,519;

PL 215 173 B1

09/766.442; 09/760,574; 60/193,126; 09/232,468; 09/232,469; oraz 09/232,279, a także we francuskim wniosku patentowym nr 00 00798, złożonym 21 stycznia 2000.

Te i inne wykonania wynalazku zostały ujawnione lub są oczywiste z przedstawionego poniżej szczegółowego opisu wynalazku i nim objęte.

Krótki opis figur rysunku

Przedstawiony poniżej szczegółowy opis, mający charakter przykładu, nie ograniczającego wynalazku do opisanych tu specyficznych wykonań, może być lepiej zrozumiany w połączeniu z towarzyszącymi mu figurami, włączonymi tu w charakterze odnośników, na których:

Fig. 1 przedstawia plazmid pVR1012;

Fig. 2 przedstawia plazmid pAB110;

Fig. 3 pokazuje wykres przedstawiający zmianę temperatury w odbycie po poddaniu zwierząt procedurze opisanej w przykładzie 11;

Fig. 4 pokazuje wykres przedstawiający częstość oddechów po poddaniu zwierząt procedurze opisanej w przykładzie 11;

Fig. 5 pokazuje wykres przedstawiający wyniki testu klinicznego po poddaniu procedurze opisanej w przykładzie 11;

Fig. 6 pokazuje wykres przedstawiający wysokość wskaźników uszkodzenia płuc po poddaniu zwierząt procedurze opisanej w przykładzie 11;

Fig. 7 pokazuje wykres przedstawiający poziom wydzielania wirusa po poddaniu zwierząt procedurze opisanej w przykładzie 11;

Fig. 8 pokazuje wykres przedstawiający swoistą wobec BRSV odpowiedź z udziałem limfocytów T pamięci IFNy+ po poddaniu zwierząt procedurze opisanej w przykładzie 11;

Lista sekwencji:

NR ID SEK 1: oligonukleotyd PB326 oligonukleotyd PB329 oligonukleotyd SB090 oligonukleotyd SB091 oligonukleotyd LF001 oligonukleotyd LF002 oligonukleotyd PB234 oligonukleotyd PB235 oligonukleotyd PB511

NR ID SEK 2 NR ID SEK 3 NR ID SEK 4 NR ID SEK 5 NR ID SEK 6 NR ID SEK 7 NR ID SEK 8 NR ID SEK 9

NR ID SEK 10 NR ID SEK 11 NR ID SEK 12 NR ID SEK 13 NR ID SEK 14 NR ID SEK 15 NR ID SEK 16 NR ID SEK 17 NR ID SEK 18 NR ID SEK 19 NR ID SEK 20 NR ID SEK 21 NR ID SEK 22 NR ID SEK 23 NR ID SEK 24 NR ID SEK 25 NR ID SEK 26 NR ID SEK 27 NR ID SEK 28 NR ID SEK 29 NR ID SEK 30 NR ID SEK 31 NR ID SEK 32 NR ID SEK 33 oligonukleotyd PB512 oligonukleotyd SB221 oligonukleotyd SB222 oligonukleotyd PB507 oligonukleotyd PB508 oligonukleotyd PB513 oligonukleotyd PB514 oligonukleotyd SB223 oligonukleotyd SB224 oligonukleotyd PB497 oligonukleotyd PB498 oligonukleotyd SB225 oligonukleotyd SB226 oligonukleotyd SB210 oligonukleotyd SB211 oligonukleotyd SB212 oligonukleotyd SB220 oligonukleotyd SB213 oligonukleotyd SB214 oligonukleotyd SB215 oligonukleotyd SB216 oligonukleotyd LF050 oligonukleotyd LF051 oligonukleotyd LF052

PL 215 173 B1

NR ID SEK 34: oligonukleotyd LF053

NR ID SEK 35: oligonukleotyd LF039

NR ID SEK 36: oligonukleotyd LF040

NR ID SEK 37: oligonukleotyd LF041

NR ID SEK 38: oligonukleotyd LF042

NR ID SEK 39: oligonukleotyd LF043

NR ID SEK 40: oligonukleotyd LF044

NR ID SEK 41: oligonukleotyd LF045

NR ID SEK 42: oligonukleotyd LF046

NR ID SEK 43: oligonukleotyd LF064

NR ID SEK 44: oligonukleotyd LF065

NR ID SEK 45: oligonukleotyd LF066

NR ID SEK 46: oligonukleotyd LF067

NR ID SEK 47: oligonukleotyd LF047

NR ID SEK 48: oligonukleotyd LF048

NR ID SEK 49: oligonukleotyd LF058

NR ID SEK 50: oligonukleotyd LF059

NR ID SEK 51: oligonukleotyd LF060

NR ID SEK 52: oligonukleotyd LF061

NR ID SEK 53: oligonukleotyd LF062

NR ID SEK 54: oligonukleotyd LF063

NR ID SEK 55: oligonukleotyd LF054

NR ID SEK 56: oligonukleotyd LF055

NR ID SEK 57: oligonukleotyd FC129

NR ID SEK 58: oligonukleotyd FC130

NR ID SEK 59: oligonukleotyd FC131

Szczegółowy opis wynalazku

Jak przedstawiono powyżej, wynalazek obejmuje szczepienie przeciwko patogenowi bydła oparte na trybie postępowania podstawowe-przypominające, do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu BRSV (syncytialnemu wirusowi układu oddechowego bydła) które jest korzystnie stosowane u bydła, na przykład u młodych cieląt, które mogą posiadać matczyne przeciwciała przeciwko czynnikowi patogennemu, przeciw któremu skierowana jest immunizacja lub szczepienie.

Szczepionka DNA albo kompozycja immunologiczna lub immunogenna mogą być podawane młodemu zwierzęciu, cielęciu; przy czym „młode zwierzę” lub „młode cielę” jest cielęciem do 12 tygodnia życia, na przykład do 6 tygodnia życia, korzystnie do 4 tygodnia życia, np. do 3 tygodnia życia.

Szczepionka przypominająca może być korzystnie podawana między około 2 tygodniem a około 5 miesiącem po podaniu szczepionki podstawowej, na przykład między około 3 a 6 tygodniem po podaniu pierwszej szczepionki, a korzystnie około 4 tygodni po podaniu pierwszej szczepionki. Można zastosować drugie podanie szczepionki przypominającej albo kompozycji immunologicznej lub immunogennej, na przykład gdy cielęta przenoszone są do jednostek docelowych.

Szczepionka DNA albo kompozycja immunogenna lub immunologiczna zawiera, jako składnik aktywny, plazmid obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą immunogen, antygen lub epitop czynnika patogennego, korzystnie bydlęcego czynnika patogennego. Termin plazmid obejmuje jednostkę transkrypcyjną DNA zawierającą sekwencję polinukleotydową, obejmującą sekwencję cząsteczki kwasu nukleinowego mającego ulec ekspresji oraz elementy niezbędne do otrzymania tej ekspresji w warunkach in vivo. Wynalazek obejmuje swoim zakresem kolistą postać plazmidu, superzwinięty plazmid (tzw. postać ccc), itp. Wynalazek ten obejmuje swoim zakresem także liniową postać plazmidu.

Każdy plazmid zawiera promotor, umożliwiający ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej immunogen, antygen lub epitop, w wyniku czego cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca immunogen, antygen lub epitop jest operacyjnie sprzężona z promotorem lub znajduje się pod jego kontrolą. Korzystnie, promotor jest promotorem eukariotycznym, a korzystniej jest silnym promotorem, takim jak silny promotor eukariotyczny, np. wczesny promotor cytomegalowirusa (CMV-IE) pochodzenia ludzkiego lub mysiego, lub też opcjonalnie innego pochodzenia, np. od szczura lub świnki morskiej. Funkcjonalne fragmenty takich promotorów, tj. części tych promotorów, które utrzymują odpowiednią aktywność promotorową, są objęte zakresem prezentowanego wynalazku, i obejmują np.

PL 215 173 B1 skrócone promotory CMV-IE według wniosku patentowego WO98/00166 lub patentu USA Nr 6,156,567, które mogą być zastosowane w praktyce tego wynalazku. W konsekwencji, w praktyce niniejszego wynalazku promotor obejmuje pochodne i fragmenty promotora pełnej długości, które utrzymują odpowiednią aktywność promotorową i są wobec tego zdolne do funkcjonowania jako promotory, korzystnie wykazując aktywność promotorową zasadniczo zbliżoną do aktywności właściwego promotora lub promotora pełnej długości, od którego pochodzi dany fragment promotora lub jego pochodna, na przykład podobnie do relacji aktywności skróconych promotorów CMV-IE według patentu USA Nr 6,156,567 wobec aktywności promotorów CMV-IE o pełnej długości. Tak więc promotor CMV-IE w praktyce niniejszego wynalazku może obejmować lub składać się zasadniczo z promotorowej części promotora o pełnej długości i/lub wzmacniającej (enhancerowej) części promotora o pełnej długości, jak również z jego pochodnych i fragmentów.

Generalnie biorąc, promotor może być promotorem pochodzenia wirusowego lub pochodzenia komórkowego. W przypadku promotora wirusowego innego niż CMV-IE, może nim być wczesny lub późny promotor wirusa SV40 albo też promotor LTR wirusa mięsaka Rousa (RSV). Promotor może również być promotorem pochodzącym z bydlęcego czynnika patogennego, np. z czynnika patogennego, z którego pochodzi cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca antygen, immunogen lub epitop, na przykład promotor specyficzny dla danej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej antygen, immunogen lub epitop. Promotorem komórkowym, mogącym znaleźć zastosowanie w praktyce tego wynalazku, jest promotor genu białka cytoszkieletowego, taki jak na przykład promotor desminy lub alternatywnie promotor aktyny. Gdy w tym samym plazmidzie obecnych jest kilka genów, mogą one być dostarczone w tej samej jednostce transkrypcyjnej lub w kilku różnych jednostkach.

Plazmid lub plazmidy w szczepionkach DNA albo opartych na DNA kompozycjach immunogennych lub immunologicznych umieszczone są w dopuszczalnym weterynaryjnie nośniku lub zaróbce. Generalnie rzecz biorąc, takim nośnikiem lub zaróbką (Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. przez E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, USA, wyd. 15, 1975) może być dowolny zwykły płyn nadający się do wstrzyknięcia, taki jak woda, sól fizjologiczna, zrównoważony roztwór soli, uwodniona dekstroza, glicerol, itp. Szczepionki DNA albo oparte na DNA kompozycje immunogenne lub immunologiczne mogą więc korzystnie zawierać dopuszczalny weterynaryjnie nośnik lub zaróbkę.

Szczepionka DNA według niniejszego wynalazku lub kompozycje immunogenne lub immunologiczne mogą również zawierać adiuwant. Przykłady adiuwantów obejmują niemetylowane grupy CpG (Klinman D. M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 98:2879-2883; WO 98/16247), lub wodorotlenek glinu, fosforan glinu oraz tlenek glinu („Vaccine Design. The subunit and adjuvant approach” Pharmaceutical Biotechnology, tom 6, wyd. przez M. F. Powell i M. J. Newman, 1995, Plenum Press New York). Adiuwantami korzystnie wykorzystywanymi w praktyce wynalazku są lipidy kationowe, takie jak te zawierające czteroskładnikowe sole amonowe według wzoru:

ch₃ r_x- o - ch₂- ch - ch₂- n⁺— R₂- X ^0Ri CH₃ w którym R1 jest nasyconym lub nienasyconym liniowym rodnikiem alifatycznym, zawierającym 12 do 18 atomów węgla, R2 jest innym rodnikiem alifatycznym zawierającym 2 lub 3 atomy węgla, a X jest grupą hydroksylową lub aminową.

Korzystnie, lipidem kationowym jest DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu; WO-A-9634109).

Lipid kationowy może być połączony z lipidem neutralnym, takim jak DOPE (dioleoilo-fosfatydylo-etanoloamina). DMRIE i DOPE tworzą DMRIE-DOPE.

Korzystnie, plazmid mieszany jest z lipidem kationowym bezpośrednio przed użyciem, a jeszcze korzystniej przed podaniem zwierzęciu, tak aby pozwolić przygotowanej w ten sposób mieszaninie wytworzyć kompleks, na przykład poprzez pozostawienie takiej mieszaniny przez okres czasu od około 10 do około 60 minut, na przykład przez około 30 minut.

PL 215 173 B1

Gdy obecny jest lipid neutralny, np. DOPE, stosunek molowy lipidu kationowego do lipidu neutralnego, np. DMRIE:DOPE, korzystnie mieści się w zakresie od około 95:5 do około 5:95, a korzystniej wynosi około 1:1.

Stosunek wagowy plazmidu do lipidu kationowego, np. do DMRIE, lub do mieszaniny lipidu kationowego i lipidu neutralnego, np. DMRIE:DOPE, może mieścić się w zakresie od około 50:1 do około 1:10, na przykład od około 10:1 do około 1:5, korzystnie od około 1:1 do około 1:2.

Szczepionki DNA według niniejszego wynalazku albo oparte na DNA kompozycje immunogenne lub immunologiczne mogą być przygotowywane przy użyciu liposomy, z obecnością lub bez obecności opisanego powyżej adiuwanta.

Dodatkowo lub alternatywnie, szczepionki DNA albo oparte na DNA kompozycje immunogenne lub immunologiczne mogą zawierać GM-CSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów; Clark S. C. i wsp., Science 1987, 230:1229; Grant S. M. i wsp., Drugs 1992, 53:516), lub wektor ekspresyjny eksprymujący GM-CSF, wraz z „wektorem ekspresyjnym” obejmującym plazmid eksprymujący antygen, immunogen lub epitop bydlęcego patogenu. Tak więc do szczepionki DNA albo opartej na DNA kompozycji immunogennej lub immunologicznej dodawany jest GM-CSF lub wektor eksprymujący GM-CSF, np. dodawany do szczepionek albo kompozycji immunogennych lub immunologicznych przygotowywanych z dodatkiem adiuwanta lub bez i/lub z użyciem liposomów; lub też plazmid DNA eksprymujący antygen, immunogen lub epitop bydlęcego patogenu jest konstruowany w ten sposób, że eksprymuje także GM-CSF. Jeśli wektor ekspresyjny dostarcza GM-CSF, sekwencja kwasu nukleinowego kodująca GM-CSF obecna jest w wektorze ekspresyjnym w warunkach umożliwiających jej ekspresję in vivo (np. jest ona operacyjnie sprzężona z odpowiednim promotorem). Korzystnie, wektor ekspresyjny eksprymujący GM-CSF jest plazmidem, np. plazmidem zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą odpowiedni immunogen lub immunogeny (czyli kodującą bydlęcy antygen, immunogen lub epitop), lub też innym plazmidem. GM-CSF jest korzystnie bydlęcym GM-CSF (Maliszewski i wsp., Molec. Immunol. 1988, 25;843-850).

W szczepionkach według niniejszego wynalazku albo w kompozycjach immunogennych lub immunologicznych, na przykład w szczepionkach albo w kompozycjach immunogennych lub immunologicznych przygotowywanych z dodatkiem adiuwanta lub bez i/lub z użyciem liposomów, zawierających lub nie zawierających GM-CSF lub wektor ekspresyjny eksprymujący GM-CSF, sekwencje nukleotydowe kodujące immunogen mają zoptymalizowaną lub zmodyfikowaną postać. Optymalizacja rozumiana jest przy tym jako modyfikacja sekwencji nukleotydowej, która manifestuje się przynajmniej podwyższonym poziomem ekspresji tej sekwencji nukleotydowej, i/lub wzrostem stabilności mRNA kodującego ten antygen, i/lub zainicjowaniem wydzielania tego antygenu do przestrzeni międzykomórkowej, i której pośrednią lub bezpośrednią konsekwencją może być zwiększenie wywołanej odpowiedzi immunologicznej.

Optymalizacja sekwencji nukleotydowej kodującej immunogen może obejmować delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę przezbłonową immunogenu (przy czym delecja rozumiana jest jako całkowita lub częściowa delecja, albo też zaburzenie sekwencji wystarczające do tego, aby domena przezbłonowa przestała być w całości lub w znacznej części funkcjonalna, przez co taka delecja sekwencji nukleotydowej kodującej domenę przezbłonową może obejmować rozerwanie sekwencji kodującej), i/lub wstawienie (z zachowaniem ramki odczytu) sekwencji nukleotydowej kodującej heterologiczną (wobec patogenu) sekwencję sygnałową tPA, taką jak ludzka sekwencja sygnałowa tPA (Montgomery i wsp., Cell. Mol. Biol. 1997. 43:285-292; Harris i wsp., Mol. Biol. Med. 1986, 3:279-292), i/lub wstawienie stabilizującego intronu, korzystnie w kierunku 5' od cząsteczki kwasu nukleinowego (kodującej immunogen, antygen lub epitop) mającej ulec ekspresji, takiej jak intron II β-globiny królika. Delecja fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową pożądanego antygenu promuje sekrecję takiego skróconego antygenu do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, przez co zwiększa się prawdopodobieństwo tego, że antygen wejdzie w kontakt z komórkami systemu immunologicznego. Wstawienie sekwencji nukleotydowej kodującej sygnał tPA ułatwia translację mRNA, do którego przyłączony jest sygnał tPA, zwiększając w ten sposób poziom ekspresji mRNA, a w konsekwencji produkcję antygenów. Sygnał tPA odgrywa również rolę w procesie sekrecji syntetyzowanego antygenu. Stosowane mogą być również inne sekwencje nukleotydowe kodujące peptydy sygnalne, takie jak te dla peptydu sygnałowego melityny, otrzymanego z pszczół (Sisk W. P. i wsp., J. Virol. 1994, 68:766-775). Wstawienie stabilizującego intronu do cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego pożądany antygen zapobiega nieprawidłowemu procesowi składania mRNA i utrzymuje jego fizyczną integralność.

PL 215 173 B1

Korzystnie, sygnał tPA jest pochodzenia ludzkiego. Sekwencja nukleotydowa ludzkiego sygnału tPA dostępna jest w bazie danych GenBank pod numerem dostępu NM_000930. Korzystnie, intronem jest intron II króliczego genu β-globiny (van Ooyen i wsp., Science 1979, 206:337-344), którego sekwencja nukleotydowa dostępna jest w bazie danych GenBank pod numerem dostępu V00882 (oznaczona w tym odnośniku jako intron nr 2).

Zastosowanie rozwiązań według wynalazku obejmuje szczepienie lub immunizację przeciwko syncytialnemu wirusowi układu oddechowego bydła BRSV (ang. bovine respiratory syncytial virus).

Wirus BRSV jest paramyksowirusem, członkiem rodziny Paramyxoviridae (Baker i wsp., Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 1997, 13:425-454).

Sekwencje nukleotydowe kodujące glikoproteinę F, białko N oraz glikoproteinę G są powszechnie znane i dostępne są w bazie GenBank odpowiednio pod numerami dostępu Y17970, M35076 oraz U33539. Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna, stosowane według trybu postępowania podstawowe-przypominające, skierowana przeciwko wirusowi BRSV może więc zawierać sekwencje nukleotydowe kodujące białka F, N i/lub G.

