TWI733653B

TWI733653B - Ｆｍｄｖ重組疫苗及其用途

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Publication number: TWI733653B
Application number: TW104131548A
Authority: TW
Inventors: 真克利斯多夫亞多納特; 迪潔貝拉札海漢那斯; 泰斯合麥班遜; 有為蔣; 賈斯汀維德諾; 費德里克瑞那德
Original assignee: 美商百靈佳殷格翰動物保健美國有限公司
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2021-07-21
Also published as: MA40151B2; TW201625297A; KR20170058430A; CN107073100B; CN107073100A; JO3600B1; AP2017009834A0; KR102526219B1; US10010605B2; BR112017005833A2; RU2745373C2; AU2015320673B2; AR102006A1; JP6931327B2; ZA201701851B; JP2017530124A; RU2017113571A; WO2016049209A1; MA40151A1; AU2019210537A1

Abstract

本發明涵蓋FMDV疫苗或組合物。該疫苗或組合物可為含有FMDV抗原之疫苗或組合物。本發明亦涵蓋編碼及表現可用於保護動物(特定言之綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物)免受FMDV侵害之FMDV抗原、抗原決定基或免疫原之重組載體。

Description

FMDV重組疫苗及其用途

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2014年9月23日申請之美國臨時申請案62/054,073之優先權。

本發明係關於用於對抗動物中之口蹄病病毒(FMDV)感染之組合物。本發明提供包含FMDV抗原之醫藥組合物、針對FMDV之疫苗接種方法及適用於此類方法及組合物之套組。

口蹄病(FMD)是感染家畜之最具毒性及傳染性的疾病中之一者。此疾病在世界上許多國家是地方特有的疾病，尤其在非洲、亞洲及南美洲。另外，流行性傳染病爆發會周期性地出現。國家中存在此疾病具有極嚴重經濟後果，其肇因於生產率損失、經感染畜群體重及產奶量的損失及加諸在此等國家之貿易禁運。對抗此疾病所採取之措施由以下組成：嚴格執行進口限制、衛生控制及檢疫、撲殺患病動物及使用不活化疫苗之疫苗接種計畫，該等措施係作為國家或區域層面上之預防性措施，或當流行性傳染病爆發發生時周期性措施。

FMD的特徵在於其具有：短暫潛伏期、高度傳染性性質、在口內及足部上會形成潰瘍，且有時會造成幼齡動物死亡。FMD會感染多種動物物種，特定言之牛、豬、綿羊及山羊。造成此疾病之病原為屬於小核糖核酸病毒科之口蹄病病毒屬之核糖核酸(RNA)病毒(Cooper等人，Intervirology,1978,10,165-180)。目前，已知至少七種類型之口蹄病病毒(FMDV)：歐洲型(A、O及C)、非洲型(SAT1、SAT2及SAT3)及亞洲型(Asia 1)。許多亞型亦已識別出來(Kleid等人Science(1981),214,1125-1129)。

FMDV為約25nm直徑之裸二十面體病毒，含有由約8500個核苷酸組成之單股RNA分子，具有正極性。此RNA分子包含單一開放閱讀框架(ORF)，其編碼其中包括含有亦稱為蛋白質P1或P88之衣殼前驅體之單一聚合蛋白。蛋白質P1在其胺基末端經十四烷基化。在成熟過程期間，蛋白P1會被蛋白酶3C切解為稱為VP0、VP1及VP3之三種蛋白質(或分別為1AB、1D及1C；Belsham G.J.,Progress in Biophysics and Molecular Biology,1993,60,241-261)。在病毒粒子中，蛋白質VP0隨後切解為兩種蛋白質，VP4及VP2(或分別為1A及1B)。蛋白質VP0轉化為VP4及VP2，及形成成熟病毒粒子之機制尚未得知。蛋白質VP1、VP2及VP3具有約26,000Da之分子量，而蛋白質VP4較小，約8,000Da。

衣殼蛋白質之簡單組合會形成原聚體或5S分子，其為FMDV衣殼之基本成分。此原聚體隨後會錯合成五聚體以形成12S分子。該病毒粒子是藉由組裝12個12S五聚物將基因組RNA分子衣殼化後產生的，因此構成146S粒子。病毒衣殼亦可在其內部不存在RNA分子的情況下形成(下文稱為「空衣殼」)。空衣殼亦可以粒子70S表示之。空衣殼之形成可在病毒複製期間自然地發生或可藉由化學處理人工方式產生。

已對天然的空衣殼進行了一些研究。特定言之，Rowlands等人(Rowlands等人，J.Gen.Virol.,1975,26,227-238)已證實A10口蹄病之病毒粒子主要包含四種蛋白質VP1、VP2、VP3及VP4。比較之下，天然的空衣殼(非藉由重組獲得但純化自A10口蹄病病毒之培養物)基本上含有未切解蛋白質VP0；Rweyemamu(Rweyemamu等人，Archives of Virology,1979,59,69-79)描述與A-Pando口蹄病病毒一致之結果。在存在Tris-EDTA之情況下經透析之後及在離心之後所獲得之人工空的衣殼不含蛋白質VP4。根據Rowlands等人，此等人工衣殼略微具有免疫原性，且天然空衣殼僅在藉由甲醛處理以使其穩定化之後才具免疫原性，而天竺鼠中藉由天然空衣殼誘導之抗體反應仍然不穩定，如作者所述。此外，Rowlands等人及Rweyemamu等人不同意使天然空衣殼穩定化之必要性。以Rweyemamu等人而言，未經甲醛處理不會對天然空衣殼之抗原性水平造成不利。免疫原性僅藉由天竺鼠中之中和抗體誘導作用加以測試。

將藉助於昆蟲細胞中重組桿狀病毒編碼衣殼蛋白質之前驅體P1之基因的表現相比於編碼與大腸桿菌中蛋白酶3C相關之P1之基因的表現(Grubman等人，Vaccine,1993,11,825-829；Lewis等人，J.Virol.,1991,65,6572-6580)。大腸桿菌中P1及3C之共表現會導致空衣殼70S之組裝。此兩種構築體之表現產物在天竺鼠及豬中會產生中和抗體。P1/桿狀病毒結構所獲得之效價較低。此等相同表現產物會誘導豬中部分保護。然而，一些經保護免於疾病之豬無法保護免於攻毒用病毒(challenge virus)之複製。然而，大腸桿菌表現系統不會使蛋白質十四烷基化，且蛋白酶3C對此細胞為毒性的。Lewis等人結論是，動物中最大保護所需的病毒之構成及衣殼之結構相關之基本問題尚未得解答。此外，Grubman等人表明，需要在調配疫苗之前使空衣殼穩定化；在這此觀點上，其等承認藉由從病毒培養物萃取所得之空衣殼所遇到的問題(參見上文)。

亦可藉由使用病毒載體(即疱疹病毒或牛痘病毒)獲得含有一些或所有蛋白質P1之融合蛋白。CA-A-2,047,585尤其描述用於生產融合蛋白之牛類動物疱疹病毒，該融合蛋白含有與此牛類動物疱疹病毒之醣蛋白gpIII融合之口蹄病病毒之肽序列(結合至P1之胺基酸200至213的P1之胺基酸141至158)。病毒載體亦已用於表現經穩定化之FMDV空衣殼(US 7,531,182)。最近，植物已作為產生FMDV抗原之來源進行研究(US 2011/0236416)。

為試圖設計有效對抗FMD之疫苗，業已發展出許多假設、研究途徑及建議。現今，市場上僅有之疫苗是含有失活的病毒。因為歐洲FMD之爆發係與疫苗製造中的缺點具有相關性(King,A.M.Q.等人，1981,Nature 293：479-480)，所以存在關於FMDV疫苗之安全性之擔憂。不活化疫苗無法提供長期免疫性，因此需要每一年，或在流行性傳染病爆發之情況下更頻繁給予之強化注射。另外，不活化疫苗生產期間之不完全不活化及/或病毒遺漏相關聯的風險是存在的(King,A.M.Q.，同上)。此項技術中之一個目標為構築缺乏感染性FMDV基因組之構形性適當免疫原，以製造有效且安全之疫苗。

業經報導，母源抗體(MDA)能夠抑制小牛(2年齡以下之牛)對抗FMD之疫苗接種之反應(Graves,1963,Journal of Immunology 91：251-256；Brun等人，1977,Developments in Biological Standardisation,25：117-122)。

考慮動物(包括人類，儘管罕見)對FMDV之易感性，預防FMDV感染及保護動物之方法為必需的。因此，需要有對抗FMDV之更有效且穩定之疫苗。

本發明提供以下：包含抗原FMDV多肽及其片段及變異體之組合物或疫苗，及包含可表現FMDV多肽及其片段及變異體之重組病毒載體之組合物或疫苗。抗原及其片段及變異體具有免疫原性及保護特性。FMDV抗原可由昆蟲細胞中之桿狀病毒表現載體產生。FMDV抗原可經修飾以增強FMDV空衣殼或FMDV VLP(病毒樣粒子)之穩定性。重組病毒載體可為表現FMDV抗原之腺病毒載體。

抗原多肽及其片段及變異體或重組病毒載體可調配至疫苗及/或醫藥組合物中。此類疫苗或組合物可用於對動物接種疫苗，且提供對抗同源及異源FMDV菌株之保護。

本發明提供習知動物及母源抗體陽性(MDA陽性)動物中對抗FMDV感染之增強型保護的方法。本發明亦提供包含至少一個抗原多肽或其片段或變異體及使用說明書之套組。

以舉例方式給出，但並非意欲將本發明僅限制於描述之特定實施例之以下實施方式可與隨附圖式結合而最佳地理解，其中：圖1描繪概述DNA及蛋白質序列之表。

圖2表示根據3C之表現之FMDV聚合蛋白及方法。

圖3描繪pMEB097之質體圖譜。

圖4描繪MacMEB097之電子顯微術結果。

圖5描繪A24菌株之FMDV衣殼蛋白之西方墨點法結果。

圖6A及6B描繪BacMEB099之電子顯微術及特異性ELISA。

圖7A-7D描繪蛋白質序列之序列比對。

圖8描繪FMDV VLP。

圖9描繪平均FMDV A24 Cruzeiro中和抗體效價之演變。

圖10描繪FMDV A24 Cruzeiro中和抗體效價。

圖11A及11B描繪平均FMDV A24 Cruzeiro中和抗體效價之演變。

圖12A-12C描繪攻毒之後的平均直腸溫度之演變。

圖13描繪在存在或不存在熱或酸下在具有或不具有共價籠突變之情況下之A24 Cruzeiro VLP之EM分析。

圖14描繪在加熱之後的A24 Cruzeiro血清型之具有或不具有共價籠突變之VLP之ELISA分析。

圖15描繪隨時間推移儲存於5℃下之具有或不具有共價籠突變之A24 Cruzeiro VLP之ELISA分析。

圖16描繪顯示O1 Manisa共價籠VLP對熱具抗性之ELISA結果及EM圖片。

圖17描繪顯示酸(上圖)及熱(下圖)中之O1 Manisa共價籠VLP穩定性之ELISA結果。

圖18A描繪疫苗接種及分析方案。圖18B描繪針對FMD Asia1 Shamir及FMD A22 Iraq之中和抗體效價之演變。

圖19A描繪體液反應(記憶B細胞偵測)方案。圖19B描繪Asia Shamir共價籠及Iraq A22共價籠VLP血清學資料。

圖20描繪第27天時FMDV VLP疫苗接種動物中之B細胞ELISPOT檢定。

圖21描繪第43天時FMDV VLP疫苗接種動物中之B細胞ELISPOT檢定(量測B記憶細胞)。

圖22描繪第27天時FMDV VLP疫苗接種動物中之特異性γ干擾素(IFNγ)分泌細胞檢定。

圖23描繪第42天根據組之FMDV SVN log10效價。

圖24描繪經研究過程(第0天-第42天)之平均FMDV VN log10效價。

圖25描繪質體pAD3027圖譜。

圖26描繪vAD3027之西方墨點法。

本發明提供以下各物：包含FMDV多肽、抗原及其片段及變異體之組合物，及包含可表現引發動物中免疫原性反應之FMDV抗原之重組病毒載體之組合物。抗原多肽或其片段或變異體係藉由昆蟲細胞中之桿狀病毒表現載體所產生。重組病毒載體為表現FMDV抗原之腺病毒載體。抗原多肽或片段或變異體或表現抗原之重組病毒載體可調配至疫苗或醫藥組合物中且用於引發或刺激動物中之保護反應。在一個實施例中，多肽抗原為FMDV P1、VP2或3C多肽或其活性片段或變異體。FMDV抗原可經修飾以增強FMDV空衣殼或FMDV VLP(病毒樣粒子)之穩定性。

要體認本發明抗原多肽可為全長多肽或其活性片段或變異體。「活性片段」或「活性變異體」意指仍保留多肽之抗原性質的片段或變異體。因此，本發明涵蓋任何可引發動物中免疫原性反應之FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原。FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原可為任何FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原，諸如(但不限於)引發、誘發或刺激動物，諸如綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物中之反應之蛋白質、肽或其片段或變異體。

