KR102526219B1 - Ｆｍｄｖ 재조합 백신 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FMDV 백신 또는 조성물을 포함한다. 상기 백신 또는 조성물은 FMDV 항원을 함유하는 백신 또는 조성물이다. 본 발명은 또한 FMDV에 대항하여, 동물, 구체적으로 양, 소, 염소, 또는 돼지를 보호하는데 사용할 수 있는 FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하고 발현하는 재조합 벡터를 포함한다.

Description

ＦＭＤＶ 재조합 백신 및 이의 용도{FMDV RECOMBINANT VACCINES AND USES THEREOF}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2014년 9월 23일 출원된 미국 가출원 제62/054,073호의 우선권을 청구한다.
발명의 분야
본 발명은 동물에서 구제역 바이러스(FMDV) 감염과 싸우기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 FMDV 항원을 포함하는 약학 조성물, FMDV에 대항하여 백신을 접종하는 방법, 및 그러한 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트를 제공한다.
구제역(FMD)은 농장 동물에 발병하는 가장 치명적인 전염성 질환 중 하나이다. 이러한 질환은 전세계, 특히 아프리카, 아시아 및 남아메리카의 수많은 나라에서 고질적이다. 또한, 집단 발병이 주기적으로 일어난다. 한 나라에서 이 질환의 존재는 생산성 손실, 감염된 무리의 중량 및 우유 생산 손실, 및 이들 나라에 부과되는 통상 금지로 인해 매우 심각한 경제적 결과를 초래할 수 있다. 이 질환에 대한 조치는 국가적 또는 지역적 수준에서의 예방 조치로서, 또는 집단 발병이 발생시 주기적으로, 엄격한 수입 제한 적용, 위생 통제 및 격리, 병든 동물의 도축 및 불활성화 백신을 사용한 백신접종 프로그램으로 이루어진다.
FMD는 그의 짧은 잠복기, 그의 고도의 전염성 특성, 입과 발에 궤양의 형성 및 때때로 어린 동물의 폐사를 특징으로 한다. FMD는 수많은 동물종, 구체적으로 소, 돼지, 양 및 염소에서 발병된다. 이러한 질환의 원인이 되는 작용제는 피코르나바이러스과(Picornaviridae)의 아프토바이러스(Aphtovirus) 속에 속하는 리보핵산(RNA) 바이러스이다(Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180). 현재, 적어도 7가지 유형의 구제역 바이러스(FMDV)가 알려져 있는데, 유럽형(A, O 및 C), 아프리카형(SAT1, SAT2 및 SAT3) 및 아시아형(아시아1)이 있다. 수많은 아형이 또한 알려져 있다(Kleid et al. Science (1981), 214, 1125-1129).
FMDV는 양극성인 약 8500 뉴클레오타이드로 이루어진 단일 가닥 RNA 분자를 함유하는, 직경 약 25 nm의 나형 20면체 바이러스이다. 이러한 RNA 분자는 특히 단백질 P1 또는 P88이라고도 알려진 캡시드 전구체를 함유하는 단일 다단백질을 코딩하는 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 단백질 P1은 그의 아미노 말단 끝에 미리스틸화되어 있다. 성숙화 과정 중에, 단백질 P1은 VP0, VP1 및 VP3(또는 각각 1AB, 1D 및 1C로 알려짐; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261)으로 알려진 3개 단백질로 프로테아제 3C에 의해 절단된다. 비리온에서, 단백질 VP0는 2개 단백질, VP4 및 VP2(또는 각각 1A 및 1B)로 절단된다. VP4 및 VP2로 단백질 VPO의 전환, 및 성숙한 비리온의 형성에 관한 기전은 알려져 있지 않다. 단백질 VP1, VP2 및 VP3은 분자량이 약 26,000 Da인데 반해, 단백질 VP4는 약 8,000 Da으로 보다 작다.
캡시드 단백질의 단순 조합은 FMDV 캡시드의 기본 성분인, 5S 분자 또는 프로모터를 형성한다. 이러한 프로모터는 펩타머로 복합체화되어 12S 분자를 형성한다. 비리온은 146S 입자를 구성하는, 12개의 12S 펜타머의 조합에 의한 게놈 RNA 분자의 캡시드화에 의해 생성된다. 바이러스 캡시드는 또한 그 안에 RNA 분자의 존재없이 형성될 수도 있다(이하, "중공 캡시드"라 함). 중공 캡시드는 또한 입자 70S로 표시된다. 중공 캡시드의 형성은 바이러스 복제 동안 자연적으로 일어나거나 또는 화학적 처리에 의해 인공적으로 생성시킬 수 있다.
일부 연구들이 천연 중공 캡시드에 대해 수행되었다. 구체적으로, Rowlands 등(Rowlands et al., J. Gen. Virol., 1975, 26, 227-238)은 A10 구제역의 비리온이 주로 4개의 단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 포함하는 것을 확인하였다. 비교를 통해서, 천연 중공 캡시드(재조합에 의해 획득되지 않고 A10 구제역 바이러스의 배양으로 정제)는 미절단된 단백질 VP0를 본질적으로 함유하며 A-Pando 수족구 바이러스로 동일한 결과가 Rweyemamu(Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979, 59, 69-79)에 의해 설명되었다. Tris-EDTA의 존재 하에 투석 후 및 원심분리 후 얻은 인공 중공 캡시드는 단백질 VP4를 함유하지 않는다. 이들 인공 캡시드는 Rowlands 등에 따라서 약간 면역원성이고 천연 중공 캡시드는 그들을 안정화시키기 위한 포름알데하이드의 처리 후에만 면역원성인데 반해, 기니 피그에서 천연 중공 캡시드에 의해 유도된 항체 반응은 그럼에도 불구하고, 저자에 의해 언급된 바와 같이, 일정하지 않았다. 또한, 문헌 [Rowlands et al.] 및 [Rweyemamu et al.]은 천연 중공 캡시드를 안정화시킬 필요성은 동의하지 않았다. 문헌 [Rweyemamu et al.]에서, 포름알데하이드 처리 부재는 천연 중공 캡시드의 항원성 수준에 불리하지 않다. 면역원성은 기니 피그에서 중화 항체의 유도에 의해서만 검사된다.
곤충 세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의한 캡시드 단백질의 전구체 P1을 코딩하는 유전자의 발현은 이.콜라이(E. coli)에서 프로테아제 3C와 연관된 P1을 코딩하는 유전자의 발현과 비교된다(Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829; Lewis et al., J. Virol., 1991, 65, 6572-6580). 이.콜라이에서 P1 및 3C의 공동 발현은 중공 캡시드 70S의 조립을 야기시킨다. 이들 2개 구성물의 발현 생성물은 기니 피그 및 돼지에서 중화 항체를 생산한다. P1/배큘로바이러스 구성물로 얻은 역가는 낮다. 이들 동일한 발현 생성물은 돼지에서 부분 보호를 유도한다. 그러나, 질환에 대항하여 보호된 일부 돼지는 챌린지 바이러스의 복제에 대항해서는 보호되지 않는다. 그러나, 이. 콜라이 발현 시스템은 단백질을 미리스틸화하지 않고 프로테아제 3C는 이 세포에 유독하다. 문헌 [Lewis et al.]은 동물에서 최대 보호성을 획득하는데 필요한 캡시드의 구조 및 바이러스의 구성과 관련된 근본 문제가 아직 해결되지 않았다고 결론내렸다. 또한, 문헌 [Grubman et al.]은 백신을 제제화하기 전에 중공 캡시드를 안정화시키는데 필수적이라고 서술되어 있고, 이러한 점에서, 그들은 바이러스 배양에서 추출을 통해 얻은 중공 캡시드가 마주하게 되는 문제에 대해 동의한다(상기 참조).
단백질 P1의 일부 또는 전부를 함유하는 융합 단백질은 또한, 바이러스 벡터, 즉 헤르페스 바이러스 또는 백시니아 바이러스의 사용으로 획득되었다. CA-A-2,047,585는, 구체적으로 소 헤르페스 바이러스의 당단백질 gpIII과 융합된 구제역 바이러스의 펩티드 서열(P1의 아미노산 200 내지 213에 결합된 P1의 아미노산 141 내지 158)을 함유하는 융합 단백질을 생산하는데 사용된 소 헤르페스 바이러스를 기술한다. 바이러스 벡터는 또한 안정화된 FMDV 중공 캡시드(US 7,531,182)를 발현하는데 사용되었다. 최근에, 식물이 FMDV 항원의 생산을 위한 공급원으로서 연구되었다(US 2011/0236416).
많은 가설, 조사 경로, 및 제안들이 FMD에 대항한 효과적인 백신을 디자인하기 위한 시도로 개발되었다. 최근에, 시판되는 백신만이 불활성화된 바이러스를 함유한다. 유럽에서 FMD의 발병이 백신 제조의 결점과 연관되어 있어서, FMDV의 안전성 문제가 존재한다(King, A.M.Q. et al., 1981, Nature 293: 479-480). 불활성화된 백신은 장기간 면역성을 부여하지 않고, 따라서 정해진 매년, 또는 집단 발병 사건의 경우 보다 자주 부스터 주사를 요한다. 또한, 불완전 불활성화 및/또는 불활성화된 백신의 생산 동안 바이러스의 누출과 연관된 위험성이 존재한다(King, A.M.Q., ibid). 당분야의 목표는 효율적이고 안전한 백신을 만들기 위해 감염성 FMDV 게놈이 결여된 입체형태적으로 정확한 면역원을 제작하는 것이다.
모체 이행 항체(MDA)가 FMD에 대항한 백신접종에 대한 소(2연령 이하의 소)의 반응을 억제할 수 있다고 보고된 바 있다(Graves, 1963, Journal of Immunology 91:251-256; Brun et al., 1977, Developments in Biological Standardisation, 25:117-122).
FMDV에 대한 동물(비록 드물지라도, 인간을 포함)의 감수성을 고려하여, FMDV 감염을 예방하고 동물을 보호하는 방법이 필수적이다. 따라서, FMDV에 대항한 보다 효과적이고 안정한 백신의 필요성이 존재한다.
항원성 FMDV 폴리펩타이드 및 이의 단편 및 변이체를 포함하는 조성물 또는 백신 및 FMDV 폴리펩타이드 및 이의 단편 및 변이체를 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신이 제공된다. FMDV 항원 및 이의 단편 및 변이체는 면역원성 및 보호성 특성을 보유한다. FMDV 항원은 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 생산될 수 있다. FMDV 항원은 FMDV 중공 캡시드 또는 FMDV VLP(바이러스-유사 입자)의 안정성이 강화되도록 개질될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터는 FMDV 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
항원성 폴리펩타이드 및 이의 단편 및 변이체 또는 재조합 바이러스 벡터는 백신 및/또는 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 백신 또는 조성물은 동물을 백신접종하고 동종성 및 이종성 FMDV 균주에 대항한 보호성을 제공하는데 사용될 수 있다.
FMDV 감염에 대항하여 통상의 동물 및 모체 이행 항체-양성(MDA-양성) 동물에서 보호성을 강화하기 위한 방법을 제공한다. 적어도 하나의 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
본 발명을 단지 기술된 특정 실시형태로 국한하려는 의도없이, 예로서 제공된 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 최고로 이해될 수 있다:
도 1은 DNA 및 단백질 서열을 요약한 표를 도시한다.
도 2는 발현된 FMDV 다단백질 및 3C에 의한 프로세스를 나타낸다.
도 3은 pMEB097의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 4는 MacMEB097의 전자 현미경 결과를 도시한다.
도 5는 A24 균주의 FMDV 캡시드 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 도시한다.
도 6A 및 6B는 BacMEB099의 전자 현미경 및 특이적 ELISA를 도시한다.
도 7A-7D는 단백질 서열의 서열 정렬을 도시한다.
도 8은 FMDV VLP를 도시한다.
도 9는 평균 FMDV A24 크루제이루 중화 항체 역가의 전개를 도시한다.
도 10은 FMDV A24 크루제이루 중화 항체 역가를 도시한다.
도 11A 및 11B는 평균 FMDV A24 크루제이루 중화 항체 역가의 전개를 도시한다.
도 12A-12C는 챌린지 후 평균 직장 온도의 전개를 도시한다.
도 13은 열 또는 산 존재 또는 부재 하에서 공유 케이지 돌연변이가 있거나 또는 없는 A24 크루제이루 VLP의 EM 분석을 도시한다.
도 14는 가열 후 A24 크루제이루 혈청형에 대한 공유 케이지 돌연변이가 있거나 또는 없는 VLP의 ELISA 분석 결과를 도시한다.
도 15는 시간 경과에 따라 5℃에 저장된 공유 케이지 돌연변이가 있거나 또는 없는 A24 크루제이루 VLP의 ELISA 분석 결과를 도시한다.
도 16은 O1 마니사 공유 케이지 VLP가 열에 내성임을 보여주는 ELISA 결과 및 EM 사진을 도시한다.
도 17은 산(위) 및 열(아래)에서 O1 마니사 공유 케이지 VLP의 안정성을 보여주는 ELISA 결과를 도시한다.