Sekwencje nukleotydowe oraz kodowane przez nie antygeny mogą być poddane modyfikacjom. Mogą one polegać na podstawieniu, np. przez sekwencję „sygnałową”, taką jak sekwencja sygnałowa ludzkiego tPA sekwencji sygnałowej białka F wirusa BRSV i/lub glikoproteiny płaszcza G wirusa BRSV, i/lub na delecji fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową białka F i/lub białka G. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową jednego z tych białek towarzyszy korzystnie delecja cytoplazmatycznego końca białka. Możliwe jest zwiększenie poziomu ekspresji glikoproteiny F poprzez dalsze usuwanie (delecję) sekwencji nukleotydowej poprzedzającej sekwencje domeny przezbłonowej i odpowiadającej aminokwasom od 1 do 92.

Korzystnie, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko wirusowi BRSV obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą białko F, lub sekwencję nukleotydową kodującą białko N, albo sekwencję nukleotydową kodującą białko F i białko N.

W szczególnym wykonaniu szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna obejmuje sekwencje nukleotydowe kodujące białko F, przy czym sekwencja nukleotydowa kodująca białko F jest zmodyfikowana. Modyfikacja ta wybrana jest spośród następujących rodzajów modyfikacji:

i. podstawienie sekwencji „sygnałowej” heterologiczną sekwencją sygnałową, taką jak sekwencja tPA pochodzenia ludzkiego, ii. delecja fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową białka F oraz korzystnie jego cytoplazmatycznego końca, iii. delecja fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową, cytoplazmatycznego końca i opisanego powyżej regionu poprzedzającego domenę przezbłonową, iv. podstawienie sekwencji „sygnałowej” heterologiczną sekwencją sygnałową, taką jak sekwencja tPA pochodzenia ludzkiego, oraz delecja fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową białka F oraz korzystnie jego cytoplazmatycznego końca, lub

v. podstawienie sekwencji „sygnałowej” heterologiczną sekwencją sygnałową, taką jak sekwencja tPA pochodzenia ludzkiego, oraz delecja fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową, cytoplazmatycznego końca i opisanego powyżej regionu poprzedzającego domenę przezbłonową.

W drugim wykonaniu, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna obejmuje sekwencje nukleotydowe kodujące białko F i białko N, zawarte na jednym plazmidzie obejmującym obie sekwencje nukleotydowe, lub na dwóch oddzielnych plazmidach, z których jeden zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko F, a drugi zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko N.

W trzecim wykonaniu, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna obejmuje sekwencje nukleotydowe kodujące białko F i białko N, zawarte na jednym plazmidzie obejmującym obie sekwencje nukleotydowe, lub na dwóch oddzielnych plazmidach, z których jeden zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko F, a drugi zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko N, przy czym sekwencja nukleotydowa kodująca białko F jest zmodyfikowana w opisany powyżej sposób (po dokonaniu wyboru modyfikacji spośród tych opisanych w punktach od i do v).

Przedstawione są tu sekwencje nukleotydowe kodujące antygeny BRSV, które mogą być zastosowane w niniejszym wynalazku, oraz różne konstrukty wektorów ekspresyjnych, np. w towarzy16

PL 215 173 B1 szących wnioskowi przykładach, oraz we wniosku FR-A1-2751229, np. w przykładach 9 i 10, oraz w Fig. 5 i 6 (patrz także patent USA Nr 6,376,473 oraz wniosek patentowy USA Nr 10/085,519).

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko wirusowi BRSV, według powyższego opisu, może korzystnie obejmować dopuszczalny weterynaryjnie nośnik lub zaróbkę, zgodnie z powyższą dyskusją na temat przedmiotu wynalazku.

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko wirusowi BRSV, według powyższego opisu, może również korzystnie obejmować adiuwant (zgodnie z powyższą dyskusją na temat przedmiotu wynalazku), korzystnie DMRIE, a korzystniej DMRIE-DOPE.

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko wirusowi BRSV, według powyższego opisu, nie zawierająca lub zawierająca adiuwant, może obejmować GM-CSF lub wektor ekspresyjny, korzystnie plazmid, eksprymujący GM-CSF, przy czym GM-CSF jest korzystnie bydlęcym GM-CSF.

Dodanie bydlęcego GM-CSF może zostać przeprowadzone poprzez wprowadzenie bydlęcego polipeptydu GM-CSF do szczepionkowej lub immunogennej albo immunologicznej kompozycji, lub też korzystnie poprzez wstawienie sekwencji nukleotydowej kodującej bydlęce białko GM-CSF do wektora ekspresyjnego zapewniającego ekspresję w warunkach in vivo, takiego jak plazmid. Sekwencja nukleotydowa kodująca GM-CSF może być wprowadzona do drugiego plazmidu ekspresyjnego (np. pLF1032, Przykład 8), różnego od tego (lub tych), do którego wstawiono gen lub geny kodujące antygen lub antygeny BRSV.

Sekwencja nukleotydowa kodująca bydlęce białko GM-CSF jest dostępna w bazie GenBank pod numerem dostępu U22385.

Korzystnie, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko BRSV, która może być przygotowana z wykorzystaniem DMRIE-DOPE, obejmuje plazmid ekspresyjny (np. pSB108, Przykład 4.1.2) kodujący antygen F wirusa BRSV, poddany optymalizacji poprzez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej białka F kodującego domenę przezbłonową oraz koniec cytoplazmatyczny, opcjonalnie także z delecją regionu poprzedzającego opisanego powyżej (np. pPB449, Przykład 4.1.4), oraz drugiego plazmidu ekspresyjnego (np. pFC123, Przykład 4.3) kodującego natywne białko N wirusa BRSV.

Jak przedstawiono w opisie niniejszego wynalazku szczepionka ta może być również zastosowana w celu szczepienia lub immunizacji przeciwko bydlęcej grypie rzekomej typu 3 (bPI-3).

Wirus choroby bPI-3 jest paramyksowirusem, również członkiem rodziny Paramyxoviridae (Tsai i wsp., Infect. Immun. 1975, 11:783-803).

Sekwencje nukleotydowe kodujące białka hemaglutyniny i neuraminidazy (HN) oraz białko fuzyjne (F) wirusa wywołującego bPI-3 są powszechnie znane i dostępne w bazie GenBank pod numerem dostępu U31671. Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko bPI-3 może więc zawierać plazmid DNA obejmujący sekwencje nukleotydowe kodujące białka HN i/lub F.

Opisana powyżej szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko bPI-3 zawiera korzystnie dopuszczalny weterynaryjnie nośnik lub zaróbkę, zgodnie z powyższą dyskusją na temat przedmiotu wynalazku.

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko bPI-3, według powyższego opisu, może również obejmować adiuwant taki jak DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE.

Wykonania te mogą opcjonalnie obejmować w dalszej kolejności (1) dodanie GM-CSF lub wektora ekspresyjnego, korzystnie plazmidu, eksprymującego GM-CSF, lub (2) optymalizację przynajmniej jednego antygenu bPI-3, lub (3) dodanie GM-CSF lub wektora ekspresyjnego, korzystnie plazmidu, eksprymującego GM-CSF, oraz optymalizację przynajmniej jednego antygenu bPI-3. GM-CSF jest korzystnie bydlęcym GM-CSF. Dodanie GM-CSF może być przeprowadzone w sposób opisany dla BRSV oraz w powyższej dyskusji na temat przedmiotu wynalazku.

Optymalizacja antygenów pochodzących z wirusa wywołującego bPI-3 przeprowadzana jest poprzez podstawienie sekwencji „sygnałowej”, na przykład poprzez podstawienie sekwencji sygnałowej antygenu bPI-3 heterologiczną sekwencją sygnałową, taką jak sekwencja sygnałowa ludzkiego tPA, np. podstawienie sekwencji sygnałowej hemaglutyniny-neuraminidazy (HN) wirusa bPI-3 i/lub białka fuzyjnego (F) wirusa bPI-3 sekwencją sygnałową ludzkiego tPA, i/lub poprzez delecję fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową białek HN i/lub F, i/lub poprzez wstawienie intronu, takiego

PL 215 173 B1 jak intron II β-globiny królika, korzystnie przed sekwencją nukleotydową kodującą białko FIN i/lub białko F. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową jednego z tych białek towarzyszy korzystnie delecja cytoplazmatycznego końca. Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko bPI-3 może więc kodować i eksprymować pojedynczy zoptymalizowany antygen PI-3 (HN lub F) lub obydwa antygeny (HN i F).

Przedstawione są tu sekwencje nukleotydowe kodujące antygeny bPI-3, które mogą być wykorzystane zgodnie z przedstawionym ujawnieniem, oraz różne konstrukty wektorów ekspresyjnych, np. w towarzyszących wnioskowi przykładach, oraz we wniosku FR-A1-2751229, np. w przykładach 14 i 15, oraz w Fig. 10 i 11 (patrz także patent USA Nr 6,376,473 oraz wniosek patentowy USA Nr 10/085,519).

Korzystnie, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko bPI-3, obejmuje DMRIE-DOPE, i zawiera plazmid ekspresyjny (np. pLF1025, Przykład 1.7.2) kodujący antygen HN wirusa bPI-3, poddany optymalizacji poprzez insercję sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA w miejsce sekwencji sygnałowej białka HN, poprzez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej białka HN kodującej domenę przezbłonową oraz koniec cytoplazmatyczny, oraz poprzez wstawienie intronu II genu β-globiny królika przed genem białka HN, oraz drugiego plazmidu ekspresyjnego (np. pLF1027, Przykład 7.2.2) kodującego antygen F wirusa bPI-3, poddanego optymalizacji poprzez insercję sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA w miejsce sekwencji sygnałowej białka F, poprzez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę przezbłonową białka F oraz koniec cytoplazmatyczny, oraz poprzez wstawienie intronu II genu β-globiny królika przed genem białka F.

W innym wykonaniu przedstawione są szczepienia lub immunizacja przeciwko zakaźnemu nieżytowi nosa i tchawicy u bydła (IBR - ang. infectious bovine rhinotracheitis).

Wirus odpowiedzialny za zakaźny nieżyt nosa i tchawicy u bydła jest bydlęcym wirusem opryszczki typu 1 (BHV-1, ang. bovine herpesvirus type 1), członkiem rodziny Alphaherpesvirinae (Babiuk L. A. i wsp., Vet. Microbiol. 1996, 53:31-42). Sekwencje nukleotydowe kodujące glikoproteiny gB, gC oraz gD są powszechnie znane i dostępne są w bazie GenBank pod numerem dostępu AJ004801. Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko BHV-1 może więc obejmować plazmid lub plazmidy DNA zawierające sekwencję lub sekwencje nukleotydowe kodujące białka gB, gC i/lub gD.

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko BHV-1, według powyższego opisu, zawiera korzystnie dopuszczalny weterynaryjnie nośnik lub zaróbkę, zgodnie z przedstawioną powyżej dyskusją na temat przedmiotu wynalazku.

Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko BHV-1, według powyższego opisu, może obejmować adiuwant (zgodnie z przedstawioną powyżej dyskusją na temat przedmiotu wynalazku), taki jak DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE.

Wykonania te mogą opcjonalnie obejmować w dalszej kolejności (1) dodanie GM-CSF lub wektora ekspresyjnego, korzystnie plazmidu, eksprymującego GM-CSF, lub (2) optymalizację przynajmniej jednego antygenu BHV-1, lub (3) dodanie GM-CSF lub wektora ekspresyjnego, korzystnie plazmidu, eksprymującego GM-CSF, oraz optymalizację przynajmniej jednego antygenu BHV-1. GM-CSF jest korzystnie bydlęcym GM-CSF. Dodanie GM-CSF może być przeprowadzone w sposób opisany dla BRSV oraz w powyższej dyskusji na temat przedmiotu wynalazku.

Optymalizacja antygenów pochodzących z wirusa BHV-1 przeprowadzana jest poprzez podstawienie, na przykład sekwencji „sygnałowej” antygenu wirusa BHV-1 heterologiczną sekwencją „sygnałową”, np. sekwencją sygnałową ludzkiego tPA (numer dostępu GenBank NM 000930), np. podstawienie sekwencji sygnałowej glikoproteiny gB i/lub glikoproteiny gC i/lub glikoproteiny gD sekwencją sygnałową ludzkiego tPA; i/lub poprzez delecję fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową glikoprotein gB i/lub gC i/lub gD. Delecji fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową jednej z tych glikoprotein towarzyszy korzystnie delecja cytoplazmatycznego końca. Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko BHV-1 według niniejszego wynalazku może więc kodować i eksprymować pojedynczy zoptymalizowany antygen BHV-1 (gB, gC lub gD) lub dwa spośród nich albo wszystkie trzy, np. optymalizowaną glikoproteinę gB, optymalizowaną glikoproteinę gC, oraz optymalizowaną glikoproteinę gD.

Przedstawione są tu sekwencje nukleotydowe kodujące antygeny BHV-1, które mogą być zastosowane w przedstawionych rozwiązaniach, oraz różne konstrukty wektorów ekspresyjnych, np.

PL 215 173 B1 w towarzyszących wnioskowi przykładach, oraz we wniosku FR-A1-2751229, np. w przykładach 7 i 8, oraz w Fig. 3 i 4 (patrz także patent USA Nr 6,376,473 oraz wniosek patentowy USA Nr 10/085,519).

Korzystnie, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko BHV-1 jest przygotowywana przy użyciu DMRIE-DOPE, i zawiera plazmid ekspresyjny (np. pPB281, Przykład 3.1.2) kodujący antygen gB wirusa BHV-1, poddany optymalizacji poprzez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę przezbłonową oraz koniec cytoplazmatyczny, oraz drugiego plazmidu ekspresyjnego (np. pPB292, Przykład 3.2.2) kodującego antygen gC wirusa BHV-1, poddanego optymalizacji poprzez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę przezbłonową oraz koniec cytoplazmatyczny, oraz trzeciego plazmidu ekspresyjnego (np. pPB284, Przykład 3.3.2) kodującego antygen gD wirusa BHV-1, poddanego optymalizacji poprzez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę przezbłonową oraz koniec cytoplazmatyczny.

W jeszcze innym wykonaniu szczepionki przedstawionej w opisie niniejszego wynalazku może być ona wykorzystana do szczepienia lub immunizacji przeciwko wirusowi BVDV.

Wirus BVDV jest pestiwirusem z rodziny Flaviviridae. Występuje on powszechnie u bydła i objawia się występowaniem wad rozwojowych u płodów, poronień lub symptomów obejmujących układ oddechowy (choroba śluzówkowa) oraz układ pokarmowy (bydlęca biegunka wirusowa).

Wirusy BVDV różnicuje się w oparciu o nasilenie wywoływanych objawów klinicznych, przy czym wyróżnia się dwie grupy: wirusy BVDV typu 1 (związane z niewidocznymi lub łagodnymi objawami klinicznymi) oraz wirusy BVDV typu 2 (związane z ostrymi objawami klinicznymi, krwotokami, wysoką chorobowością i wysoką śmiertelnością) (Dean H. J. oraz Leyh R., Vaccine 1999, 17:1117-1124).

Jeśli typ wirusa BVDV nie jest jasno określony, rozumie się przez to, że chodzi o wirusa typu 1 lub typu 2.

Wirus BVDV jest posiadającym otoczkę jednoniciowym wirusem RNA, zawierającym jeden gen kodujący poliproteinę, która po przecięciu daje kilka pojedynczych białek, np. białko E0 (gp48) oraz białko E2 (gp53) (Vassilev V. B. i wsp., J. Virol., 1997, 71:471-478).

Sekwencje nukleotydowe kodujące poliproteiny E0-E2 są powszechnie znane i dostępne w bazie GenBank pod numerem dostępu N96687 (w przypadku BVDV-1) oraz AF145967 (w przypadku BVDV-2). Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko wirusowi BVDV może więc zawierać plazmid DNA lub plazmidy zawierające sekwencje nukleotydowe kodujące białko E0 i/lub białko E2.

Opisana powyżej szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko wirusowi BVDV zawiera korzystnie dopuszczalny weterynaryjnie nośnik lub zaróbkę, zgodnie z przedstawioną powyżej dyskusją na temat przedmiotu wynalazku.

Opisana powyżej szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko wirusowi BVDV zawierać może adiuwant taki jak DMRIE, korzystnie DMRIE-DOPE, zgodnie z przedstawioną powyżej dyskusją na temat przedmiotu wynalazku.

Te dwa wykonania mogą obejmować w dalszej kolejności (1) dodanie bydlęcego GM-CSF lub wektora ekspresyjnego, korzystnie plazmidu eksprymującego GM-CSF, lub (2) optymalizację przynajmniej jednego antygenu BVDV, lub (3) dodanie bydlęcego GM-CSF lub wektora ekspresyjnego, korzystnie plazmidu eksprymującego GM-CSF, oraz optymalizację przynajmniej jednego antygenu BVDV. GM-CSF jest korzystnie bydlęcym GM-CSF. Dodanie GM-CSF może być przeprowadzone w sposób opisany dla BRSV oraz w powyższej dyskusji na temat przedmiotu wynalazku.

Optymalizacja antygenów pochodzących z wirusa BVDV przeprowadzana jest poprzez dodanie sekwencji „sygnałowej”, takiej jak heterologiczna sekwencja sygnałowa, korzystnie sekwencja sygnałowa ludzkiego tPA, korzystnie przed sekwencją nukleotydową kodującą białko E0 wirusa BVDV i/lub białko E2 wirusa BVDV, i/lub poprzez delecję fragmentu DNA kodującego domenę przezbłonową białka E2, i/lub poprzez wstawienie intronu, takiego jak intron II β-globiny królika, korzystnie przed sekwencją nukleotydową kodującą białko E0 lub białko E2. Szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko BVDV według niniejszego wynalazku może więc kodować i eksprymować pojedynczy zoptymalizowany antygen BVDV (E0 lub E2) lub obydwa te antygeny (E0 i E2).

Przedstawione są tu sekwencje nukleotydowe kodujące antygeny BVDV, które mogą być zastosowane w niniejszym wynalazku, oraz różne konstrukty wektorów ekspresyjnych, np. w towarzyPL 215 173 B1 szących wnioskowi przykładach, oraz we wniosku FR-A1-2751229, np. w przykładzie 13, oraz w Fig. 9 (patrz także patent USA Nr 6,376,473 oraz wniosek patentowy USA Nr 10/085,519).

Korzystnie, szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna przeciwko BVDV jest przygotowywana przy użyciu DMRIE-DOPE, i zawiera plazmid ekspresyjny (np. pLF1029, Przykład 5.1.2, pLF1031, Przykład 6.2.2) kodujący antygen E0 wirusa BVDV, poddany optymalizacji poprzez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA przed sekwencją E0 oraz przez wstawienie intronu II króliczego genu β-globiny przed genem dla E0, oraz drugiego plazmidu ekspresyjnego (np. pLF1021, Przykład 5.2.2, pLF1023, Przykład 6.1.2) kodującego antygen E2 wirusa BVDV, poddanego optymalizacji poprzez wstawienie sekwencji sygnałowej ludzkiego tPA przed sekwencją E2, poprzez delecję fragmentu sekwencji nukleotydowej kodującej domenę przezbłonową białka E2 oraz koniec cytoplazmatyczny oraz wstawienie intronu II króliczego genu β-globiny przed genem dla E2.