特定FMDV抗原多肽包括P1、VP2及3C。FMDV為約25nm直徑之無包膜二十面體病毒，含有由約8500個核苷酸組成之單股RNA分子，具有正極性。此RNA分子包含單一開放閱讀框架(ORF)，其編碼尤其含有亦稱為蛋白質P1或P88之衣殼前驅體之單一聚合蛋白。蛋白質P1在其胺基末端經十四烷基化。在成熟過程中，蛋白質P1藉由蛋白酶3C切解為稱為VP0、VP1及VP3之三種蛋白質(或分別為1AB、1D及1C；Belsham G.J.,Progress in Biophysics and Molecular Biology,1993,60,241-261)。在病毒粒子中，蛋白質VP0隨後切解為兩種蛋白質，VP4及VP2(或分別為1A及1B)。蛋白質VP1、VP2及VP3具有約26,000Da之分子量，而蛋白質VP4較小，為約8,000Da。FMDV序列亦描述於US 7,527,960及US 7,531,182中，該等文獻全文併入本文中。

本發明係關於牛類動物、綿羊類動物、山羊類動物或豬類動物疫苗或組合物，其可包含有效量之重組FMDV抗原或表現FMDV抗原之重組病毒載體，及醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑。

在一些實施例中，疫苗另外包含佐劑，諸如美國專利7371395中所述之水包油(O/W)乳液。

在其他實施例中，佐劑包括EMULSIGEN、氫氧化鋁、皂素及CpG，或其組合。

在一些實施例中，動物中之反應為保護免疫反應。

「動物」意欲為哺乳動物、禽類及其類似者。動物或宿主包含哺乳動物及人類。動物可選自由以下組成之群：馬類動物(例如馬)、犬類動物(例如狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼)、貓類動物(例如獅、虎、家貓、野貓、其他大貓及其他貓科動物，包括獵豹及山貓)、綿羊類動物(例如綿羊)、牛類動物(例如牛、母牛)、豬類動物(例如豬)、山羊類動物(例如山羊)、禽類動物(例如雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、野雞、鸚鵡、雀、鷹、烏鴉、鴕鳥、鴯鶓及食火雞)、靈長類動物(例如原猴、眼鏡猴、猴、長臂猿、猿)及魚。術語「動物」亦包括所有發育階段，包括胚胎及胎兒階段之個體動物。

除非另外解釋，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。除非上下文另外明確指出，否則單數術語「一」及「該」包括複數個提及物。類似地，除非上下文另外明確指示，否則字語「或」意欲包括「及」。

應注意在本揭示內容及尤其是申請專利範圍及/或章節中，諸如「包含」及其類似形式之術語可具有美國專利法中賦予其之含義，例如其可意謂「包括」及其類似形式；且諸如「基本上由……組成」之術語具有美國專利法中賦予其之含義，例如其容許未明確列出之元素，但不包括可見於先前技術中或影響本發明之基本或新穎特性之元素。

本發明之抗原多肽能夠保護免受FMDV侵害。亦即其能夠刺激動物中之免疫反應。「抗原」或「免疫原」意謂誘發宿主動物中之特異性免疫反應之物質。抗原可包含經殺死、減毒或活的整個生物；生物之子單元或部分；含有具有免疫原性特性之插入物之重組載體；能夠在呈現至宿主動物時誘發免疫反應之DNA片塊或片段；多肽、抗原決定基、半抗原或其任何組合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。

如本文所用，術語「免疫原性蛋白質、多肽或肽」包括在在向宿主投與後，其能夠引起針對蛋白質之體液及/或細胞類型之免疫反應之意義上為免疫活性之多肽。較佳地，蛋白質片段使得其具有與總蛋白質實質上相同之免疫活性。因此，本發明之蛋白質片段包含至少一個抗原決定基或抗原決定因素，或基本上由其組成，或由其組成。如本文所用，「免疫原性」蛋白質或多肽包括蛋白質之全長序列、其類似物或其免疫原性片段。「免疫原性片段」意謂包括一或多個抗原決定基且因此引發上文所述之免疫反應之蛋白質之片段。此類片段可使用任何數目之此項技術中熟知之抗原決定基定位技術鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編，1996)。舉例而言，藉由在固體載體上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白分子之部分)及當該等肽仍附著至該等載體時使該等肽與抗體反應可測定線性抗原決定基。此類技術為此項技術中已知的且描述於例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人，1984,PNAS USA,81(13)：3998-400；Geysen等人，1985,PNAS USA,82(1)：178-82中。類似地，藉由測定胺基酸之空間構象(諸如藉由例如X光晶體學及二維核磁共振)來容易地確定構象抗原決定基。例如參見上述Epitope Mapping Protocol。尤其適用於小泰勒蟲(T.parva)之蛋白質中之方法充分描述於PCT/US2004/022605中，其以全文引用之方式併入本文中。

如所論述，本發明涵蓋抗原多肽之活性片段及變異體。因此，術語「免疫原性蛋白質、多肽或肽」另外涵蓋序列之缺失、添加及取代，只要多肽用於產生如本文中所定義之免疫反應。術語「保守變異」指示胺基酸殘基由另一種生物學上類似之殘基置換，或核酸序列中核苷酸之置換，使得經編碼胺基酸殘基不變化或為另一種生物學上類似之殘基。就此而言，尤其較佳取代將一般為在本質上保守的，亦即發生在胺基酸家族內之彼等取代。舉例而言，胺基酸一般分成四個家族：(1)酸性--天冬胺酸及麩胺酸；(2)鹼性--離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性--丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及(4)不帶電極性--甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有時分類為芳族胺基酸。保守變異之實例包括一個疏水性殘基，諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸取代另一疏水性殘基，或一個極性殘基取代另一極性殘基，諸如精胺酸取代離胺酸，麩胺酸取代天冬胺酸，或麩醯胺酸取代天冬醯胺，及其類似者；或藉由將不對生物活性具有重大影響的結構相關胺基酸類似保守地置換胺基酸。與參考分子具有實質上相同之胺基酸序列，但具有不實質上影響蛋白質之免疫原性之微小胺基酸取代之蛋白質因此在參考多肽之定義內。由此等修飾產生之所有多肽包括於本文中。術語「保守變異」亦包括使用經取代胺基酸替代未經取代親本胺基酸，其條件為針對經取代多肽培養之抗體亦與未經取代多肽進行免疫反應。

術語「抗原決定基」係指特異性B細胞及/或T細胞反應之抗原或半抗原上之位點。術語亦可與「抗原決定因素」或「抗原決定因素位點」互換使用。識別相同抗原決定基之抗體可在顯示一個抗體阻斷另一抗體與目標抗原之結合之能力之簡單免疫檢定中鑑別。

組合物或疫苗之「免疫反應」為在宿主中產生對相關組合物或疫苗之細胞及/或抗體介導免疫反應。通常，「免疫反應」包括(但不限於)以下效應中之一或多者：產生特異性針對包括於相關組合物或疫苗中之一或多個抗原之抗體、B細胞、輔助T細胞及/或細胞毒性T細胞。宿主較佳將展現治療或保護性免疫學反應以便增強對新感染之抵抗力及/或降低疾病之臨床嚴重性。此類保護將藉由通常由感染宿主顯示之症狀之減少或缺乏、更快速恢復時間及/或感染宿主中降低之病毒效價展示。

在定義中亦包括合成抗原，例如多抗原決定基、側翼抗原決定基及其他重組或合成衍生之抗原。參見例如Bergmann等人，1993；Bergmann等人，1996；Suhrbier,1997；Gardner等人，1998。出於本發明之目的，免疫原性片段將通常包括分子之至少約3個胺基酸、至少約5個胺基酸、至少約10-15個胺基酸或約15-25胺基酸或更多胺基酸。片段長度不存在臨界上限，其可包含蛋白質序列之幾乎全長，或甚至包含蛋白質之至少一個抗原決定基之融合蛋白。

因此，表現抗原決定基之聚核苷酸之最小結構為其包含編碼FMDV多肽之抗原決定基或抗原決定因素之核苷酸，或基本上由其組成，或由其組成。編碼FMDV多肽之片段之聚核苷酸可包含編碼多肽之序列之最少15個核苷酸、約30-45個核苷酸、約45-75或至少57、87或150個相連或連續核苷酸，或基本上由其組成，或由其組成。

術語「核酸」及「聚核苷酸」係指直鏈或分支鏈、單股或雙股或其混雜物之RNA或DNA。術語亦涵蓋RNA/DNA混雜物。以下為聚核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組聚核苷酸、分支鏈聚核苷酸、質體、載體、任何序列之經分離DNA、任何序列之經分離RNA、核酸探針及引物。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物、尿嘧啶基、其他糖及鍵聯基團，諸如氟核糖及硫醇鹽，及核苷酸分支。核苷酸之序列可在聚合之後經進一步修飾，諸如藉由與標記組分共軛。包括於此定義中之其他類型的修飾為caps，藉由類似物取代天然存在之核苷酸中的一或多者，及引入將聚核苷酸連接至蛋白質、金屬離子、標記組分、其他聚核苷酸或固體載體之方法。聚核苷酸可藉由化學合成獲得或衍生自微生物。

術語「基因」廣泛用於指與生物功能相關之聚核苷酸之任何片段。因此，基因在基因組序列中包括內含子及外顯子，或在其表現所需的cDNA及/或調節序列中僅包括編碼序列。舉例而言，基因亦指表現mRNA或功能RNA，或編碼特定蛋白質，且包括調節序列之核酸片段。

本發明進一步包含編碼FMDV抗原、抗原決定基或免疫原之聚核苷酸之互補股。互補股可為聚合的且具有任何長度，且可含有任何組合形式的去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及類似物。

術語「蛋白質」、「肽」、「多肽」及「多肽片段」在本文中可互換使用以指任何長度之胺基酸殘基之聚合物。聚合物可為直鏈或分支鏈的，其可包含經修飾胺基酸或胺基酸類似物，且其可雜有除胺基酸以外之化學部分。該等術語亦涵蓋已天然或藉由介入來修飾之胺基酸序列；例如，雙硫鍵形成、糖基化作用、脂化作用、乙醯化作用、磷酸化作用，或任何其他操作或修飾(諸如與標記之組分共軛)。

「經分離」生物組分(諸如核酸或蛋白質或細胞器)係指已與組分天然地存在之生物之細胞中之其他生物組分，例如其他染色體及染色體外DNA及RNA、蛋白質及細胞器實質上分離或與其純化遠離之組分。已「經分離」之核酸及蛋白質包括藉由標準純化方法純化之核酸及蛋白質。術語亦包涵藉由重組技術以及化學合成製備之核酸及蛋白質。

如本文所用之術語「純化」不要求絕對純度；相反，其意欲為相對術語。因此，舉例而言，純化多肽製劑為其中多肽比其天然環境中之多肽更富集之多肽製劑。亦即多肽與細胞組分分離。「實質上純化」意欲使得多肽表示若干實施例，細胞組分或材料之至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%或98%以上已經移除。同樣，多肽可經部分純化。「部分純化」預期細胞組分或材料之小於60%經移除。上述情況適用於聚核苷酸。本文所揭示之多肽可藉由此項技術中已知之任一方法純化。

如上文所指出，抗原多肽或其片段或變異體為由昆蟲細胞中之桿狀病毒表現載體活體外或由病毒載體活體內產生之FMDV抗原多肽。本發明亦涵蓋揭示之聚核苷酸及藉由其編碼之多肽之片段及變異體。「片段」預期為聚核苷酸之一部分或藉由其編碼之抗原胺基酸序列之一部分。聚核苷酸之片段可編碼保留天然蛋白質之生物活性且因此具有如本文中其他地方所述之免疫原性活性之蛋白質片段。多肽序列之片段保留誘發動物中之保護免疫反應之能力。

「變異體」欲意謂實質上類似之序列。對於聚核苷酸，變異體包含天然聚核苷酸內之一或多個位點處之一或多個核苷酸之缺失及/或添加及/或天然聚核苷酸中之一或多個位點處之一或多個核苷酸之取代。如本文所用，「天然」聚核苷酸或多肽分別包含天然存在之核苷酸序列或胺基酸序列。本發明之特定聚核苷酸(亦即參考聚核苷酸)之變異體亦可藉由比較藉由變異體聚核苷酸編碼之多肽與藉由參考聚核苷酸編碼之多肽之間的序列一致性%評估。「變異體」蛋白質欲意謂藉由天然蛋白質中之一或多個位點處之一或多個胺基酸之缺失或添加及/或天然蛋白質中之一或多個位點處之一或多個胺基酸之取代衍生自天然蛋白質之蛋白質。本發明涵蓋之變異體蛋白質為生物學上活性的，亦即其具有引發免疫反應之能力。

在一態樣中，本發明提供來自綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物FMDV分離株之FMDV多肽。在另一態樣中，本發明提供具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之序列之多肽及其變異體或片段。

在另一態樣中，本發明係關於改進FMDV空衣殼或FMDV VLP(病毒樣粒子)之溫度及/或酸穩定性。空衣殼之溫度及/或酸穩定性有利地藉由形成二硫橋鍵確保。

特定言之，此改進藉由用衣殼蛋白質VP2(衍生自P1)之結構蛋白之多肽序列中之半胱胺酸置換初始序列之胺基酸獲得，例如在胺基酸序列SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16(FMDV A24菌株、FMDV O1 manisa菌株、FMDV Iraq菌株或FMDV Asia菌株之P1)之位置179處。一般情況下，此胺基酸之位置與衍生自其他口蹄病病毒之VP2蛋白質中一致(在實例中所述之菌株之情形下情況尤其如此)。含有此胺基酸之區域對應於α螺旋。為了鑑別或證實待突變之胺基酸，考慮序列在不同FMDV中在結構上非常保守之事實，此區域之胺基酸序列與序列SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16上之對應區域(例如約10個或略微更多--例如10至20個--胺基酸)比對。待突變之胺基酸位於FMDV P1(SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16)之位置179處。按照慣例，對應於起始密碼子之甲硫氨酸(其不存在於天然序列中且因此添加)編號為1。