도 18A는 백신접종 및 분석 계획을 도시한다. 도 18B는 FMD 아시아1 샤미르 및 FMD A22 이라크에 대항한 중화 항체 역가의 전개를 도시한다.
도 19A는 체액성 반응(기억 B 세포 검출) 계획을 도시한다. 도 19B는 아시아 샤미르 공유 케이지 & 이라크 A22 공유 케이지 VLP 혈청학 데이터를 도시한다.
도 20은 27일에 FMDV VLP 백신접종된 동물에서 B 세포 ELISPOT 검정 결과를 도시한다.
도 21은 43일에 FMDV VLP 백신접종된 동물에서 B 세포 ELISPOT 검정 결과를 도시한다(B 기억 세포 측정).
도 22는 27일에 FMDV VLP 백신접종된 동물에서 특이적 γ 인터페론(IFNγ) 분비 세포 검정 결과를 도시한다.
도 23은 42일 동안 그룹들에 의한 FMDV SVN log10 역가를 도시한다.
도24는 실험 과정 동안(0일-42일) 평균 FMDV VN log10 역가를 도시한다.
도 25는 플라스미드 pAD3027 지도를 도시한다.
도 26은 vAD3027의 웨스턴 블롯을 도시한다.
FMDV 폴리펩타이드, 항원 및 이의 단편 및 변이체를 포함하는 조성물 및 동물에서 면역 반응을 유발하는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다. 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체는 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 생산된다. 재조합 바이러스 벡터는 FMDV 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 항원성 폴리펩타이드 또는 단편 또는 변이체 또는 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터는 백신 또는 약학 조성물로 제제화될 수 있고 동물에서 보호 반응을 유발시키거나 또는 자극시키는데 사용된다. 일 실시형태에서 폴리펩타이드 항원은 FMDV P1, VP2 또는 3C 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편 또는 변이체이다. FMDV 항원은 FMDV 중공 캡시드 또는 FMDV VLP(바이러스 유사 입자)의 안정성이 강화되도록 개질될 수 있다.
본 발명의 항원성 폴리펩타이드는 전체 길이 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편 또는 변이체일 수 있음을 이해한다. "활성 단편" 또는 "활성 변이체"는 단편 또는 변이체가 폴리펩타이드의 항원성 성질을 보유하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 동물에서 면역 반응을 유발하는 임의의 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함한다. FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 동물, 예컨대 양, 소, 염소 또는 돼지에서 반응을 유발시키거나, 유도하거나 또는 자극하는 임의의 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 예컨대 제한없이, 단백질, 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
특정 FMDV 항원성 폴리펩타이드는 P1, VP2 및 3C를 포함한다. FMDV는 양극성의, 약 8500 뉴클레오타이드로 이루어진 단일 가닥 RNA 분자를 함유하는, 직경이 약 25 nm인 무-엔벨로프의(non-enveloped) 20면체 바이러스이다. 이러한 RNA 분자는 특히 단백질 P1 또는 P88이라고도 알려진, 캡시드 전구체를 함유하는 단일 다단백질을 코딩하는, 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 단백질 P1은 이의 아미노 말단 끝에 미리스틸화된다. 성숙화 과정 동안, 단백질 P1은 VP0, VP1 및 VP3(또는 각각 1AB, 1D 및 1C; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261)이라고 알려진 3개 단백질로 프로테아제 3C에 의해 절단된다. 비리온에서, 단백질 VP0는 2개 단백질, VP4 및 VP2(또는 각각 1A 및 1B)로 절단된다. 단백질 VP1, VP2 및 VP3은 분자량이 약 26,000 Da인데 반해, 단백질 VP4는 약 8,000 Da으로 보다 작다. FMDV 서열은 또한 미국 특허 제7,527,960호 및 미국 특허 제7,531,182호에 기술되어 있고, 이 문헌들을 그들 전체로 참조하여 본원에 편입시킨다.
캡시드 단백질의 단순 조합은 FMDV 캡시드의 기본 성분인 5S 분자 또는 프로모터를 형성한다. 이후 이 프로모터는 펜타머로 복합체화되어 12S 분자를 형성한다. 비리온은 12개 12S 펜타머의 조립에 의해 게놈 RNA 분자의 캡시드화에 의해 생성되어서, 146S 입자로 구성된다. 바이러스 캡시드는 또한 그 안에 RNA 분자의 존재없이 형성될 수도 있다(이하, "중공 캡시드"). 중공 캡시드는 또한 입자 70S라고도 표시한다. 중공 캡시드의 형성은 바이러스 복제 동안 자연적으로 일어나거나 또는 화학적 처리에 의해 인공적으로 생성될 수 있다.
본 발명은 재조합 FMDV 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터의 유효량, 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제 또는 비히클을 포함할 수 있는 소, 양, 염소, 또는 돼지 백신 또는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 백신은 미국 특허 제7371395호에 기술된 보조제, 예컨대 수중유(O/W) 에멀션을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 보조제는 EMULSIGEN, 수산화알루미늄, 사포닌, 및 CpG, 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 동물의 반응은 보호 면역 반응이다.
"동물"이란, 목적하는 포유동물, 조류 등이다. 동물 또는 숙주는 포유동물 및 인간을 포함한다. 동물은 말과(예를 들어, 말), 갯과(예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 재칼), 고양잇과(예를 들어, 사자, 호랑이, 애완용 고양이, 야생 고양이, 다른 대형 고양이, 치타 및 스라소니를 포함한 다른 고양잇과), 양과(예를 들어, 양), 솟과(예를 들어, 소, 젖소), 돼지류(예를 들어, 돼지), 염소류(예를 들어, 염소), 조류(예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 되새류, 매, 수탉, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류(예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 기번 원숭이, 유인원), 및 어류로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 용어 "동물"은 또한 배아 및 태아기를 포함한, 모든 발생기의 개별 동물을 포함한다.
달리 설명하지 않으면, 본원에서 사용하는 모든 기술 및 과학 용어는 본원이 속하는 숙련가가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는다. 단수 용어 "한", "하나", 및 "그"는 문맥에서 명확하게 언급하지 않으면 복수 대상을 포함한다. 유사하게, 용어 "또는"은 문맥에서 명확하게 언급하지 않으면 "및"을 포함하고자 한다.
본원에서 구체적으로 청구항 및/또는 단락에서, "포함하다", "포함된", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 간주하는 의미를 가지며, 예를 들어, "포괄하다", "포괄된", "포괄하는" 등을 의미할 수 있고, "본질적으로 이루어지는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 지정하는 의미를 가지며, 예를 들어, 명백하게 언급하지 않은 성분을 허용하지만, 종래에 발견되거나 또는 본 발명의 기본 또는 신규 특징에 영향을 미치는 성분을 배제하지 않는다.
본 발명의 항원성 폴리펩타이드는 FMDV에 대항해 보호할 수 있다. 다시 말해서, 동물에서 면역 반응을 자극할 수 있다. "항원" 또는 "면역원"이란 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 전체 유기체, 사멸, 약독화 또는 생존 유기체; 유기체의 서브유닛 또는 일부분; 면역원성 특성을 갖는 삽입물을 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시되면 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 조각 또는 단편; 폴리펩타이드, 에피토프, 합텐, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다. 다르게, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용시 용어 "면역원성 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드"는 숙주에 투여되면, 단백질에 대항하여 유도된 체액성 및/또는 세포 유형의 면역 반응을 일으킬 수 있다는 의미에서 면역학적으로 활성인 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게, 단백질 단편은 전체 단백질과 동일한 면역학적 활성을 실질적으로 갖는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 단편은 적어도 하나의 에피토프 또는 항원성 결정부를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진다. 본원에서 사용시, "면역원성" 단백질 또는 폴리펩타이드는 단백질의 전체 길이 서열, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. "면역원성 단편"이란 1 이상의 에피토프를 포함하고 따라서 상기 기술된 면역학적 반응을 유발시키는 단백질의 단편을 의미한다. 그러한 단편은 당분야에 충분히 공지된, 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용해 동정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 단백질 분자의 일부분에 상응하는 펩타이드인, 많은 수의 펩타이드를 고상 지지체 상에서 동시에 합성시키고, 그 펩타이드를 여전히 지지체 상에 부착시킨 상태로, 펩타이드를 항체와 반응시켜서 결정할 수 있다. 이러한 기술은 당분야에 공지이고 예를 들어, 미국 특허 제4,708,871호; 문헌 [Geysen et al., 1984, PNAS USA, 81(13): 3998-400; Geysen et al., 1985, PNAS USA, 82(1): 178-82]에 기술되어 있다. 유사하게, 입체형태 에피토프는 예컨대, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명 등에 의해 아미노산의 공간 입체형태를 결정하여 쉽게 동정한다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, 상동]을 참조한다. 티. 파르바(T. parva)의 단백질에 특히 적용할 수 있는 방법은 그 전체로 참조하여 본원에 편입시킨 PCT/US2004/022605에 자세히 설명되어 있다.
기술된 바와 같이, 본 발명은 항원성 폴리펩타이드의 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 따라서, 용어 "면역원성 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드"는 폴리펩타이드가 본원에 정의된 바와 같이, 면역학적 반응을 생성시키는 기능을 하는 한, 서열에 대한 결실, 부가, 및 치환을 더욱 고려한다. 용어 "보존성 변이"는 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환, 또는 코딩된 아미노산 잔기가 변화되지 않거나 또는 다른 생물학적으로 유사한 잔기이도록 하는 핵산 서열의 뉴클레오타이드의 치환을 의미한다. 이러한 점에서, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 사실상 보존성이고, 다시 말해서, 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 치환이다. 예를 들어, 아미노산은 대체로 다음의 4개 패밀리로 나뉜다: (1) 산성--아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예는 하나의 소수성 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등; 또는 생물학적 활성에 주요한 효과를 갖지 않는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 보존성 치환을 포함한다. 기준 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 소수의 아미노산 치환을 보유하는 단백질은 따라서, 기준 폴리펩타이드의 정의 내이다. 이들 개질에 의해 생성되는 모든 폴리펩타이드가 본원에 포함된다. 용어 "보존성 변이"는 또한 치환된 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체가 미치환된 폴리펩타이드와 면역반응한다면 미치환된 부모 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함한다.
용어 "에피토프"는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 합텐 상의 부위를 의미한다. 이 용어는 또한 "항원성 결정부" 또는 "항원성 결정 부위"와 상호교환적으로 사용된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 한 항체의 능력을 보여주는 단순 면역검정법으로 동정될 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응"은 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 발생이다. 일반적으로, "면역학적 반응"은 제한없이, 다음의 효과 중 1 이상을 포함한다: 관심 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 유도된, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생산. 바람직하게, 숙주는 신규 감염에 대한 내성이 강화되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되도록 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낸다. 그러한 보호는 감염된 숙주에 의해 정상적으로 나타나는 증상의 감소 또는 결여, 보다 신속한 회복 시간 및/또는 감염된 숙주에서 낮아진 바이러스 역가로 입증될 것이다.
합성 항원은 또한, 예를 들어, 폴리에피토프, 측접한 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성 유도 항원을 그 정의에 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998]을 참조한다. 본 발명의 목적을 위해, 면역원성 단편은 일반적으로, 분자의 적어도 약 3개 아미노산, 적어도 약 5개 아미노산, 적어도 약 10-15개 아미노산, 또는 약 15-25개 아미노산 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 단편의 길이에 결정적인 상한치는 존재하지 않고, 거의 전체 길이의 단백질 서열, 또는 단백질의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다.
따라서, 에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오타이드의 최소 구조는 FMDV 폴리펩타이드의 에피토프 또는 항원성 결정부를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 것이다. FMDV 폴리펩타이드의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 최소 15개 뉴클레오타이드, 약 30-45개 뉴클레오타이드, 약 45-75개, 또는 적어도 57개, 87개 또는 150개의 연속하는 또는 인접하는 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이의 하이브리드인 RNA 또는 DNA를 의미한다. 이 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 개질된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체, 우라실, 다른 당류 및 연결기 예컨대 플루오로리보스 및 티올레이트, 및 뉴클레오타이드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 중합 후에, 예컨대 표지된 성분과의 접합에 의해 더욱 개질될 수 있다. 이러한 정의에 포함되는 다른 유형의 개질은 캡, 유사체로 1 이상의 천연 발생 뉴클레오타이드의 치환, 및 폴리뉴클레오타이드를 단백질, 금속 이온, 표지화 성분, 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 고상 지지체에 부착시키기 위한 수단의 도입이다. 폴리뉴클레오타이드는 화학 합성에 의해 얻거나 또는 미생물로부터 유도될 수 있다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 폴리뉴클레오타이드의 임의 절편을 의미하는데 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 게놈 서열처럼 인트론 및 엑손, 또는 cDNA처럼 코딩 서열 및/또는 그들 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 유전자는 또한 mRNA 또는 기능성 RNA를 발현하거나, 또는 특이적 단백질을 코딩하고, 조절 서열을 포함하는 핵산 단편을 의미한다.
본 발명은 FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상보성인 가닥을 더 포함한다. 상보성 가닥은 중합체이고 임의 길이일 수 있으며, 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 및 임의 조합의 유사체를 함유할 수 있다.