Korzystnie, w praktyce niniejszego wynalazku produkowana i wykorzystywana może być mieszanina plazmidów, np. szczepionka DNA albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna może zawierać mieszaninę plazmidów. Mieszanina taka może zawierać przynajmniej dwa plazmidy ekspresyjne, z których każdy eksprymuje inny immunogen (E0 lub E2) i/lub każdy z nich pochodzi z innego typu wirusa BVDV (BVDV-1 lub BVDV-2). Mieszanina może zawierać cztery plazmidy: jeden eksprymujący białko E0 wirusa BVDV-1, jeden eksprymujący białko E2 wirusa BVDV-1, jeden eksprymujący białko E0 wirusa BVDV-2, oraz jeden eksprymujący białko E2 wirusa BVDV-2.

W jednym z wykonań wynalazku dawka przypominająca podawana jest przy użyciu szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej, zawierającej nieaktywne lub osłabione wirusy, albo też ich podjednostki. Szczepionki zawierające nieaktywne lub osłabione wirusy, albo też ich podjednostki, dostępne są specjalistom z tej dziedziny (np. patrz Ellis i wsp., J. Am. Vet. Met. Assoc. 2001, 218(12):1973-1980, w przypadku BRSV; patent brytyjski Nr 1,131,851, w przypadku BHV; patent USA Nr 6,291,228, w przypadku BVDV). Ponadto, zastosować można dowolne dostępne komercyjnie szczepionki zawierające inaktywowane lub osłabione wirusy, albo też ich podjednostki, np. BAR VAC® (Boehringer) dla BRSV, VIRBOV H® (Merial) dla bPI-3, IFFAVAX® I.B.R. (Merial) dla BHV, BOVILIS BVD® (Intervet) lub MUCOBOVIN® (Merial) dla BVDV.

Korzystnie, szczepionka albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna zawierająca nieaktywne lub osłabione wirusy lub ich podjednostki może obejmować adiuwant, np. adiuwant omawiany powyżej.

W innym wykonaniu przedstawionym w niniejszym opisie dawka przypominająca podawana jest przy użyciu rekombinowanej szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej, która zawiera wektor zdolny do ekspresji in vivo, taki jak wirus ospy, adenowirus lub wirus opryszczki.

Wektor ekspresyjny zawiera i eksprymuje sekwencję nukleotydową kodującą immunogen pochodzący z bydlęcego patogenu, takiego jak BRSV, bPI-3, BHV-1 oraz BVDV. Wektor taki zawiera i eksprymuje przynajmniej jeden immunogen, który jest wspólny z immunogenem użytym w szczepionce DNA albo w kompozycji immunogennej lub immunologicznej. Dla wszystkich tych immunogenów oraz odpowiadających im sekwencji nukleotydowych kodujących owe immunogeny odpowiednie zastosowanie mają umieszczone tu opisy odnoszące się do szczepionki DNA albo opartej na DNA kompozycji immunogennej lub immunologicznej. Sekwencje nukleotydowe mogą być również modyfikowane i ulepszane według zawartego tu opisu.

Specyficzne przykłady, nie mające ograniczającego charakteru, obejmują rekombinowane wirusy ospy, włącznie z wirusami ptasiej ospy, takimi jak wirus ospy kanarków (patent USA Nr 5,505,941), oraz wirusy ospy krowiej (patent USA Nr 4,603,112), takie jak osłabiony wirus ospy krowiej, np. NYVAC (patrz patent USA Nr 5,494,807) lub modyfikowany wirus ospy krowiej Ankara (MVA, Stickle H. oraz Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971, 113:1149-1153; Sutter G. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:10847-10851; Carroll M. W. i wsp., Vaccine 1997, 15(4):387-394; Stittelaar K. J. i wsp., J. Virol. 2000, 74(9):4236-4243; Sutter G. i wsp., Vaccine 1994, 12(11):1032-1040). W przypadku stosowania wirusów ospy ptasiej wykorzystać można wirusy ospy gołębi, wirusy ospy kanarków (patent USA Nr 5,756,103) oraz wirusy ospy drobiu (patent USA Nr 5,766,599), np. osłabione wirusy ospy kanarków oraz osłabione wirusy ospy drobiu, na przykład ALVAC oraz TROVAC. W przypadku rekombinowanych wektorów opartych na wirusie ospy kanarków miejsca insercji mogą znajdować się w obrębie otwartych ramek odczytu (ORF) C3, C5, lub C6. Gdy wektorem ekspresyjnym jest wirus ospy, heterologiczny polinukleotyd może być wstawiony w miejsce znajdujące się pod kontrolą swoistego promotora wirusa ospy, takiego jak promotor 7,5 kDa wirusa ospy krowiej (Cochran

PL 215 173 B1 i wsp., J. Virology, 1985, 54:30-35), promotor I3L wirusa ospy krowiej (Riviere i wsp., J. Virology, 1992, 66:3424-3434), promotor HA wirusa ospy krowiej (Shida, Virology, 1986, 150:451-457), promotor ATI wirusa ospy krowiej (Funahashi i wsp., J. Gen. Virol., 1988, 69:35-47), promotor H6 wirusa ospy krowiej (Taylor i wsp., Vaccine 1988, 6:504-508; Guo i wsp., J. Virol., 1989, 63:4189-4198; Perkus i wsp., J. Virol., 1989, 63:3829-3836).

Inne użyteczne wektory wirusowe obejmują wektory oparte na wirusie opryszczki lub wektory oparte na adenowirusie. Specyficzne przykłady, nie mające ograniczającego charakteru, obejmują krowiego wirusa opryszczki (BHV) lub krowiego adenowirusa (BAV), stosowanych jako wektory (patrz na przykład europejski wniosek patentowy Nr EP 0,663,403; wniosek patentowy PCT Nr WO 98/59063). W przypadku BHV miejsca insercji znajdować się mogą w obrębie genu kinazy, gE lub g1 (patrz wniosek patentowy PCT Nr WO 92/21751). W przypadku BAV miejsca insercji mogą znajdować się w regionie E2 lub w regionie E4 (patrz Patent USA Nr 6,451, 319; Patent USA Nr 6,319,716). W wektorach BHV lub BAV insert (heterologiczna cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca immunogen, antygen lub epitop będących przedmiotem zainteresowania, na przykład pochodzących od patogenu bydlęcego, np. eksprymowanych przez szczepionki DNA lub kompozycje immunogenne) znajduje się na ogół pod kontrolą promotora (lub jest operacyjnie sprzężony z promotorem). Promotorem może być promotor pochodzenia wirusowego lub komórkowego. Zastosowany może być wczesny promotor cytomegalowirusa (CMV-IE), włącznie z promotorem i enhancerem (sekwencją wzmacniającą). Promotor CMV-IE może być promotorem pochodzenia ludzkiego lub mysiego, lub opcjonalnie może mieć inne pochodzenie, na przykład może pochodzić od szczura lub od świnki morskiej (patrz EP 0260148, EP 0323597; WO 89/01036; Pasleau i wsp., Gene 1985, 38:227-232; Boshart M. i wsp., Cell, 1985, 41:521-530); patrz także powyższa dyskusja (dotycząca promotorów stosowanych w plazmidach DNA). Stosowane mogą być również funkcjonalne fragmenty promotora CMV-IE (WO 98/00166); patrz także powyższa dyskusja (dotycząca promotorów stosowanych w plazmidach DNA). Zastosowany może być również wczesny lub późny promotor wirusa SV40 oraz promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Inne promotory obejmują między innymi promotory genów kodujących białka cytoszkieletowe, takie jak promotor desminy (Kwissa M. i wsp., Vaccine 2000, 18(22):2337-2344) lub promotor aktyny (Miyazaki J. i wsp., Gene 1989, 79(2):269-277). Korzystnym promotorem jest promotor CMV-IE.

Szczepionka albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna zawierająca nieaktywny lub osłabiony wirus, albo też jego podjednostkę, lub rekombinowana szczepionka albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna mogą być stosowane z dodatkiem adiuwanta, takiego jak fMLP (N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina; patent USA Nr 6,017,537) i/lub polimeru kwasu akrylowego lub kwasu metakrylowego i/lub kopolimeru bezwodnika kwasu maleinowego oraz pochodnych alkenylowych. Polimery kwasu akrylowego lub kwasu metakrylowego mogą być poddane usieciowaniu, np. przy użyciu polialkenylowych eterów cukrów lub polialkoholi. Związki te znane są pod nazwą „karbomerów” (Pharmeuropa, tom 8 nr 2, czerwiec 1996). Specjaliści z tej dziedziny mogą również znaleźć odpowiednie informacje na ten temat w patencie USA Nr 2,909,462 (włączonym tu w charakterze odnośnika), który omawia takie polimery akrylowe usieciowane przy użyciu polihydroksylowanego związku zawierającego przynajmniej trzy grupy hydroksylowe: w jednym z zastosowań związek polihydroksylowany zawiera nie więcej niż osiem grup hyd roksylowych; w innym zastosowaniu atomy wodoru przynajmniej trzech grup hydroksylowych są zastąpione nienasyconymi rodnikami alifatycznymi zawierającymi przynajmniej dwa atomy węgla; w innych zastosowaniach rodniki zawierają od około dwóch do około czterech atomów węgla, np. rodniki winylowe, allilowe, oraz inne grupy nienasycone o charakterze etylenowym. Nienasycone rodniki mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Szczególnie użyteczne jako adiuwanty są produkty sprzedawane jako Carbopol® (Noveon Inc., Ohio, USA). Są one usieciowane przy użyciu allilowanej sacharozy lub allilopentaerytrytolu, tak jak w przypadku produktów noszących nazwę Carbopol® 974P, 934P oraz 971P.

W przypadku kopolimerów bezwodnika kwasu maleinowego oraz pochodnych alkenylowych wymienić można produkty znane pod nazwą EMA® (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego oraz etylenu, w postaci liniowej lub usieciowanej. np. usieciowanej przy użyciu eteru diwinylowego. Odpowiednie informacje na ten temat znaleźć można w pracy J. Fieldsa i wsp., (Nature 1960, 186:778-780), włączonej tu w charakterze odnośnika. Ogólnie rzecz biorąc, polimery kwasu akrylowego lub kwasu metakrylowego, takie jak karbomery, a także kopolimery bezwodnika kwasu maleinowego i pochodnych alkenylowych, takie jak produkty EMA®, tworzone są z jednostek opartych na następującym wzorze:

PL 215 173 B1

Ri

--—c—(CH₂) —C-™ (CH₂)_y--COOH COOH w którym:

- R1 oraz R2, które są identyczne lub różne, oznaczają H lub CH3

- x = 0 lub 1, korzystnie x = 1

- y = 1 lub 2, przy czym x + y = 2.

W przypadku produktów EMA®, x = 0, y = 2. Dla karbomerów, x = y = 1.

Rozpuszczenie tych polimerów w wodzie prowadzi do otrzymania kwaśnego roztworu, który jest neutralizowany do poziomu fizjologicznego pH w celu otrzymania roztworu adiuwanta, do którego włączona jest kompozycja immunogenna lub szczepionka. Grupy karboksylowe polimeru mają więc częściowo postać COO^-.

Korzystnie, roztwór adiuwanta, np. karbomeru, przygotowywany jest w destylowanej wodzie, na przykład w obecności soli, takiej jak chlorek sodu; otrzymany roztwór ma kwasowe pH. Taki roztwór wyjściowy jest rozcieńczony poprzez dodawanie go do pożądanej objętości (w celu otrzymania pożądanego stężenia końcowego), albo istotnej części tej objętości wody zawierającej sól, taką jak NaCl, korzystnie fizjologicznego roztworu soli (NaCl, 9 g/l), używając przy tym całego roztworu wyjściowego lub dzieląc go na kilka porcji, i doprowadzając jednocześnie lub w kolejnym etapie do neutralizacji (pH 7,3-7,4). Roztwór wyjściowy jest neutralizowany przy użyciu zasady, takiej jak NaOH. Taki roztwór adiuwanta o fizjologicznej wartości pH jest wykorzystywany w tej postaci do zmieszania go z kompozycją immunogenną lub ze szczepionką, która może być przechowywana w postaci liofilizowanej, ciekłej lub zamrożonej.

Stężenie polimeru w ostatecznej kompozycji szczepionkowej może wynosić od około 0,01% do około 1,5% (waga/objętość). Stężenie tego polimeru w ostatecznej kompozycji szczepionkowej może wynosić od około 0,05 do około 1% (waga/objętość). Stężenie tego polimeru w ostatecznej kompozycji szczepionkowej może wynosić od około 0,1 do około 0,4% (waga/objętość).

Inaktywowana, lub osłabiona, lub podjednostkowa, albo też rekombinowana szczepionka, albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna, może być przygotowywana w postaci emulsji typu olej w wodzie. Emulsja typu olej w wodzie może być oparta na przykład na lekkim, ciekłym oleju parafinowym (typu European Pharmacopea); oleju zawierającym pochodne izoprenu, takim jak skwalan, skwalen, EICOSANE™ lub tetratetrakontan; oleju pochodzącym z oligomeryzacji alkenów, np. izobutenu lub decenu; estrach kwasów lub alkoholi zawierających liniowe grupy alkilowe, takich jak oleje roślinne, oleinian etylowy, di(kaprylan/kaprynian) glikolu propylenowego, tri(kaprylan/kaprynian) glicerolowy, lub dioleinian glikolu propylenowego; estrach rozgałęzionych kwasów tłuszczowych lub alkoholi, np. estry kwasu izostearynowego. Olej taki jest korzystnie stosowany w połączeniu z emulgatorem, co prowadzi do otrzymania emulsji. Emulgatory mogą być niejonowymi substancjami powierzchniowo czynnymi, takimi jak estry sorbitanu, mannitolu (np. oleinian bezwodnego mannitolu), glicerol, poliglicerol, glikol propylenowy, oraz kwasy oleinowy, izostearynowy, rycynolowy i hydroksystearynowy, które opcjonalnie są etoksylowane, a także polioksypropylenopolioksyetylenowe bloki kopolimerowe, takie jak produkty pod nazwą Pluronic®, np. L121. W jednym ze specyficznych przykładów, nie mających ograniczającego charakteru, olej taki jest dostarczany w stężeniu wynoszącym od około 1 do około 60%. Stężenie tego oleju może wynosić od około 5 do około 30%. Adiuwant może być mieszaniną emulgatora (lub emulgatorów), czynnika inicjującego powstawanie miceli oraz oleju, takiego jak ten dostępny pod nazwą Provax® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, Ca, USA).

Plazmid DNA albo też wektor ekspresyjny (np. wirusowy), kodujący inaktywowany lub osłabiony wirus, albo też jego podjednostkę, według niniejszego wynalazku, mogą być zachowywane i/lub konserwowane i przechowywane zarówno w postaci płynnej, np. w niskiej temperaturze, np. wynoszącej około 5°C, lub w postaci liofilizowanej, np. w obecności stabilizatora. Liofilizacja może być przeprowadzona zgodnie z powszechnie obowiązującymi procedurami. Dopuszczalne farmaceutycznie stabilizatory mogą obejmować SPGA (sacharoza, fosforan, glutaminian, albumina) (Bovamik i wsp., J. Bacteriology, 1950, 59:509), węglowodany (np. sorbitol, mannitol, laktoza, sacharoza, glukoza, dekstran,

PL 215 173 B1 trehaloza), glutaminian sodu (Tsvetkov T. i wsp., Cryobiology, 1983, 20(3):318-323; Israeli E. i wsp., Cryobiology 1993. 30(5):519-523), białka takie jak pepton, albumina lub kazeina, środki zawierające białko, takie jak odtłuszczone mleko (Mills C. K. i wsp., Cryobiology 1988, 25(2):148-152; Wolff E. i wsp., Cryobiology 1990, 27(5):569-575), oraz bufory (np. bufor fosforanowy, zasadowy bufor oparty na fosforanie metalu). Adiuwant i/lub nośnik albo zaróbka mogą być wykorzystane do tworzenia rozpuszczalnych lub liofilizowanych preparatów.

Przedstawiono także zastosowania plazmidów zawierających i eksprymujących in vivo (u bydła) przynajmniej jeden immunogen pochodzący od patogenu bydlęcego, którym jest BRSV, bPI-3, BHV-1 Iub BVDV, w celu przygotowania szczepionki DNA, np. do wykorzystania w szczepieniu według niniejszego wynalazku (opartym na trybie postępowania podstawowe-przypominające) i/lub do tworzenia zestawu przeznaczonego do szczepienia opartego na trybie postępowania podstawowe-przypominające według niniejszego wynalazku, i/lub do indukowania odpowiedzi immunologicznej u młodych bydląt, np. cieląt mających lub mogących mieć matczyne przeciwciała skierowane przeciwko bydlęcemu patogenowi.

Korzystnie, szczepionka DNA ma być podawana (i jest podawana) młodemu zwierzęciu (cielęciu) od momentu jego narodzin do osiągnięcia wieku około 12 tygodni życia (włącznie), co może obejmować okres od narodzin do 6 tygodnia życia włącznie, na przykład od narodzin do 4 tygodnia życia włącznie, np. od narodzin do 3 tygodnia życia włącznie.

Korzystniej, szczepionka DNA ma indukować (i indukuje) pierwotną odpowiedź immunologiczną, swoistą wobec eksprymowanego immunogenu, lub „indukowaną przez DNA odpowiedź immunologiczną” (taką jak swoista wobec eksprymowanego immunogenu odpowiedź komórkowa angażująca pamięć limfocytów T eksprymujących interferon γ (IFNy+)), która może być przypominana poprzez podanie szczepionki przypominającej, będącej inaktywowaną Iub atenuowaną lub podjednostkową szczepionką lub osłabionym wektorem, albo jego podjednostką, lub też rekombinowanym albo modyfikowanym wektorem (np. wirusowym, bakteryjnym), lub kompozycją immunogenną zawierającą wektor, np. wektor wirusowy, taki jak żywy rekombinowany wirus ospy, zawierający i eksprymujący in vivo przynajmniej jeden ten sam immunogen, antygen lub epitop, który był eksprymowany przez szczepionkę DNA.

Szczepionka przypominająca może być podawana w okresie od około 2 tygodni do około 5 miesięcy po podaniu szczepionki podstawowej, na przykład od około 3 do około 6 tygodni po podaniu szczepionki podstawowej, a korzystnie w terminie około 4 tygodni po podaniu szczepionki podstawowej. Można przeprowadzić drugie podanie przypominającej szczepionki albo kompozycji immunologicznej lub immunogennej, na przykład gdy cielę przenoszone jest do jednostki docelowej.