此外，來自綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物之 FMDV多肽之同源物意欲在本發明之範疇內。如本文中所使用，術語「同源物」包括直系同源物、類似物及旁系同源物。術語「類似物」具有相同或類似功能，但在不相關生物中分開進化之兩種聚核苷酸或多肽。術語「直系同源物」係指來自不同物種，但藉由物種形成自共同祖先基因進化之兩種聚核苷酸或多肽。通常，直系同源物編碼具有相同或類似功能之多肽。術語「旁系同源物」係指藉由基因組內之複製相關之兩種聚核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同功能，但此等功能可相關。野生型FMDV多肽之類似物、直系同源物及旁系同源物可藉由轉譯後修飾、藉由胺基酸序列差異或藉由兩者不同於野生型FMDV多肽。特定言之，本發明之同源物將一般展現與全部或部分野生型FMDV多肽或聚核苷酸序列之至少80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%序列一致性，且將展現類似功能。變異體包括對偶基因變異體。術語「對偶基因變異體」係指含有導致蛋白質之胺基酸序列中之變化且存在於天然群體(例如病毒物種或變種)內之多形現象之聚核苷酸或多肽。此類天然對偶基因變異可通常導致聚核苷酸或多肽中之1-5%變化。對偶基因變異體可藉由對多種不同物種照組相關核酸序列測序鑑別，其可藉由使用雜交探針鑑別彼等物種中之相同基因基因座容易地進行。為天然對偶基因變異之結果且不改變相關基因之功能活性之任何及所有此類核酸變異及所得胺基酸多形現象或變異意欲在本發明之範疇內。

如本文所用，術語「衍生物」或「變異體」係指多肽或編碼多肽之核酸，其具有一或多個保守胺基酸變異或其他微小修飾以使得(1)當相比於野生型多肽時，對應多肽具有實質上等效之功能，或(2)針對多肽培養之抗體為與野生型多肽免疫反應性的。此等變異體或衍生物包括具有FMDV多肽一級胺基酸序列之微小修飾之多肽，該等微小修飾可產生具有相比於未經修飾之對應體多肽實質上等效之活性之肽。此類修飾可為有意的，如藉由定點突變誘發，或可為自發的。術語「變異體」另外涵蓋序列之缺失、添加及取代，只要多肽用於產生如本文中所定義之免疫反應。

術語「保守變異」指示胺基酸殘基由另一種生物學上類似之殘基置換，或核酸序列中核苷酸之置換，使得經編碼胺基酸殘基不變化或為另一種生物學上類似之殘基。就此而言，尤其較佳取代將一般為在本質上保守的，如上文所述。

本發明之聚核苷酸包括由於基因密碼，例如特定宿主之最佳化密碼子使用簡併之序列。如本文所用，「最佳化」係指經基因工程改造以增加其於給定物種中之表現之聚核苷酸。為了提供FMDV多肽之最佳化聚核苷酸編碼，FMDV蛋白質基因之DNA序列可經修飾以1)包含特定物種中之高度表現基因首選之密碼子；2)包含在該物種中實質上發現之核苷酸鹼基組合物中之A+T或G+C含量；3)形成該物種之起始序列；或4)消除引起不穩定、不當聚腺苷酸化、RNA之降解及終止或形成二級結構髮夾或RNA剪接位點之序列。FMDV蛋白質於該物種中增加之表現可藉由利用真核生物及原核生物或特定物種中之密碼子使用之分佈頻率達成。術語「較佳密碼子使用之頻率」係指特定宿主細胞在使用核苷酸密碼子指定給定胺基酸中展現之偏好。存在20種天然胺基酸，其中大部分藉由一個以上密碼子指定。因此，所有簡併核苷酸序列包括於本發明中，只要核苷酸序列編碼之FMDV多肽之胺基酸序列在功能上不變。

兩個胺基酸序列之間的序列一致性可藉由NCBI(National Center for Biotechnology Information)成對blast及blosum62矩陣，使用標準參數建立(參見例如「National Center for Biotechnology Information」(NCBI,Bethesda,Md.,USA)伺服器上以及Altschul等人中可用之BLAST或BLASTX算法；且因此，此文獻藉由術語「blasts」談及使用算法或BLAST或BLASTX及BLOSUM62矩陣)。

關於序列之「一致性」可指具有一致核苷酸或胺基酸之位置數目除以兩個序列中之較短者中之核苷酸或胺基酸數目，其中兩個序列之比對可根據威爾伯及利普曼算法(Wilbur and Lipman algorithm)確定。兩個胺基酸序列之序列一致性或序列相似性，或兩個核苷酸序列之間的序列一致性可使用Vector NTI套裝軟體(Invitrogen,1600 Faraday Ave.,Carlsbad,CA)確定。當RNA序列據說類似或與DNA序列在一定程度上具有序列一致性或同源性時，認為DNA序列中之胸腺嘧啶(T)與RNA序列中之尿嘧啶(U)相等。因此，藉由認為DNA序列中之胸苷(T)與RNA序列中之尿嘧啶(U)相等，RNA序列在本發明之範疇內且可衍生自DNA序列。

雜交反應可在不同「嚴格度」之條件下進行。增加雜交反應嚴格度之條件已為所熟知。參見例如「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」，第二版(Sambrook等人，1989)。

本發明另外涵蓋包含於載體分子或表現載體中且可操作地連接於啟動子元件且視情況連接於強化子之FMDV聚核苷酸。

「載體」係指活體外或活體內包含待傳遞至靶細胞之異源聚核苷酸之重組DNA或RNA質體或病毒。異源聚核苷酸可出於預防或治療之目的而包含相關序列，且可視情況呈表現卡匣形式。如本文所用，載體不必能夠在終極靶細胞或個體中複製。術語包括選殖載體及病毒載體。

術語「重組」意謂聚核苷酸半合成或合成來源，其不存在於自然界中或以未發現於自然界中之配置連接至另一聚核苷酸。

「異源」意謂衍生自與其所比較的實體的其餘部分基因上不同的實體。舉例而言，聚核苷酸可藉由基因工程改造技術置放至衍生自不同源之質體或載體中，且為異源聚核苷酸。自天然編碼序列移除且可操作地連接於除天然序列以外之編碼序列之啟動子為異源啟動子。

本發明係關於綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物及豬類動物疫苗或醫藥或免疫組合物，其可包含有效量之重組FMDV抗原及醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、佐劑、賦形劑或媒劑。

本文所述的主題部分針對與高度免疫原性且保護動物免受來自同源及異源FMDV菌株之攻毒之桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統中製備之FMDV抗原相關之組合物及方法。

組合物

本發明係關於FMDV疫苗或組合物，其可包含有效量之重組FMDV抗原及醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑。在一個實施例中，重組FMDV抗原藉由昆蟲細胞中之桿狀病毒表現載體表現。在另一實施例中，FMDV疫苗或組合物包含表現FMDV抗原之重組病毒載體。

本發明之一個實施例係關於包含FMDV空衣殼之疫苗或組合物。在另一實施例中，本發明係關於包含表現FMDV空衣殼之病毒載體之疫苗或組合物。FMDV空衣殼藉由區域P1、2A/2B'/3B'及3C之cDNA之表現獲得。FMDV空衣殼或FMDV VLP(病毒樣粒子)可經增強之熱及/或酸(低PH)穩定性修飾。

本發明係關於對抗口蹄病之疫苗，且尤其關於改良其熱及/或酸(低PH)穩定性。其亦關於製備此等疫苗之方法、抗原用於產生此等疫苗之用途及使用其之疫苗接種方法。

本發明亦關於核苷酸序列，特定言之cDNA，及胺基酸序列，該等相比於病毒之天然序列係經修飾的。本發明亦關於經修飾核苷酸序列之表現產物及併有此等修飾之FMDV抗原及病毒。

本發明涵蓋任何引發動物，諸如綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物中之免疫原性反應之FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原。FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原可為任何FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原，諸如(但不限於)引發、誘發或刺激動物，諸如綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物中之反應之蛋白質、肽或其片段。

在其中FMDV免疫組合物或疫苗為重組免疫組合物或疫苗之一個實施例中，組合物或疫苗包含重組載體及醫藥或獸醫學上可接受之賦形劑、載劑、佐劑或媒劑；重組載體為桿狀病毒表現載體，其可包含編碼FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原之聚核苷酸。FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原可為VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、NS1、VP7、NS2、VP6、NS3、NS3a、P1、VP0、3C或其任何片段。

在另一實施例中，FMDV抗原為P1、VP0、VP3、VP1、VP2、VP4、2A、2B或3C。

在一個實施例中，編碼一或多個FMDV抗原之核酸分子為編碼FMDV P1區之cDNA及編碼FMDV之FMDV 3C蛋白酶之cDNA。

在一個實施例中，FMDV抗原可為P1-3C多肽。在另一實施例中，FMDV抗原可為單獨的P1或P1-2A/2B1。在另一實施例中，FMDV抗原可為VP0-VP3。在另一實施例中，FMDV抗原可為VP4-VP2。在另一實施例中，FMDV抗原可為3C，或可為具有關於昆蟲細胞中表現最佳化之5'UTR的3C。在一個實施例中，P1-2A/2B1及3C多肽均可使用單一構築體表現於昆蟲細胞中且表現可藉由一或多個啟動子序列調節。在另一實施例中，FMDV抗原為經修飾P1或VP2。

在另一實施例中，FMDV抗原可衍生自FMDV O1 Manisa、O1 BFS或Campos、A24 Cruzeiro、Asia 1 Shamir、A Iran'96、A22 Iraq、SAT2 Saudi Arabia。

本發明係關於FMDV疫苗，其可包含有效量之重組FMDV抗原或表現FMDV抗原之重組病毒載體，及醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑。

在另一實施例中，醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑可為油包水乳液。在另一實施例中，油包水乳液可為水包油乳液。

在一態樣中，本發明提供FMDV多肽，特定言之具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之序列之綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物多肽，及其變異體或片段。

在另一態樣中，本發明提供與本發明之抗原多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之多肽，特定言之具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之序列之多肽。

在另一態樣中，本發明提供以上鑑別之FMDV多肽(SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16)之片段及變異體，其可由熟習此項技術者使用熟知分子生物技術容易地製備。

變異體為具有與如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列之同源多肽。

FMDV多肽之免疫原性片段包括具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之序列之FMDV多肽或其變異體之至少8、10、15或20個連續胺基酸、至少21個胺基酸、至少23個胺基酸、至少25個胺基酸或至少30個胺基酸。在另一實施例中，FMDV多肽之片段包括發現於全長FMDV多肽上之特異性抗原抗原決定基。

在另一態樣中，本發明提供編碼FMDV多肽之聚核苷酸，諸如編碼具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之序列之多肽的聚核苷酸。在另一態樣中，本發明提供編碼與具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之序列之多肽、或包含此等多肽中之一者或此等多肽之組合之至少8個或至少10個連續胺基酸之保守變異體、對偶基因變異體、同源物或免疫原性片段具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之多肽的聚核苷酸。

在另一態樣中，本發明提供具有如SEQ ID NO：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20中所闡述之核苷酸序列之聚核苷酸，或其變異體。在另一態樣中，本發明提供與具有如SEQ ID NO：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20中所闡述之序列之聚核苷酸中的一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之聚核苷酸，或其變異體。

本發明之聚核苷酸可包含額外序列，諸如相同轉錄單元內之額外編碼序列；控制元件，諸如啟動子；核糖體結合位點；強化子；5'UTR；3'UTR；轉錄終止子；聚腺苷酸化位點；相同或不同啟動子控制下之額外轉錄單元；准許宿主細胞之選殖、表現、同源重組及轉形之序列；及提供本發明之實施例可能需要之任何此類構築體。

用於FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原之表現之元件有利地存在於本發明載體中。以最小方式，此包含起始密碼子(ATG)、終止密碼子及啟動子，且視情況亦包含用於某些載體，諸如質體及某些病毒載體，例如除痘病毒以外之病毒載體之聚腺苷酸化序列，基本上由其組成，或由其組成。當聚核苷酸有利地在載體中編碼聚合蛋白片段，例如FMDV肽時，ATG置放於閱讀框架之5'處且終止密碼子置放於3'處。可存在控制表現之其他元件，諸如強化子序列、穩定化序列，諸如內含子及允許蛋白質之分泌之信號序列。

本發明亦關於包含載體，諸如表現載體之製劑，例如治療組合物。製劑可包含一或多個載體，例如表現載體，諸如活體內表現載體，其包含及表現一或多個FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原。在一個實施例中，載體含有且表現醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑或媒劑中之包含編碼(且有利地表現)FMDV抗原、抗原決定基或免疫原之聚核苷酸、基本上由其組成或由其組成之聚核苷酸。因此，根據本發明之一實施例，製劑中之一或多個其他載體包含編碼，且在適當情況下，載體表現FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原或其片段之一或多個其他蛋白質之聚核苷酸，基本上由其組成或由其組成。

根據另一實施例，製劑中之一或多個載體包含編碼FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原一或多個蛋白質或其片段之聚核苷酸，或基本上由其組成或由其組成，該一或多個載體表現聚核苷酸。在另一實施例中，製劑包含一個、兩個或兩個以上包含編碼且表現(有利地活體內)FMDV多肽、其抗原、融合蛋白或抗原決定基之聚核苷酸的載體。本發明亦針對包含編碼且表現不同FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原，例如來自不同動物物種，諸如(但不限於)綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物之FMDV多肽、抗原、抗原決定基或免疫原之聚核苷酸的載體混合物。