용어 "단백질", "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "폴리펩타이드 단편"은 임의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 개질된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있으며, 아미노산 이외의 화학 모이어티가 개재될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 개질되거나 또는 개재에 의해, 예를 들어 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 개질, 예컨대 표지화 또는 생활성 성분과의 접합에 의해 개질된 아미노산 중합체를 포함한다.
"단리된" 생물학적 성분(예컨대 핵산 또는 단백질 또는 소기관)은 성분이 자연적으로 존재하는 유기체 세포내 다른 생물학적 성분들, 예를 들어, 다른 염색체 및 염색체 외 DNA 및 RNA, 단백질, 및 소기관으로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 성분을 의미한다. "단리된" 핵산 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 이 용어는 또한 재조합 기술을 비롯해 화학 합성으로 제조된 핵산 및 단백질을 포함한다.
본원에서 사용시 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않고, 그 보다는 상대적인 용어를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 정제된 폴리펩타이드 조제물은 폴리펩타이드가 그 폴리펩타이드가 이의 천연 환경에서 존재하는 것보다 더 농축된 것이다. 다시 말해 폴리펩타이드가 세포 성분으로부터 분리된다. "실질적으로 정제된"은 폴리펩타이드가 세포 성분 또는 물질의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 그 이상이 제거된 몇몇 실시형태를 나타내는 것으로 의미한다. 유사하게, 폴리펩타이드는 부분적으로 정제될 수 있다. "부분 정제된"은 세포 성분 또는 물질의 60% 미만이 제거된 것을 의미한다. 동일하게 폴리뉴클레오타이드에도 적용된다. 본원에 개시된 폴리펩타이드는 당분야에 공지된 임의 수단으로 정제할 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체는 시험관 내 곤충 세포 중 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 또는 생체 내 바이러스 벡터에 의해 생산된 FMDV 항원성 폴리펩타이드이다. 개시된 폴리뉴클레오타이드의 단편 및 변이체 및 이에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 본 발명에 포함된다. "단편"은 폴리뉴클레오타이드의 일부분 또는 이에 의해 코딩된 항원성 아미노산 서열의 일부분을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드의 단편은 천연 단백질의 생물학적 활성을 보유하고 따라서, 본원에서 언급한 바와 같은 면역원성 활성을 갖는 단백질 단편을 코딩할 수 있다. 폴리펩타이드 서열의 단편은 동물에서 보호성 면역 반응을 유도하는 능력을 보유한다.
"변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미하고자 한다. 폴리뉴클레오타이드의 경우, 변이체는 천연 폴리뉴클레오타이드 내 1 이상의 부위에 1 이상의 뉴클레오타이드의 결실 및/또는 부가, 및/또는 천연 폴리뉴클레오타이드의 1 이상의 부위에 1 이상의 뉴클레오타이드의 치환을 포함한다. 본원에서 사용시, "천연" 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 각각 천연 발생 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 폴리뉴클레오타이드(즉, 기준 폴리뉴클레오타이드)의 변이체는 변이체 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드와 기준 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드 간 서열 동일성 비율을 비교하여 평가할 수 있다. "변이체" 단백질은 천연 단백질의 1 이상의 부위에 1 이상의 아미노산의 결실 또는 부가 및/또는 천연 단백질의 1 이상의 부위에 1 이상의 아미노산의 치환에 의해 천연 단백질로부터 유도된 단백질을 의미하고자 한다. 본 발명에 포함되는 변이체 단백질은 생물학적 활성이고, 즉 그들이 면역 반응을 유발시키는 능력을 갖는다.
일 측면에서, 본 발명은 양, 소, 염소, 또는 돼지 FMDV 단리주 유래의 FMDV 폴리펩타이드를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 또는 16에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이의 변이체 또는 단편을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 FMDV 중공 캡시드 또는 FMDV VLP(바이러스-유사 입자)의 온도 및/또는 산 안정성을 개선시키는 것과 관련된다. 중공 캡시드의 온도 및/또는 산 안정성은 유리하게 이황화 브릿지의 형성에 의해 보장된다.
구체적으로, 이러한 개선은 본래 서열의 아미노산을 캡시드의 구조 단백질, 단백질 VP2(P1에서 유도)의 폴리펩타이드 서열 내 시스테인으로, 예를 들어 아미노산 서열 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 16(FMDV A24 균주, FMDV O1 마니사 균주, FMDV 이라크 균주, 또는 FMDV 아시아 균주의 P1)의 179 위치에서, 치환시켜 얻는다. 일반적으로, 이 아미노산의 위치는 다른 구제역 바이러스 유래의 VP2 단백질에서와 동일하다(특히 실시예에 기술된 균주처럼). 이 아미노산을 함유하는 영역은 알파 나선에 상응한다. 돌연변이되는 아미노산을 동정하거나 또는 확인하기 위해서, 이 영역의 아미노산 서열은 서열이 상이한 FMDV 간에 구조에서 충분히 보존되어 있다는 점을 고려하여 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 16의 서열 상의 상응하는 영역(예를 들어, 대략 10 또는 약간 그 이상, 예를 들어 10 내지 20개 아미노산)과 정렬된다. 돌연변이되는 아미노산은 FMDV P1(서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 또는 16)의 위치 179에 존재한다. 관례 상, 개시 코돈에 상응하는 메티오닌(천연 서열에 존재하지 않아서 부가됨)이 1로 번호매겨진다.
또한, 양, 소, 염소, 또는 돼지 유래의 FMDV 폴리펩티드의 상동체를 본 발명의 범주 내에 포함하고자 한다. 본원에서 사용시, 용어 "상동체"는 오르쏘로그, 유사체 및 파라로그를 포함한다. 용어 "유사체"는 동일하거나 또는 유사한 기능을 갖지만, 미관련 유기체에서 개별적으로 진화된 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 용어 "오르쏘로그"는 상이한 종에서 유래하지만, 공통 조상 유전자로부터 종분화에 의해 진화된 2개 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 정상적으로, 오르쏘로그는 동일하거나 또는 유사한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 코딩한다. 용어 "파라로그"는 게놈 내에서 중복과 관련된 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 파라로그는 일반적으로 상이한 기능을 갖지만, 이들 기능은 관련될 수 있다. 야생형 FMDV 폴리펩타이드의 유사체, 오르쏘로그, 및 파라로그는 번역 후 개질, 아미노산 서열 차이, 또는 둘 모두가 야생형 FMDV 폴리펩타이드와 상이할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 상동체는 일반적으로 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타내며, 야생형 FMDV 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부가 유사한 기능을 나타낼 것이다. 변이체는 대립유전자 변이체를 포함한다. 용어 "대립유전자 변이체"는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 초래하고 천연 개체군(예를 들어, 바이러스 종 또는 품종) 내에 존재하는 다형성을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 천연 대립유전자 변이는 전형적으로 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 1-5% 변이량을 초래한다. 대립유전자 변이체는 그들 종에서 동일한 유전자의 유전자좌를 동정하기 위한 혼성화 프로브를 사용해 쉽게 수행할 수 있는, 수많은 상이한 종에서의 관심 핵산 서열을 서열분석하여 동정할 수 있다. 천연 대립유전자 변이의 결과이고 관심 유전자의 기능적 활성을 변경시키지 않는 임의의 모든 그러한 핵산 변이 및 최종 아미노산 다형체 또는 변이를 본 발명의 범주 내에 포함하고자 한다.
본원에서 사용시, 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 (1) 상응하는 폴리펩타이드가 야생형 폴리펩타이드와 비교시 실질적으로 균등한 기능을 갖거나 또는 (2) 폴리펩타이드에 대항해 생성된 항체가 야생형 폴리펩타이드와 면역반응성이도록 1 이상의 보존성 아미노산 변이 또는 다른 소수의 개질을 갖는, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 이들 변이체 또는 유도체는 미개질된 대응 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 균등한 활성을 갖는 펩타이드를 생성시킬 수 있는 FMDV 폴리펩타이드 1차 아미노산 서열의 소수 개질을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 개질은 부위-지정 돌연변이유발법으로서, 의도적이거나, 또는 자발적일 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 폴리펩타이드가 본원에 정의된 바와 같이 면역학적 반응을 생성시키는 기능을 하는 한, 서열에 결실, 부가 및 치환을 더 고려한다.
용어 "보존성 변이"는 다른 생물학적으로 유사한 잔기로 아미노산 잔기의 치환, 또는 코딩된 아미노산 잔기가 변하지 않거나 또는 다른 생물학적으로 유사한 잔기가 되도록 핵산 서열 내 뉴클레오타이드의 치환을 의미하다. 이러한 점에서 특히 바람직한 치환은 대체로 상기 기술된 바와 같이, 사실상 보존성이다.
본원의 폴리뉴클레오타이드는 유전자 코드, 예를 들어, 특정 숙주의 최적 코돈 용법의 결과로서 축퇴성인 서열을 포함한다. 본원에서 사용시, "최적화"는 소정 종에서 그 발현이 증가되도록 유전자 조작된 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. FMDV 폴리펩타이드를 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오타이드를 제공하기 위해서, FMDV 단백질 유전자의 DNA 서열은 1) 특정 종에서 고도로 발현된 유전자에 의해 선호되는 코돈을 포함하거나; 2) 상기 종에서 실질적으로 존재하는 뉴클레오타이드 염기 조성으로 A+T 또는 G+C 함량을 포함하거나; 3) 상기 종의 개시 서열을 형성하거나; 또는 4) 탈안정화, 부적절한 폴리아데닐화, RNA의 분해 및 종결, 또는 2차 구조 헤어핀 또는 RNA 스플라이싱 부위를 형성하는 서열을 제거하도록 개질될 수 있다. 상기 종에서 FMDV 단백질의 증가된 발현은 진핵생물 및 원핵생물, 또는 특정 종에서 코돈 용법의 분포 빈도를 이용하여 획득할 수 있다. 용어 "바람직한 코돈 용법의 빈도"는 소정 아미노산을 특정하는 뉴클레오타이드 코돈의 용법으로 특정 숙주 세포에 의해 나타나는 선호도를 의미한다. 대부분이 1개 초과의 코돈으로 특정되는 20개 천연 아미노산이 존재한다. 따라서, 모든 축퇴성 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 FMDV 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 기능적으로 변하지 않는 한 본원에 포함된다.
2개 아미노산 서열 간 서열 동일성은 표준 변수를 사용하는, NCBI(National Center for Biotechnology Information) 쌍별 블라스트 및 blosum62 매트릭스를 통해 규명할 수 있다(예를 들어, "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md., USA) 서버를 비롯해, 문헌 [Altschul et al.]에서 이용할 수 있는 BLAST 또는 BLASTX 알고리즘을 참조하며, 따라서, 본 문헌은 이러한 알고리즘 또는 BLAST 또는 BLASTX 및 BLOSUM62 매트릭스를 "블라스트"라는 용어를 사용해 언급한다).
서열에 관한 "동일성"은 2개 서열 중 보다 짧은 것의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수로 나눈 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 갖는 위치의 수를 의미하고 여기서 2개 서열의 정렬은 Wilbur 및 Lipman 알고리즘에 따라 결정된다. 2개 아미노산 서열의 서열 동일성 또는 서열 유사성, 또는 2개 뉴클레오타이드 서열 간 서열 동일성은 벡터 NTI 소프트웨어 패키지(Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA)를 사용해 결정할 수 있다. RNA 서열이 유사하거나, 또는 DNA 서열과 서열 동일성 또는 상동성 정도를 갖는다고 할때, DNA 서열의 티민(T)은 RNA 서열 내 우라실(U)과 동일하게 간주한다. 따라서, RNA 서열은 본 발명의 범주에 속하고, DNA 서열의 티민(T)을 RNA 서열의 우라실(U)로 간주하여, DNA 서열로부터 유도할 수 있다.
혼성화 반응은 상이한 "엄격성" 조건 하에서 수행될 수 있다. 혼성화 반응의 엄격성을 증가시킨 조건은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]을 참조한다.
본 발명은 벡터 분자 또는 발현 벡터에 함유되고 프로모터 성분 및 선택적으로 인핸서에 작동적으로 연결된 FMDV 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다.
"벡터"는 시험관 내 또는 생체 내에서, 표적 세포에 전달되는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 플라스미드 또는 바이러스에 관한 것이다. 이종성 폴리뉴클레오타이드는 예방 또는 요법의 목적으로 관심 서열을 포함할 수 있고, 경우에 따라 발현 카세트의 형태일 수 있다. 본원에서 사용시, 벡터는 궁극적인 표적 세포 또는 피험체에서 복제할 필요가 없다. 이 용어는 클로닝 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하다.
용어 "재조합"은 자연계에서 존재하지 않거나, 또는 자연계에서 발견되지 않는 배열로 다른 폴리뉴클레오타이드에 연결된 폴리뉴클레오타이드의 반합성, 또는 합성 기원을 의미한다.