W innym aspekcie wynalazku dotyczy on wykorzystania bydlęcego czynnika patogennego (włączony jest tu jego fragment), takiego jak BRSV, bPI-3, BHV-1 lub BVDV, do przygotowania podstawowej szczepionki opartej na plazmidach (szczepionki DNA albo opartej na DNA kompozycji immunogennej lub immunologicznej), zawierającej i eksprymującej in vivo (u bydła, np. krów, byków, cieląt) cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą przynajmniej jeden immunogen, antygen lub epitop, pochodzący od czynnika patogennego, oraz do przygotowania drugiej szczepionki (szczepionki przypominającej albo immunogennej lub immunologicznej kompozycji przypominającej), obejmującej czynnik patogenny w nieaktywnej postaci (inaktywowanej), lub w osłabionej postaci (atenuowanej), albo też takiej drugiej szczepionki, która zawiera podjednostkę (wyizolowane białko, antygen, immunogen lub epitop) czynnika patogennego, lub takiej drugiej szczepionki, która obejmuje rekombinowany lub modyfikowany wektor ekspresyjny (np. wektor wirusowy, bakteryjny lub drożdżowy), taki jak żywy rekombinowany wirus ospy, adenowirus lub wirus opryszczki, korzystnie wirus ospy, który zawiera i eksprymuje in vivo cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą przynajmniej jeden immunogen, antygen lub epitop czynnika patogennego, który obejmuje immunogen, antygen lub epitop, eksprymowany przez szczepionkę opartą na plazmidzie. Używany tu zwrot „zastosowanie czynnika patogennego” obejmuje zastosowanie patogenu do klonowania sekwencji nukleotydowej kodującej immunogen, antygen lub epitop, a także zastosowanie czynnika patogennego do izolowania z niego immunogenu, antygenu lub epitopu (np. w celu uzyskania odpowiedniej podjednostki lub do jej zsekwencjonowania i określenia w ten sposób sekwencji kodującej, wykorzystanej następnie do przygotowania plazmidu DNA albo rekombinowanego lub modyfikowanego wektora ekspresyjnego), oraz zastosowania czynnika patogennego do przygotowania szczepionki lub kompozycji immunogennej zawierającej nieaktywny lub osłabiony wirus. Tak więc inny aspekt niniejszego wynalazku obejmuje wykorzystanie sekwencji nukleotydowej kodującej przynajmniej jeden immunogen, antygen lub epitop bydlęcego czynnika patoPL 215 173 B1 gennego, takiego jak BRSV, bPI-3, BHV-1 lub BVDV, do przygotowania podstawowej szczepionki opartej na plazmidzie (szczepionki DNA albo opartej na DNA kompozycji immunogennej lub immunologicznej) i/lub do przygotowania drugiej szczepionki (albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej), która zawiera zmodyfikowany lub rekombinowany wektor ekspresyjny. Szczepionka lub kompozycja immunogenna zawierająca podjednostkę albo nieaktywny lub osłabiony wirus obejmuje korzystnie immunogen, antygen lub epitop eksprymowany przez szczepionkę DNA albo kompozycję immunogenną lub immunologiczną opartą na DNA; a rekombinowany lub modyfikowany wektor ekspresyjny eksprymuje korzystnie immunogen, antygen lub epitop eksprymowany przez szczepionkę DNA albo kompozycję immunogenną lub immunologiczną opartą na DNA. Szczepionka oparta na plazmidzie jest przeznaczona do pierwszego podania zwierzęciu (np. młodemu cielęciu, które ma lub może mieć matczyne przeciwciała skierowane przeciwko patogenowi bydlęcemu), natomiast szczepionka oparta na nieaktywnym lub osłabionym wirusie, albo też jego podjednostce, lub na rekombinowanym lub modyfikowanym wektorze ekspresyjnym, przeznaczona jest do podawania po uprzednim podaniu szczepionki DNA temu samemu bydlęciu, w celu przypomnienia odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko immunogenowi, antygenowi lub epitopowi (na przykład, w momencie gdy podawana jest szczepionka zawierająca nieaktywny lub osłabiony wirus, albo też jego podjednostkę. lub modyfikowany albo rekombinowany wektor ekspresyjny, u cielęcia otrzymano już swoistą pierwotną odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko immunogenowi, antygenowi lub epitopowi, taką jak na przykład swoista odpowiedź na szczepionkę DNA lub „indukowana szczepionką DNA” odpowiedź immunologiczna przeciwko immunogenowi, antygenowi lub epitopowi, np. odpowiedź komórkowa angażująca pamięć limfocytów T IFNy+, swoistą wobec immunogenu, antygenu lub epitopu; natomiast szczepionka obejmująca nieaktywny lub osłabiony wirus, albo też jego podjednostkę, lub rekombinowany albo modyfikowany wektor ekspresyjny, indukuje odpowiedź immunologiczną przeciwko patogenowi bydlęcemu, włączając w to odpowiedź przeciwko przynajmniej jednemu spośród immunogenów, antygenów lub epitopów eksprymowanych przez szczepionkę DNA).

Zgodnie z powyższym, inny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy zastosowania bydlęcego czynnika patogennego, takiego jak BRSV, bPI-3, BHV-1 lub BVDV do przygotowania szczepionki lub kompozycji immunogennej obejmującej inaktywowany lub osłabiony wirus, albo też jego podjednostkę, z przeznaczeniem do użycia w szczepieniu lub immunizacji bydła przeciwko czynnikowi patogennemu, przy czym zwierzę takie (np. młode cielę mające lub mogące mieć matczyne przeciwciała przeciwko patogenowi bydlęcemu) było uprzednio immunizowane przy użyciu szczepionki DNA eksprymującej in vivo przynajmniej jeden immunogen, antygen lub epitop pochodzący z tego samego czynnika patogennego i rozwinęło swoistą pierwotną odpowiedź immunologiczną przeciwko immunogenowi, antygenowi lub epitopowi, taką jak „indukowana przez szczepionkę DNA” odpowiedź immunologiczna, a korzystniej odpowiedź komórkowa angażująca pamięć limfocytów T IFN_Y+, swoista wobec eksprymowanego immunogenu, antygenu lub epitopu.

W opisie niniejszego wynalazku przedstawiono też potencjalne zastosowania rekombinowanego lub modyfikowanego wektora ekspresyjnego, np. wektora wirusowego, takiego jak wektor oparty na wirusie ospy, który zawiera i eksprymuje in vivo przynajmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą przynajmniej jeden immunogen, antygen lub epitop pochodzący od bydlęcego czynnika patogennego, takiego jak BRSV, bPI-3, BHV-1 lub BVDV, w celu przygotowania szczepionki lub kompozycji immunogennej, obejmującej rekombinowany lub modyfikowany wektor ekspresyjny (np. żywy, rekombinowany lub modyfikowany wektor), przeznaczonej do użycia w szczepieniu lub immunizacji bydła przeciwko czynnikowi patogennemu, przy czym zwierzę takie (np. młode cielę mające lub mogące mieć matczyne przeciwciała przeciwko patogenowi bydlęcemu) było uprzednio immunizowane przy użyciu szczepionki DNA eksprymującej in vivo przynajmniej jeden immunogen, antygen lub epitop i rozwinęło swoistą pierwotną odpowiedź immunologiczną przeciwko immunogenowi, antygenowi lub epitopowi, taką jak „indukowana przez szczepionkę DNA” odpowiedź immunologiczna, a korzystniej odpowiedź komórkowa angażująca pamięć limfocytów T IFNy+, swoista wobec eksprymowanego immunogenu, antygenu lub epitopu.

Szczepionka DNA jest korzystnie podawana młodemu zwierzęciu (cielęciu) w okresie od jego narodzin do około 12 tygodnia życia włącznie, na przykład od narodzin do około 6 tygodnia życia włącznie, przykładowo od narodzin do 4 tygodnia życia włącznie, np. od narodzin do 3 tygodnia życia włącznie. Szczepionka lub kompozycja immunogenna oparta na inaktywowanym lub osłabionym wirusie, albo też jego podjednostce, lub na rekombinowanym lub modyfikowanym wektorze ekspresyjnym, przeznaczona jest do podawania w okresie od około 2 tygodni do około 5 miesięcy po podaniu pod24

PL 215 173 B1 stawowym, na przykład w okresie od około 3 do 6 tygodni po podaniu podstawowym, a korzystnie w terminie około 4 tygodni po podaniu podstawowym. Można też przeprowadzić drugie podanie szczepionki przypominającej albo immunologicznej lub immunogennej kompozycji przypominającej, na przykład w momencie, gdy cielę przenoszone jest do jednostki docelowej.

W praktyce niniejszego wynalazku korzystnie stosowana jest szczepionka lub immunogenna kompozycja oparta na nieaktywnym wirusie albo na rekombinowanym lub modyfikowanym wektorze ekspresyjnym. Szczepionka lub kompozycja immunogenna oparta na nieaktywnym lub osłabionym wirusie, albo też na jego podjednostce, lub na rekombinowanym lub modyfikowanym wektorze ekspresyjnym, może być stosowana w opisanej tutaj postaci i zawierać korzystnie odpowiedni adiuwant. W celu uniknięcia nadmiernego powtarzania, zaznacza się niniejszym, że dyskusja zawarta w innych częściach prezentowanego opisu może odnosić się do omawianych tu aspektów wynalazku związanych z jego „zastosowaniem”.

Sposoby i zastosowania przedstawione w niniejszym opisie mogą łączyć szczepienia przeciwko więcej niż jednemu patogenowi bydlęcemu, przy czym sposoby i zastosowania według niniejszego opisu mogą obejmować dowolną kombinację immunizacji lub szczepień przeciwko dwóm, trzem, lub czterem spośród poszczególnych, omawianych tu patogenów. Może to być dokonane poprzez jednoczesne lub następujące po sobie podawanie szczepionek albo kompozycji immunogennych lub immunologicznych skierowanych przeciwko tym patogenom. Może to również obejmować zastosowanie mieszanin odpowiednich immunogenów, szczepionek albo kompozycji immunogennych lub immunologicznych. Zastosować można również plazmidy lub wektory zawierające i eksprymujące cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące immunogeny, antygeny lub epitopy dwóch lub większej liczby patogenów. Zgodnie z powyższym, możliwe są wielowartościowe szczepionki DNA albo oparte na DNA kompozycje immunogenne lub immunologiczne.

Jeszcze inny aspekt rozwiązań według wynalazku pozwala na wytworzenie zestawu zawierającego pierwszą szczepionkę albo kompozycję immunogenną lub immunologiczną, co obejmuje szczepionkę DNA albo kompozycję immunogenną lub immunologiczną opartą na DNA, oraz drugą szczepionkę albo kompozycję immunogenną lub immunologiczną, obejmującą szczepionkę albo kompozycję immunogenną lub immunologiczną opartą na nieaktywnym albo osłabionym żywym wirusie, lub też na jego podjednostce, korzystnie na nieaktywnym wirusie, lub szczepionkę albo kompozycję immunogenną lub immunologiczną opartą na rekombinowanym lub modyfikowanym wektorze ekspresyjnym zdolnym do ekspresji in vivo, przy czym wspomniana podjednostka zawiera immunogen, antygen lub epitop eksprymowany przez pierwszą szczepionkę, a szczepionka albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna oparta na zmodyfikowanym wektorze eksprymuje immunogen, antygen lub epitop eksprymowany przez pierwszą szczepionkę, natomiast szczepionka albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna oparta na osłabionym wirusie eksprymuje lub prezentuje immunogen, antygen lub epitop eksprymowany przez pierwszą szczepionkę, a szczepionka albo oparta na DNA kompozycja immunogenna lub immunologiczna oparta na nieaktywnym wirusie prezentuje immunogen, antygen lub epitop eksprymowany przez pierwszą szczepionkę. Szczepionki lub kompozycje znajdują się korzystnie w oddzielnych pojemnikach. Te oddzielne pojemniki mogą znajdować się w jednym opakowaniu. Zestaw zawierać może instrukcję podawania szczepionki przy użyciu procedury opartej na trybie postępowania podstawowe-przypominające, zgodnej z niniejszym wynalazkiem.

Ilość DNA, stosowana w kompozycjach i szczepionkach według niniejszego wynalazku, mieści się korzystnie w zakresie od około 1 μg do około 1000 μg, na przykład w zakresie od około 50 μg do około 500 μg, dla danego plazmidu. Specjaliści z tej dziedziny posiadają wiedzę wystarczającą do precyzyjnego określenia skutecznej dawki DNA, która będzie wykorzystywana w protokole szczepienia w oparciu o wiedzę zawartą w niniejszym wniosku i literaturze specjalistycznej.

Objętości stosowanych dawek mogą mieścić się w zakresie od około 0,2 do około 5 ml, korzystnie w zakresie od około 1 do około 3 ml.

Szczepionki DNA wynalazku mogą być podawane (w kontekście sposobu szczepienia) przy użyciu rozmaitych dróg podawania, proponowanych przez specjalistów w dziedzinie szczepienia polinukleotydami, i przy użyciu środków przewidywanych w ramach stosowania znanych technik podawania szczepionek.

Zgodnie z zastosowaniem objętym niniejszym wynalazkiem, szczepionki lub kompozycje DNA według wynalazku podawane są drogą domięśniową, drogą podskórną lub przy pomocy bezigłowego urządzenia do wstrzykiwania takiego jak Biojector 2000 (Bioject Inc., Portland. OR, USA), korzystnie

PL 215 173 B1 przy użyciu drogi śródskórnej. Szczegóły dotyczące podawania szczepionek bydłu przy użyciu śródskórnej drogi podawania z zastosowaniem bezigłowego urządzenia do wstrzykiwania znaleźć można w opracowaniu US-A-6,451,770.

Jak przedstawiono w opisie niniejszego wynalazku, w przypadku podawania przypominającego, przeprowadzanego przy użyciu szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej opartej na rekombinowanym lub modyfikowanym wektorze ekspresyjnym przewidywanym do ekspresji in vivo (na przykład kompozycji zawierającej rekombinowany wirus, taki jak rekombinowany wirus opryszczki, adenowirus lub wirus ospy, takiej jak kompozycja oparta na rekombinowanym wirusie ospy krowiej, ospy ptasiej, ospy kanarków lub ospy drobiu, korzystnie takiej jak kompozycja oparta na

ALVAC, TROVAC, lub NYCAC), droga podawania może obejmować drogę śródskómą (ID - ang.

intradermal), domięśniową (IM ang. intramuscular), podskórną (SC - ang. subcutaneous), dożylną, doustną lub donosową. Podawanie to może się odbywać przy użyciu strzykawki i igły, lub przy użyciu bezigłowego urządzenia do wstrzykiwania. Wprowadzana dawka mieści się korzystnie w zakresie od 39 około 10³ pfu (ang. plaque forming units, jednostki tworzące łysinki) do około 10⁹ pfu w przypadku rekombinowanego wektora. Gdy wektorem jest wirus ospy kanarków, stosowana dawka mieści się korzystnie w zakresie od około 10⁵ do około 10⁹ pfu, np. od około 10⁶ pfu do około 10⁷ pfu. Objętość dawek stosowanych w przypadku bezigłowego urządzenia do wstrzykiwania powinna mieścić się w zakresie od około 0,1 ml do około 0,5 ml, np. około 0,25 ml. W przypadku wstrzykiwania przy użyciu strzykawki i igły, stosowane objętości powinny korzystnie mieścić się w zakresie od około 0,5 do około 5 ml, np. od około 1 do około 3 ml. Stosowane dawkowanie może odpowiadać zawartemu tu opisowi.

W przypadku podawania przypominającego, przeprowadzanego przy użyciu szczepionki albo kompozycji immunogennej lub immunologicznej opartej na inaktywowanym lub osłabionym wirusie, albo też jego podjednostce, droga podawania może obejmować drogę śródskómą (ID), domięśniową (IM), podskórną (SC), dożylną, doustną lub donosową. Podawanie to może się odbywać przy użyciu strzykawki i igły, lub przy użyciu bezigłowego urządzenia do wstrzykiwania. Objętość dawek stosowanych w przypadku bezigłowego urządzenia do wstrzykiwania może korzystnie mieścić się w zakresie od około 0,1 ml do około 0,5 ml, np. około 0,25 ml. W przypadku wstrzykiwania przy użyciu strzykawki i igły, stosowane objętości powinny korzystnie mieścić się w zakresie od około 0,5 do około 5 ml, np. od około 1 do około 3 ml.

Wynalazek będzie teraz dodatkowo opisany i zilustrowany przy użyciu następujących przykładów, nie mających charakteru ograniczającego.

P r z y k ł a d y

W przypadku każdego z rozpatrywanych patogenów, każdy gen kodujący zasadniczy antygen (w postaci natywnej i w postaci zmodyfikowanej) był poddany oddzielnej procedurze zmierzającej do skonstruowania eukariotycznego plazmidu ekspresyjnego. Postacie antygenu ulegające sekrecji były otrzymywane poprzez delecję fragmentów genu kodujących domeny przezbłonowe i cytoplazmatyczne. We wszystkich tych przypadkach domeny przezbłonowe białek identyfikowano na podstawie profilów hydrofobowości odpowiadających im sekwencji białka (stosując oprogramowanie MacVector 6.5).

P r z y k ł a d 1: Sposoby biologii molekularnej

1.1 Ekstrakcja wirusowego DNA genomowego

Zawiesiny wirusów traktowano proteinazą K (w stężeniu końcowym wynoszącym 100 mg/ml) w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS) (w stężeniu końcowym wynoszącym 0,5%) przez dwie godziny w temperaturze 37°C. Następnie ekstrahowano wirusowy DNA przy użyciu mieszaniny fenol/chloroform, po czym precypitowano DNA przy użyciu dwóch objętości bezwodnego etanolu w temperaturze -20°C przez 16 godzin, a na koniec wirowano przy 10000 g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Uzyskany osad DNA był suszony, a następnie zawieszany w minimalnej objętości sterylnej, ultraczystej wody.

1.2 Izolacja wirusowego RNA genomowego

Genomowy RNA dla każdego wirusa był ekstrahowany przy użyciu techniki „tiocyjanian guanidyny/fenol-chloroform”, opisanej przez P. Chomczyńskiego i N. Sacehi (Anal. Biochem. 1987,

162:156-159).

1.3 Techniki biologii molekularnej

Wszystkie procedury konstruowania plazmidów przeprowadzano przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej opisanych przez Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Wyd. 2, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, USA). Wszystkie fragmenty restrykcyjne wykorzystane w niniejszym wynalazku izolowano przy pomocy ze26

PL 215 173 B1 stawu „Geneclean” (BIO101 Inc., La Jolla, CA, USA). W przypadku wszystkich konstruktów, klonowane fragmenty DNA, a także miejsca połączeń z wektorem ekspresyjnym, były poddane sekwencjonowaniu przy użyciu sposobu Sangera (Sambrook i wsp., 1989).

1.4 PCR oraz RT-PCR

Syntetyzowano oligonukleotydy specyficzne wobec klonowanych genów lub fragmentów genów, przy czym niektóre z nich zawierały (na końcu 5') miejsca restrykcyjne ułatwiające klonowanie powielanych fragmentów. Reakcje odwrotnej transkrypcji (RT - ang. reverse transcription) oraz polimerazową reakcję łańcuchową (PCR - ang. polymerase chain reaction) przeprowadzano zgodnie ze standardowymi technikami (Sambrook i wsp., 1989).

1.5 Oczyszczanie plazmidów na dużą skalę

Produkowanie (na skalę około 10 mg) oczyszczonych plazmidów wchodzących w skład kompozycji szczepionkowych przeprowadzano przy użyciu sposobu wykorzystującego gradient chlorku cezu w roztworze bromku etydyny (Sambrook i wsp., 1989).