根據本發明之另一實施例，表現載體為質體載體或DNA質體載體，特定言之活體內表現載體。在特定、非限制性實例中，pVR1020或1012質體(VICAL Inc.；Luke等人，1997；Hartikka等人，1996,Hum Gene Ther,7(10)：1205-17；參見例如美國專利第5,846,946號及第6,451,769號)可用作用於聚核苷酸序列之插入的載體。pVR1020質體衍生自pVR1012且含有人類tPA信號序列。在一個實施例中，人類tPA信號包含Genbank中以寄存編號HUMTPA14之胺基酸M(1)至胺基酸 S(23)。在另一特定、非限制性實例中，用作用於聚核苷酸序列之插入之載體的質體可含有來自Genbank中以寄存編號U28070之胺基酸M(24)至胺基酸A(48)之馬類動物IGF1之信號肽序列。可在實踐中查詢或採用之DNA質體之額外資訊例如發現於美國專利第6,852,705號；第6,818,628號；第6,586,412號；第6,576,243號；第6,558,674號；第6,464,984號；第6,451,770號；第6,376,473號及第6,221,362號中。

術語質體涵蓋任何DNA轉錄單元，其包含本發明之聚核苷酸及其於所需宿主或目標之一或多個細胞中之活體內表現所需之元件；且就此而言，應注意，超螺旋或非超螺旋、圓形質體以及線性形式意欲在本發明之範疇內。

除編碼FMDV抗原、抗原決定基或免疫原之聚核苷酸以外，各質體包含或含有異源肽序列、變異體、模擬物或片段或基本上由其組成，視情況與其融合，可操作地連接於啟動子或在啟動子之控制下或依賴於啟動子。一般而言，採用在真核細胞中功能性的強啟動子為有利的。強啟動子可為(但不限於)人類或鼠類來源，或視情況具有另一來源，諸如大鼠或天竺鼠之立即早期巨細胞病毒啟動子(CMV-IE)，超啟動子(Ni,M.等人，Plant J.7,661-676,1995.)。CMV-IE啟動子可包含實際啟動子部分，其可或可不與強化子部分結合。可參考EP-A-260 148、EP-A-323 597、美國專利第5,168,062號、第5,385,839號及第4,968,615號以及PCT申請案第WO87/03905號。CMV-IE啟動子有利地為人類CMV-IE(Boshart等人，1985,Cell,41(2)：521-30)或鼠類CMV-IE。

更一般而言，啟動子具有病毒、植物或細胞來源。可有用地用於本發明之實踐中的除CMV-IE以外的強病毒啟動子為SV40病毒之早期/晚期啟動子或勞斯(Rous)肉瘤病毒之LTR啟動子。可有用地用於本發明之實踐中的強細胞啟動子為細胞骨架之基因之啟動子，諸如結蛋白啟動子(Kwissa等人，2000,Vaccine,18(22)：2337-44)或肌動蛋白啟動子(Miyazaki等人，1989,Gene,79(2)：269-77)。

質體可包含其他表現控制元件。尤其有利的為併入穩定化序列，例如內含子序列，例如玉米酒精去氫酶內含子(Callis等人Genes & Dev.1(10)：1183-1200,1987年12月)、hCMV-IE之第一內含子(PCT申請案第WO1989/01036號)、家兔β-血球蛋白基因之內含子II(van Ooyen等人，1979,Science,206(4416)：337-44)。在另一實施例中，質體可包含3'UTR。3'UTR可為(但不限於)農桿菌胭脂鹼合成酶(Nos)3'UTR(Nopaline synthase：transcript mapping and DNA sequence.Depicker,A.等人J.Mol.Appl.Genet.,1982；Bevan,NAR,1984,12(22)：8711-8721)。

關於除痘病毒以外之質體及病毒載體之聚腺苷酸化信號(polyA)，可更多地利用牛類動物生長激素(bGH)基因之聚(A)信號(參見U.S.5,122,458)，或家兔β-血球蛋白基因之聚(A)信號或SV40病毒之聚(A)信號。

「宿主細胞」指示已基因改變，或能夠藉由投與外源聚核苷酸，諸如重組質體或載體基因改變之原核或真核細胞。當指基因改變細胞時，術語係指初始改變細胞及其後代兩者。

在一個實施例中，重組FMDV抗原表現於昆蟲細胞中。

使用方法

在一個實施例中，本文所揭示之主題係關於一種對綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物接種疫苗之方法，包含向綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物投與有效量之疫苗，該疫苗可包含有效量之重組FMDV抗原或表現FMDV抗原之重組病毒載體，及醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑。

在本發明之一個實施例中，方法包含單次投與藉由本發明之乳液調配之疫苗組合物。舉例而言，在一個實施例中，免疫或疫苗組合物包含桿狀病毒表現之FMDV抗原，包括多肽及VLP(病毒樣粒子)或空衣殼，或表現FMDV抗原之重組病毒載體。電子顯微術指示藉由桿狀病毒表現載體轉化之昆蟲細胞產生FMDV VLP或FMDV空衣殼，且因此根據本發明之免疫或疫苗組合物涵蓋包含FMDV VLP或FMDV空衣殼之彼等。

在本發明之另一實施例中，方法包含單次投與兩種異源疫苗組合物。異源疫苗或組合物可為不同類型之疫苗，諸如FMDV VLP疫苗或病毒載體疫苗。異源疫苗亦可為表現不同FMDV血清型之衣殼之相同類型疫苗，諸如A24、O1 Manisa、Asia或Iraq菌株。

在一個實施例中，本文所揭示之主題係關於一種對綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物接種疫苗之方法，包含向綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物投與由昆蟲細胞中之桿狀病毒載體產生之FMDV抗原或表現FMDV抗原之重組病毒載體。

在一個實施例中，本文所揭示之主題係關於一種引發免疫反應之方法，包含向綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物投與包含由昆蟲細胞中之桿狀病毒載體產生之FMDV抗原或表現FMDV抗原之重組病毒載體之疫苗。

在一個實施例中，本文所揭示之主題係關於一種製備疫苗或組合物之方法，包含分離由昆蟲細胞中之桿狀病毒載體產生之FMDV抗原或表現FMDV抗原之重組病毒載體及視情況於醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑組合。

同源及異源FMDV菌株均用於攻毒以測試疫苗功效。投與可為皮下或肌肉內的。投與可為無針的(例如Pigjet或Bioject)。

在本發明的一個實施例中，可採用促發-強化(prime-boost)方案，其包含使用至少一種常用多肽、抗原、抗原決定基或免疫原之至少一次初步投與及至少一次強化投與。用於初步投與之免疫組合物或疫苗與用作強化投與之彼等在本質上不同。然而，應注意，相同組合物可用作促發投與及強化投與。此投與方案稱作「促發-強化」。

本發明之促發-強化可包括用於表現編碼抗原多肽或其片段或變異體之FMDV編碼序列或其片段的重組病毒載體。特定言之，病毒載體可表現編碼抗原多肽之FMDV基因或其片段。本文中涵蓋之病毒載體包括(但不限於)痘病毒[例如牛痘病毒或減毒牛痘病毒、禽痘病毒或減毒禽痘病毒(例如金絲雀痘、禽痘、鴿痘(dovepox/pigeonpox)、鵪鶉痘、ALVAC、TROVAC；參見例如US 5,505,941、US 5,494,8070)、浣熊痘病毒、豬痘病毒等]、腺病毒(例如人類腺病毒、犬類動物腺病毒)、疱疹病毒(例如犬類動物疱疹病毒、火雞之疱疹病毒、馬利克病(Marek's disease)病毒、感染性喉氣管炎病毒、貓類動物疱疹病毒、喉氣管炎病毒(ILTV)、牛類動物疱疹病毒、豬類動物疱疹病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒等。在另一實施例中，禽痘表現載體可為金絲雀痘載體，諸如ALVAC。在另一實施例中，禽痘表現載體可為禽痘載體，諸如TROVAC。待表現之本發明的FMDV抗原在特定痘病毒啟動子之控制下插入，尤其為例如昆蟲痘病毒桑燈蛾昆蟲(Amsacta moorei)42K啟動子(Barcena,Lorenzo等人，2000,J Gen Virol.,81(4)：1073-85)、牛痘啟動子7.5kDa(Cochran等人，1985,J Virol,54(1)：30-7)、牛痘啟動子I3L(Riviere等人，1992,J Virol,66(6)：3424-34)、牛痘啟動子HA(Shida,1986,Virology,150(2)：451-62)、牛痘啟動子ATI(Funahashi等人，1988,J Gen Virol,69(1)：35-47)、牛痘啟動子H6(Taylor等人，1988,Vaccine,6(6)：504-8；Guo等人，1989,J Virol,63(10)：4189-98；Perkus等人，1989,J Virol,63(9)：3829-36.)。

在另一實施例中，禽痘表現載體可為金絲雀痘載體，諸如ALVAC。FMDV抗原、抗原決定基或免疫原可為FMDV P1-3C。 FMDV病毒載體可為金絲雀痘病毒，諸如vCP2186、vCP2181或vCP2176，或禽痘病毒，諸如vFP2215(參見US 7,527,960)。在另一實施例中，FMDV抗原、抗原決定基或免疫原可產生於浮萍中(US 2011/0236416)。

在本發明之促發-強化方案之另一態樣中，投與包含本發明之FMDV抗原之組合物，接著投與包含活體內含有且表現FMDV抗原之重組病毒載體之疫苗或組合物，或包含FMDV抗原之失活病毒疫苗或組合物，或含有或表現FMDV抗原之DNA質體疫苗或組合物。同樣，促發-強化方案可包含投與包含活體內含有且表現FMDV抗原之重組病毒載體之疫苗或組合物，或包含FMDV抗原之不活化病毒疫苗或組合物，或含有或表現FMDV抗原之DNA質體疫苗或組合物，接著投與包含本發明之FMDV抗原之組合物。另外注意初步及二次投藥均可包含含本發明之FMDV抗原之組合物。

促發-強化方案包含使用至少一種常用多肽及/或其變異體或片段之至少一次促發投與及至少一次強化投與。用於促發投與之疫苗可於用作後續強化疫苗之彼等在本質上不同。促發投與可包含一或多次投與。類似地，強化投與可包含一或多次投與。

基於病毒載體之用於為哺乳動物之目標物種之組合物之劑量體積，例如綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物組合物，例如基於非痘病毒載體之組合物之劑量體積一般在約0.1至約5.0ml之間、約0.1至約3.0ml之間及約0.5ml至約2.5ml之間。

疫苗之功效可在最後一次免疫接種之後約2至4週藉由用FMDV之毒性菌株，有利地FMDV O1 Manisa、O1 BFS或Campos、A24 Cruzeiro、Asia 1 Shamir、A Iran'96、A22 Iraq、SAT2 Saudi Arabia菌株攻毒動物，諸如綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物來測試。

其他菌株可包括FMDV菌株A10-61、A5、A12、A24/Cruzeiro、C3/Indaial、O1、C1-Santa Pau、C1-C5、A22/550/Azerbaijan/65、SAT1-SAT3、A、A/TNC/71/94、A/IND/2/68、A/IND/3/77、A/IND/5/68、A/IND/7/82、A/IND/16/82、A/IND/17/77、A/IND/17/82、A/IND/19/76、A/IND/20/82、A/IND/22/82、A/IND/25/81、A/IND/26/82、A/IND/54/79、A/IND/57/79、A/IND/73/79、A/IND/85/79、A/IND/86/79、A/APA/25/84、A/APN/41/84、A/APS/44/05、A/APS/50/05、A/APS/55/05、A/APS/66/05、A/APS/68/05、A/BIM/46/95、A/GUM/33/84、A/ORS/66/84、A/ORS/75/88、A/TNAn/60/947/Asia/1、A/IRN/05、Asia/IRN/05、O/HK/2001、O/UKG/3952/2001、O/UKG/4141/2001、Asia 1/HNK/CHA/05(GenBank寄存編號EF149010，以引用方式併入本文)、Asia I/XJ(Li,ZhiYong等人Chin Sci Bull,2007)、HK/70(Chin Sci Bull,2006,51(17)：2072-2078)、O/UKG/7039/2001、O/UKG/9161/2001、O/UKG/7299/2001、O/UKG/4014/2001、O/UKG/4998/2001、O/UKG/9443/2001、O/UKG/5470/2001、O/UKG/5681/2001、O/ES/2001、HKN/2002、O5India、O/BKF/2/92、K/37/84/A、KEN/1/76/A、GAM/51/98/A、A10/Holland、O/KEN/1/91、O/IND49/97、O/IND65/98、O/IND64/98、O/IND48/98、O/IND47/98、O/IND82/97、O/IND81/99、O/IND81/98、O/IND79/97、O/IND78/97、O/IND75/97、O/IND74/97、O/IND70/97、O/IND66/98、O/IND63/97、O/IND61/97、O/IND57/98、O/IND56/98、O/IND55/98、O/IND54/98、O/IND469/98、O/IND465/97、O/IND464/97、O/IND424/97、O/IND423/97、O/IND420/97、O/IND414/97、O/IND411/97、O/IND410/97、O/IND409/97、O/IND407/97、 O/IND399/97、O/IND39/97、O/IND391/97、O/IND38/97、O/IND384/97、O/IND380/97、O/IND37/97、O/IND352/97、O/IND33/97、O/IND31/97、O/IND296/97、O/IND23/99、O/IND463/97、O/IND461/97、O/IND427/98、O/IND28/97、O/IND287/99、O/IND285/99、O/IND282/99、O/IND281/97、O/IND27/97、O/IND278/97、O/IND256/99、O/IND249/99、O/IND210/99、O/IND208/99、O/IND207/99、O/IND205/99、O/IND185/99、O/IND175/99、O/IND170/97、O/IND164/99、O/IND160/99、O/IND153/99、O/IND148/99、O/IND146/99、O/SKR/2000、A22/India/17/77。