"이종성"은 비교하려는 독립체의 나머지와 유전적으로 별개인 독립체로부터 유도된 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 유전자 조작 기술에 의해 상이한 공급원에서 유도된 플라스미드 또는 벡터에 위치될 수 있고, 이종성 폴리뉴클레오타이드이다. 이의 천연 코딩 서열에서 제거되고 천연 서열 이외의 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터가 이종성 프로모터이다.
본 발명은 재조합 FMDV 항원의 유효량 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있는 양, 소, 염소 및 돼지 백신 또는 약학적 또는 면역학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 기술된 대상 주제는 부분적으로, 고도로 면역원성이고 동종성 및 이종성 FMDV 균주로부터의 챌린지에 대항하여 동물을 보호하는 배큘로로바이러스/곤충 세포 발현 시스템으로 제조된 FMDV 항원에 관한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
조성물
본 발명은 재조합 FMDV 항원의 유효량 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 함유할 수 있는 FMDV 백신 또는 조성물에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 재조합 FMDV 항원은 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 발현된다. 다른 실시형태에서, FMDV 백신 또는 조성물은 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태는 FMDV 중공 캡시드를 포함하는 백신 또는 조성물에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 FMDV 중공 캡시드를 발현하는 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물에 관한 것이다. FMDV 중공 캡시드는 영역 P1, 2A/2B'/3B' 및 3C의 cDNA의 발현으로 얻는다. FMDV 중공 캡시드 또는 FMDV VLP(바이러스 유사 입자)는 강화된 열 및/또는 산(낮은 pH) 안정성으로 개질될 수 있다.
본 발명은 구제역에 대항한, 구체적으로 그들의 열 및/또는 산(낮은 pH) 안정성을 개선하기 위한 백신에 관한 것이다. 또한 이들 백신의 제조 방법, 이들 백신을 제조하기 위한 항원의 용도 및 이들을 사용한 백신접종 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 바이러스의 천연 서열과 비교해 개질된, 뉴클레오타이드 서열, 구체적으로 cDNA, 및 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개질된 뉴클레오타이드 서열의 발현 생성물 및 FMDV 항원 및 이들 개질이 도입된 바이러스에 관한 것이다.
본 발명은 동물, 예컨대 양, 소, 염소 또는 돼지에서 면역원성 반응을 유발시키는 임의의 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함한다. FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 임의의 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 예컨대 제한없이, 동물, 예컨대 양, 소, 염소 또는 돼지에서 반응을 유발시키거나, 유도하거나 또는 자극하는 단백질, 펩타이드 또는 이의 단편일 수 있다.
FMDV 면역학적 조성물 또는 백신이 재조합 면역학적 조성물 또는 백신인 실시형태에서, 조성물 또는 백신은 재조합 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 부형제, 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하고, 재조합 벡터는 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 배큘로바이러스 발현 벡터이다. FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, NS1, VP7, NS2, VP6, NS3, NS3a, P1, VP0, 3C, 또는 이의 임의 단편일 수 있다.
다른 실시형태에서, FMDV 항원은 P1, VP0, VP3, VP1, VP2, VP4, 2A, 2B, 또는 3C이다.
일 실시형태에서, 1 이상의 FMDV 항원(들)을 코딩하는 핵산 분자는 FMDV P1 영역을 코딩하는 cDNA 및 FMDV의 FMDV 3C 프로테아제를 코딩하는 cDNA이다.
일 실시형태에서, FMDV 항원은 P1-3C 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 실시형태에서, FMDV 항원은 P1 단독, 또는 P1-2A/2B1일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, FMDV 항원은 VP0-VP3일 수 있다. 다른 실시형태에서, FMDV 항원은 VP4-VP2일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, FMDV 항원은 3C이거나, 또는 곤충 세포에서 발현을 위해 최적화된 5'UTR을 갖는 3C일 수 있다. 일 실시형태에서, P1-2A/2B1 및 3C 폴리펩타이드 둘 모두는 단일 구성체를 사용해 곤충 세포에서 발현될 수 있고, 발현은 1 이상의 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 다른 실시형태에서, FMDV 항원은 개질된 P1 또는 VP2이다.
다른 실시형태에서, FMDV 항원은 FMDV O1 마니사, O1 BFS 또는 캄포스, A24 크루제이루, 아시아 1 샤미르, A 이란'96, A22 이라크, SAT2 사우디 아라비아에서 유래될 수 있다.
본 발명은 재조합 FMDV 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터의 유효량, 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제 또는 비히클을 포함할 수 있는 FMDV 백신에 관한 것이다.
다른 실시형태에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클은 유중수 에멀션일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 유중수 에멀션은 수중유 에멀션일 수 있다.
본 발명은 벡터 분자 또는 발현 벡터에 함유되고 프로모터 성분 및 경우에 따라 인핸서에 작동적으로 연결된 FMDV 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 FMDV 폴리펩타이드, 특히 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 또는 16 및 이의 변이체 또는 단편에 기재된 서열을 갖는 양, 소, 염소 또는 돼지 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원성 폴리펩타이드, 구체적으로 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 또는 16에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 충분히 공지된 분자 생물학 기술을 사용해 당업자가 쉽게 제조할 수 있는 상기 동정된 FMDV 폴리펩타이드(서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 또는 16)의 단편 및 변이체를 제공한다.
변이체는 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 또는 16에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성의 아미노산 서열을 갖는 상동성 폴리펩타이드이다.
FMDV 폴리펩타이드의 면역원성 단편은 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 또는 16에 기재된 서열을 갖는 FMDV 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체의 적어도 8, 10, 15, 또는 20개 연속 아미노산, 적어도 21개 아미노산, 적어도 23개 아미노산, 적어도 25개 아미노산, 또는 적어도 30개 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, FMDV 폴리펩타이드의 단편은 전체 길이 FMDV 폴리펩타이드 상에 존재하는 특이적 항원성 에피토프를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 또는 16에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 같은, FMDV 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 또는 16에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드, 또는 이들 폴리펩타이드 중 하나의 적어도 8개 또는 적어도 10개 연속하는 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립유전자 변이체, 상동체 또는 면역원성 단편, 또는 상기 폴리펩타이드의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 3, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 19, 또는 20에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 변이체를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 3, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 19, 또는 20에 기재된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 중 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 변이체를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 추가 서열, 예컨대 동일한 전사 유닛 내 추가의 코딩 서열, 제어 성분 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서, 5'UTR, 3'UTR, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위, 동일하거나 상이한 프로모터 제어 하의 추가 전사 유닛, 클로닝, 발현, 상동성 재조합, 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 서열, 및 본 발명의 실시형태를 제공하는 것이 바람직한 임의의 그러한 구성체를 포함할 수 있다.
FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원의 발현을 위한 성분은 유리하게 본 발명의 벡터에 존재한다. 최소 방식으로, 이는 개시 코돈(ATG), 중지 코돈 및 프로모터, 경우에 따라 또한 일정 벡터 예컨대 플라스미드 및 일정 바이러스 벡터, 예를 들어, 폭스바이러스 이외의 바이러스 벡터를 위한 폴리아데닐화 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 폴리뉴클레오타이드가 다단백질 단편, 예를 들어 FMDV 펩타이드를 코딩하는 경우, 유리하게, 벡터에서, ATG는 리딩 프레임의 5'에 위치하고 중지 코돈은 3'에 위치한다. 발현을 제어하기 위한 다른 성분들, 예컨대 인핸서 서열, 안정화 서열, 예컨대 인트론 및 단백질의 분비를 허용하는 신호 서열이 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 벡터, 예컨대 발현 벡터를 포함하는 조제물, 예를 들어, 치료 조성물에 관한 것이다. 조제물은 1 이상의 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함하고 발현하는, 1 이상의 벡터, 예를 들어 발현 벡터, 예컨대 생체 내 발현 벡터를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 벡터는 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 비히클에, FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩(및 유리하게 발현)하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 함유하고 발현한다. 따라서, 본 발명의 실시형태에 따라, 조제물 중 다른 벡터 또는 벡터들은 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어지고, 적절한 상황 하에서, 벡터는 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 또는 이의 단편의 1 이상의 다른 단백질을 발현한다.
다른 실시형태에 따라서, 조제물 중 벡터 또는 벡터들은 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원의 1 이상의 단백질 또는 이의 단편(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, 벡터 또는 벡터들은 상기 폴리뉴클레오타이드(들)를 발현한다. 다른 실시형태에서, 조제물은 유리하게, 생체 내에서, FMDV 폴리펩타이드, 항원, 융합 단백질 또는 이의 에피토프를 코딩하고 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 1, 2, 또는 그 이상의 벡터를 포함한다. 본 발명은 또한 상이한 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원, 예를 들어, 상이한 동물 종, 예컨대 제한없이, 양, 소, 염소 또는 돼지 유래의 FMDV 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하고 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터의 혼합물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 추가 실시형태에 따라서, 발현 벡터는 플라스미드 벡터 또는 DNA 플라스미드 벡터, 구체적으로 생체 내 발현 벡터이다. 특정한 비제한적인 예에서, pVR1020 또는 1012 플라스미드(VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7(10): 1205-17; 예를 들어, 미국 특허 제5,846,946호 및 제6,451,769호 참조)는 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입을 위한 벡터로 이용될 수 있다. pVR1020 플라스미드는 pVR1012로부터 유도되고 인간 tPA 신호 서열을 함유한다. 일 실시형태에서, 인간 tPA 신호는 수탁번호 HUMTPA14 하에 유전자은행의 아미노산 M(1)에서 아미노산 S(23)까지 포함된다. 다른 특정한 비제한적인 예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입을 위한 벡터로 이용되는 플라스미드는 수탁번호 U28070 하에 유전자 은행의 아미노산 M(24)에서 아미노산 A(48)까지 말 IGF1의 신호 펩타이드 서열을 함유할 수 있다. 실시에 참고하거나 적용할 수 있는 DNA 플라스미드에 관한 추가 정보는 예를 들어 미국 특허 제6,852,705호, 제6,818,628호, 제6,586,412호, 제6,576,243호, 제6,558,674호, 제6,464,984호, 제6,451,770호, 제6,376,473호, 및 제6,221,362호를 참조한다.
용어 플라스미드는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 DNA 전사 유닛 및 원하는 숙주 또는 표적의 세포 또는 세포들에서 그의 생체 내 발현에 필요한 성분을 포괄하고, 이러한 면에서, 수퍼코일 또는 비수퍼코일의, 환형 플라스미드를 비롯한, 선형 형태를 본 발명의 범주 내에 포함하고자 한다.
각각의 플라스미드는 프로모터에 작동적으로 연결되거나 또는 프로모터의 제어 하이거나 또는 프로모터에 의존적인, 경우에 따라 이종성 펩타이드 서열, 변이체, 유사체 또는 단편에 융합된, FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 비롯해 포함하거나 또는 함유하거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 대체로, 진핵생물 세포에서 기능성인 강력한 프로모터를 적용하는 것이 유리하다. 강력한 프로모터는 제한없이, 인간 또는 쥣과동물 기원의 전초기 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV-IE), 또는 경우에 따라 래트 또는 기니 피그와 같은 다른 기원을 갖는 것, 수퍼 프로모터일 수 있다(Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995.). CMV-IE 프로모터는 인핸서 부분과 회합되거나 또는 회합되지 않을 수 있는, 실제 프로모터 부분을 포함할 수 있다. EP-A-260 148, EP-A-323 597, 미국 특허 제5,168,062호, 제5,385,839호, 및 제4,968,615호를 비롯해, PCT 출원 WO87/03905를 참조한다. CMV-IE 프로모터는 유리하게 인간 CMV-IE(Boshart et al., 1985, Cell, 41(2): 521-30) 또는 쥣과동물 CMV-IE이다.
보다 일반적으로, 프로모터는 바이러스, 식물 또는 세포 기원을 갖는다. 본 발명의 실시에 유용하게 적용할 수 있는 CMV-IE 이외의 강력한 바이러스 프로모터는 SV40 바이러스의 초기/후기 프로모터 또는 루이스 사르코마 바이러스의 LTR 프로모터이다. 본 발명의 실시에 유용하게 적용할 수 있는 강력한 세포 프로모터는 예컨대 데스민 프로모터(Kwissa et al., 2000, Vaccine, 18(22): 2337-44), 또는 액틴 프로모터(Miyazaki et al., 1989, Gene, 79(2): 269-77) 등과 같은 세포골격 유전자의 프로모터이다.
플라스미드는 다른 발현 제어 성분을 포함할 수 있다. 안정화 서열(들), 예를 들어, 인트론 서열(들), 예를 들어, 옥수수 알콜 디히드로게나제 인트론(Callis et al. Genes & Dev.1(10):1183-1200, Dec. 1987), hCMV-IE의 제1 인트론(PCT 출원 WO1989/01036), 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 II(van Ooyen et al., 1979, Science, 206(4416): 337-44)를 도입시키는 것이 특이 유리하다. 다른 실시형태에서, 플라스미드는 3' UTR을 포함할 수 있다. 3' UTR은 제한없이, 아그로박테리움(agrobacterium) 노팔린 신타제(Nos) 3' UTR(Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721)일 수 있다.