P r z y k ł a d 2: Podstawowe konstrukty plazmidowe

Eukariotyczny plazmid ekspresyjny pVR1020 (Luke C. J. i wsp., J. of Infectious Diseases, 1997, 175:95-97), wywodzący się z plazmidu pVR1012 (Fig. 1, Fig. 1 i Przykład 7 we wniosku patentowym WO-A-9803199), zawiera sekwencję sygnałową ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA).

Plazmid pVR1020 poddano modyfikacji poprzez trawienie BamHI-BglII oraz wstawienie sekwencji zawierającej kilka miejsc do klonowania (BamHI, NotI, EcoRI, XbaI, PmlI, PstI, BglII) i otrzymanej w wyniku parowania następujących oligonukleotydów:

PB326 (40 nukleotydów) (NR ID SEK:1)

5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' oraz

PB329 (40 nukleotydów) (NR ID SEK:2)

5' GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'.

Uzyskany w ten sposób wektor, o długości 5105 par zasad (bp - ang. base pairs), nazwano pAB110 (Fig. 2).

Intron II króliczego genu β-globiny sklonowano w wektorze pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) po zsyntetyzowaniu odpowiedniego fragmentu DNA przy użyciu PCR z zastosowaniem następujących oligonukleotydów:

SB090 (20 nukleotydów) (NR ID SEK:3)

5' TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' oraz

SB091 (21 nukleotydów) (NR ID SEK:4)

5' CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3' przy czym jako matrycy użyto genomowego DNA z komórek krwi obwodowej królika.

Otrzymany plazmid nazwano pNS050.

Plazmid ekspresyjny pAB110 zmodyfikowano poprzez wprowadzenie sekwencji intronu II króliczego genu globiny w miejsce restrykcyjne SalI położone przed kodonem ATG peptydu sygnałowego białka tPA. Sekwencję intronu II króliczego genu globiny amplifikowano w polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) przy użyciu plazmidu pNS050 jako matrycy i stosując następującą parę oligonukleotydów:

LF001 (30 nukleotydów) (NR ID SEK:5)

5' CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT 3' oraz

LF002 (30 nukleotydów) (NR ID SDEK:6)

5' CTCCATGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAA 3'.

Produkt PCR (o długości 573 par zasad) trawiono enzymem restrykcyjnym SalI i klonowano w plazmidzie pAB110, zlinearyzowanym uprzednio przy użyciu SalI, tworząc w ten sposób plazmid pLF999 o długości 5678 bp.

P r z y k ł a d 3: Plazmidy kodujące różne postacie antygenów bydlęcego wirusa opryszczki typu I (BHV-1)

Fragmenty wirusowego DNA zawierające geny gB, gC oraz gD szczepu B901 wirusa BHV-1 izolowano poprzez trawienie genomu wirusowego różnymi enzymami restrykcyjnymi, a następnie rozdzielanie tych fragmentów w procesie elektroforezy w żelu agarozowym i analizowanie ich techniką Southern blot przy użyciu sond odpowiadających fragmentom genów gB, gC oraz gD szczepu ST wirusa BHV-1 (Leung-Tack P. i wsp., Virology 1994, 199:409-421). Użyty może być również szczep Colorado wirusa BHV-1 [Cooper] (ATCC nr VR-864). Zidentyfikowane w ten sposób fragmenty skloPL 215 173 B1 nowano w wektorze pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA), które to klony wykorzystano następnie do klonowania trzech powyższych genów w wektorze ekspresyjnym pVR1012.

3.1 Plazmidy kodujące różne postacie białka gB wirusa BHV-1

3.1.1 pPB280: gen gB (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012

Fragmenty XhoI-XhoI zawierające części 5' oraz 3' genu gB wirusa BHV-1 identyfikowano przy użyciu techniki Southern blot i klonowano w wektorze pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA), trawionym uprzednio enzymem restrykcyjnym XhoI.

Otrzymane w ten sposób plazmidy oznaczono odpowiednio jako pPB128 oraz pPB117.

Plazmid pPB128, zawierający fragment 5' genu gB, trawiono enzymami NotI i XhoI, otrzymując fragment o długości 1708 bp (fragment A).

Plazmid pPB117, zawierający część 3' genu gB, trawiono enzymami XhoI i Stul, otrzymując fragment o długości 1345 bp. Ten właśnie fragment sklonowano w wektorze pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA), trawionym uprzednio enzymami restrykcyjnymi EcoRV i XhoI. Otrzymany plazmid nazwano pPB279. Plazmid pPB279 trawiono następnie enzymami XhoI i BamHI, otrzymując fragment DNA o długości 1413 bp (fragment B).

Fragmenty A i B klonowano następnie w wektorze pBluescript KS+ trawionym enzymami NotI i BamHI, otrzymując plazmid pPB278 (6063 bp) i doprowadzając do odtworzenia genu gB wirusa BHV-1.

Wektor pPB278 posłużył następnie jako matryca w reakcji PCR prowadzonej przy użyciu następujących oligonukleotydów:

PB234 (30 nukleotydów) (NR ID SEK:7)

5' TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3' oraz

PB235 (21 nukleotydów) (NR ID SEK:8)

5' GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3'.

Produkt PCR (146 bp) trawiono następnie enzymami restrykcyjnymi SaII i NheI.

Plazmid pPB278 trawiono enzymami restrykcyjnymi NheI i BamHI. Otrzymany w ten sposób fragment o długości 2728 bp oraz fragment uzyskany w wyniku wspomnianego wcześniej trawienia produktu PCR poddano ligacji z wektorem pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami SalI i BamHI, tworząc w ten sposób plazmid pPB280 o długości 7742 bp.

Gen gB wirusa BHV-1 koduje białko zawierające 933 aminokwasy.

3.1.2 pPB281: gen gB (postać A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012

Postać skróconą (pozbawioną domeny przezbłonowej (TM) oraz domeny C-końcowej (Cter)) genu gB wirusa BHV-1 otrzymano ligując plazmid pVR1012 (Przykład 2), trawiony uprzednio enzymami SalI i BamHI, z dwoma fragmentami DNA, z których jeden, o długości 2234 bp, otrzymano po trawieniu SalI-PvuII plazmidu pPB280 (Przykład 3.1.1), a drugi, o długości 56 bp uzyskano w wyniku parowania następujących oligonukleotydów:

PB511 (52 nukleotydy) (NR ID SEK:9)

5' CTGCACGAGCTCCGGTTCTACGACATTGACCGCGTGGTCAAGACGGACTGAG 3', oraz

PB512 (57 nukleotydów) (NR ID SEK:10)

5' GATCCTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTCAATGTCGTAGAACCGGAGCTCGTGCAG 3'.

Otrzymany w ten sposób plazmid o długości 7154 bp nazwano pPB281. Skrócony gen gB wirusa BHV-1 koduje białko zawierające 759 aminokwasów.

3.1.3 pSB115: gen gB (postać tPA A(TM-Cterj) sklonowany w wektorze pAB110.

Postać tPA A[TM-Cter] genu gB wirusa BHV-1 amplifikowano (powielano) w reakcji PCR przy użyciu matrycy pPB281 (Przykład 3.1.2) stosując następujące startery:

SB221 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:11)

5' AAAATTTCGATATCCGCCGCGGGGCGACCGGCGACAACG 3' oraz

SB222 (33 nukleotydy) (NR ID SEK:12)

5' GGAAGATCTTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTC 3'.

Produkt amplifikacji (2088 bp) trawiono enzymami EcoRV i BglII, a następnie klonowano w wektorze pAB110 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami EcoRV i BglII, otrzymując plazmid pSB115 o długości 7154 bp.

Postać tPA A[TM-Cter] genu gB wirusa BHV-1 koduje glikoproteinę zawierającą 729 aminokwasów, obejmujących domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gB wirusa BHV-1.

3.2 Plazmidy kodujące różne postacie białka gC wirusa BHV-1

3.2.1 pPB264: gen gC (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012

PL 215 173 B1

Fragment BamHI-HinTIII (o długości 3,5 kb) zawierający kompletny gen gC wirusa BHV-1 identyfikowano przy użyciu techniki Southern blot i klonowano w wektorze pBluescript SK+. Otrzymany w ten sposób plazmid nazwano pPB287.

Plazmid pPB287 trawiono następnie enzymami NcoI i BssSI. Otrzymano fragment restrykcyjny o długości 1492 bp. Poddano go ligacji z syntetycznym fragmentem DNA otrzymanym w wyniku parowania następujących oligonukleotydów:

PB507 (37 nukleotydów) (NR ID SEK:13)

5' TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT 3' oraz

PB508 (37 nukleotydów) (NR ID SEK:14)

5'CTAGACTACAGGCGCGCCCGGGCCTTGCGCCGCAGGC3' oraz z plazmidem pLitmus 28 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA), trawionym uprzednio enzymami NcoI i XbaI, otrzymując pośredni plazmid pPB290.

Fragment o długości 1554 bp, pochodzący z trawienia plazmidu pPB290 przy użyciu enzymów PstI i XbaI, sklonowano w wektorze pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami PstI i XbaI, tworząc w ten sposób plazmid pPB264 o długości 6427 bp. Gen gC wirusa BHV-1 koduje białko zawierające 508 aminokwasów.

3.2.2 pPB292: gen gC (postać A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012

Skróconą postać genu gC wirusa BHV-1 otrzymano ligując następujące trzy fragmenty DNA z wektorem pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami PstI i XbaI:

(a) fragment o długości 1035 bp, uzyskany z trawienia plazmidu pPB264 (Przykład 3.2.1) przy użyciu enzymów PstI i XhoI, (b) fragment o długości 350 bp, uzyskany z trawienia plazmidu pPB264 przy użyciu enzymów XhoI i BanI, oraz (c) syntetyczny fragment o długości 43 bp, otrzymany w wyniku parowania oligonukleotydów

PB513 i PB514.

Oligonukleotydy te mają następującą sekwencję:

PB513 (43 nukleotydy) (NR ID SEK:15)

5' GCACCGCTGCCCGAGTTCTCCGCGACCGCCACGTACGACTAGT 3' oraz

PB514 (43 nukleotydów) (NR ID SEK:16)

5' CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGGCAGCG 3'.

Otrzymany w ten sposób plazmid o długości 6305 bp nazwano pPB292. Skrócony gen gC wirusa BHV-1 koduje białko zawierające 466 aminokwasów.

3.2.3 pSB116: gen gC (postać tPA A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pAB110.

Postać tPA A[TM-Cter] genu gC wirusa BHV-1 amplifikowano w reakcji PCR przy użyciu matrycy pPB292 (Przykład 3.2.2) stosując następujące startery:

SB223 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:17)

5‘ AAAATTTCGATATCCCGGCGGGGGCTCGCCGAGGAGGCG 3' oraz

SB224 (32 nukleotydy) (NR ID SEK:18)

5' GGAAGATCTCTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGG 3'

Produkt amplifikacji (1362 bp) trawiono enzymami EcoRV i BglII, a następnie klonowano w wektorze pAB110 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami EeoRV i BglII, otrzymując plazmid pSB116 o długości 6404 bp.

Postać tPA A[TM-Cter] genu gC koduje glikoproteinę zawierającą 479 aminokwasów, obejmujących domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gC wirusa BHV-1.

3.3 Plazmidy kodujące różne postacie białka gD wirusa BHV-1

3.3.1 pPB148: gen gD (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012

Fragment XhoI-XhoI (o długości 5 kb) zawierający gen gD wirusa BHV-1 identyfikowano przy użyciu techniki Southern blot i klonowano w wektorze pBluescript SK+, trawionym uprzednio enzymem restrykcyjnym XhoI, otrzymując w ten sposób plazmid pPB147.

Fragment o długości 325 bp, uzyskany z trawienia plazmidu pPB147 enzymami NdeI i BsrBI, oraz fragment o długości 943 bp, uzyskany z trawienia plazmidu pB147 enzymami NdeI i Styl, ligowano z wektorem pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami EcoRV i XbaI, tworząc w ten sposób plazmid pPB148 o długości 6171 bp. Gen gD wirusa BHV-1 koduje białko zawierające 417 aminokwasów.

3.3.2 pPB284: gen gD (postać A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012

PL 215 173 B1

Skrócony gen gD wirusa BHV-1 otrzymano z fragmentu uzyskanego w wyniku amplifikacji w reakcji PCR przeprowadzonej na matrycy genomowego DNA (szczepu B901 wirusa BHV-1), trawionego uprzednio enzymami PstI i XbaI, przy użyciu następującej pary starterów:

PB497 (33 nukleotydy) (NR ID SEK:19)

5' TTTCTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG 3' oraz

PB498 (31 nukleotydów) (NR ID SEK:20)

5' TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG 3'.

Otrzymany w ten sposób fragment PCR sklonowano w plazmidzie pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami PstI i XbaI, tworząc plazmid pPB284 o długości 5943 bp.

Skrócony gen gD wirusa BHV-1 koduje białko zawierające 355 aminokwasów.

3.3.3 pSB117: gen gD (postać tPA A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pAB110.

Postać tPA A[TM-Cter] genu gD wirusa BHV-1 amplifikowano w reakcji PCR przy użyciu matrycy pPB284 (Przykład 3.3.2) stosując następujące startery:

SB225 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:21)

5' AAAATTTCGATATCCCCCGCGCCGCGGGTGACGGTATAC 3' oraz

SB226 (33 nukleotydy) (NR ID SEK:22)

5' GGAAGATCTTTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCGG 3'.

Produkt amplifikacji (1029 bp) trawiono enzymami EcoRV i BglII, a następnie klonowano w wektorze pAB110 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami EcoRV i BglII, otrzymując plazmid pSB117 o długości 6071 bp.

Postać tPA A[TM-Cter] genu gD koduje glikoproteinę zawierającą 368 aminokwasów, obejmujących domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny gD wirusa BHV-1.

P r z y k ł a d 4: Plazmidy kodujące różne postacie antygenów bydlęcego wirusa BRSV

Geny kodujące antygeny F i G wirusa BRSV otrzymano przy użyciu reakcji RT-PCR, przeprowadzonej na matrycy wirusowego RNA szczepu Snook (Thomas i wsp., Research in Vet. Science 1982, 33:170-182). Wykorzystany może być również szczep A 51908 wirusa BRSV (ATCC nr VR-794).

4.1 Plazmidy kodujące różne postacie BRSV-F

4.1.1 pSB107: gen F (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012

Gen F szczepu Snook wirusa BRSV był amplifikowany w reakcji RT-PCR, przy zastosowaniu jako matrycy wirusowego RNA i przy użyciu następujących starterów:

SB210 (34 nukleotydów) (NR ID SEK:23)

5' AAATTTTCTGCAGATGGCGACAACAGCCATGAGG 3' oraz

SB211 (35 nukleotydy) (NR ID SEK:24)

5' TTAAGGATCCTCATTTACTAAAGGAAAGATTGTTG 3'.

Produkt amplifikacji o długości 1739 bp trawiono enzymami PstI i BamHI, a następnie klonowano w wektorze pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami PstI i BamHI, otrzymując plazmid pSB107 o długości 6583 bp.

Gen F wirusa BRSV koduje glikoproteinę zawierającą 574 aminokwasy.

4.1.2 pSB108: gen F (postać A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012

Skrócona postać genu F szczepu Snook wirusa BRSV była amplifikowana w reakcji RT-PCR, przy zastosowaniu jako matrycy wirusowego RNA i przy użyciu następujących starterów: SB210 (NR ID SEK:23)

SB212 (39 nukleotydy) (NR ID SEK:25)

5' AATTTTGGATCCTCATGTGGTGGATTTTCCTACATCTAC 3'.

Produkt amplifikacji (1581 bp) trawiono enzymami PstI i BamHI, a następnie klonowano w wektorze pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami PstI i BamHI, otrzymując plazmid pSB108 o długości 6430 bp.

Skrócona postać genu F koduje glikoproteinę zawierającą 523 aminokwasy, obejmujące domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny F wirusa BRSV.

4.1.3 pSB114: gen F (postać tPA A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pAB110

Skrócona postać genu F szczepu Snook wirusa BRSV była amplifikowana w reakcji RT-PCR, przy zastosowaniu jako matrycy wirusowego RNA i przy użyciu następujących starterów: SB212 (NR ID SEK:25)

SB220 (38 nukleotydów) (NR ID SEK:26)

5' AAAATTCACGTGAACATAACAGAAGAATTTTATCAATC 3'.

PL 215 173 B1

Produkt amplifikacji (1516 bp) trawiono enzymami PmlI i BglII, a następnie klonowano w wektorze pAB110 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami PmlI i BglII, otrzymując plazmid pSB114 o długości 6572 bp.

Postać tPA A[TM-Cter] genu F koduje glikoproteinę zawierającą 535 aminokwasów, obejmujące domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny F wirusa BRSV.

4.1.4 pSB449: gen F (postać dużej delecji A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pVR1012

Skrócona postać genu F szczepu Snook wirusa BRSV była amplifikowana w reakcji RT-PCR, przy zastosowaniu jako matrycy wirusowego RNA i przy użyciu następujących starterów:

SB210 (NR ID SEK:23)

FC129 (39 nukleotydy) (NR ID SEK:57)

5' AATTTTGGATCCTCAGATTCCACGATTTTTATTAGAAGC 3'.

Produkt amplifikacji (1305 bp) trawiono enzymami PstI i BamHI, a następnie klonowano w wektorze pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami PstI i BamHI, otrzymując plazmid pPB449 o długości około 6150 bp.

Skrócona postać genu F koduje glikoproteinę zawierającą 431 aminokwasów, obejmujących domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny F wirusa BRSV.

4.2 Plazmidy kodujące różne postacie BRSV-G

W przypadku białka G (glikoproteiny typu II) wirusa BRSV nie można odróżnić sekwencji sygnałowej od sekwencji przezbłonowej, co wymaga dodania sekwencji sygnałowej przed sekwencją odpowiadającą domenie zewnątrzkomórkowej podczas wprowadzania delecji domeny przezbłonowej.

Do skonstruowania plazmidów zawierających skrócone postacie genu kodującego białko G wirusa BRSV wykorzystano plazmid pAB110 (Przykład 2).

4.2.1 pSB109: gen G (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012

Gen G szczepu Snook wirusa BRSV był amplifikowany w reakcji RT-PCR, przy zastosowaniu jako matrycy wirusowego RNA i przy użyciu następujących starterów:

SB213 (32 nukleotydów) (NR ID SEK:27)

5' ACGCGTCGACATGTCCAACCATACCCATCATC 3' oraz

SB214 (38 nukleotydy) (NR ID SEK:28)

5' TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTGATTTG 3'.

Produkt amplifikacji (784 bp) trawiono enzymami SaIl i XbaI, a następnie klonowano w wektorze pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami SaIl i XbaI, otrzymując plazmid pSB109 o długości 5661 bp.

Gen G wirusa BRSV koduje glikoproteinę zawierającą 257 aminokwasów.