此等FMDV菌株之其他細節可發現於歐洲生物資訊(EMBL-EBI)網頁上，且所有相關核苷酸序列以引用的方式併入本文中。本發明人預期所有FMDV菌株(本文中所列及待鑑別之彼等)可根據本發明之教示內容表現以產生(例如)有效疫苗組合物。同源及異源菌株均用於攻毒以測試疫苗功效。動物可以皮內、皮下、噴霧、鼻內、眼內、氣管內及/或經口方式進行攻毒。

促發-強化投與可有利地相隔1至6週，例如相隔約3週進行。根據一個實施例，亦設想有利地使用基於病毒載體之疫苗之每半年強化投與或每年強化投與。動物在第一次投與時有利地為至少6至8週齡。

用於促發-強化方案中之包含本發明之重組抗原多肽之組合物包含於醫藥學或獸醫學上可接受之媒劑、稀釋劑、佐劑或賦形劑中。本發明之方案保護動物免受綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物FMDV侵害及/或防止感染動物中之疾病進展。

熟習此項技術者應理解，本文中之揭示內容以舉例方式提供且本發明不限於此。自本文中之揭示內容及此項技術中之知識，熟習此項技術者可在無任何不當實驗的情況下確定用於各注射方案之投與次數、投與途徑及劑量。

本發明預期至少一次向動物投與有效量之根據本發明製得之治療組合物。動物可為雄性、雌性、懷孕雌性及新生兒。此投與可經由各種途徑，包括(但不限於)肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)注射或經由鼻內或經口投與。本發明之治療組合物亦可藉由無針裝置(如藉由Pigjet、Dermojet、Biojector、Avijet(Merial,GA,USA)、Vetjet或Vitajet裝置(Bioject,Oregon,USA))投與。投與質體組合物之另一種方法為使用電穿孔(參見例如Tollefsen等人，2002；Tollefsen等人，2003；Babiuk等人，2002；PCT申請案第WO99/01158號)。在另一實施例中，治療組合物藉由基因槍或金粒子轟擊傳遞至動物。

在一個實施例中，本發明提供投與治療有效量之調配物以在靶細胞中傳遞及表現FMDV抗原或抗原決定基。確定治療有效量對於一般熟習此項技術者而言為常規實驗。在一個實施例中，調配物包含含表現FMDV抗原或抗原決定基之聚核苷酸之表現載體及醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、媒劑或賦形劑。在另一實施例中，醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、媒劑或賦形劑促進聚核苷酸轉染或以其他方式轉移至宿主動物及/或改進載體或蛋白質於宿主中之保存。

在一個實施例中，本文所揭示之主題提供一種在經感染與經疫苗接種動物之間進行區分(DIVA)之偵測方法。

本文揭示使用本發明之疫苗或組合物允許偵測動物中之FMDV感染。本文揭示使用本發明之疫苗或組合物允許藉由在經感染與經疫苗接種動物之間進行區分(DIVA)而偵測動物中之感染。本文揭示一種使用FMDV非結構蛋白診斷動物中之FMDV之感染的方法(例如FMDV 3ABC或3D特異性ELISA)。

製品

在一個實施例中，本文所揭示之主題係關於一種進行引發或誘發免疫反應之方法的套組，其可包含重組FMDV免疫組合物或疫苗，或不活化FMDV免疫組合物或疫苗，重組FMDV病毒組合物或疫苗及進行方法之說明書中的任一者。

本發明的另一實施例為一種進行誘發針對動物中之FMDV之免疫或保護反應之方法的套組，其包含含本發明之FMDV抗原之組合物或疫苗及重組FMDV病毒免疫組合物或疫苗，及進行以有效量傳遞以引發動物中之免疫反應之方法的說明書。

本發明的另一實施例為一種進行誘發針對動物中之FMDV之免疫或保護反應之方法的套組，其包含含本發明之FMDV抗原之組合物或疫苗及不活化FMDV免疫組合物或疫苗，及進行以有效量傳遞以引發動物中之免疫反應之方法的說明書。

本發明之另一態樣係關於一種用於如上文所述之本發明之促發-強化疫苗接種之套組。套組可包含至少兩個小瓶：含有用於本發明之促發疫苗接種之疫苗或組合物之第一小瓶，及含有用於本發明之增強免疫疫苗接種之疫苗或組合物之第二小瓶。套組可有利地含有額外第一或第二小瓶以用於額外促發疫苗接種或額外強化疫苗接種。

本發明涵蓋以下實施例。在一個實施例中，揭示一種包含FMDV抗原或其片段或變異體及醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑之組合物。在另一實施例中，揭示一種包含表現FMDV抗原之重組病毒載體及醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑之組合物。在另一實施例中，揭示上文所述之組合物，其中FMDV抗原或其片段或變異體包含含綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物FMDV抗原之至少15個胺基酸之免疫原性片段。在一個實施例中，揭示以上組合物，其中FMDV抗原或其片段或變異體經部分純化。在一個實施例中，揭示以上組合物，其中FMDV抗原或其片段或變異體實質上經純化。

在一個實施例中，揭示以上組合物，其中FMDV抗原或其片段或變異體為綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物FMDV多肽。在一個實施例中，揭示以上組合物，其中FMDV多肽為P1-3C多肽、P1多肽、VP0多肽、VP1多肽、VP3多肽、VP2多肽、VP4多肽、2A多肽、2B1多肽或3C多肽。在一個實施例中，揭示以上組合物，其中FMDV抗原或其片段或變異體與如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之序列具有至少80%序列一致性。在一個實施例中，揭示以上組合物，其中FMDV抗原藉由與如SEQ ID NO：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20中所闡述之序列具有至少70%序列一致性之聚核苷酸編碼。在一個實施例中，揭示以上組合物，其中醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑為油包水乳液或水包油乳液。在另一實施例中，揭示一種對易受綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物FMDV影響之動物接種疫苗之方法，其包含向動物投與以上組合物。在一個實施例中，揭示一種對易受綿羊類動物、牛類動物、山羊類動物或豬類動物FMDV影響之動物接種疫苗之方法，其包含促發-強化方案。在一個實施例中，揭示一種表現於昆蟲細胞中之實質上純化之抗原多肽，其中多肽包含：與具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所闡述之序列之多肽具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在任何實施例中，動物較佳為綿羊類動物、牛類動物、豬類動物或山羊類動物。在一個實施例中，揭示一種診斷動物中之FMDV感染之方法。在另一實施例中，揭示一種用於促發-強化疫苗接種之套組，其包含至少兩個小瓶，其中第一小瓶含有包含FMDV抗原或其片段或變異體之組合物，且第二小瓶含有包含或表現FMDV抗原之重組病毒載體。

醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑或媒劑或佐劑或賦形劑已為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑或媒劑或賦形劑可為0.9% NaCl(例如生理鹽水)溶液或磷酸鹽緩衝液。可用於本發明之方法之其他醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑或媒劑或賦形劑包括(但不限於)聚-(L-麩胺酸鹽)或聚乙烯吡咯啶酮。醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑或媒劑或佐劑或賦形劑可為任何促進載體(或活體外表現自本發明載體之蛋白質)投與之化合物或化合物組合；有利地，載劑、媒劑或賦形劑可促進轉染及/或改良載體(或蛋白質)之保存。劑量及劑量體積在本文中論述於一般描述中且亦可由熟習此項技術者自本發明閱讀以及此項技術中之知識而在無任何不當實驗的情況下確定。

有利地但非排他地適合於質體之含四級銨鹽之陽離子脂質有利地為具有下式之彼等：

其中R1為具有12至18個碳原子之飽和或不飽和直鏈脂族基團，R2為含有2或3個碳原子之另一脂族基團，且X為胺或羥基，例如DMRIE。在另一實施例中，陽離子脂質可與中性脂質，例如DOPE締合。

在此等陽離子脂質中，較佳為DMRIE(N-(2-羥乙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十四烷氧基)-1-丙烷銨；WO96/34109)，有利地與中性脂質，有利地DOPE(二油醯基-磷脂醯基-乙醇胺；Behr,1994)締合以形成DMRIE-DOPE。

有利地，與佐劑之質體混合物臨時地且有利地與投與製劑同時或在投與製劑之前不久形成；例如在投與之前不久形成質體-佐劑混合物，有利地以便給予足夠投與前時間以使得混合物形成複合物，例如投與之前約10與約60分鐘之間，諸如投與之前大致30分鐘。

當DOPE存在時，DMRIE：DOPE莫耳比有利地為約95：約5至約5：約95，更有利地為約1：約1，例如1：1。

DMRIE或DMRIE-DOPE佐劑：質體重量比可在約50：約1與約1：約10，諸如約10：約1與約1：約5，及約1：約1與約1：約2，例如1：1與1：2之間。

在另一實施例中，醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑可為油包水乳液。適合之油包水乳液之實例包括油基油包水疫苗乳液，其在4℃下穩定且為流體，含有：6至50v/v%，較佳12至25v/v%含抗原水相，總計或部分含有非可代謝油(例如礦物油，諸如石蠟油)及/或可代謝油(例如植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)之50至94v/v%油相，0.2至20p/v%，較佳3至8p/v%界面活性劑，後者為總計或部分的，或在聚甘油酯(該等聚甘油酯較佳為聚丙三醇(聚)蓖麻酸酯)或聚氧乙烯蓖麻毒素油或氫化聚氧乙烯蓖麻毒素油之混合物中。可用於油包水乳液中之界面活性劑之實例包括乙氧基化脫水山梨糖醇酯(例如聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯(TWEEN 80®)，購自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT)及脫水山梨糖醇酯(例如脫水山梨糖醇單油酸酯(SPAN 80®)，購自Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。另外，就油包水乳液而言，亦參見以引用的方式併入本文中之美國專利第6,919,084號，例如其實例8。在一些實施例中，含抗原水相包含含一或多種緩衝劑之生理鹽水溶液。適合之緩衝溶液之實例為磷酸鹽緩衝鹽水。在有利實施例中，油包水乳液可為水/油/水(W/O/W)三重乳液(美國專利第6,358,500號)。其他適合之乳液之實例描述於美國專利第7,371,395號中。

本發明之免疫組合物及疫苗可包含一或多種佐劑或基本上由其組成。用於本發明的實踐中之適合之佐劑為(1)丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，順丁烯二酸酐及烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列 (ISS)，諸如具有一或多個非甲基化CpG單元之寡脫氧核苷酸序列(Klinman等人，1996,PNAS USA,93(7)：2879-83；WO98/16247)，(3)水包油乳液，諸如M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995,6：147,183出版之「Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach」之第147頁上描述之SPT乳液，及相同作品之第183頁上描述之乳液MF59，(4)含有四級銨鹽之陽離子脂質，例如DDA(5)細胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁，(7)皂素或(8)所引用及以引用的方式併入本申請案中之任何文獻中論述之其他佐劑，或(9)其任何組合或混合物。

尤其適合於病毒載體之水包油乳液(3)可基於：輕液體石蠟油(歐洲藥典型)；類異戊二烯油，諸如角鯊烷、角鯊烯；產生於烯烴之寡聚之油，例如異丁烯或癸烯；具有直鏈烷基之酸或醇之酯，諸如植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)及丙二醇二油酸酯；或分支鏈、脂肪醇或酸之酯，尤其異硬脂酸酯。

油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑可為非離子界面活性劑，諸如：一方面，脫水山梨糖醇、甘露糖醇(例如無水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚丙三醇或丙二醇及另一方面，油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯，該等酯視情況經乙氧基化，或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，諸如Pluronic，例如L121。

在類型(1)佐劑聚合物中，較佳為交聯丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，尤其藉由糖或多元醇之聚烯基醚交聯。此等化合物以名稱carbomer已知(Pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號，其提供藉由具有至少三個羥基，較佳不超過八個此類基團之聚羥基化合物交聯之此類丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子經具有至少兩個碳原子之不飽和、脂族基團置換。較佳基團為含有2至4個碳原子之彼等基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團亦可含有其他取代基，諸如甲基。以名稱Carbopol銷售之產品(BF Goodrich,Ohio,USA)尤其適合。其藉由烯丙基蔗糖或藉由烯丙基異戊四醇交聯。其中，提及Carbopol 974P、934P及971P。

關於順丁烯二酸酐-烯基衍生物共聚物，較佳為EMA(Monsanto)，其為直鏈或交聯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物且其例如藉由二乙烯醚交聯。亦參考J.Fields等人，1960。

關於結構，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物及EMA較佳由具有下式之基本單元形成：

其中：

- 可相同或不同之R1及R2表示H或CH3

- x=0或1，較佳x=1

- y=1或2，x+y=2。

就EMA而言，x=0且y=2且就carbomer而言，x=y=1。

此等聚合物可溶於水或生理鹽溶液(20g/l NaCl)中且pH可調節至7.3至7.4，例如藉由鈉鹼(NaOH)，以提供可併入表現載體之佐劑溶液。最終免疫或疫苗組合物中之聚合物濃度可在約0.01至約1.5% w/v、約0.05至約1% w/v及約0.1至約0.4% w/v之間的範圍內。