폭스바이러스 이외에 플라스미드 및 바이러스 벡터에 대한 폴리아데닐화 신호(폴리A)로서, 소 성장 호르몬(bGH) 유전자(미국 특허 제5,122,458호)의 폴리(A) 신호, 또는 토끼 β-글로빈 유전자의 폴리(A) 신호 또는 SV40 바이러스의 폴리(A) 신호를 이용할 수 있다.
"숙주 세포"는 유전자적으로 변경되거나 또는 외생성 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 투여에 의해 유전자적으로 변경될 수 있는 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 의미한다. 유전자적으로 변경된 세포를 언급시, 이 용어는 본래 변경된 세포와 이의 자손 둘 모두를 의미한다.
일 실시형태에서, 재조합 FMDV 항원은 곤충 세포에서 발현된다.
사용 방법
일 실시형태에서, 본원에 개시된 대상은 재조합 FMDV 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터의 유효량, 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함할 수 있는 백신의 유효량을 양, 소, 염소 또는 돼지에 투여하는 단계를 포함하는 양, 소, 염소, 또는 돼지를 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 에멀션으로 제제화된 백신 조성물의 단일 투여를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 면역학적 또는 백신 조성물은 폴리펩타이드 및 VLP(바이러스-유사 입자) 또는 중공 캡시드를 포함한, 배큘로바이러스 발현된 FMDV 항원, 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 전자 현미경은 배큘로바이러스 발현 벡터로 형질전환된 곤충 세포가 FMDV VLP 또는 FMDV 중공 캡시드를 생산하는 것을 보여주며, 본 발명에 따른 면역학적 또는 백신 조성물은 FMDV VLP 또는 FMDV 중공 캡시드를 포함하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 방법은 2종의 이종성 백신 조성물의 단일 투여를 포함한다. 이종성 백신 또는 조성물은 상이한 유형의 백신, 예컨대 FMDV VLP 백신 또는 FMDV 바이러스 벡터 백신일 수 있다. 이종성 백신은 또한 A24, O1 마니사, 아시아 또는 이라크 균주 등과 같은 상이한 FMDV 혈청형의 캡시드를 발현하는 동일 유형의 백신일 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 개시된 대상은 곤충 세포에서 배큘로바이러스 벡터에 의해 생산된 FMDV 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 양, 소, 염소 또는 돼지에 투여하는 단계를 포함하는 양, 소, 염소, 또는 돼지를 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본원에 개시된 대상은 곤충 세포에서 배큘로바이러스 벡터에 의해 생산된 FMDV 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신을 양, 소, 염소, 또는 돼지 백신에 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 유발시키는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본원에 개시된 대상은 곤충 세포에서 배큘로바이러스 벡터에 의해 생산된 FMDV 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 단리하는 단계 및 경우에 따라 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클과 배합하는 단계를 포함하는 백신 또는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
동종성 및 이종성 FMDV 균주 둘 모두는 백신의 효능을 시험하기 위한 챌린지에 사용된다. 투여는 피하 또는 정맥으로 할 수 있다. 투여는 바늘을 함유하지 않는다(예를 들어, Pigjet 또는 Bioject).
본 발명의 일 실시형태에서, 적어도 하나의 공통 폴리펩타이드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용한 적어도 1회의 1차 투여 및 적어도 1회의 부스터 투여를 포함하는, 프라임-부스트 계획을 적용할 수 있다. 1차 투여에 사용되는 면역학적 조성물 또는 백신은 부스터로 사용되는 것과 실제로 상이하다. 그러나, 동일한 조성물이 1차 투여 및 부스트로서 사용될 수 있음을 주의한다. 이러한 투어 프로토콜을 "프라임-부스트"라고 한다.
본 발명에 따른 프라임-부스트는 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 FMDV 코딩 서열 또는 이의 단편을 발현하는데 사용되는 재조합 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 구체적으로, 바이러스 벡터는 항원성 폴리펩타이드를 코딩하는 FMDV 유전자 또는 이의 단편을 발현할 수 있다. 본원에서 고려하는 바이러스 벡터는 제한없이, 폭스바이러스[예를 들어, 백시니아 바이러스 또는 약독화 백시니아 바이러스, 아비폭스 바이러스 또는 약독화 아비폭스 바이러스(예를 들어, 카나리폭스, 파울폭스, 도브폭스, 피젼폭스, 퀘일폭스, ALVAC, TROVAC; 예를 들어, 미국 특허 제5,505,941호, 미국 특허 제5,494,8070호 참조), 라쿤폭스 바이러스, 스와인폭스 바이러스 등], 아데노바이러스(예를 들어, 인간 아데노바이러스, 개 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스(예를 들어, 개 헤르페스 바이러스, 칠면조 헤르페스 바이러스, 마렉병 바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스, 고양이 헤르페스 바이러스, 후두기관염 바이러스(ILTV), 소 헤르페스 바이러스, 돼지 헤르페스 바이러스), 배큘로바이러스, 레트로바이러스 등을 포함한다. 다른 실시형태에서, 아비폭스 발현 벡터는 카나리폭스 벡터, 예컨대, ALVAC일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 아비폭스 발현 벡터는 파울폭스 벡터, 예컨대, TROVAC일 수 있다. 발현시키는 본 발명의 FMDV 항원은 특이적 폭스바이러스 프로모터, 예를 들어 엔토모폭스바이러스 암사크타 무레이(Amsacta moorei) 42K 프로모터(Barcena, Lorenzo et al., 2000, J Gen Virol., 81(4): 1073-85), 백시니아 프로모터 7.5 kDa(Cochran et al., 1985, J Virol, 54(1): 30-7), 백시니아 프로모터 I3L(Riviere et al., 1992, J Virol, 66(6): 3424-34), 백시니아 프로모터 HA(Shida, 1986, Virology, 150(2): 451-62), 카우폭스 프로모터 ATI(Funahashi et al., 1988, J Gen Virol, 69 (1): 35-47), 백시니아 프로모터 H6 (Taylor et al., 1988, Vaccine, 6(6): 504-8; Guo et al., 1989, J Virol, 63(10): 4189-98; Perkus et al., 1989, J Virol, 63(9): 3829-36.) 등의 제어 하에 삽입된다.
다른 실시형태에서, 아비폭스 발현 벡터는 카나리폭스 벡터, 예컨대, ALVAC일 수 있다. FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원은 FMDV P1-3C일 수 있다. FMDV 바이러스 벡터는 카나리폭스 바이러스 예컨대 vCP2186, vCP2181, 또는 vCP2176, 또는 파울폭스 바이러스 예컨대 vFP2215(미국 특허 제7,527,960호 참조)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원은 좀개구리밥에서 생산시킬 수 있다(US 2011/0236416).
본 발명의 프라임-부스트 프로토콜의 다른 측면에서, 본 발명의 FMDV 항원을 포함하는 조성물은 투여 후에 생체 내에서 FMDV 항원을 함유하여 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 FMDV 항원을 포함하는 불활성화된 바이러스 백신 또는 조성물, 또는 FMDV 항원을 함유하거나 또는 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물의 투여가 후속된다. 유사하게, 프라임-부스트 프로토콜은 생체 내에서 FMDV 항원을 함유하고 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 백신 또는 조성물, 또는 FMDV 항원을 포함하는 불활성화된 바이러스 백신 또는 조성물, 또는 FMDV 항원을 함유하거나 또는 발현하는 DNA 플라스미드 백신 또는 조성물의 투여와 후속하여, 본 발명의 FMDV 항원을 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 1차 및 2차 투여 둘 모두는 본 발명의 FMDV 항원을 포함하는 조성물을 포함할 수 있음을 더욱 주의한다.
프라임-부스트 프로토콜은 적어도 하나의 공통 폴리펩타이드 및/또는 이의 변이체 또는 단편을 사용한 적어도 1회의 프라임-투여 및 적어도 1회의 부스트 투여를 포함한다. 프라임 투여에 사용되는 백신은 이후 부스터 백신으로서 사용되는 것과 사실상 상이할 수 있다. 프라임-투여는 1 이상의 투여를 포함할 수 있다. 유사하게, 부스트 투여는 1 이상의 투여를 포함할 수 있다.
포유동물인 표적 종에 대한 조성물의 용량 부피, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예를 들어 비폭스바이러스-바이러스 벡터 기반 조성물을 기반으로, 양, 소, 염소 또는 돼지 조성물의 용량 부피는 대체로 약 0.1 내지 약 5.0 mL, 약 0.1 내지 약 3.0 mL, 및 약 0.5 mL 내지 약 2.5 mL이다.
백신의 효능은 FMDV의 독성 균주, 유리하게 FMDV O1 마니사, O1 BFS 또는 캠포스, A24 크루제이루, 아시아 1 샤미르, A 이란'96, A22 이라크, SAT2 사우디 아라비아 균주를 사용한, 동물, 예컨대 양, 소, 염소 또는 돼지를 챌린지하여 마지막 면역화 이후 약 2 내지 4주에 시험할 수 있다.
여전히 다른 균주는 FMDV 균주 A10-61, A5, A12, A24/크루제이루, C3/인다이알, O1, C1-산타 파우, C1-C5, A22/550/아제르바이잔/65, SAT1-SAT3, A, A/TNC/71/94, A/IND/2/68, A/IND/3/77, A/IND/5/68, A/IND/7/82, A/IND/16/82, A/IND/17/77, A/IND/17/82, A/IND/19/76, A/IND/20/82, A/IND/22/82, A/IND/25/81, A/IND/26/82, A/IND/54/79, A/IND/57/79, A/IND/73/79, A/IND/85/79, A/IND/86/79, A/APA/25/84, A/APN/41/84, A/APS/44/05, A/APS/50/05, A/APS/55/05, A/APS/66/05, A/APS/68/05, A/BIM/46/95, A/GUM/33/84, A/ORS/66/84, A/ORS/75/88, A/TNAn/60/947/아시아/1, A/IRN/05, 아시아/IRN/05, O/HK/2001, O/UKG/3952/2001, O/UKG/4141/2001, 아시아 1/HNK/CHA/05(유전자은행 수탁 번호 EF149010, 본원에 참조로 편입시킴), 아시아 I/XJ(Li, ZhiYong et al. Chin Sci Bull, 2007), HK/70(Chin Sci Bull, 2006, 51(17): 2072-2078), O/UKG/7039/2001, O/UKG/9161/2001, O/UKG/7299/2001, O/UKG/4014/2001, O/UKG/4998/2001, O/UKG/9443/2001, O/UKG/5470/2001, O/UKG/5681/2001, O/ES/2001, HKN/2002, O5인디아, O/BKF/2/92, K/37/84/A, KEN/1/76/A, GAM/51/98/A, A10/Holland, O/KEN/1/91, O/IND49/97, O/IND65/98, O/IND64/98, O/IND48/98, O/IND47/98, O/IND82/97, O/IND81/99, O/IND81/98, O/IND79/97, O/IND78/97, O/IND75/97, O/IND74/97, O/IND70/97, O/IND66/98, O/IND63/97, O/IND61/97, O/IND57/98, O/IND56/98, O/IND55/98, O/IND54/98, O/IND469/98, O/IND465/97, O/IND464/97, O/IND424/97, O/IND423/97, O/IND420/97, O/IND414/97, O/IND411/97, O/IND410/97, O/IND409/97, O/IND407/97, O/IND399/97, O/IND39/97, O/IND391/97, O/IND38/97, O/IND384/97, O/IND380/97, O/IND37/97, O/IND352/97, O/IND33/97, O/IND31/97, O/IND296/97, O/IND23/99, O/IND463/97, O/IND461/97, O/IND427/98, O/IND28/97, O/IND287/99, O/IND285/99, O/IND282/99, O/IND281/97, O/IND27/97, O/IND278/97, O/IND256/99, O/IND249/99, O/IND210/99, O/IND208/99, O/IND207/99, O/IND205/99, O/IND185/99, O/IND175/99, O/IND170/97, O/IND164/99, O/IND160/99, O/IND153/99, O/IND148/99, O/IND146/99, O/SKR/2000, A22/인디아/17/77을 포함한다.
이들 FMDV 균주의 추가 상세 설명은 유럽 생물정보학 정보(EMBL-EBI) 웹 페이지 상에서 확인할 수 있고, 모든 연관된 뉴클레오타이드 서열을 본원에 참조로 편입시킨다. 본 발명자들은 본원에 열거하고, 아직 동정해야 되는 모든 FMDV 균주를 본원의 교시에 따라 발현시켜서, 예를 들어 효과적인 백신 조성물을 생산하는 것을 고려한다. 동종성 및 이종성 균주 둘 모두가 백신의 효능을 시험하기 위한 챌린지에 사용된다. 동물은 피부내, 피하, 분무, 비내, 안내, 기관내, 및/또는 경구로 챌린지될 수 있다.
프라임-부스트 투여는 유리하게 1 내지 6주 간격, 예를 들어 약 3주 간격으로 수행될 수 있다. 일 실시형태에 따라서, 유리하게 바이러스 벡터-기반 백신을 사용한, 반년 부스터 또는 년간 부스터가 또한 고려된다. 동물은 유리하게 제1 투여 시에 적어도 6 내지 8주령이다.