4.2.2 pSB110: gen G (postać tPA A[TM-Cter]) sklonowany w wektorze pAB110

Skrócona postać genu G szczepu Snook wirusa BRSV była amplifikowana w reakcji RT-PCR, przy zastosowaniu jako matrycy wirusowego RNA i przy użyciu następujących starterów: SB215 (33 nukleotydy) (NR ID SEK:29)

5' TTTTAAGGATCCGCTAAAGCCAAGCCCACATCC 3' oraz

SB216 (33 nukleotydy) (NR ID SEK:30)

5' TTAAAATCTAGATTAGATCTGTGTAGTTGATTG 3'.

Produkt amplifikacji (666 bp) trawiono enzymami BamHI i XbaI, a następnie klonowano w wektorze pAB110 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami BamHI i XbaI, otrzymując plazmid pSB110 o długości 5660 bp.

Postać tPA A[TM-Cter] genu G wirusa BRSV koduje glikoproteinę zawierającą 218 aminokwasów, obejmujących domenę zewnątrzkomórkową glikoproteiny G, jednak poprzedzoną sekwencją sygnałową tkankowego aktywatora plazminogenu.

4.3 pFC123: gen N (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012

Gen N wirusa BRSV był amplifikowany w reakcji RT-PCR, przy zastosowaniu jako matrycy wirusowego RNA i przy użyciu następujących starterów:

FC130 (34 nukleotydy) (NR ID SEK:58)

5' AAATTTTGTCGACATGGCTCTTAGCAAGGTCAAA 3' oraz

FC131 (35 nukleotydów) (NR ID SEK:59)

5' TTAAGGATCCTCACAGTTCCACATCATTGTCTTTG 3'.

Produkt amplifikacji o długości 1199 bp trawiono enzymami SalI i BamHI, a następnie klonowano w wektorze pVR1012 (Przykład 2), trawionym uprzednio enzymami SalI i BamHI, otrzymując plazmid pFC123 o długości 6057 bp.

PL 215 173 B1

Gen N wirusa BRSV koduje białko nukleokapsydu zawierające 391 aminokwasów.

P r z y k ł a d 5: Plazmidy kodujące różne postacie antygenów bydlęcego wirusa BVD-1

Geny kodujące antygeny E0 (glikoproteinę o masie 48 kDa, albo gp48) oraz E2 (gp53) wirusów

BVDV typu 1 otrzymano w reakcji RT-PCR na matrycy wirusowego RNA szczepu Osloss (De Moerlooze L. i wsp., J. Gen. Virol 1993, 74:1433-1438; Renard A. i wsp., DNA 1985, 4:439-438; Renard A. i wsp., Ann. Rech. Vet. 1987, 18:121-125). Można również zastosować szczepy NADL (ATCC VR534) lub New York (ATCC VR-524).

5.1 Plazmidy kodujące różne postacie antygenu E0 szczepu Osloss wirusa BVDV

5.1.1 pLF1028: gen E0 (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012

Komplementarny DNA (cDNA) genu E0 szczepu Osloss syntetyzowano na matrycy odpowiedniego wirusowego RNA przy użyciu startera LF051, a następnie amplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem następującej pary oligonukleotydów:

LF050 (36 nukleotydów) (NR ID SEK:31)

5' CATACCGTCGACATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3' oraz

LF051 (40 nukleotydów) (NR ID SEK:32)

5' CATACCGGATCCTCAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3'.

Fragment DNA o długości 765 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami SalI i BamHI, ligowano z fragmentem o długości 4866 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pVR1012 (Przykład 2) enzymami SalI i BamHI, w celu stworzenia plazmidu pLF1028 (5636 bp). Gen

E0 szczepu Osloss wirusa BVDV-1 koduje białko zawierające 252 aminokwasy.

Do sekwencji oligonukleotydu LF050 wprowadzono kodon ATG aby umożliwić inicjację translacji odpowiedniego rekombinowanego polipeptydu E0.

5.1.2 pLF1029: gen E0, postać (β-globina tPA-ΕΟ) sklonowana w wektorze pLF999.

Gen E0 syntetyzowano w reakcji PCR na matrycy plazmidu pLF1028 (Przykład 5.1.1) przy użyciu następującej pary oligonukleotydów:

LF052 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:33)

5' CATGACGCGGCCGCTATGAAGAAACTAGAGAAAGCCCTG 3' oraz

LF053 (40 nukleotydów) (NR ID SEK:34)

5' CATGACAGATCTTTAGGCTGCATATGCCCCAAACCATGTC 3'.

Fragment DNA o długości 700 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami NotI i BglII, ligowano z fragmentem o długości 5642 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pLF999 (Przykład 2) enzymami NotI i BglII, w celu stworzenia plazmidu pLF1029 (6417 bp).

Gen E0 szczepu Osloss wirusa BVDV-1 zmodyfikowany w ten sposób (β-globina tPA-E0) koduje białko zawierające 283 aminokwasy.

5.2 Plazmidy kodujące różne postacie antygenu E2 szczepu Osloss wirusa BVDV typu 1

5.2.1 pLF1020: gen E2 (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012.

cDNA genu E2 szczepu Osloss syntetyzowano na matrycy odpowiedniego wirusowego RNA przy użyciu startera LF040, a następnie amplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem następującej pary oligonukleotydów:

LF039 (33 nukleotydy) (NR ID SEK:35)

5' CATGACGTCGACATGACGACTACTGCATTCCTG 3' oraz

LF040 (36 nukleotydów) (NR ID SEK:36)

5' CATGACAGATCTTCAACGTCCCGAGGTCATTTGTTC 3'.

Fragment DNA o długości 1235 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami SaIl i BglII, ligowano z fragmentem o długości 4860 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pVR1012 (Przykład 2) enzymami SaIl i BglII, w celu stworzenia plazmidu pLF1020 (6100 bp).

Gen E2 szczepu Osloss wirusa BVDV-1 koduje białko zawierające 409 aminokwasów.

Do sekwencji oligonukleotydu LF039 wprowadzono kodon ATG aby umożliwić inicjację translacji odpowiedniego rekombinowanego polipeptydu E2.

5.2.2 pLF1021: gen E2, postać (β-globina tPA-E2 A[TM+Cter]) sklonowana w wektorze pLF999.

Gen E2, zawierający delecję domeny przezbłonowej oraz domeny C-końcowej, syntetyzowano w reakcji PCR na matrycy plazmidu pLF1020 (Przykład 5.2.1) przy użyciu następującej pary oligonukleotydów:

LF041 (36 nukleotydów) (NR ID SEK:37)

5' CATGACGCGGCCGCTATGACGACTACTGCATTCCTG 3' oraz

LF042 (35 nukleotydów) (NR ID SEK:38)

PL 215 173 B1

5' CATGACAGATCTCAAGCGAAGTAATCCCGGTGGTG 3'.

Fragment DNA o długości 1132 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami NotI i BglII, ligowano z fragmentem o długości 5642 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pLF999 (Przykład 2) enzymami NotI i BglII, w celu stworzenia plazmidu pLF1021 (6799 bp).

Gen E2 szczepu Osloss wirusa BVDV-1, zmodyfikowany w ten sposób (β-globina tPA-E2 A[TM+Cter]), koduje białko zawierające 404 aminokwasy.

P r z y k ł a d 6: Plazmidy kodujące różne postacie antygenów bydlęcego wirusa BVDV-2

Geny kodujące antygeny E2 (gp53) wirusów BVDV typu 2 otrzymano w reakcji RT-PCR na matrycy wirusowego RNA szczepu 890 (Ridpath J. F. oraz Bolin S. R., Virology 1995, 212:36-46). Można również zastosować szczep Q140, który można otrzymać z Ministerstwa Rolnictwa prowincji Quebec (Quebec Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Armand-Frappier Institute) (Tijssen P. i wsp., Virology 1996, 217:356-361). Można również wykorzystać szczepy 1373 oraz 296 (Ridpath J. F., BVDV Research Project, National Animal Disease Center, 2300 Dayton Avenue, Ames, USA).

6.1 Plazmidy kodujące różne postacie antygenu E2 szczepu 890 wirusa BVDV typu 2

6.1.1 pLF1022: gen E2 (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu E2 szczepu 890 syntetyzowano na matrycy odpowiedniego wirusowego RNA przy użyciu startera LF044, a następnie amplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem następującej pary oligonukleotydów:

LF043 (36 nukleotydów) (NR ID SEK:39)

5' ACTGTATCTAGAATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3' oraz

LF044 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:40)

5' ACTGTAAGATCTTTAAGTATTCACTCCAGCACCCATAGC 3'.

Fragment DNA o długości 1240 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami XbaI i BglII, ligowano z fragmentem o długości 4891 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pVR1012 (Przykład 2) enzymami XbaI i BglII, w celu stworzenia plazmidu pLF1022 (6136 bp).

Gen E2 szczepu 890 wirusa BVDV-2 koduje białko zawierające 410 aminokwasów.

Do sekwencji oligonukleotydu LF043 wprowadzono kodon ATG aby umożliwić inicjację translacji odpowiedniego rekombinowanego polipeptydu E2.

6.1.2 pLF1023: gen E2, postać (β-globina tPA-E2 A[TM+Cter]) sklonowana w wektorze pLF999.

Gen E2, zawierający delecję domeny przezbłonowej oraz domeny C-końcowej, syntetyzowano w reakcji PCR na matrycy plazmidu pLF1022 (Przykład 6.2.1) przy użyciu następującej pary oligonukleotydów:

LF045 (41 nukleotydów) (NR ID SEK:41)

5' CATGACGCGGCCGCCCTATGACCACCACAGCTTTCCTAATC 3' oraz

LF046 (36 nukleotydów) (NR ID SEK:42)

5' CATGACAGATCTTTATATGAACTCTGAGAAGTAGTC 3'.

Fragment DNA o długości 1140 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami NotI i BglII, ligowano z fragmentem o długości 5642 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pLF999 (Przykład 2) enzymami NotI i BglII, w celu stworzenia plazmidu pLF1023 (6787 bp).

Gen E2 szczepu 890 wirusa BVDV-2, zmodyfikowany w ten sposób (β-globina tPA-E2 A[TM+Cterj), koduje białko zawierające 405 aminokwasów.

6.2 Plazmidy kodujące różne postacie antygenu E0 szczepu 890 wirusa BVDV typu 2

6.2.1 pLF1030: gen E0 (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu E0 szczepu 890 syntetyzowano na matrycy odpowiedniego wirusowego RNA przy użyciu startera LF065, a następnie amplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem następującej pary oligonukleotydów:

LF064 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:43)

5' CATACCGTCGACATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3' oraz

LF065 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:44)

5' CATACCGGATCCTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3'.

Fragment DNA o długości 768 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami SalI i BamHI, ligowano z fragmentem o długości 4866 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pVR1012 (Przykład 2) enzymami SalI i BamHI, w celu stworzenia plazmidu pLF1030 (5639 bp). Gen E0 szczepu 890 wirusa BVDV-2 koduje białko zawierające 253 aminokwasy.

Do sekwencji oligonukleotydu LF064 wprowadzono kodon ATG aby umożliwić inicjację translacji odpowiedniego rekombinowanego polipeptydu E0.

PL 215 173 B1

6.2.2 pLF1031: gen E0, postać (β-globina tPA^0), sklonowanej w wektorze pLF999.

Gen E0 syntetyzowano w reakcji PCR na matrycy plazmidu pLF1030 (Przykład 6.2.1) przy użyciu następującej pary oligonukleotydów:

LF066 (42 nukleotydy) (NR ID SEK:45)

5' CATGACGCGGCCGCTATGAGAAAGAAATTGGAGAAGGCACTG 3' oraz

LF067 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:46)

5' CATACCAGATCTTCATGCTGCATGAGCACCAAACCATGC 3'.

Fragment DNA o długości 770 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami NotI i BglII, ligowano z fragmentem o długości 5642 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pLF999 (Przykład 2) enzymami NotI i BglII, w celu stworzenia plazmidu pLF1031 (6417 bp).

Gen E0 szczepu 890 wirusa BVDV-2, zmodyfikowany w ten sposób (β-globina tPA-E0), koduje białko zawierające 283 aminokwasy.

P r z y k ł a d 7: Plazmidy kodujące różne postacie antygenów bydlęcego wirusa bPI-3

Geny kodujące antygen hemaglutyniny-neuraminidazy (HN) oraz antygen fuzyjny (F) wirusa bPI-3 otrzymano w reakcji RT-PCR na matrycy wirusowego RNA szczepu Reisinger SF-4 (dostępnego w ATCC pod numerem VR-281).

7.1 Plazmidy kodujące różne postacie antygenu HN szczepu SF-4 wirusa bPI-3

7.1.1 pLF1024: gen HN (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu HN szczepu SF-4 syntetyzowano na matrycy odpowiedniego wirusowego RNA przy użyciu startera LF048, a następnie amplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem następującej pary oligonukleotydów:

LF047 (39 nukleotydów) (NR ID SEK:47)

5' CATATCGTCGACATGGAATATTGGAAACACACAAACAGC 3' oraz

LF048 (38 nukleotydów) (NR ID SEK:48)

5' CATGACGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTCTGT 3'.

Fragment DNA o długości 1726 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami SaIl i EcoRV, ligowano z fragmentem o długości 4896 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pVR1012 (Przykład 2) enzymami SaIl i EeoRV, w celu stworzenia plazmidu pLF1024 (6619 bp).

Gen HN wirusa bPI-3 koduje białko zawierające 572 aminokwasy.

7.1.2 pLF1025: gen HN, postać (β-globina tPA-E2 Δ[ΤΜ]), sklonowany w wektorze pLF999.

Gen HN, zawierający delecję domeny przezbłonowej, syntetyzowano w reakcji PCR na matrycy plazmidu pLF1024 (Przykład 7.1.1) przy użyciu następującej pary oligonukleotydów: LF058 (33 nukleotydy) (NR ID SEK:49)

5' CATACTGCGGCCGCTTTAATTC AAGAGAACAAT 3' oraz

LF059 (35 nukleotydów) (NR ID SEK:50)

5' CATATCGATATCTAGCTGCAGTTTTTCGGAACTTC 3'.

Fragment DNA o długości 1566 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami NotI i EcoRV, ligowano z fragmentem o długości 5663 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pLF999 (Przykład 2) enzymami NotI i EcoRV, w celu stworzenia plazmidu pLF1025 (7229 bp).

Gen HN wirusa bPI-3, zmodyfikowany w ten sposób (β-globina tPA-E2 Δ[ΤΜ]), koduje białko zawierające 548 aminokwasów.

7.2 Plazmidy kodujące różne postacie antygenu F szczepu SF-4 wirusa bPI-3

7.2.1 pLF1026: gen F (postać natywna) sklonowany w wektorze pVR1012 cDNA genu F szczepu SF-4 syntetyzowano na matrycy odpowiedniego wirusowego RNA przy użyciu startera LF061, a następnie amplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem następującej pary oligonukleotydów:

LF060 (36 nukleotydów) (NR ID SEK:51)

5' CATATCGTCGACATGATCATCACAAACACAATCATA 3' oraz

LF061 (36 nukleotydów) (NR ID SEK:52)

5' CATGACCAGATCTTATTGTCTATTTGTCAGTATATA 3'.

Fragment DNA o długości 1628 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami SaIl i BglII, ligowano z fragmentem o długości 4860 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pVR1012 (Przykład 2) enzymami SaIl i BglII, w celu stworzenia plazmidu pLF1026 (6488 bp).

Gen F wirusa bPI-3 koduje białko zawierające 550 aminokwasów.

7.2.2 pLF1027: gen F, postać (β-globina tPA-F A[TM+Cter]), sklonowany w wektorze pLF999.

PL 215 173 B1

Gen F, zawierający delecję domeny przezbłonowej oraz domeny C-końcowej, syntetyzowano w reakcji PCR na matrycy plazmidu pLR1026 (Przykład 7.2.1) przy użyciu następującej pary oligonukleotydów:

LF062 (42 nukleotydy) (NR ID SEK:53)

5' CATACTGCGGCCGCTCAAATAGACATAACAAAACTGCAACGT 3' oraz

LF063 (41 nukleotydów) (NR ID SEK:54)

5' CATATCGATATCTATGCACTAGATTGATACCAACTTCCAAC 3'.

Fragment DNA o długości 1434 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami NotI i EcoRV, ligowano z fragmentem o długości 5663 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pLF999 (Przykład 2) enzymami NotI i EcoRV, w celu stworzenia plazmidu pLF1027 (7097 bp).

Gen F wirusa bPI-3, zmodyfikowany w ten sposób (β-globina tPA-F A[TM+Cter]), koduje białko zawierające 504 aminokwasy.

P r z y k ł a d 8: Plazmid kodujący bydlęce białko GM-CSF cDNA bydlęcego genu GM-CSF syntetyzowano na matrycy komórkowego RNA (uzyskanego z jednojądrzastych komórek krwi bydlęcej) przy użyciu startera LF065, a następnie amplifikowano w reakcji PCR z zastosowaniem następującej pary oligonukleotydów:

LF054 (36 nukleotydów) (NR ID SEK:55)

5' CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3' oraz

LF055 (34 nukleotydy) (NR ID SEK:56)

5' CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCA 3'.

Fragment DNA o długości 437 bp, otrzymany po trawieniu produktu PCR enzymami SalI i BglII, ligowano z fragmentem o długości 4860 bp, powstałym w wyniku trawienia plazmidu pVR1012 (Przykład 2) enzymami SaIl i BglII, w celu stworzenia plazmidu pLF1032 (5297 bp).

Bydlęcy gen GM-CSF koduje białko zawierające 143 aminokwasy.

P r z y k ł a d 9: Przygotowywanie plazmidów szczepionkowych

Roztwór DNA zawierający jeden lub większą liczbę plazmidów według Przykładów 3-8 jest zatężany przy użyciu precypitacji etanolem, według opisu Sambrooka i wsp. (1989). Otrzymany osad DNA jest zawieszany w 0,9% roztworze NaCl, tak aby otrzymać stężenie 1 mg/ml. Roztwór DMRIE-DOPE o stężeniu 0,75 mM przygotowywany jest poprzez zawieszenie liofilizatu DMIRIE-DOPE w odpowiedniej objętości sterylnej wody.

Przygotowanie kompleksów obejmujących DNA plazmidowy oraz lipid osiągane jest poprzez rozcieńczenie 0,75 mM roztworu DMRIE-DOPE w równej objętości roztworu DNA o stężeniu 1 mg/ml (w 0,9% NaCl). Roztwór DNA jest dodawany stopniowo, przy użyciu igły 26G ze szwem, po ściance probówki zawierającej roztwór kationowego lipidu, tak aby zapobiec tworzeniu się piany. Tuż po zmieszaniu obu roztworów poddaje się otrzymaną mieszaninę delikatnemu wytrząsaniu. W rezultacie otrzymuje się kompozycję zawierającą 0,375 mM DMRIE-DOPE oraz 500 μg/ml plazmidu.

Pożądane jest, aby wszystkie używane roztwory miały temperaturę pokojową podczas wykonywania wszystkich opisanych powyżej operacji. Tworzenie się kompleksu DNA/DMRIE-DOPE przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed immunizacją zwierząt.

P r z y k ł a d 10: Immunizacja bydła przeciwko BHV-1

Dwanaście sztuk bydła dzielono losowo na trzy grupy po cztery sztuki.