細胞激素或細胞因子(5)可在免疫或疫苗組合物中呈蛋白質形式，或可與其一或多個免疫原或抗原決定基共表現於宿主中。較佳為細胞激素或細胞因子之共表現，此藉由與表現其一或多個免疫原或抗原決定基相同之載體，或藉由其獨立載體。

本發明包含製備此類組合組合物；例如藉由摻合活性組分，有利地摻合在一起且與佐劑、載劑、細胞激素及/或稀釋劑一起。

可用於本發明中之細胞因子包括(但不限於)粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、干擾素α(IFNα)、干擾素β(IFNβ)、干擾素γ(IFNγ)、介白素-1α(IL-1α)、介白素-1β(IL-1β)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10(IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、聚肌苷酸及聚胞苷酸、胞嘧啶核苷-磷酸鹽-鳥苷寡脫氧核苷酸(CpG ODN)及轉形生長因子β(TGFβ)。應理解，細胞因子可與本發明之免疫或疫苗組合物共投與及/或依序投與。因此，舉例而言，本發明之疫苗亦可含有活體內表現適合之細胞激素之外源性核酸分子，例如與待疫苗接種或在其中引發免疫反應之此宿主匹配之細胞激素(例如用於待向牛類動物投與之製劑之牛類動物細胞激素)。

在一特定實施例中，佐劑可包括TS6、TS7、TS8及TS9乳液(US 7,371,395)；LR3及LR4(US7,691,368)；TSAP(US20110129494)；TRIGEN^TM(Newport Labs)；合成dsRNA(例如poly-IC、poly-ICLC[HILTONOL®])；及MONTANIDE^TM佐劑(W/O、W/O/W、O/W、IMS及Gel；全部由SEPPIC生產)。

在基於桿狀病毒/昆蟲細胞表現多肽之免疫組合物及/或疫苗的情況下，劑量可包括約1μg至約2000μg、約50μg至約1000μg及約100μg至約500μg FMDV抗原、抗原決定基或免疫原。劑量可包括約10²至約10²⁰、約10³至約10¹⁸、約10⁴至約10¹⁶、約10⁵至約10¹² VLP。在基於表現FMDV抗原之病毒載體之免疫組合物及/或疫苗的情況下，劑量可包括約10³ TCID₅₀至約10¹⁵ TCID₅₀(50%組織培養感染劑量)、約10³ TCID₅₀至約10¹⁴ TCID₅₀、約10³ TCID₅₀至約10¹³ TCID₅₀、約10³ TCID₅₀ 至約10¹² TCID₅₀。劑量體積可在約0.1與約10ml之間，有利地約0.2與約5ml之間。

現將藉由以下非限制性實例進一步描述本發明。

實例

DNA插入物、質體及重組病毒或桿狀病毒載體之構築使用J.Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)描述之標準分子生物技術進行。

實例1 桿狀病毒/昆蟲細胞系統中之FMDV抗原之構築及表現

血清型A FMDV之陽性菌株RNA基因組包含藉由兩個非編碼區側接之單一ORF(1662個胺基酸)。ORF保持3個部分。第一部分為聚合蛋白P1-2A，其導致成熟及裂解之後4種衣殼組分(VP4、VP2、VP3及VP1)之表現。第二部分為含有2種蛋白質(2B及2C)且參與RNA合成及細胞膜囊泡增殖之P2。第三部分為含有4種蛋白質(3A、3B、3C及3D)之P3。3C為參與聚合蛋白之裂解之主要蛋白質。3D為另一蛋白酶且3A/3B參與膜錨定、發病機制、RNA合成及衣殼化。P1-2A及3C對於構成FMDV衣殼粒子或FMDV VLP之所有蛋白質之表現及裂解為所需的(參見圖2)。潛在功能域顯示於下表1中。

實例1.1 藉由VP2(H93C)中之突變產生二硫橋鍵(+最佳化轉譯起始背景)及產生對應重組桿狀病毒BacMEB097而構築含有編碼FMDV A24 Cruzeiro菌株之聚合蛋白之聚核苷酸之質體pMEB097 產生質體pMEB097

含有編碼FMDV A24 Cruzeiro菌株之聚合蛋白之野生型聚核苷酸之質體pMEB096經突變以產生質體pMEB097。質體pMEB097含有編碼經修飾聚合蛋白(SEQ ID NO：2)之聚核苷酸(SEQ ID NO：3)，該經修飾聚合蛋白在VP2(H93C)或P1(H179C)處含有突變。經修飾聚合蛋白(SEQ ID NO：2)在VP2之位置93或P1之位置179處含有組胺酸經半胱胺酸之取代。

產生重組桿狀病毒BacMEB097

質體pMEB097(參見圖3)係藉由同源重組產生桿狀病毒，其係在多角體蛋白啟動子之控制下編碼FMDV A24 Cruzeiro菌株之FMDV P1/2A/2B'3B'/3C基因(半胱胺酸在VP2之位置93處)。根據製造商步驟(Baculogold,Pharmingen)，將來自ATCC之草地黏蟲(Spodoptera frugiperda；Sf)9昆蟲細胞經質體pMEB097及Bsu36I三重切割線性化AcNPV DNA共轉染。將共轉染上清液之重組桿狀病毒經空斑方式純化兩次。5個純系以25cm²單層燒瓶規模在28℃下進行擴增(繼代1)。5個純系擴增於Sf9昆蟲細胞中且藉由使用對FMDV A24血清型具特異性之單株抗體之西方墨點法分析重組純系。純系2顯示良好表現量。此純系在105rpm下在Erlenmeyers(懸浮液)中以50mL規模在28℃下經進一步擴增(繼代2)。進行200mL規模下之第三繼代(繼代3)以獲得用於蛋白質表現之病毒儲備液。此病毒儲備液隨後藉由空斑分析法滴定。製備病毒儲備液係使用補充有2% FCS之SF900III培養基進行。在滴定之後，重組桿狀病毒儲備液(繼代3)係使用無血清培養基產生蛋白質。

桿狀病毒BacMEB097之表現分析

昆蟲細胞(Sf9-Invitrogen)藉由所產生之桿狀病毒BacMEB097及藉由BacMEB084(作為無突變之參考)在1pfu/ml之感染倍率(MOI)下加以感染。昆蟲細胞在4天期間於28℃下，在無FCS之Sf900II培養基中以105rpm生長。上清液以約倍數4濃縮且經以下處理：A=無處理；B=56℃下1小時；C=添加HCl以達到5以下之pH。

衣殼蛋白適當組裝至VLP中藉由電子顯微術評估(參見圖4，「A」欄)。25-30nm之粒子顯示極均一圓形至二十面體形態、31nm之恆定尺寸且具有染料滲透的特徵，且因此解釋為FMDV樣。粒子數目估計為約每毫升10⁸個。

此外，VLP之穩定性會隨著BacMEB097中之突變(如56℃下處理1小時(「B」欄)之後看出)及培養基之酸化(「C」欄)引起之二硫橋鍵之形成明顯地增加。

FMDV蛋白質之標識藉由使用對FMDV A24血清型具特異性之單株抗體之西方墨點法分析上清液確認(參見圖5)。

總之，藉由轉移質體pMEB097產生之桿狀病毒BacMEB097可誘導Sf9昆蟲細胞中之FMDV衣殼表現及加工。此等FMDV表現之衣殼會以FMDV樣病毒粒子之特徵形態自行組裝至VLP中。相比於藉由BacMEB084獲得之VLP(含有含編碼FMDV A24 Cruzeiro菌株之聚合蛋白之野生型聚核苷酸之質體pMEB096)，涉及二硫橋鍵之形成之突變會增加VLP之穩定性(在熱處理或酸化之後)。

實例1.2 藉由VP2(S93C)中之突變產生二硫橋鍵(+最佳化轉譯起始背景)產生表現FMDV衣殼蛋白質之重組桿狀病毒BacMEB099而構築含有編碼FMDV O1 manisa菌株之聚合蛋白之聚核苷酸之質體pMEB099

含有編碼FMDV O1 manisa菌株之聚合蛋白之野生型聚核苷酸之質體pMEB095經突變以產生質體pMEB099。質體pMEB099含有編碼含有VP2(S93C)或P1(S179C)中之突變之經修飾聚合蛋白(SEQ ID NO：6)之聚核苷酸(SEQ ID NO：7)。經修飾聚合蛋白(SEQ ID NO：6)在VP2之位置93或P1之位置179處含有絲胺酸經半胱胺酸之取代。

重組桿狀病毒BacMEB099之產生及表現根據關於BacMEB097在實例1.1中所述之程序進行。昆蟲細胞(Sf9-Inv)藉由桿狀病毒BacMEB099在0.5pfu/ml之感染倍率(MOI)下感染。昆蟲細胞在4天期間在28℃下在無FCS之Sf900II培養基中以105rpm生長。蛋白質生產在上清液之處理之後進行：濃縮及具有或不具有56℃下之1h加熱(以查看共價籠突變之效應)。處理之上清液直接藉由電子顯微術及特異性ELISA分析(參見圖6)。

結果(圖6A及6B)顯示獲得藉由ELISA方法之顯著效價。此ELISA對VLP具有特異性，表明在藉由BacMEB099感染之後存在VLP。

衣殼蛋白適當組裝至VLP中藉由電子顯微術評估(圖6B)。25-30nm之粒子顯示極均一圓形至二十面體形態、31nm之恆定尺寸且藉由染料滲透表徵且因此解釋為FMDV樣。粒子數目估計為約每毫升10⁸個。

總之，藉由轉移質體pMEB099產生之桿狀病毒BacMEB099誘導Sf9昆蟲細胞中之FMDV衣殼表現及加工。此等FMDV表現之衣殼以FMDV樣病毒粒子之特徵形態自組裝至VLP中。

實例1.3 藉由VP2中之突變產生二硫橋鍵(+最佳化轉譯起始背景)及產生表現FMDV衣殼蛋白質之重組桿狀病毒而構築含有編碼FMDV Iraq菌株之聚合蛋白之聚核苷酸之質體pMEB106及含有編碼FMDV Asia菌株之聚合蛋白之聚核苷酸之質體pMEB104

含有編碼含有FMDV Iraq菌株之P1(位置179處之C)中之突變之經修飾聚合蛋白(SEQ ID NO：8)之聚核苷酸(SEQ ID NO：9)及編碼含有FMDV Asia菌株之P1(位置179處之C)中之突變之經修飾聚合蛋白(SEQ ID NO：10)之聚核苷酸(SEQ ID NO：11)之質體根據實例1.1中概述之程序構築。

表現FMDV Iraq菌株之經修飾聚合蛋白(SEQ ID NO：8)及FMDV Asia菌株之聚合蛋白(SEQ ID NO：10)之重組桿狀病毒之產生及表現根據關於BacMEB097在實例1.1中所述之程序進行。

藉由轉移質體pMEB106產生之桿狀病毒BacMEB106誘導Sf9昆蟲細胞中之FMDV衣殼表現及加工。藉由轉移質體pMEB104產生之桿狀病毒BacMEB104誘導Sf9昆蟲細胞中之FMDV衣殼表現及加工。此等FMDV表現之衣殼以FMDV樣病毒粒子之特徵形態自組裝至VLP中。

實例2 桿狀病毒表現之「籠鎖」FMDV VLP之穩定性

展示大規模(150L)產生FMDV VLP之能力。當以150L批量、製造規模生長時，獲得桿狀病毒表現之共價籠及野生型A24 FMDV-VLP之令人滿意的效價(log10CCID₅₀ 7.14/mL)(CCID：細胞培養感染劑量)。出人意料地，存在大量穩定FMD VLP，甚至在加熱樣品之後亦如此(2.14 log10 CCID₅₀/ml經加熱相對於2.19 log10 CCID₅₀/ml未加熱)(參見圖8)。此外，如圖8中指示，EM計數自4L及150L批量兩者顯示極好VLP數目。

實例3 藉由桿狀病毒、浮萍及金絲雀痘表現之FMDV對牛疫苗接種及後續毒性攻毒

此研究之目的為測試在牛中，針對TS6佐劑中調配之3種實驗FMD A24 Cruzeiro抗原之FMD毒性攻擊之功效。

含有浮萍屬(浮萍，參見US2011/0236416)、桿狀病毒或vCP(金絲雀痘病毒)表現之抗原之疫苗在D0投與至牛類動物(表2.1)。根據相關歐洲藥典專論(European Pharmacopoeia Monograph)，經由在D21進行之毒性FMDV A24 Cruzeiro攻毒，接著進行牛類動物之臨床監測評估疫苗保護(表2.2)。對照組中之FMD病變證實攻毒。桿狀病毒疫苗接種組中之兩隻動物經完全保護免於病變指示完全保護，而其他三隻呈現病變之極有限擴展，表示部分保護。G2及G3中之動物全部呈現病變，儘管病變強度有變化。中和效價資料顯示於圖9及圖10中。在疫苗接種之後三週(D21)，在G2中之所有牛犢中觀測到明顯血清轉化。在G1及G3中，觀測到極少或無血清轉化。對照組在該日期為陰性的。所有牛犢在攻毒之後(D25或D28)經強烈血清轉化。血清反應似乎在D28比D25更劇烈且在G2中之疫苗接種動物中比對照組中更劇烈。此觀測結果表明疫苗接種在G2中之啟動效應。結果指示桿狀病毒FMDV A24(野生型A24)疫苗組在相比於其他兩組時提供最高SN效價且提供針對毒性FMDV A24 Cruzeiro攻毒之保護。