프라임-부스트 프로토콜에 사용되는 본 발명의 재조합 항원성 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 비히클, 희석제, 보조제 또는 부형제에 함유된다. 본 발명의 프로토콜은 양, 소, 염소 또는 돼지 FMDV로부터 동물을 보호하고/하거나 감염된 동물에서 질환 진행을 예방한다.
본원은 예로서 제공되고 본 발명을 이에 제한하려는 것이 아님을 당업자는 이해해야 한다. 당분야의 지식 및 본원에 개시로부터, 당업자는 임의의 과도한 실험없이, 각 주사 프로토콜에 사용되는 투여 횟수, 투여 경로, 및 용량을 결정할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따라 제조된 치료 조성물의 유효량의 적어도 1회의 동물 투여를 고려한다. 동물은 수컷, 암컷, 임신한 암컷 및 신생 동물일 수 있다. 이 투여는 제한없이, 근육내(IM), 피부내(ID) 또는 피하(SC) 주사 또는 비내 또는 경구 투여를 포함한 다양한 경로를 통할 수 있다. 본 발명에 따른 치료 조성물은 또한 무바늘 장비로 투여될 수 있다(예를 들어, Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet(Merial, GA, USA), Vetjet 또는 Vitajet 장비(Bioject, Oregon, USA)). 플라스미드 조성물을 투여하는 다른 접근법은 전기천공을 사용하는 것이다(예를 들어, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; PCT 출원 WO99/01158을 참조). 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 유전자 총 또는 금 입자 충격을 통해 동물에 전달된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 표적 세포에 FMDV 항원 또는 에피토프의 전달 및 발현을 위한 제제의 치료 유효량의 투여를 제공한다. 치료 유효량의 결정은 당업자 중 한명의 통상의 실험이다. 일 실시형태에서, 제제는 FMDV 항원 또는 에피토프를 발현하는 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 비히클 또는 부형제를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 비히클 또는 부형제는 숙주 동물에 폴리뉴클레오타이드의 형질 감염 또는 다른 전달 수단을 용이하게 하고/하거나 숙주에서 벡터 또는 단백질의 보존을 개선시킨다.
일 실시형태에서, 본원에 개시된 대상은 감염 및 백신접종 동물 사이의 구별(DIVA)을 위한 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 백신 또는 조성물의 사용이 동물에서 FMDV 감염 검출을 가능하게 한다는 것을 본원에서 개시한다. 본 발명의 백신 또는 조성물의 사용이 감염 및 백신접종 동물 간 구별(DIVA)에 의해 동물에서 감염을 검출할 수 있음을 본원에서 개시한다. FMDV 비구조 단백질(예를 들어, FMDV 3ABC 또는 3D-특이적 ELISA)을 사용해 동물에서 FMDV의 감염을 진단하기 위한 방법을 본원에서 개시한다.
제조 물품
일 실시형태에서, 본원에 개시된 대상은 재조합 FMDV 면역학적 조성물 또는 백신, 또는 불활성화된 FMDV 면역학적 조성물 또는 백신, 재조합 FMDV 바이러스 조성물 또는 백신 중 어느 하나, 및 방법 수행을 위한 설명서를 포함할 수 있는 면역 반응을 유발시키거나 또는 유도시키는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 FMDV 항원을 포함하는 조성물 또는 백신 및 재조합 FMDV 바이러스 면역학적 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 유발시키기 위한 유효량을 전달하는 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 동물에서 FMDV에 대항하여 면역학적 또는 보호성 반응을 유도시키는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 FMDV 항원을 포함하는 조성물 또는 백신 및 불활성화된 FMDV 면역학적 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 유발시키기 위한 유효량을 전달하는 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 동물에서 FMDV에 대항하여 면역학적 또는 보호성 반응을 유도시키는 방법을 수행하기 위한 키트이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 프라임-부스트 백신접종을 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 적어도 2개의 바이알을 포함하는데, 제1 바이알은 본 발명에 따른 프라임-백신접종용 백신 또는 조성물을 함유하고, 제2 바이알은 본 발명에 따른 부스트-백신접종용 백신 또는 조성물을 함유한다. 키트는 유리하게 추가의 프라임-백신접종 또는 추가의 부스트-백신접종을 위한 추가의 제1 또는 제2 바이알을 함유한다.
이하의 실시형태를 본원에 포함시킨다. 일 실시형태에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 실시형태에서, FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클을 포함하는 조성물을 개시한다. 다른 실시형태에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 양, 소, 염소, 또는 돼지 FMDV 항원의 적어도 15개 아미노산을 포함하는 면역원성 단편을 포함하는 상기 기술된 조성물을 개시한다. 일 실시형태에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 부분 정제된 상기 조성물을 개시한다. 일 실시형태에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 실질적으로 정제된 상기 조성물을 개시한다.
일 실시형태에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 양, 소, 염소, 또는 돼지 FMDV 폴리펩타이드인 상기 조성물을 개시한다. 일 실시형태에서, FMDV 폴리펩타이드가 P1-3C 폴리펩타이드, P1 폴리펩타이드, VP0 폴리펩타이드, VP1 폴리펩타이드, VP3 폴리펩타이드, VP2 폴리펩타이드, VP4 폴리펩타이드, 2A 폴리펩타이드, 2B1 폴리펩타이드, 또는 3C 폴리펩타이드인 상기 조성물을 개시한다. 일 실시형태에서, FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체가 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13 또는 16에 개시된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 조성물을 개시한다. 일 실시형태에서, FMDV 항원이 서열번호 3, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 18, 19 또는 20에 기재된 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 상기 조성물을 개시한다. 일 실시형태에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클이 유중수 에멀션 또는 수중유 에멀션인 상기 조성물을 개시한다. 다른 실시형태에서, 동물에게 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 양, 소, 염소, 또는 돼지 FMDV에 감수성인 동물을 백신접종하는 방법을 개시한다. 일 실시형태에서, 프라임-부스트 계획을 포함하는 양, 소, 염소, 또는 돼지 FMDV에 감수성인 동물을 백신접종하는 방법을 개시한다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드가 서열번호 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 또는 16에 기재된 서열을 갖는 폴리펩타이드와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 곤충 세포에서 발현된 실질적으로 정제된 항원성 폴리펩타이드를 개시한다. 임의 실시형태에서, 동물은 바람직하게 양, 소, 돼지, 또는 염소이다. 일 실시형태에서, 동물에서 FMDV 감염을 진단하는 방법을 개시한다. 또 다른 실시형태에서, 제1 바이알은 FMDV 항원 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물을 함유하고, 제2 바이알은 FMDV 항원을 함유하거나 또는 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 함유하는, 적어도 2개의 바이알을 포함하는 프라임-부스트 백신접종을 위한 키트를 개시한다.
약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체 또는 비히클 또는 보조제 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체 또는 비히클 또는 부형제는 0.9% NaCl(예를 들어, 염수) 용액 또는 포스페이트 완충액일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 다른 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체 또는 비히클 또는 부형제는 제한없이, 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체 또는 비히클 또는 보조제 또는 부형제는 벡터(또는 시험관 내에서 본 발명의 벡터에서 발현된 단백질)의 투여를 촉진하는 임의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있고, 유리하게 담체, 비히클 또는 부형제는 형질감염을 촉진하고/하거나 벡터(또는 단백질)의 보존성을 개선시킬 수 있다. 투약 및 용량 부피는 일반 설명에서 설명하고 또한 임의의 과도한 실험없이, 당분야의 지식과 함께 본원을 내용으로부터 당업자가 결정할 수 있다.
유리하지만 배타적이지 않게 플라스미드에 적합한 4차 암모늄 염을 함유하는 양이온 지질은 유리하게 하기 화학식을 갖는 것들이다:
Figure 112017039482288-pct00001
상기 식에서, R1은 12개 내지 18개 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화된 직쇄 지방족 라디칼이고, R2는 2개 또는 3개 탄소 원자를 함유하는 다른 지방족 라디칼이고 X는 아민 또는 하이드록실 기, 예를 들어 DMRIE이다. 다른 실시형태에서, 양이온 지질은 중성 지질, 예를 들어 DOPE와 회합될 수 있다.
이들 양이온 지질 중에서, DMRIE-DOPE를 형성하도록, 유리하게 중성 지질, 유리하게 DOPE(디올레오일-포스파티딜-에탄올 아민; Behr, 1994)와 회합된, DMRIE(N-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판 암모늄; WO96/34109)가 바람직하다.
유리하게, 보조제와 플라스미드 혼합물은 즉석으로, 유리하게 조제물의 투여와 동시에 또는 조제물의 투여 직전에 형성되고, 예를 들어 투여 직전 또는 전에, 플라스미드-보조제 혼합물은, 유리하게, 복합체를 형성하도록 혼합물의 투여 전에 충분한 시간이 주어지게, 예를 들어 투여 전 약 10분 내지 약 60분, 예컨대 투여 전 대략 30분에 형성된다.
DOPE가 존재할 때, DMRIE:DOPE 몰비율은 유리하게 약 95: 약 5∼약 5: 약 95, 보다 유리하게 약 1: 약 1, 예를 들어, 1:1이다.
DMRIE 또는 DMRIE-DOPE 보조제:플라스미드 중량비는 약 50: 약 1∼약 1: 약 10, 예컨대 약 10: 약 1∼약 1:약 5, 및 약 1: 약 1∼약 1: 약 2, 예를 들어, 1:1 내지 1:2일 수 있다.
다른 실시형태에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 또는 비히클은 유중수 에멀션일 수 있다. 적합한 유중수 에멀션의 예는 4℃에서 유동성이고 안정한 오일 기반 유중수 백신 에멀션을 포함하고, 이는 6 내지 50 v/v%의 항원-함유 수성층, 바람직하게 12 내지 25 v/v%, 50 내지 94 v/v%의 전체 또는 부분으로 비대사성 오일(예를 들어, 광유 예컨대 파라핀유) 및/또는 대사성 오일(예를 들어, 식물성유 또는 지방산, 폴리올 또는 알콜에스테르)을 함유하는 오일층, 0.2 내지 20 p/v%의 계면활성제, 바람직하게 3 내지 8 p/v%를 함유하고, 후자는 전체 또는 부분이거나, 또는 혼합물로서 폴리글리세롤 에스테르이고, 상기 폴리글리세롤 에스테르는 바람직하게 폴리글리세롤 (폴리)리시놀레에이트, 또는 폴리옥시에틸렌 리신 오일 또는 수첨 폴리옥시에틸렌 리신 오일이다. 유중수 에멀션에 사용될 수 있는 계면활성제의 예는 에톡시화 솔비탄 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레에이트 (TWEEN 80®), AppliChem, Inc.(Cheshire, CT)에서 입수)) 및 솔비탄 에스테르(예를 들어, 솔비탄 모노올레에이트(SPAN 80®), Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 입수)를 포함하다. 또한, 유중수 에멀션은, 미국 특허 제6,919,084호에서, 예를 들어 이의 실시예 8을 참조하며, 이를 참조로 본원에 편입시킨다. 일부 실시형태에서, 항원-함유 수성상은 1 이상의 완충제를 포함하는 염수 용액을 포함한다. 적합한 완충 용액의 예는 포스페이트 완충 염수이다. 유리한 실시형태에서, 유중수 에멀션은 물/오일/물(W/O/W) 삼중 에멀션이다(미국 특허 제6,358,500호). 다른 적합한 에멀션의 예가 미국 특허 제7,371,395호에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 면역학적 조성물 및 백신은 1 이상의 보조제를 포함할 수 있거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 본 발명의 실시에 사용하기 위한 적합한 보조제는 (1) 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체 중합체, (2) 면역자극 서열(ISS), 예컨대 1 이상의 비-메틸화 CpG 유닛을 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 서열(Klinman et al., 1996, PNAS USA, 93(7): 2879-83; WO98/16247), (3) 수중유 에멀션, 예컨대 문헌 ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, 6: 147, 183]의 147 페이지에 기술된 SPT 에멀션, 및 동일 문헌의 183 페이지에 기술된 에멀션 MF59, (4) 4차 암모늄 염을 함유하는 양이온 지질, 예를 들어, DDA (5) 사이토카인, (6) 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원에 참조로 인용 및 편입시킨 임의 문헌에 설명된 다른 보조제, 또는 (9) 이의 임의 조합 또는 혼합물이다.
바이러스 벡터에 특히 적절한, 수중유 에멀션 (3)은 경질 액상 파라핀 오일(유럽 약전 유형), 이소프레노이드 오일 예컨대 스쿠알란, 스쿠알렌, 알켄의 올리고머화에 의한 오일, 예를 들어 이소부텐 또는 데센, 직쇄 알킬 기를 갖는 산 또는 알콜의 에스테르 예컨대 식물성 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜, 디(카프릴레이트/카프레이트), 글리세롤 트리(카프릴레이트/카프레이트) 및 프로필렌 글리콜 디올레에이트, 또는 분지된, 지방 알콜 또는 산의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다.