Grupa 1 stanowi grupę zwierząt kontrolnych.

Zwierzętom z grupy 2 podawano mieszaninę szczepionkowych plazmidów: pPB281 (kodującego białko gB wirusa BHV-1 w postaci A[TM-Cter], Przykład 3.1.2), pPB292 (kodującego białko gC wirusa BHV-1 w postaci A[TM-Cter], Przykład 3.2.2) oraz pPB284 (kodującego białko gD wirusa BHV-1 w postaci A[TM-Cter], Przykład 3.3.2).

Zwierzętom z grupy 3 podawano tę samą mieszaninę, co w przypadku grupy 2, lecz przygotowanej z DMRIE-DOPE według opisu w Przykładzie 15.

Każdemu zwierzęciu wstrzykiwano domięśniowo 10 ml odpowiedniego preparatu, używając do tego strzykawki wyposażonej w igłę, przy czym iniekcję tę powtarzano po 21 dniach. Całkowita masa każdego plazmidu użytego podczas każdej immunizacji wynosiła 1500 μg.

Specjaliści z tej dziedziny posiadają wiedzę, umożliwiającą odpowiednie dostosowanie objętości lub stężeń, w zależności od wymaganej dawki plazmidu.

Monitorowanie odpowiedzi serologicznej, indukowanej przez dwie mieszaniny plazmidów szczepionkowych eksprymujących antygeny gB, gC oraz gD wirusa BHV-1, przeprowadzano w okresie 35 dni po pierwszym szczepieniu.

PL 215 173 B1

Otrzymane wyniki przedstawione są w poniższej tabeli:

Plazmidy	Dodatek	Antygeny	Dawka	SN w dniu 28	SN w dniu 35
Kontrola	...	---	---	0,2±0,0	0,2±0,0
pPB281 pPB292 pPB294	---	GB \[TM-Cter] gC \[TM-Cter] gD \[TM-Cter]	1500 μg 1500 μg 1500 μς	1,0±0,5	1,2±0,8
pPB281 pPB292 pPB294	DMRIE-DOPE	GB \[TM-Cter] gC \[TM-Cter] gD \[TM-Cter]	1500 μg 1500 μg 1500 μg	2,1±0,6	2,7±0,6

P r z y k ł a d 11: Immunizacja bydła przeciwko BRSV z zastosowaniem trybu postępowania podstawowe-przypominające

Plazmidy szczepionkowe, kodujące antygen F wirusa BRSV w postaci obejmującej dużą delecję A[TM-Cter] oraz postaci A[TM-Cter], a także kodujące antygen N wirusa BRSV, były zatężane przy użyciu precypitacji etanolem według opisu Sambrooka i wsp. (1989). Otrzymany osad DNA zawieszano w 1,8% NaCl, tak aby otrzymać stężenie wynoszące 1,6 mg/ml. Roztwór zawierający 1,2 mM DMRIE-DOPE przygotowywano zawieszając liofilizowaną postać DMRIE-DOPE w odpowiedniej objętości sterylnej wody.

Tworzenie się kompleksów obejmujących DNA plazmidowy i lipid osiągano mieszając równe objętości roztworu 1,2 mM DMRIE-DOPE oraz roztworu DNA o stężeniu 1,6 mg/ml (w 1,8% NaCl). Roztwór DNA jest dodawany stopniowo, przy użyciu igły 26G ze szwem, po ściance probówki zawierającej roztwór kationowego lipidu, tak aby zapobiec tworzeniu się piany. Tuż po zmieszaniu obu roztworów poddaje się otrzymaną mieszaninę delikatnemu wytrząsaniu. W rezultacie otrzymuje się kompozycję zawierającą 0,6 mM DMRIE-DOPE oraz 800 μg/ml plazmidu.

Pożądane jest, aby wszystkie używane roztwory miały temperaturę pokojową podczas wykonywania wszystkich opisanych powyżej operacji. Tworzenie się kompleksu DNA/DMRIE-DOPE przeprowadza się w temperaturze pokojowej prze 30 minut przed immunizacją zwierząt.

Wirus BSV (szczep 375, zdeponowany w amerykańskiej kolekcji ATCC (American Type Culture Collection) pod numerem dostępu # VR-1339) inaktywowano przy użyciu β-propiolaktonu i wykorzystywano do tworzenia preparatu przy użyciu odczynnika Carbopol® 974P (Noveon Inc.) (20% (objętość/objętość) roztwór Carbopol, 15 g/l), tak aby otrzymać końcowe stężenie Carbopol 3 mg/ml.

Dwadzieścia sztuk bydła, w wieku od 3 do 4 tygodni, dzielono losowo na 4 grupy obejmujące po 5 zwierząt.

Grupa 1 stanowiła grupę zwierząt kontrolnych (nie poddawanych żadnemu szczepieniu).

W celu przeprowadzenia podstawowej immunizacji podawano domięśniowo zwierzętom z grupy 2 i grupy 3 szczepionkę DNA, przygotowaną z użyciem DMRIE-DOPE, stosując dawkę o objętości 2 ml wprowadzaną przy użyciu strzykawki i igły. Całkowita ilość plazmidów wykorzystanych w immunizacji wynosiła 1600 μg. Zwierzętom z grupy 4 podawano domięśniowo inaktywowaną szczepionkę przygotowaną z wykorzystaniem Carbopol, stosując dawkę o objętości 5 ml wprowadzaną przy użyciu strzykawki i igły.

Po upływie 28 dni przeprowadzono immunizację przypominającą. Zwierzętom z grupy 2 podawano domięśniowo szczepionkę DNA przygotowaną z użyciem DMRIE-DOPE, stosując dawkę o objętości 2 ml wprowadzaną przy użyciu strzykawki i igły. Całkowita ilość plazmidów wykorzystanych w immunizacji wynosiła 1600 μg. Zwierzętom z grupy 3 i grupy 4 podawano domięśniowo inaktywowaną szczepionkę przygotowaną z wykorzystaniem Carbopol, stosując dawkę o objętości 5 ml wprowadzaną przy użyciu strzykawki i igły.

Wszystkie zwierzęta były poddane w dniu 193 testowaniu, polegającym na podaniu patogennego wirusa BRSV (szczep Snook; Taylor G. i wsp., J. Gen. Virol. 1998, 79(7): 1759-1767), w dawce 4,5 log10 CCID50/ml. 10 ml zawiesiny inokulacyjnej wprowadzono donosowo każdemu z cieląt przy użyciu rozpylacza, przy czym całkowita dawka infekcyjna dla cielęcia wynosiła około 10^5,5 CCID50.

Monitorowanie temperatury w odbycie, częstości oddechów, objawów klinicznych, objawów uszkodzeń płucnych, wydalania wirusów, oraz swoistej dla BRSV odpowiedzi z udziałem limfocytów T IFN-/+ przeprowadzano w okresie 10 dni po poddaniu działaniu wirusa.

Wyniki pomiaru temperatury w odbycie zwierząt przedstawiono w Fig. 3 (w °C).

PL 215 173 B1

Wszystkie zwierzęta poddane działaniu wirusa wykazywały podwyższoną temperaturę. Zwierzęta z grupy 3 (DNA/inaktywowanej) wykazywały przeciętnie wcześniejszy okresowy wzrost temperatury niż zwierzęta z innych grup, a wartość temperatury w odbycie była znacząco niższa (p=0,001) w porównaniu z grupą kontrolną, gdy rozpatrywano okres od dnia 4 do 10 (D4-D10).

Wyniki pomiaru częstości oddechów (liczba oddechów na minutę) przedstawiono w Fig. 4.

Zwierzęta z grupy 3 wykazywały przeciętnie niższy i wcześniejszy okresowy wzrost częstości oddechów, niż zwierzęta z innych grup. W przypadku tej grupy, obserwowano mniejszą częstość oddechów niż u zwierząt kontrolnych (p=0,06).

Objawy kliniczne przedstawiały się następująco:

Objaw kliniczny	0	1	2
Prostracja	Nie	Tak	-
Anoreksja	Brak	Częściowa	Całkowita
Kaszel	Brak	Okazyjnie	Powtarzający się
Duszność	Brak	Umiarkowana	Ciężka

Stwierdzono 8 przypadków śmierci, obejmujących też eutanazję ze względów etycznych.

Wyniki testu klinicznego przedstawiono w Fig. 5.

Wszystkie cielęta wykazywały hiperwentylację (od umiarkowanej do ciężkiej) po poddaniu działaniu wirusa. Wszystkie zwierzęta wykazywały przynajmniej objawy wyczerpania (prostracji) lub częściowej anoreksji w okresie przeprowadzania testu. Obserwowano znaczne zróżnicowanie ciężkości objawów, nawet w obrębie tej samej grupy. Przykładowo, jedno ze zwierząt w grupie 4 wykazywało bardzo ciężkie objawy (prowadzące do śmierci w dniu 8), a wynik jego testu klinicznego (GSS - ang. global clinical score) stanowił ponad 50% całkowitego wyniku GSS dla całej grupy. Podobna sytuacja była jeszcze wyraźniejsza w grupie 3, gdzie wynik GSS dla jednego z cieląt reprezentował niemal 2/3 całkowitego wyniku GSS dla grupy 3.

Wszystkie cielęta, u których stwierdzono śmierć lub które poddano eutanazji, poddane były nekropsji. Przeprowadzono badanie makroskopowe głębokich dróg oddechowych, a grzbietową i brzuszną stronę płuc obserwowano w kierunku występowania uszkodzeń. Rozmiar tych uszkodzeń był oceniany dla każdego płata płucnego (obu jego stron) jako procentowe uszkodzenie płata (powierzchnia uszkodzona/powierzchnia całkowita), w celu obliczenia stanu płata płucnego w następujący sposób:

Stan płata płucnego = (indeks płata) x (wynik dla strony grzbietowej + wynik dla strony brzusznej)/2

Indeks płata przedstawia relatywną ważność poszczególnych płatów płucnych i wynosi odpowiednio:

Dla prawego płata górnego oraz dla płata środkowo-górnego: 0,11

Dla prawego płata środkowo-dolnego: 0,07

Dla prawego płata dolnego: 0,35

Dla lewego płata górnego: 0,05

Dla lewego płata środkowego: 0,06

Dla lewego płata dolnego: 0,32

Oraz dla płata nieparzystego: 0,04.

Całkowity wskaźnik uszkodzeń płucnych dla każdego z cieląt określano dodając wyniki dla poszczególnych płatów.

Wyniki wskaźników uszkodzeń płucnych przedstawiono w Fig. 6.

Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że 4/5 cieląt z grupy 3 wykazywało mniej niż 7,5% uszkodzeń płucnych, podczas gdy u piątego cielęcia wskaźnik ten wynosił prawie 100%.

Wyniki badania wymazów nosowych pod kątem wydzielania wirusów przedstawiono w Fig. 7.

Szczep BRSV, użyty w teście, wykryto u zwierząt ze wszystkich grup, choć poziom obecności wirusa był zróżnicowany, a zwierzęta kontrolne wykazywały najwyższy poziom wydalania wirusa. W porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, całkowite wydalanie (suma dziennego miana wydalania w log10) było znacząco obniżone jedynie w grupie 3.

PL 215 173 B1

Z próbek krwi bydląt poddanych podstawowej immunizacji in vivo, pobieranych w 36 i 92 dniu po szczepieniu oraz w 10 dniu po testowym podaniu wirusa, pobierano jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC - ang. peripheral blood mononuclear cells).

Komórki PBMC pobrane w dniu 36 były poddane ponownej stymulacji ex vivo przy użyciu autologicznych komórek dendrytycznych, zakażonych rekombinowanym wirusem ospy eksprymującym białko F wirusa BRSV lub rodzicielskim wirusem ospy (jako kontrolą).

Komórki PBMC pobrane w dniu 92 lub też w dniu 10 po testowym podaniu wirusa poddawano ponownej stymulacji ex vivo, przeprowadzonej z bezpośrednim użyciem wirusów BRSV hodowanych w komórkach VERO (szczep 375 od około 6,0 log10 CCID50/ml do około 6,4 Iog10 CCID50/ml). W doświadczeniu kontrolnym, komórki PBMC były infekowane przy użyciu lizatu z komórek VERO.

Częstości występowania swoistych wobec antygenu limfocytów T określano na podstawie liczby komórek wydzielających IFN-γ, stosując do tego test ilościowy typu ELISPOT (ang. enzyme-linked immune spot) (Laval F. i wsp., Vet. Immunol. Immunopathol. 2002, 90(3-4):191-201). Przy użyciu tego podejścia poszczególne strategie szczepionkowe mogą być oceniane pod względem zdolności do wywoływania pierwotnej przeciwwirusowej odpowiedzi komórkowej, angażującej limfocyty T IF^(+).

Swoiste wobec wirusa BRSV odpowiedzi komórkowe z udziałem limfocytów T pamięci IFN;.'+ przedstawiono w Fig. 8.

W przeciwieństwie do wyników z dnia 36, które przekładały się na wtórną odpowiedź efektorowych limfocytów T, analiza w dniu 92 wykazała zachodzenie odpowiedzi limfocytów T pamięci (2 miesiące po drugim zastrzyku). Cielęta o wysokim poziomie swoistej odpowiedzi z udziałem limfocytów T pamięci należały głównie do grupy 3 (cielęta szczepione przy użyciu szczepionki DNA oraz inaktywowanej, przypominającej szczepionki wirusowej).

Co ciekawe, te cielęta z grupy 3, które niezmiennie wykazywały swoistą wobec wirusa BRSV odpowiedź z udziałem limfocytów T pamięci IFN;.'+, bez względu na czas przeprowadzania analizy, były też cielętami wykazującymi znaczący efekt ochronny.

Wynalazek będzie dalej opisywany przy użyciu następujących numerowanych paragrafów:

1. Zastosowanie plazmidu, zawierającego i eksprymującego in vivo u bydła przynajmniej jeden immunogen pochodzący z bydlęcego patogenu, wybranego spośród BRSV, bPI-3, BHV-1 oraz BVDV, do przygotowania szczepionki DNA przeznaczonej do wywołania odpowiedzi immunologicznej u młodych sztuk bydła, np. u cieląt, które mają lub mogą mieć matczyne przeciwciała przeciwko powyższemu patogenowi bydlęcemu.

2. Zastosowanie według paragrafu 1, w którym szczepionka DNA jest przeznaczona do podawania młodym zwierzętom lub bydłu od momentu urodzenia do 12 tygodnia życia włącznie, np. od momentu urodzenia do 6 tygodnia życia włącznie, np. od momentu urodzenia do 4 tygodnia życia włącznie, a zwłaszcza od momentu urodzenia do 3 tygodnia życia włącznie.

3. Zastosowanie według paragrafu 1 lub 2, w którym szczepionka DNA jest przeznaczona do wywołania pierwotnej odpowiedzi immunologicznej, takiej jak swoista wobec eksprymowanego immunogenu odpowiedź angażująca limfocyty T pamięci IFN;.'+, która to pierwotna odpowiedź immunologiczna może być wzmocniona poprzez następujące po niej podanie inaktywowanej szczepionki lub żywej rekombinowanej szczepionki zawierającej wektor wirusowy, taki jak żywy rekombinowany wirus ospy, zawierający i eksprymujący in vivo przynajmniej jeden taki sam immunogen, jaki eksprymowany był przez szczepionkę DNA.

4. Zastosowanie bydlęcego czynnika patogennego, wybranego spośród BRSV, bPI-3, BHV-1 oraz BVDV, w celu przygotowania podstawowej szczepionki DNA obejmującej plazmid zawierający i eksprymujący in vivo u bydła przynajmniej jeden immunogen pochodzący z powyższego czynnika patogennego, oraz w celu przygotowania drugiej szczepionki zawierającej wspomniany czynnik patogenny w postaci nieaktywnej, przy czym szczepionka DNA przeznaczona jest do pierwszego podawania bydłu, np. młodym cielętom mającym lub mogącym mieć matczyne przeciwciała przeciwko wspomnianemu patogenowi bydlęcemu, natomiast inaktywowana szczepionka przeznaczona jest do podawania po szczepionce DNA temu samemu zwierzęciu, na przykład młodemu cielęciu, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciwko wspomnianemu immunogenowi.

5. Zastosowanie według paragrafu 4, w którym szczepionka DNA przeznaczona jest do wywołania u bydła, na przykład u cieląt, odpowiedzi immunologicznej przeciwko wspomnianemu immunogenowi lub immunogenom, np. swoistej wobec eksprymowanego immunogenu odpowiedzi limfocytów T pamięci IFN;.'+.

PL 215 173 B1

6. Zastosowanie według paragrafu 4 lub 5, w którym szczepionka DNA jest przeznaczona do podawania młodym zwierzętom lub bydłu od momentu urodzenia do 12 tygodnia życia włącznie, np. od momentu urodzenia do 6 tygodnia życia włącznie, np. od momentu urodzenia do 4 tygodnia życia włącznie, a zwłaszcza od momentu urodzenia do 3 tygodnia życia włącznie.

7. Zastosowanie według paragrafu 4, 5 lub 6, w którym inaktywowana szczepionka jest przeznaczona do podawania w okresie od około 2 tygodni do około 5 miesięcy po podaniu podstawowym, np. w okresie od około 3 do 6 tygodni, np. około 4 tygodni po podaniu szczepionki DNA.

8. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej kodującej przynajmniej jeden immunogen pochodzący z bydlęcego czynnika patogennego, wybranego spośród BRSV, bPI-3, BFIV-1 oraz BVDV, w celu przygotowania podstawowej szczepionki DNA obejmującej plazmid zawierający i eksprymujący in vivo wspomniany immunogen, oraz w celu przygotowania drugiej szczepionki zawierającej żywy rekombinowany wektor wirusowy, taki jak żywy rekombinowany wirus ospy, zawierający i eksprymujący in vivo przynajmniej jeden wspomniany immunogen, przy czym szczepionka DNA przeznaczona jest do pierwszego podawania bydłu, np. młodym cielętom mającym lub mogącym mieć matczyne przeciwciała przeciwko wspomnianemu patogenowi bydlęcemu, natomiast oparta na wektorze szczepionka wirusowa przeznaczona jest do podawania po szczepionce DNA temu samemu zwierzęciu, na przykład cielęciu, w celu zwiększenia (przypomnienia) odpowiedzi immunologicznej przeciwko wspomnianemu immunogenowi.

9. Zastosowanie według paragrafu 8, w którym szczepionka DNA przeznaczona jest do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko wspomnianemu immunogenowi lub immunogenom, np. swoistej wobec eksprymowanego immunogenu odpowiedzi limfocytów T pamięci IFNy+.

10. Zastosowanie według paragrafu 8 lub 9, w którym szczepionka DNA jest przeznaczona do podawania młodym zwierzętom lub bydłu od momentu urodzenia do 12 tygodnia życia włącznie, np. od momentu urodzenia do 6 tygodnia życia włącznie, np. od momentu urodzenia do 4 tygodnia życia włącznie, a zwłaszcza od momentu urodzenia do 3 tygodnia życia włącznie.

11. Zastosowanie według paragrafu 8, 9 lub 10, w którym żywa, oparta na wektorze szczepionka jest przeznaczona do podawania w okresie od około 2 tygodni do około 5 miesięcy po podaniu podstawowym, np. w okresie od około 3 do 6 tygodni, np. około 4 tygodni po podaniu szczepionki DNA.