實例4 FMDV攻毒研究中之不同實驗FMD A24 Cruzeiro疫苗(表現野生型FMDV之桿狀病毒)之牛中之保護之評估

研究之目標為測試在牛中，針對TS6/皂素佐劑中調配之3種實驗FMD A24 Cruzeiro抗原之FMD毒性攻毒之功效。含有表現於桿狀病毒(BacMEB084，經過濾或未過濾)或金絲雀痘病毒中之FMD A24 Cruzeiro抗原之疫苗在D0投與至牛類動物。針對D21進行之毒性FMDV A24 Cruzeiro攻毒評估疫苗保護(根據相關歐洲藥典專論)。

A24 BAC經過濾*：桿狀感染效價8.71 log₁₀CCID₅₀/ml

A24 BAC未過濾**：桿狀感染效價5.58 log₁₀CCID₅₀/ml，10⁸ VLP

vCP2166***：桿狀感染效價8.8 log₁₀CCID₅₀/ml

兩種桿狀病毒疫苗在完全及四分之一疫苗劑量處在100%之動物中展示保護性。經過濾桿狀病毒疫苗仍在1/16疫苗劑量處在60%之動物中為保護性的。金絲雀痘病毒疫苗在完全劑量處在80%之動物中展示保護性。圖11A、11B及圖12C呈現描繪隨時間推移之FMDV A24 Cruzeiro抗體效價之圖及表。結果顯示在疫苗接種之後三週(D21)，在所有經疫苗接種牛犢中觀測到明顯血清轉化。在桿狀疫苗接種組(G1-G2-G3及G5-G6)中存在劑量/效應關係。對照組在兩個日期均為陰性的。所有經疫苗接種牛犢在攻毒之後(D25及D28)均經強烈血清轉化。血清反應似乎在D28比D25更劇烈。對照組中之血清轉化相當弱。圖12A及12B呈現隨時間推移之溫度演變。結果顯示僅對照組呈現顯著溫度增加。疫苗不增加直腸溫度。

使用此等資料，使用邏輯回歸及斯皮爾曼-卡柏方法(Spearman-Kärber method)計算PD50。邏輯回歸方法估計疫苗A>16 PD₅₀之強度。卡勃方法估計疫苗A>26PD₅₀之強度。儘管在估計之間存在差異，兩種方法表明疫苗A之高度顯著及實質性功效。鑒於臨床結果，疫苗B之類似估計亦表明疫苗B之極大功效。

實例5使用桿狀病毒之實驗FMDV調配物之豬崽中之免疫原性

此研究之目標為分析表現於桿狀病毒中且調配於TS6或TS6+皂素中之4種FMDV抗原之免疫原性。疫苗根據以下比例(表4.1)製備。

經研究之抗原就血清型(A24 Cruzeiro或O1-Manisa)、生產方法(昆蟲細胞或蠶)或插入方法(標準或共價籠)而言不同。術語「共價籠」係指FMDV P1肽中之非天然存在之二硫鍵之機構，其藉由取代半胱胺酸殘基實現。評估在幼齡豬崽中進行，肌肉內疫苗接種兩次，時間間隔為21天。監測豬崽在各疫苗接種之後的一般反應且監測D1、D20及D42時之FMDV-A24或FMDV-O1M中和抗體效價。

O1-Manisa桿狀病毒表現之抗原不在G5中之任一動物中引發血清轉化。此等資料首次展示含有「共價籠」突變之產生桿狀病毒之FMDV子單元為免疫原性的(參見下文表5)。此外，此處之資料強有力地顯示「籠鎖」FMDV子單元當相比於未經修飾之野生型FMDV時顯著更高產、有效及穩定。另外，基於蠶之疫苗似乎不含比其他測試疫苗顯著更多的抗原。

*：效價

1.35 log10PD₅₀；sd**：標準差。

總之，如藉由表5中之結果指示，所有SF9細胞培養、桿狀病毒表現之A24 VLP(第G1、G2及G3組)產生顯著「促升」效應(亦即第二劑量顯著增加血清轉化動物之數目)。相比之下，蠶培養之A24 VLP似乎在不引發明顯促升效應的情況下引發初始及持續性血清學反應。

實例6 桿狀病毒表現之A24 FMDV VLP之酸及熱穩定性

A24 FMDV VLP經受酸及熱處理，且使用EM(圖13)及ELISA分析(圖14)評估其穩定性。如圖式中所指示，共價籠VLP但並非野生型VLP對低pH及熱量兩者顯著具抗性。此外，如圖15及表6中所指示，當儲存於5℃下時，共價籠VLP相對於其野生型對應物隨時間推移顯著更穩定。

總之，來自具有「共價籠突變」之A24 Cruzeiro血清型之VLP之穩定化關於對加熱或酸化處理之抗性高度有效。共價籠在18個月儲存之後使VLP穩定化。若干FMDV血清型現已顯示藉由引入共價籠突變有效地穩定化，包括：A24 Cruzeiro；O1 Manisa(圖16，EM及圖17，ELISA)；Asia 1 Shamir；及A22 Iraq。圖17顯示加熱對穩定化VLP(共價籠，BacMEB099)無影響，而標準FMDV O1-Manisa活性成分在加熱之後未偵測到信號指示標準FMDV O1 Manisa在加熱之後無組裝之VLP。

實例7 習知豬崽中藉由桿狀病毒FMD O1 Manisa(經修飾，共價籠)調配之疫苗之免疫原性

研究之目標為分析習知豬中調配於TS6中之兩種桿狀病毒FMD O1-Manisa抗原及一種以腺病毒為載體之FMDV O1-Manisa之安全性及功效。各調配物以相隔三週(D0-D21)之兩次注射投與。豬在D0時為11-12週齡且接受2mL肌肉內疫苗感染。安全性經由監測局部及全身反應評估。功效經由血清學(血清中和效價)監測(D1、D20、D43)及細胞媒介免疫(CMI)檢定(D27、D43)評估。

在D27及D43收集血液樣品以用於細胞媒介免疫(CMI)檢定。樣品在再刺激之後經檢定以用於γ干擾素(IFNγ)分泌細胞定量、漿細胞定量或記憶B細胞定量(參見表7.2)。所有定量藉由ELISpot進行。

+：經測試；NT：未測試

結果出人意料地顯示不同於桿狀病毒表現之野生型FMDV O1 M(參見實例5)，桿狀病毒表現之經修飾(共價籠)FMDV O1 M引發豬崽中之血清轉化。如以下表7.3中所示，在第一疫苗接種(D0)之後，在D20時在2個桿狀病毒組(G1及G2)中觀測到血清轉化。在第二疫苗接種之後，在兩組(G1及G2)中觀測到促升效應。

如圖20中所示，特異性IgG分泌漿細胞偵測於桿狀病毒表現之FMDV-VLP(經修飾，共價籠)/TS6疫苗接種組(G1及G2)兩者中。特異性IgG分泌漿細胞在G1及G2中顯著高於G4中。未在G3中偵測到特異性IgG分泌漿細胞。

圖21顯示高數目之特異性IgG分泌記憶B細胞偵測於組G1及G2織者所有經疫苗接種豬中，微弱部分之特異性IgG分泌記憶B細胞偵測於G3中，且無特異性IgG分泌記憶B細胞偵測於G4中。

圖22顯示特異性IFNγ分泌細胞按G1及G2>G4>G3次序偵測於疫苗接種組中。G1與G2之間不存在差異。特異性IFNγ分泌細胞在G1及G2中顯著高於G3中。

桿狀病毒表現之FMDV-VLP(經修飾，共價籠)/TS6疫苗接種組(G1及G2)兩者中之高含量之特異性IFNγ分泌細胞、特異性IgG分泌漿細胞及特異性IgG分泌記憶B細胞指示良好水準之針對FMDV感染之保護。

實例8 Asia Shamir BacMEB102(野生型)及BacMEB104(共價籠)

結果顯示在加熱之後呈現BacMEB104(共價籠)之大量穩定FMD VLP，且VLP穩定達至至少15個月，而BacMEB102(WT)在加熱之後不形成任何可偵測VLP。

實例9 Iraq 22 BacMEB106(共價籠)穩定性

相比於共價籠Iraq22 VLP，野生型Iraq22 VLP在第0天在加熱之後不穩定。

實例10 豬中之Asia Shamir共價籠及Iraq A22共價籠血清學研究

研究之目標為分析產生於桿狀病毒中之FMD Asia1 Shamir及FMD A22 Iraq VLP抗原之習知豬中之免疫原性。兩批Asia1 Shamir抗原及2批A22 Iraq抗原測試於TS6調配物中。各調配物以相隔三週(D0-D21)之兩次注射向豬投與。豬在D0時為8-9週齡。免疫原性經由血清學監測(D-1、D20、D42)及細胞媒介免疫(CMI)檢定(D26、D41)評估。

如圖18中所指示，來自兩種菌株之共價籠VLP均引發強力、血清型特異性血清學反應。

所有經VLP Asia1 Shamir疫苗接種之豬(G1及G3)對第一疫苗接種具明顯血清反應，平均效價接近1.20 Log10 PD50。另外，在第二疫苗接種之後存在明顯促升效應，大部分豬超出1.8 Log10 PD50之效價。對照組(G5)及大部分A22 Iraq疫苗接種豬(G2及G4)不顯示任何針對Asia1 Shamir之血清反應，甚至在強化疫苗接種之後亦如此。

所有經VLP A22 Iraq疫苗接種之豬(G2及G4)對第一疫苗接種具血清反應，平均效價接近1.15 Log10 PD50。另外，在第二疫苗接種之後存在強力促升效應，大部分豬超出2.0 Log10 PD50之效價。對照組(G5)及大部分Asia1 Shamir疫苗接種豬(G1及G3)不顯示任何針對A22 Iraq之血清反應，甚至在強化疫苗接種之後亦如此。

出人意料地，觀測到交叉反應性，如圖19中所指示。結果顯示當使用Asia1 Shamir FMDV肽池時，在兩個Asia1 Shamir VLP組中均偵測到特異性IFNγ反應(細胞反應)，且當使用A22 Iraq FMDV肽池時，在兩個A22 Iraq VLP組中均偵測到特異性IFNγ(細胞反應)。當使用A22 Iraq FMDV肽池時，Asia1 Shamir VLP組顯示交叉免疫原性。分別藉由Asia1 Shamir不活化AI塗層及A22 Iraq不活化AI塗層在兩個Asia1 Shamiar VLP組及兩個A22 Iraq VLP組中偵測到特異性漿細胞(體液反應)。藉由A22 Iraq不活化AI塗層觀測到Asia1 Shamir VLP組中之交叉免疫原性(漿細胞)。分別藉由Asia1 Shamir AI塗層及A22 Iraq AI塗層在兩個Asia1 Shamiar VLP組及兩個A22 Iraq VLP組中偵測到特異性記憶B細胞(體液反應)。藉由A22 Iraq AI塗層觀測到Asia1 Shamir VLP組中之良好交叉免疫原性(B細胞)。亦藉由Asia1 Shamir AI塗層觀測到A22 Iraq VLP組中之一些交叉免疫原性(B細胞)。結合在一起，結果指示VLP可引發足以保護免受異源攻毒之免疫反應。

總之，4種FMDV血清型-VLP抗原(A24、O1 Manisa、Asia1 Shamir及A22 Iraq)藉由強力、血清型特異性中和抗體反應、一致比例之特異性IFNγ反應、記憶B細胞(2種血清型之間具有交叉反應性)之存在、指示良好水準之針對同源及異源FMDV感染之保護輔佐TS6誘導之體液及細胞反應。

實例11 以人類腺病毒5為載體之重組FMDV之構築

研究之目標為藉由血清型A24 Cruzeiro之C142T位點突變產生表現密碼子最佳化FMDV結構蛋白及非最佳化3C蛋白酶之腺病毒重組體。藉由C142T位點突變(SEQ ID NO：16)，FMDV抗原含有FMDV衣殼前驅體(VP1、VP2(具有H93C位點突變，共價籠)、VP3、VP4、2A及完全2B密碼子最佳化)及非最佳化部分3B及全長3C蛋白酶。

HEK 293細胞(ATCC)在37℃下在5% CO₂中維持於具有10%胎牛血清(Moregate批號81827101)之MEM(Gibco編號11095)中。此等細胞用於解救重組腺病毒vAD3027及製造病毒儲備液。

表現質體pAD3027(參見圖25)含有連接至CMV啟動子及SV40 polyA尾之密碼子最佳化聚核苷酸(SEQ ID NO：17，編碼FMDV衣殼蛋白SEQ ID NO：16)。聚核苷酸包括合成內含子。

表現純系藉由使用Gateway技術(Invitrogen)用目的載體對入門載體進行LR重組產生。重組腺病毒vAD3027藉由用轉染試劑轉染HEK 293細胞中之線性化表現純系產生。在解救之後，各病毒藉由凍融循環及藉由離心澄清細胞殘渣進行採集。對於繼代，各病毒接種至HEK 293細胞之單層中且在感染後大致3-4天，病毒藉由凍融循環及藉由離心澄清進行採集。進行五個繼代以製造病毒儲備液，其儲存於-80℃下。

重組純系之序列分析確認CMV啟動子開端至SV40尾末端之序列為適當的(SEQ ID NO：20)。免疫螢光測試顯示發現vAD3027之所有檢查之空斑表現FMDV衣殼蛋白。使用針對VP2蛋白質之抗體之西方墨點法將VP2之線性抗原決定基偵測為藉由vAD3027表現之VP2(完全加工，約25kDA)、VP0(部分加工轉殖基因，約37kDa)或P1(未加工轉殖基因，約80kDa)(參見圖26)。