오일은 에멀션을 형성하도록 유화제와 조합하여 사용된다. 유화제는 비이온성 계면활성제, 예컨대: 한편으로는 솔비탄의 에스테르, 만니드(예를 들어, 언하이드로만니톨 올레에이트), 글리세롤, 폴리글리세롤 또는 프로필렌 글리콜 및 다른 한편, 올레산, 이소스테아르산, 리시놀산 또는 하이드록시스테아르산일 수 있고, 상기 에스테르는 경우에 따라 에톡시화, 또는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 예컨대 Pluronic, 예를 들어, L121이다.
유형 (1) 보조제 중합체 중에서, 특히 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐 에테르에 의해 가교된, 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체가 바람직하다. 이들 화합물은 카보머의 명칭으로 알려져 있다(Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). 당업자는 또한 미국 특허 제2,909,462호를 참조하는데, 여기에는 적어도 3개의 하이드록실 기의 수소 원자가 적어도 2개 탄소 원자를 갖는 불포화된, 지방족 라디칼로 치환된, 적어도 3개의 하이드록실 기, 바람직하게는 그러한 기가 8개를 넘지 않는 폴리하이드록실 화합물에 의해 가교된 아크릴산 중합체를 제공한다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개 탄소 원자를 함유하는 것, 예를 들어 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이다. 불포화 라디칼은 또한 다른 치환기, 예컨대 메틸을 함유할 수 있다. 카르보폴이라는 명칭 하에 판매되는 제품(BF Goodrich, Ohio, USA)이 특히 적합하다. 그들은 알릴 사카로스 또는 알릴 펜타에리쓰리톨에 의해 가교된다. 그들 중에서, 카르보폴 974P, 934P 및 971P를 참조한다.
말레산 무수물-알케닐 유도체 공중합체로서, 바람직한 것은 EMA(Monsanto)인데, 직쇄 또는 가교된 에틸렌-말레산 무수물 공중합체이고, 이들은 예를 들어 디비닐 에테르에 의해 가교된다. 또한 문헌 [J. Fields et al., 1960]을 참조한다.
구조에 관하여, 아크릴산 또는 메타크릴산 중합체 및 EMA는 바람직하게 하기 화학식을 갖는 기본 유닛에 의해 형성된다:
Figure 112017039482288-pct00002
상기 식에서,
- R1 및 R2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고, H 또는 CH3을 나타내고,
- x = 0 또는 1, 바람직하게 x = 1이고,
- y = 1 또는 2이고, x + y = 2이다.
EMA의 경우, x = 0 및 y = 2이고, 카르보머의 경우, x = y = 1이다.
이들 중합체는 물 또는 생리적 염 용액(20 g/L의 NaCl)에 가용성이고 pH는 예를 들어 소다(NaOH)에 의해 7.3 내지 7.4로 조정되어, 발현 벡터(들)가 도입될 수 있는 보조제 용액을 제공할 수 있다. 최종 면역학적 또는 백신 조성물 중의 중합체 농도는 약 0.01 내지 약 1.5% w/v, 약 0.05 내지 약 1% w/v, 및 약 0.1 내지 약 0.4% w/v의 범위일 수 있다.
사이토카인 또는 사이토카인들(5)은 면역학적 또는 백신 조성물 중에서 단백질 형태이거나, 면역원 또는 면역원들 또는 이의 에피토프(들)와 숙주에서 공동 발현될 수 있다. 면역원 또는 면역원들 또는 이의 에피토프(들)를 발현하는 동일 벡터로, 또는 이의 개별 백터로, 사이토카인 또는 사이토카인들을 공동발현시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 예를 들어 활성 성분을, 유리하게 보조제, 담체, 사이토카인, 및/또는 희석제와 함께 혼합하여, 이러한 조합 조성물을 제조하는 것을 이해한다.
본 발명에 사용할 수 있는 사이토카인은 제한없이, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터페론 α(IFNα), 인터페론 β(IFNβ), 인터페론 γ(IFNγ), 인터루킨-1α(IL-1α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-11(IL-11), 인터루킨-12(IL-12), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 종양 괴사 인자 β(TNFβ), 폴리이노신산 및 폴리시티딜산, 시티딘-포스페이트-구아노신 올리고데옥시뉴클레오타이드(CpG ODN), 및 형질전환 성장 인자 β(TGFβ)를 포함한다. 사이토카인은 본 발명의 면역학적 또는 백신 조성물과 공동투여되고/되거나 순차적으로 투여될 수 있음을 이해한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 백신은 또한 적합한 사이토카인, 예를 들어 백신접종하려는 이러한 숙주와 일치하거나 또는 면역학적 반응을 유발시키는 사이토카인(예를 들어, 소에게 투여하려는 조제물 용의 소 사이토카인)을, 생체 내에서 발현시키는 외생성 핵산 분자를 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 보조제는 TS6, TS7, TS8 및 TS9 에멀션(미국 특허 제7,371,395호); LR3 및 LR4(미국 특허 제7,691,368호); TSAP(US20110129494); TRIGEN™(Newport Labs); 합성 dsRNA(예를 들어, 폴리-IC, 폴리-ICLC [HILTONOL®]); 및 MONTANIDE™ 보조제(W/O, W/O/W, O/W, IMS 및 Gel; 모두 SEPPIC에 의해 생산)를 포함할 수 있다.
배큘로바이러스/곤충 세포-발현된 폴리펩타이드 기반의 면역학적 조성물 및/또는 백신의 경우에서, 용량은 약 1 ㎍ 내지 약 2000 ㎍, 약 50 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 및 약 100 ㎍ 내지 약 500 ㎍의 FMDV 항원, 에피토프 또는 면역원을 포함할 수 있다. 용량은 약 102 내지 약 1020, 약 103 내지 약 1018, 약 104 내지 약 1016, 약 105 내지 약 1012 VLP를 포함할 수 있다. FMDV 항원을 발현하는 바이러스 벡터를 기반으로 하는 면역학적 조성물 및/또는 백신의 경우, 용량은 약 103 TCID50 내지 약 1015 TCID50(50% 조직 배양 감염 용량), 약 103 TCID50 내지 약 1014 TCID50, 약 103 TCID50 내지 약 1013 TCID50 , 약 103 TCID50 내지 약 1012 TCID50을 포함할 수 있다. 용량 부피는 약 0.1 내지 약 10 mL, 유리하게 약 0.2 내지 약 5 mL일 수 있다.
본 발명을 이하 비제한적인 예를 통해 더욱 설명한다.
실시예
DNA 삽입물, 플라스미드 및 재조합 바이러스 또는 배큘로바이러스 벡터의 제작은 문헌 [J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)]에 기술된 표준 분자 생물학 기술을 사용해 수행하였다.
실시예 1 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템에서 FMDV 항원의 제작 및 발현
혈청형 A FMDV의 양성 균주 RNA 게놈은 2개의 비코딩 영역이 측접한 단일 ORF(1662개 아미노산)로 구성된다. ORF는 3개 부분을 보유한다. 제1 부분은 성숙화 및 절단 후 4개 캡시드 성분(VP4, VP2, VP3 및 VP1)의 발현을 야기시키는 다단백질 P1-2A이다. 제2 부분은 2개 단백질(2B 및 2C)을 함유하는 P2이고, RNA 합성 및 세포막 소포체 증식에 관여한다. 제1 부분은 4개 단백질(3A, 3B, 3C 및 3D)을 함유하는 P3이다. 3C는 다단백질의 절단에 관여하는 주요한 하나이다. 3D는 다른 프로테아제이고 3A/3B는 막 앵커리지, 발병, RNA 합성 및 캡시드화에 관여한다. P1-2A 및 3C는 FMDV 캡시드 입자 또는 FMDV VLP를 구성하는 모든 단백질의 발현 및 절단에 필수적이다(도 2 참조). 잠재적인 기능성 도메인은 이하 표 1에 도시한다.
Figure 112017039482288-pct00003
실시예 1.1 이황화 브릿지의 생성(+최적 번역 개시 상황) 및 상응하는 재조합 배큘로바이러스 BacMEB097의 생성을 위한 VP2 내 돌연변이(H93C)를 갖는 FMDV A24 크루제이루 균주의 다단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 pMEB097의 제작
플라스미드 pMEB097의 생성
FMDV A24 크루제이루 균주의 다단백질을 코딩하는 야생형 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 pMEB096를 돌연변이시켜서 플라스미드 pMEB097을 생성시켰다. 플라스미드 pMEB097은 VP2(H93C) 또는 P1(H179C)에 돌연변이를 함유하는 개질된 다단백질(서열번호 2)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3)를 함유한다. 개질된 다단백질(서열번호 2)은 VP2의 위치 93 또는 P1의 위치 179에서 히스티틴의 시스테인으로의 치환을 함유한다.
재조합 배큘로바이러스 BacMEB097의 생성
플라스미드 pMEB097(도 3 참조)을 사용하여, 상동성 재조합에 의해, 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 FMDV A24 크루제이루 균주의 FMDV P1/2A/2B'3B'/3C 유전자(VP2의 위치 93에 시스테인을 가짐)를 코딩하는, 재조합 배큘로바이러스를 생성시켰다. ATCC로부터 얻은 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf) 9 곤충 세포를 제조사의 프로토콜(Baculogold, Pharmingen)에 따라서, 플라스미드 pMEB097 및 Bsu36I 삼중-절단 선형화 AcNPV DNA로 공동 형질감염시켰다. 공동 형질감염 상등액 유래의 재조합 배큘로바이러스는 2회 정제된 플라크였다. 5개 클론을 25 ㎠ 단층 플라스크 규모에 28℃에서 증폭시켰다(계대 1). 5개 클론을 Sf9 곤충 세포에서 증폭시키고 재조합 클론은 FMDV A24 혈청형에 특이적인 단일클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 클론 2는 발현 수준이 양호한 것으로 확인되었다. 이 클론을 105 rpm에서, 엘렌메이어(현탁) 중에서 50 mL 규모로 28℃에서 추가 증폭시켰다(계대 2). 200 mL에서 제3 계대(계대 3)를 수행하여 단백질 발현을 위해 사용된 바이러스 스톡을 얻었다. 이 바이러스 스톡은 플라크 검정법으로 적정하였다. 바이러스 스톡의 획득은 2%의 FCS가 보충된 SF900III 배지를 사용해 수행하였다. 적정 후, 재조합 배큘로바이러스 스톡(계대 3)을 사용해 혈청 무함유 배지에서 단백질을 생산하였다.
배큘로바이러스 BacMEB097의 발현 분석
곤충 세포(Sf9-Invitrogen)는 1 pfu/mL의 감염 다중도(MOI)로 생성된 배큘로바이러스 BacMEB097 및 BacMEB084(돌연변이없는 기준)로 감염시켰다. 곤충 세포를 4일 동안 28℃에서 FCS없는 Sf900II 배지에서 105 rpm에서 성장시켰다. 상등액을 대략 4배율로 농축시키고 다음과 같이 처리하였다: A = 미처리; B = 56℃에서 1시간; C = pH 5 이하에 도달하도록 부가된 HCl.
VLP로의 캡시드 단백질의 정확한 조립은 전자 현미경으로 평가하였다(도 4, 컬럼 "A" 참조). 25-30 nm의 입자는 매우 균일한 원형 내지 20면체 형상으로 보이는, 31 nm의 일정 크기이며 착색제의 침투로 특징이 보이고 따라서 FMDV-유사로 해석되었다. 입자의 수는 mL 당 약 108로 추산되었다.
또한, VLP의 안정성은 56℃에서 1시간 처리(커럼 "B") 후 및 배지의 산성화(컬럼 "C")에 의해 볼 수 있는 바와 같이, BacMEB097 내 돌연변이에 의해 야기된 이황화 브릿지의 형성에 따라 명확하게 증가되었다.
FMDV 단백질의 정체는 FMDV A24 혈청형에 특이적인 단일클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 상등액을 분석하여 확인하였다(도 5 참조).
결론적으로, 전달 플라스미드 pMEB097를 사용해 생성된, 배큘로바이러스 BacMEB097은 Sf9 곤충 세포에서 FMDV 캡시드 발현 및 프로세싱을 유도한다. 이들 FMDV 발현된 캡시드는 FMDV 유사 비리온의 특징적인 형태학을 갖는 VLP로 자가 조립되었다. 이황화 브릿지 형성에 관여하는 돌연변이는 BacMEB084(FMDV A24 크루제이루 균주의 다단백질을 코딩하는 야생형 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 pMEB096 함유)에 의해 얻은 VLP와 비교하여 VLP의 안정성을 증가시켰다(열 처리 또는 산성화 후).
실시예 1.2 이황화 브릿지(+최적 번역 개시 상황)의 생성 및 FMDV 캡시드 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스 BacMEB099의 생성을 위한 VP2 내 돌연변이(S93C)를 갖는 FMDV O1 마니사 균주의 다단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 pMEB099의 제작
FMDV O1 마니사 균주의 다단백질을 코딩하는 야생형 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 pMEB095를 돌연변이시켜서 플라스미드 pMEB099를 생성시켰다. 플라스미드 pMEB099는 VP2(S93C) 또는 P1(S179C)에 돌연변이를 함유하는 개질된 다단백질(서열번호 6)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 7)를 함유한다. 개질된 다단백질(서열번호 6)은 VP2의 위치 93 또는 P1의 위치 179에서 세린의 시스테인으로의 치환을 함유한다.