12. Zastosowanie bydlęcego czynnika patogennego, wybranego spośród BRSV, bPI-3, BHV-1 oraz BVDV, w celu przygotowania inaktywowanej szczepionki przeznaczonej do szczepienia bydła przeciwko wspomnianemu czynnikowi patogennemu, przy czym bydło to, na przykład młode cielę mające lub mogące mieć matczyne przeciwciała przeciwko wspomnianemu patogenowi bydlęcemu, było uprzednio immunizowane przy użyciu szczepionki DNA, eksprymującej in vivo przynajmniej jeden immunogen pochodzący z tego samego czynnika patogennego, i rozwinęło indukowaną przez podstawową szczepionkę DNA swoistą odpowiedź immunologiczną, np. swoistą wobec eksprymowanego immunogenu odpowiedź komórkową angażującą limfocyty T pamięci IFNy+.

13. Zastosowanie według paragrafu 12, w którym inaktywowana szczepionka jest przeznaczona do podawania w okresie od około 2 tygodni do około 5 miesięcy, np. w okresie od około 3 do 6 tygodni, np. około 4 tygodni po podaniu bydłu szczepionki DNA.

14. Zastosowanie rekombinowanego wektora wirusowego, takiego jak wektor wirusa ospy, zawierającego i eksprymującego in vivo przynajmniej jedną sekwencję nukleotydową, kodującą przynajmniej jeden immunogen pochodzący z bydlęcego czynnika patogennego, wybranego spośród BRSV, bPI-3, BHV-1 oraz BVDV, w celu przygotowania żywej rekombinowanej szczepionki przeznaczonej do szczepienia bydła przeciwko czynnikowi patogennemu, przy czym bydło to, na przykład młode cielę mające lub mogące mieć matczyne przeciwciała przeciwko wspomnianemu patogenowi bydlęcemu, było uprzednio immunizowane przy użyciu szczepionki DNA, eksprymującej in vivo przynajmniej jeden ten sam immunogen, i rozwinęło indukowaną przez podstawową szczepionkę DNA odpowiedź immunologiczną, np. swoistą wobec eksprymowanego immunogenu odpowiedź komórkową angażującą limfocyty T pamięci IFNy+.

15. Zastosowanie według paragrafu 14 w którym żywa, wirusowa, oparta na wektorze szczepionka jest przeznaczona do podawania w okresie od około 2 tygodni do około 5 miesięcy, np. w okresie od około 3 do 6 tygodni, np. około 4 tygodni po podaniu bydłu szczepionki DNA.

16. Sposób szczepienia bydła oparty na trybie postępowania podstawowe-przypominające przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi bydlęcemu, w którym bydłu podaje się najpierw podstawową szczepionkę DNA, zawierającą i eksprymującą in vivo immunogen pochodzący ze wspomniaPL 215 173 B1 nego powyżej patogenu, a następnie stosuje się podawanie przypominające przy użyciu drugiego typu szczepionki, zawierającej ten sam immunogen.

17. Sposób według paragrafu 16, w którym podawanie przypominające przeprowadzane jest przy użyciu inaktywowanej szczepionki.

18. Sposób według paragrafu 16, w którym podawanie przypominające przeprowadzane jest przy użyciu szczepionki obejmującej rekombinowany, żywy wektor wirusowy, taki jak rekombinowany wirus ospy, zawierający i eksprymujący in vivo wspomniany powyżej immunogen.

19. Sposób według któregokolwiek z paragrafów od 16 do 18, w którym szczepionka DNA podawana jest młodemu cielęciu, które może mieć matczyne przeciwciała skierowane przeciwko czynnikowi patogennemu, przeciwko któremu skierowana jest immunizacja lub szczepienie.

20. Sposób według któregokolwiek z paragrafów od 16 do 18, w którym szczepionka DNA podawana jest młodemu zwierzęciu lub cielęciu od momentu urodzenia do 12 tygodnia życia włącznie, np. od momentu urodzenia do 6 tygodnia życia włącznie, np. od momentu urodzenia do 4 tygodnia życia włącznie, a zwłaszcza od momentu urodzenia do 3 tygodnia życia włącznie.

21. Sposób według któregokolwiek z paragrafów od 16 do 20, w którym podawanie przypominające przeprowadzane jest w okresie od około 2 tygodni do około 5 miesięcy po podawaniu podstawowym, np. w okresie od około 3 do 6 tygodni, np. około 4 tygodni po podawaniu podstawowym.

22. Sposób według któregokolwiek z paragrafów od 16 do 21, w którym przeprowadzane jest drugie podawanie przypominające, na przykład w momencie przenoszenia bydła lub cieląt do jednostek wykańczalniczych.

23. Sposób szczepienia bydła oparty na trybie postępowania podstawowe-przypominające przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi bydlęcemu, który obejmuje najpierw podawanie bydłu podstawowej szczepionki DNA, zawierającej sekwencję nukleotydową, kodującą i eksprymującą in vivo immunogen pochodzący ze wspomnianego powyżej patogenu, a następnie podawanie drugiego typu szczepionki prezentującej ten sam immunogen, np. inaktywowanej, osłabionej, podjednostkowej, lub rekombinowanej, żywej szczepionki wirusowej, korzystnie inaktywowanej szczepionki lub rekombinowanego żywego wektora wirusowego (takiego jak rekombinowany wirus ospy), zawierającego i eksprymującego in vivo wspomniany immunogen. Sposób ten może być zastosowany do młodych cieląt, które posiadają matczyne przeciwciała skierowane przeciwko czynnikowi patogennemu, przeciwko któremu skierowana jest immunizacja lub szczepienie.

Dysponując opisanymi szczegółowo powyżej korzystnymi wykonaniami niniejszego wynalazku, należy wziąć pod uwagę fakt, że wynalazek zdefiniowany na podstawie załączonych zastrzeżeń nie jest ograniczony przedstawionymi powyżej szczegółowymi rozwiązaniami, gdyż możliwe jest wprowadzenie wielu oczywistych modyfikacji, bez odbiegania od ducha i zakresu niniejszego wynalazku.

PL 215 173 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Merial <120> Szczepienie oraz immunizacja z wykorzystaniem trybu postępowania podstawowe-przypominające <130> 454313-3154.4WO <160> 59 <170> Patentln, wersja 3.2 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 1 gatctgcagc acgtgtctag aggatatcga attcgcggcc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 2 gatccgcggc cgcgaattcg atatcctcta gacacgtgct 40 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 3 ttggggaccc ttgattgttc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczny

PL 215 173 B1

<220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 4
ctgtaggaaa aagaagaagg c	2 X
<210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR
<400> 5 ctccatgtcg acttggggac ccttgattgt <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR	30
<400> 6 ctccatgtcg acctgtagga aaaagaagaa <210 7 <211> 30 <212> DNA ...... <213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR	30
<400> 7 ttgtcgacat ggccgctcgc ggcggtgctg <210 8 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR	30
<400> 8

PL 215 173 B1 gcagggcagc ggctagcgcg g 21 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 9 ctgcacgagc tccggttcta cgacattgac cgcgtggtca agacggactg ag 52 <210> 10 <211> 56 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 10 gatcctcagt ccgtcttgac cacgcggtca atgtcgtaga accggagctc gtgcag 56 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 11 aaaatttcga tatccgccgc ggggcgaccg gcgacaacg 39 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 12 ggaagatctt cagtccgtct tgaccacgcg gtc 33 <210> 13 <211> 37

PL 215 173 B1 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 13 tcgtgcctgc ggcgcaaggc ccgggcgcgc ctgtagt 37 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 14 ctagactac-a ggcgcgcccg ggccttgcgc cgcaggc 37 <210> 15 <21ł> 43 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<22 3> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 15 gcaccgctgc ccgagttctc cgcgaccgcc acgtacgact agt 43 <210> 16 <211> 43 . ..... ................

<212> DNA ' <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 16 ctagactagt cgtacgtggc ggtcgcggag aactcgggca gcg 43 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczny .

<220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR

PL 215 173 B1 <400> 17 aaaatttcga tatcccggcg ggggctcgcc gaggaggcg <210 18 <211> 32 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 18 ggaagatctc tagtcgtacg tggcggtcgc gg <210> 19 <2U> 33 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 19 tttctgcaga tgcaagggcc gacattggcc gtg <210 20 <211> 31 <212> DNA <2i3> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 20 tttctagatt agggcgtagc gggggcgggc g <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 21 aaaatttcga tatcccccgc gccgcgggtg acggtatac <210 22

PL 215 173 B1 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 22 ggaagatctt tagggcgtag cgggggcggg cgg 33 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 23 aaattttctg cagatggcga caacagceat gagg 34 <210 24 <211> 35 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 24 ttaaggatcc tcatttacta aaggaaagat tgttg 35 <210 25 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 25 aattttggat cctcatgtgg tggattfctcc tacatctac 39 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

PL 215 173 B1 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 26 aaaattcacg tgaacataac agaagaattt tatcaatc <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <4QO 27 acgcgtcgac atgtccaacc atacccatca tc <210 28 <211> 38 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PC® <400> 28 ttaaaatcta gattagatct gtgtagttga ttgatttg <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczny <220 ...... .......

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 29 ttttaaggat ccgctaaagc caagcccaca tcc <210 30 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <40 0 30 ttaaaatcta gattagatct gtgtagttga ttg

PL 215 173 B1

<210>	31
<211>	36
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220>
<223>	oligonukleotyd
<400>	31

cataccgtcg acatgaagaa actagagaaa gccctg

<210>	32
<211>	40
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220>
<223>	oligonukleotyd
<400>	32

cataccggat cctcaggctg catatgcccc aaaecatgtc <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 33 catgacgcgg ccgctatgaa gaaactagag aaagccctg

<210>	34
<211>	40
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220>
<223>	oli gonukleot yd
<400>	34

catgacagat ctttaggctg catatgcccc aaaecatgtc <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczny

PL 215 173 B1 <220>

<223> oligonukłeotyd jako starter do PC?, <400> 35 catgacgtcg acatgacgac tactgcattc ctg

<210	36
<211>	36
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220
<223·^	oligonukłeotyd
<400>	36

catgacagat ettcaacgtc ccgaggtcat ttgttc

<210>	37
<211>	36
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220
<223>	oligonukłeotyd
<400>	37

catgacgcgg ccgctatgac gactactgca ttcctg

<210	36
<211>	35
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220
<223>	oli gonukle otyd
<400>	38

catgacagat ctcaagcgaa gtaatcccgg tggtg <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukłeotyd jako starter do PCR <400> 39 actgtatcta gaatgaccac cacagctttc ctaatc

PL 215 173 B1 <210 40 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 40 actgtaagat ctttaagtat tcactccagc acccatagc 39 <210> 41 <211> 41 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 41 catgacgcgg ccgccctatg accaccacag ctttcctaat c 41 <210 42 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 42 catgacagat ctttatatga actctgagaa gtagtc 36 <210 43 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <40 0 43 cataccgtcg acatgagaaa gaaattggag aaggcactg 39 <210 44 <211> 39 <212> DNA

PL 215 173 B1

<213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 44
cataccggat cctcatgctg catgagcacc aaaccatgc	39
<210> 45 <211> 42 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 45 catgacgcgg ccgctatgag aaagaaattg gagaaggcac tg	42
<210> 46 <211> 39 <2ł2> DNA <213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 46 cataccagat cttcatgctg catgagcacc aaaccatgc	39
<210> 47 <2łl> 39 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 47 catatcgtcg acatggaata ttggaaacac acaaacagc	39
<210 48 <211> 38 <212> DNA <213> Sztuczny <220> <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 48

PL 215 173 B1 ccitgacgaVa tctagctgca

<210>	49
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220
<223>	oligonukleotyd
<4 00>	49

catactgcgg ccgctttaat

<210 50
<211>	35
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220>
<223>	oligonukleotyd
<400>	50

catatcgata tctagctgca

<210>	51
<211>	36
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220
<223>	oligonukleotyd
<400>	51

catatcgtcg acatgatcat <210 52 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd <400 52 catgaccaga tcttattgtc <210> 53 <211> 42 <212> DNA gtttttcgga acttctgt jako starter do PCR tcaagagaac aat jako starter do PCR gtttttcgga acttc jako starter do PCR cacaaacaca atcata jako starter do PCR tatttgtcag tatata

PL 215 173 B1 <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 53 catactgcgg ccgctcaaat agacataaca aaactgcaac gt 42 <210> 54 <211> 41 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400> 54 catatcgata tctatgcact agattgatac caacttccaa c 41 <210 55 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 55 catatcgtcg acatgtggct gcagaacctg cttctc 36 <210> 56 <21ł> 34 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 56 catgaccaga tcttcacttc tgggctggtt ccca 34 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczny <220 <223> oligonukleotyd jako starter do PCR <400 57

PL 215 173 B1 aattttggat cctcagattc

<210>	56
<211>	34
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220>
<223>	oligonukleotyd
<400>	58

aaattttgtc gacatggctc

<210>	59
<211>	35
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220>
<223>	oligonukleotyd
<400>	59

ttaaggatcc tcacagttcc cacgattttt attagaagc jako starter do PCR ttagcaaggt caaa jako starter do PCR

Claims (17)

1. Zestaw do przeprowadzania szczepienia przeciwko patogenowi bydła oparty na trybie postępowania podstawowe-przypominające zawierający:

(a) pierwszą szczepionkę podstawową, przy czym pierwsza szczepionka podstawowa obejmuje szczepinkę DNA zawierającą cząsteczkę/cząsteczki kwasu nukleinowego kodującą i wyrażającą in vivo u bydła przynajmniej jeden immunogen z patogenu bydła, przy czym immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła), lub jego epitop lub ich kombinację, i (b) drugą szczepionkę przypominającą, która to druga szczepionka przypominająca przeciwko patogenowi bydła jest inna niż pierwsza szczepionka podstawowa, ale zawiera lub wyraża przynajmniej jeden immunogen patogenu bydła, który jest tym samym immunogenem patogenu bydła jak wyrażany w pierwszej szczepionce podstawowej, przy czym drugą szczepionkę przypominającą stanowi inaktywowany patogen, którym to patogenem jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV);

przy czym (a) i (b) są w oddzielnych pojemnikach, ewentualnie zaopatrzonych w instrukcje o sposobie podawania lub zastosowaniu;

przy czym patogenem bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV).

2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że (a) i (b) są w oddzielnych pojemnikach w tym samym opakowaniu.

3. Zestaw według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że szczepionka DNA zawiera (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu (DMRIE).

PL 215 173 B1

4. Zastosowanie czynnika patogennego bydła, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV) do wytwarzania szczepionki podstawowej DNA obejmującej plazmid zawierający i wyrażający in vivo u bydła co najmniej jeden immunogen tego czynnika patogennego bydła, którym to immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub jego epitop lub ich kombinacja, i do wytwarzania drugiej szczepionki zawierającej ten czynnik patogenny bydła w formie inaktywowanej, przy czym czynnikiem patogennym bydła jest wirus układu oddechowego bydła (BRSV), w którym szczepionka podstawowa jest przeznaczona do podawania bydlęciu jako pierwsza, a inaktywowana szczepionka jest podawana po szczepionce podstawowej DNA temu samemu bydlęciu w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu immunogenowi.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że szczepionka podstawowa DNA jest przeznaczona do indukowania u bydła odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu immunogenowi (immunogenom).

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że odpowiedzią immunologiczną przeciwko immunogenowi (immunogenom) jest odpowiedź komórkowa angażująca pamięć limfocytów T eksprymujących interferon gamma+ dla wyrażanego immunogenu.

7. Zastosowanie według zastrz. 4-6, znamienne tym, że szczepionka podstawowa DNA jest przeznaczona do podawania młodemu bydłu od ocielenia do 12 tygodnia włącznie.

8. Zastosowanie według zastrz. 4-7, znamienne tym, że druga szczepionka jest przeznaczona do podawania od 2 tygodni do 5 miesięcy po podaniu szczepionki podstawowej DNA.

9. Zastosowanie według zastrz. 4-8, znamienne tym, że bydłem jest młode ciele które ma matczyne przeciwciała skierowane przeciwko temu patogenowi bydła.

10. Zastosowanie według zastrz. 4-9, znamienne tym, że szczepionka DNA zawiera (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu (DMRIE).

11. Zastosowanie czynnika patogennego bydła, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV) do wytwarzania inaktywowanej szczepionki do szczepienia przeciw temu czynnikowi patogennemu bydła, przy czym bydło było wcześniej immunizowane szczepionką DNA wyrażającą in vivo co najmniej jeden immunogen tego samego czynnika patogennego, którym to immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub jego epitop lub ich kombinacja, i u bydła wytworzyła się specyficzna odpowiedź immunologiczna na szczepionkę podstawową

DNA.

12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że odpowiedzią immunologiczną jest odpowiedź komórkowa angażująca pamięć limfocytów T eksprymujących interferon gamma+ dla wyrażanego immunogenu.

13. Zastosowanie według zastrz. 11 albo 12, znamienne tym, że inaktywowana szczepionka jest przeznaczona do podawania od 2 tygodni do 5 miesięcy po podaniu bydlęciu szczepionki DNA.

14. Zastosowanie według zastrz. 11-12, znamienne tym, że bydłem jest młode ciele które ma matczyne przeciwciała skierowane przeciwko temu patogenowi bydła.

15. Zastosowanie według zastrz. 11-14, znamienne tym, że szczepionka DNA zawiera (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradecylooksy)-1-propan amonu (DMRIE).

16. Szczepienie oparte na trybie postępowania podstawowe-przypominajace do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu BRSV (syncytialnemu wirusowi układu oddechowego bydła), w którym szczepionka podstawowa DNA obejmuje plazmid zawierający i wyrażający in vivo u bydła, co najmniej jeden immunogen czynnika patogennego bydła, przy czym czynnikiem patogennym bydła jest BRSV, a imnmunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub jego epitop lub ich kombinacja, i przy czym szczepionka przypominająca zawiera czynnik patogenny bydła w formie inaktywowanej, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydla (BRSV), oraz przy czym szczepionka podstawowa DNA jest przeznaczona do podawania bydlęciu jako pierwsza, a inaktywowana szczepionka jest przeznaczona do podawania po szczepionce podstawoPL 215 173 B1 wej DNA i dla tego samego bydlęcia dla wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu immunogenowi.

17. Inaktywowana szczepionka do zastosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu BRSV, przy czym inaktywowana szczepionka obejmuje czynnik patogenny bydła, którym to czynnikiem patogennym bydła jest syncytialny wirus układu oddechowego bydła (BRSV), w której czynnik patogenny jest inaktywowany, przy czym inaktywowana szczepionka jest przeznaczona do podawania bydlęciu, które uprzednio było immunizowane szczepionką DNA wyrażająca in vivo co najmniej jeden immunogen tego samego czynnika patogennego, przy czym immunogenem jest BRSV F (białko F syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub BRSV N (białko N syncytialnego wirusa układu oddechowego bydła) lub jego epitop lub ich kombinacja, i u bydlęcia wytworzyła się specyficzna odpowiedź immunologiczna na podstawową szczepio n-