表現O1 Manisa、Asia及Iraq菌株之密碼子最佳化FMDV修飾之(共價籠)衣殼蛋白的腺病毒重組體根據上文所述之程序構築。

實例12在豬中疫苗接種之後的各種候選口蹄病病毒(FMDV)疫苗之血清學評估實例12.1 FMDV A24疫苗之血清學評估

研究目標為評估在豬中疫苗接種之後的各種FMDV A24疫苗調配物，包括以人類腺病毒5為載體之FMDV疫苗及桿狀病毒表現之FMD A24重組VLP(共價籠)疫苗以及不同佐劑(或無)之免疫原性。

60隻習知飼養之豬崽(大致1月齡)各自隨機分組為各含有4-7隻豬之9個處理組中之一者。所得組組成呈現於以下表11中。

TV：測試疫苗。

BacA24VLP¹：桿狀病毒表現之FMD A24重組VLP(共價籠)疫苗。

vAD3027²：以人類腺病毒5為載體之FMDV A24(共價籠)疫苗。

*第8組在D0時接受TV7且在D21時接受TV1。

**每隻豬崽之目標劑量為：就經BacA24VLP疫苗接種之彼等而言之以0.6ml活性成分之10^3.9 VLP及就經vAD3027構築體疫苗接種之彼等而言之10^10.35 TCID₅₀。

除了第9組(對照組)之外的各豬崽以21天時間間隔用2ml測試疫苗經疫苗接種兩次。所有注射在頸部區域中，在耳尾側，或者在右側及左側經由肌肉內途徑(IM)給予。

在第0(在疫苗接種之前)、7、15、21(在疫苗接種之前)、28、35及42天自所有豬崽收集血液樣品。來自所有豬崽之第42天血清樣品藉由血清病毒中和(SVN)測試FMDV抗體。來自經vAD3027構築體及對照物疫苗接種之彼等(第6-9組)之樣品在所有收集天數經受SVN檢定。

來自第1-9組之所有豬崽在研究開始之前關於FMDV抗體測試為陰性。對照組中之所有豬崽在整個研究中關於FMDV抗體為陰性。

FMDV SVN結果顯示於圖23中。結果展示FMD A24重組VLP疫苗及以人類腺病毒5為載體之FMDV疫苗均誘導動物中之免疫反應。在 10^3.9 VLP之低劑量下，FMD A24重組VLP疫苗誘導動物中之良好免疫反應。經以人類腺病毒5為載體之FMDV疫苗疫苗接種之動物(第6-7組)在兩次劑量疫苗接種方案之後比經低劑量FMD A24重組VLP疫苗疫苗接種之彼等具有更高抗體反應。出人意料地，以病毒為載體之FMDV疫苗及BacA24 VLP疫苗之異源促發-強化方案比相同疫苗之促發-強化展示更強免疫反應。

圖24顯示經研究過程(第0天-第42天)之第6-9組中之FMDV抗體效價。截至第15天(第1次疫苗接種之後2週)，來自第8組之所有vAD3027接受疫苗接種者血清轉化至FMDV。第6-7組中之彼等之29-57%之間的豬崽經血清轉化。另外，相比於第6-7組中之彼等，第8組(藉由以病毒為載體之FMDV疫苗及BacA24 VLP疫苗之異源促發-強化方案)中之每組之平均抗體效價較高。

對腺病毒之抗體反應(SVN)在第42天收集之樣品中在來自所有組之所有動物中測定。結果以Log₁₀報導且

0.6 Log₁₀之值考慮為對於血清抗體呈陰性。

結果顯示根據第42天之SN抗體效價(

0.6 Log₁₀)，所有對照及經BacA24VLP調配之疫苗疫苗接種之豬崽對腺病毒呈陰性。第6及7組中之所有經vAD3027疫苗接種之動物在效價在1.8與3.0之間變化之情況下血清轉化，而第8組中之50%之豬崽經血清轉化。總體而言，第6組中之動物對腺病毒具有較高抗體反應。

實例12.2 FMDV O1 Manisa、Asia及Iraq疫苗之血清學評估

研究之目標為評估在豬中疫苗接種之後的各種FMDV O1 Manisa、Asia及Iraq疫苗調配物，包括以人類腺病毒5為載體之FMDV疫苗及桿狀病毒表現之FMD O1 Manisa、Asia及Iraq重組VLP(共價籠)疫苗以及不同佐劑(或無)之免疫原性。

研究設計如實例12.1中所述。來自經疫苗接種動物之血液樣品在如實例12.1中所述之各階段獲取且關於血清學進行測試。結果顯示本發明之組合物或疫苗為免疫原性的且提供動物中之保護。

實例14 在習知豬及牛及MDA陽性豬及牛中疫苗接種之後的各種候選口蹄病病毒(FMDV)疫苗之血清學評估及功效

研究之目標為評估在習知豬或牛中促發-強化投與(兩次投與)兩種異源疫苗或同時投與(一次投與)兩種異源疫苗以增加免疫反應，以及在MDA陽性豬及牛中投與以克服MDA及增加免疫反應。異源疫苗可為不同類型之疫苗，諸如表現來自相同FMDV血清型之衣殼之FMDV VLP疫苗或FMDV病毒載體疫苗。異源疫苗亦可為表現不同FMDV血清型之衣殼之相同類型疫苗，諸如A24、O1 Manisa、Asia或Iraq菌株。異源疫苗亦可為表現不同FMDV血清型之衣殼之不同類型疫苗，諸如A24、O1 Manisa、Asia或Iraq菌株。異源疫苗亦可為表現不同FMDV血清型之衣殼之不同類型疫苗，亦即FMDV VLP疫苗或FMDV病毒載體疫苗，諸如A24、O1 Manisa、Asia或Iraq菌株。

在一組中，習知豬或牛以3-5週之間的時間間隔經FMDV VLP疫苗疫苗，且接著經重組病毒FMDV疫苗接種兩次，或經重組病毒FMDV疫苗促發且經FMDV VLP疫苗強化。在另一組中，習知豬或牛同時經FMDV VLP及重組病毒FMDV疫苗兩者疫苗接種一次。

在一組中，MDA陽性之豬或牛以3-5週之間的時間間隔經FMDV VLP疫苗，且接著經重組病毒FMDV疫苗疫苗接種兩次，或經重組病毒FMDV疫苗促發且經FMDV VLP疫苗強化。在另一組中，MDA陽性之豬或牛同時經FMDV VLP及重組病毒FMDV疫苗兩者疫苗接種一次。

動物在疫苗接種之後經同源或異源FMDV菌株攻毒。

藉由組合物或疫苗誘導之保護功效藉由習知動物或MDV陽性動物中之疫苗接種攻毒針對FMDV病原體評估。藉由臨床觀測及/或組織及血液這種特異性病原體之病毒負荷評估保護效應。在各階段獲取來自經疫苗接種動物之血液樣品且關於血清學進行測試。結果顯示本發明之組合物或疫苗為免疫原性的且提供習知動物及MDV陽性動物中之保護。

***

雖然已如此詳細描述本發明之各種實施例，但應瞭解由以上段落所定義之本發明並不限於在以上說明中所述之特定細節，因為不悖離本發明之精神或範疇的情況下明顯可對其進行許多修改。

本文中所引用或參考之所有文件(「本文中所引用之文件」)及本文中所引用之文件中所引用或參考之所有文件以及本文中或以引用的方式併入本文中之任何文件中所提及之任何產品的任何製造商之說明書、描述、產品規格及產品窗體皆以引用的方式併入本文中，且可用於實施本發明。

<110> 美商百靈佳殷格翰動物保健美國有限公司 (BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH USA INC.)

<120> FMDV重組疫苗及其用途

<140> TW 104131548

<141> 2015-09-23

<150> 62/054,073

<151> 2014-09-23

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2333

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A24克魯賽羅菌株(GenBank AAT01711)之野生型聚合蛋白質

<400> 1

<210> 2

<211> 1126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VP2(H93C)或P1(H179C)中之A24克魯賽羅菌株之經修飾聚合蛋白質

<400> 2

<210> 3

<211> 3378

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼A24之經修飾聚合蛋白質之聚核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 1126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A24克魯賽羅菌株之未經修飾聚合蛋白質

<400> 4

<210> 5

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMDV O1馬尼薩菌株(GenBank AAT01766)之野生型聚合蛋白質

<400> 5

<210> 6

<211> 737

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VP2(S93C)或P1(S179C)中之FMDV O1馬尼薩菌株之經修飾聚合蛋白質

<400> 6

<210> 7

<211> 2211

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼FMDV O1馬尼薩菌株之經修飾聚合蛋白質之聚核苷酸

<400> 7

<210> 8

<211> 1126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMDV伊拉克菌株之經修飾聚合蛋白質

<400> 8

<210> 9

<211> 3378

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼FMDV伊拉克菌株之經修飾聚合蛋白質之聚核苷酸

<400> 9

<210> 10

<211> 1122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMDV亞洲菌株之經修飾聚合蛋白質

<400> 10

<210> 11

<211> 3366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼FMDV亞洲菌株之經修飾蛋白質之聚核苷酸

<400> 11

<210> 12

<211> 1126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMDV伊拉克菌株之野生型聚合蛋白質

<400> 12

<210> 13

<211> 1122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMDV亞洲菌株之野生型聚合蛋白質

<400> 13

<210> 14

<211> 3378

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼FMDV伊拉克菌株之野生型聚合蛋白質之聚核苷酸

<400> 14

<210> 15

<211> 3366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼FMDV亞洲菌株之野生型聚合蛋白質之聚核苷酸

<400> 15

<210> 16

<211> 1184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 腺病毒中之FMDV衣殼蛋白

<400> 16

<210> 17

<211> 3552

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼FMDV衣殼前驅體之密碼子優化聚核苷酸

<400> 17

<210> 18

<211> 745

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CMV啟動子

<400> 18

<210> 19

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成增強子

<400> 19

<210> 20

<211> 4579

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> vAD3027中之CMV啟動子-合成增強子-密碼子優化FMDV衣殼基因-SV40聚腺苷酸

<400> 20

Claims

一種組合物，其包含口蹄病病毒(food and mouth Disease Virus；FMDV)抗原或表現FMDV抗原之重組病毒載體，其中該FMDV抗原係藉由桿狀病毒載體表現，及進一步其中該FMDV抗原序列包含位於SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16之胺基酸位置179處之半胱胺酸取代，該取代形成非天然存在之二硫橋鍵，該二硫橋鍵提供增強之熱及酸穩定性。
如請求項1之組合物，其中該FMDV抗原形成FMDV VLP或空衣殼。
如請求項1之組合物，其中該表現FMDV抗原之桿狀病毒載體係於昆蟲細胞中。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該FMDV抗原為經修飾P1多肽。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該FMDV抗原包含具有如SEQ ID NO：2、6、8、10或16中所闡述之序列之多肽。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該FMDV抗原係藉由具有如SEQ ID NO：3、7、9、11、17或20中所闡述之序列之聚核苷酸編碼。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑或媒劑。
一種經穩定轉形昆蟲細胞，其表現藉由桿狀病毒載體表現之聚核苷酸，該聚核苷酸編碼FMDV抗原，其中該FMDV抗原包含位於如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16所闡述之序列之胺基酸位置179處之半胱胺酸取代。
一種重組病毒載體，其包含一或多個編碼及表現一或多個FMDV 抗原之異源聚核苷酸，該FMDV抗原包含位於如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16所闡述之序列之胺基酸位置179處之半胱胺酸取代，且其中該FMDV抗原係藉由桿狀病毒載體表現。
如請求項9之重組病毒載體，其中該FMDV抗原係藉由具有如SEQ ID NO：3、7、9、11、17或20中所闡述之序列之聚核苷酸編碼。
一種表現於昆蟲細胞中之實質上經純化之FMDV空衣殼或FMDV VLP，其中該FMDV空衣殼或VLP包含多肽，該多肽具有位於如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16中所闡述之序列之胺基酸位置179處之半胱胺酸取代，其中該FMDV VLP係藉由桿狀病毒載體表現。
如請求項11之FMDV空衣殼或VLP，其中該多肽為包含位於SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16之胺基酸位置179處之半胱胺酸取代之經修飾FMDV P1。
一種如請求項1至7中任一項之組合物或如請求項9或10之病毒載體或如請求項11或12之FMDV空衣殼或VLP之用途，其係用於製備用於對易受FMDV感染影響之動物接種疫苗或在該動物中引發針對FMDV之免疫反應之藥物。
如請求項13之用途，其中該藥物係用於包含促發-強化投與方案(prime-boost administration regimen)之方法中。
如請求項14之用途，其中該促發-強化方案包含以下投與以保護動物免受FMDV侵害及/或防止感染動物中之疾病進展：促發投與如請求項1之組合物；及強化投與包含重組病毒載體之組合物，該重組病毒載體包含可於活體內表現FMDV抗原之聚核苷酸。
如請求項14之用途，其中該促發-強化方案包含以下投與以保護動物免受FMDV侵害及/或防止感染動物中之疾病進展：促發投與包含重組病毒載體的組合物，該重組病毒載體包含可於活體內表現FMDV抗原之聚核苷酸；及強化投與如請求項1之組合物。
如請求項13之用途，其中該藥物係供用於包含一或多次與之相同或不同之FMDV組合物或疫苗投與之方法中。
如請求項17之用途，其中該等FMDV組合物或疫苗包含活體外表現之FMDV VLP或空衣殼及活體內表現FMDV抗原之病毒載體。