재조합 배큘로바이러스 BacMEB099의 생성 및 발현은 BacMEB097에 대한 실시예 1.1에 기술된 절차에 따라서 수행하였다. 곤충 세포(Sf9-Inv)는 0.5 pfu/mL의 감염 다중도(MOI)로 배큘로바이러스 BacMEB099에 의해 감염시켰다. 곤충 세포는 28℃에서 4일 동안 FCS없는 Sf900II 배지 내에서 105 rpm에서 성장시켰다. 단백질 생산은 상등액의 처리: 농축 및 56℃에서 1h 가열 또는 비가열 이후에 이루어졌다(공유 케이지 돌연변이의 효과를 확인하기 위함). 처리된 상등액은 직접 전자 현미경 및 특이적 ELISA로 분석하였다(도 6 참조).
결과(도 6A 및 6B)는 ELISA 방법으로 유의한 역가가 얻어지는 것으로 확인되었다. 이러한 ELISA는 VLP에 특이적이어서, BacMEB099로 감염 후 VLP의 존재를 시사한다.
VLP로 캡시드 단백질의 올바른 조립을 전자 현미경으로 평가하였다(도 6B). 25-30 nm의 입자는 매우 균일한 원형 내지 20면체 형태로서, 31 nm의 일정한 크기를 보였고, 착색제 침투로 특징규명되었고 따라서 FMDV-유사로 해석되었다. 입자의 수는 mL 당 약 108으로 추산되었다.
결론으로, 전달 플라스미드 pMEB099를 사용해 생성된, 배큘로바이러스 BacMEB099는 Sf9 곤충 세포에서 FMDV 캡시드 발현 및 프로세싱을 유도시켰다. 이들 FMDV 발현된 캡시드는 FMDV 유사 비리온의 특징적 형태학을 갖는 VLP로 자가조립되었다.
실시예 1.3 이황화 브릿지(+최적 번역 개시 상황)의 생성 및 FMDV 캡시드 단백질을 발현하는 재조합 배큘로바이러스의 생성을 위한 FMDV 이라크 균주의 다단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 pMEB106 및 VP2에 돌연변이를 갖는 FMDV 아시아 균주의 다단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 pMEB104의 제작
FMDV 이라크 균주의 P1에 돌연변이(위치 179의 C)를 함유하는 개질된 다단백질(서열번호 8)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 9) 및 FMDV 아시아 균주의 P1에 돌연변이(위치 179의 C)를 함유하는 개질된 다단백질(서열번호 10)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 11)를 실시예 1.1에 개략한 절차에 따라서 제작하였다.
FMDV 이라크 균주의 개질된 다단백질(서열번호 8) 및 FMDV 아시아 균주의 다단백질(서열번호 10)을 발현하는 재조합 배큘로바이러스의 생성 및 발현은 BacMEB097에 대해 실시예 1.1에 기술된 절차에 따라 수행하였다.
전달 플라스미드 pMEB106을 사용해 생성된 배큘로바이러스 BacMEB106은 Sf9 곤충 세포에서 FMDV 캡시드 발현 및 프로세싱을 유도하였다. 전달 플라스미드 pMEB104를 사용해 생성된, 배큘로바이러스 BacMEB104는 Sf9 곤충 세포에서 FMDV 캡시드 발현 및 프로세싱을 유도하였다. 이들 FMDV는 FMDV 유사 비리온의 특징적인 형태학을 갖는 VLP로 자가조립되었다.
실시예 2 배큘로바이러스-발현된 "케이징된" FMDV VLP의 안정성
대규모(150 L)로 FMDV VLP를 생산하기 위한 능력을 검증하였다. 150 L 뱃치의 제조 규모로 성장시킬 경우, 배큘로바이러스-발현된 공유 케이지 및 야생형 A24 FMDV-VLP의 만족할 만한 역가를 얻었다(log10CCID50 7.14/mL)(CCID: 세포 배양 감염 용량). 놀랍게도, 안정한 FMD VLP의 다량이, 샘플을 가열한 후에도 존재하였다(2.14 log10 CCID50/mL 가열 대비 2.19 log10 CCID50/mL 미가열)(도 8 참조). 또한, 도 8에 표시한 바와 같이, EM 계측은 4 L 및 150 L 뱃치 둘 모두로부터 우수한 수의 VLP를 밝혀주었다.
실시에 3 배큘로바이러스, 좀개구리밥 및 카나리폭스 발현된 FMDV로 소 백신접종, 및 후속 독성 챌린지
이 실험의 목적은 소에서, TS6 보조제에 제제화된, 3종의 실험 FMD A24 크루제이루 항원의 FMD 독성 챌린지에 대항하여 효능을 시험하기 위한 것이었다.
렘나(좀개구리밥, US2011/0236416 참조), 배큘로바이러스 또는 vCP(카나리폭스 바이러스) 발현된 항원을 함유하는 백신을 소에게 D0에 투여하였다(표 2.1). 백신 보호성은, 관련 유럽 약전 논문에 따라서, D21에 수행된 독성 FMDV A24 크루제이루 챌린지를 통해서, 소의 임상 모니터링을 후속해 평가하였다(표 2.2). 대조군의 FMD 병변은 챌린지를 입증하였다. 배큘로바이러스 백신접종군의 2마리 동물은 병변이 완전하게 보호되어 완전 보호성을 시사한데 반해, 다른 3마리는 병변의 매우 제한된 확장을 보여서 부분 보호성을 나타냈다. G2 및 G3의 동물은 병변의 강도가 비록 다양하였지만 모두 병변을 보였다. 중화 역가 데이터를 도 9 및 도 10에 도시한다. 백신접종 후 3주(D21)에, G2의 모든 소에서 분명한 혈청 전환이 관찰되었다. G1 및 G3에서는, 거의 또는 전혀 혈청-전환이 관찰되지 않았다. 대조군은 그 날짜에 음성이었다. 모든 소는 챌린지 이후 강력하게 혈청 전환되었다(D25 또는 D28). 혈청 반응은 대조군에서 보다 G2의 백신접종된 동물에서 그리고 D25보다 D28에 더 강렬하게 보였다. 이러한 관찰은 G2에서 백신접종의 프라이밍 효과를 시사한다. 결과는 다른 2개군과 비교시 배큘로바이러스 FMDV A24(야생형 A24) 백신 그룹이 최고 SN 역가를 제공하고 독성 FMDV A24 크루제이루 챌린지에 대항하여 보호성을 제공함을 시사한다.
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실시예 4 FMDV 챌린지 실험에서 상이한 실험 FMD A24 크루제이루 백신(야생형 FMDV를 발현하는 배큘로바이러스)의 소에서의 보호성에 관한 평가
실험 목표는 소에서, TS6/사포닌 보조제에 제제화된, 3종 실험 FMD A24 크루제이루 항원의 FMD 독성 챌린지에 대항하는 효능을 시험하는 것이었다. 배큘로바이러스(BacMEB084, 여과 또는 미여과) 또는 카나리폭스 바이러스에서 발현된 FMD A24 크루제이루 항원을 함유하는 백신을 소에게 D0 시에 투여하였다. 백신 보호성은 D21에 수행된 독성 FMDV A24 크루제이루 챌린지에 대항하여, 평가하였다(관련 유럽 약전 논문에 따름).
Figure 112017039482288-pct00006
Figure 112017039482288-pct00007
2종 배큘로바이러스 백신은 전체 및 1/4 백신 용량으로 100% 동물에서 보호성이 입증되었다. 여과된 배큘로바이러스 백신은 1/16 백신 용량으로 60%의 동물에서 여전히 보호성이었다. 카나리폭스 바이러스 백신은 전체 용량에서 동물의 80%에서 보호성이 입증되었다. 도 11A, 11B 및 도 12C는 시간 경과에 따라 FMDV A24 크루제이루 항체 역가를 도시하는 그래프 및 표를 보여준다. 결과는 백신접종 후 3주(D21)에, 명백한 혈청 전환이 모든 백신접종 소에서 관찰되었다. 배큘로 백신접종군(G1-G2-G3 및 G5-G6) 중에서 용량/효과 관련성이 존재하였다. 대조군은 양쪽 데이터 상에서 음성이었다. 모든 백신접종된 소는 챌린지 후 강력하게 혈청 전환되었다(D25 및 D28). 혈청 반응은 D25보다 D28에 보다 강렬하게 나타났다. 대조군에서 혈청 전환은 상당히 약하였다. 도 12A 및 12B는 시간 경과에 따른 온도의 전개를 보여준다. 결과는 오직 대조군만이 상당한 온도 상승을 나타냄을 보여주었다. 백신은 직장 온도를 증가시키지 않았다.
이들 데이터를 사용하여, PD50은 로지스틱 회귀분석 및 스피어만-카버(Spearman-Karber) 방법을 사용해 계산하였다. 로지스틱 회귀분석 방법은 A > 16 PD50의 백신 강도를 추산하였다. 카버 방법은 A > 26PD50의 백신 강도를 추산하였다. 추산치 간에 편차가 존재하지만, 양쪽 방법은 고도로 유의하고 실질적인 백신 A의 효능을 시사한다. 임상 결과를 고려하면, 백신 B에 대한 유사한 추산치가 또한 백신 B의 상당한 효능을 시사한다.
실시예 5 배큘로바이러스를 사용한 실험 FMDV 제제의 새끼 돼지에서의 면역원성
이 실험의 목적은 배큘로바이러스에서 발현시키고 TS6 또는 TS6+사포닌에 제제화시킨 4 FMDV 항원의 면역원성을 평가하는 것이었다. 백신은 이하의 비율에 따라 제조하였다(표 4.1).
Figure 112017039482288-pct00008
항원은 혈청형(A24 크루제이루 또는 O1-마니사), 제조 방법(곤충 세포 또는 누에) 또는 삽입물(표준 또는 공유 케이지)로 다르게 실험하였다. 용어 "공유 케이지"는 시스테인 잔기의 치환에 의해 수행된, FMDV P1 펩타이드 내 비천연적으로 발생된 이황화 결합의 확립을 의미한다. 이러한 평가는 21일 간격으로, 2회 근육내 백신접종하여, 어린 새끼 돼지에서 수행하였다. 새끼 돼지를 각 백신접종 후에 전신 반응에 대해 모니터링하였고 D1, D20 및 D42에 FMDV-A24 또는 FMDV-O1M 중화 항체 역가에 대해 모니터링하였다.
Figure 112017039482288-pct00009
O1-마니사 배큘로바이러스-발현된 항원은 G5의 임의 동물에서 혈청 전환을 유발시키지 않았다. 이들 데이터는 처음으로, "공유 케이지" 돌연변이를 함유하는 배큘로바이러스-생산된 FMDV 서브유닛이 면역원성이었음을 입증해 주었다(하기 표 5 참조). 또한, 데이터는 여기서 "케이징된" FMDV 서브유닛이 미개질된 야생형 FMDV와 비교시, 유의하게 보다 생산적이고, 효과적이며 안정하다는 것을 강력하게 보여주었다. 또한, 누에-기반 백신은 시험된 다른 백신보다 유의하게 더 항원을 함유하는 것으로 보이지 않았다.
Figure 112017039482288-pct00010
결론적으로, 표 5의 결과에서 의미하는 바와 같이, 모든 SF9 세포 배양된, 배큘로바이러스-발현된 A24 VLP(그룹 G1, G2 및 G3)는 유의한 "부스터" 효과를 생성시켰다(즉, 제2 용량이 유의하게 혈청전환된 동물의 수를 증가시켰음). 대조적으로, 누에 배양된 A24 VLP는 분명한 부스터 효과를 유발시키지 않고, 초기에 지속적인 혈청학적 반응을 유발시키는 것으로 나타났다.
실시예 6 배큘로바이러스-발현된 A24 FMDV VLP의 산 및 열 안정성
A24 FMDV VLP에 대해 산 및 열처리를 가하고, 그들의 안정성을 EM(도 13) 및 ELISA 분석(도 14)으로 평가하였다. 도면에 나타낸 바와 같이, 야생형 VLP가 아닌, 공유 케이지 VLP는 낮은 pH 및 열에 유의하게 내성이었다. 또한, 도 15 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 공유 케이지 VLP는 그들의 야생형 대응물에 비해, 5℃에 보관시 시간 경과에 따라 유의하게 보다 안정하였다.
Figure 112017039482288-pct00011
결론적으로, "공유 케이지 돌연변이"를 갖는 A24 크루제이루 혈청형 유래의 VLP의 안정성은 가열 또는 산성화 처리에 대한 내성에 있어서 고도로 효과적이었다. 공유 케이지는 18개월 보관 후에도 VLP를 안정화시켰다. 몇몇 FMDV 혈청형은 이제 A24 크루제이루; O1 마니사(도 16, EM & 도 17, ELISA); 아시아 1 샤미르; 및 A22 이라크를 포함한, 공유 케이지 돌연변이의 도입을 통해 효과적으로 안정화될 수 있는 것으로 확인되었다. 도 17은 안정화된 VLP(공유 케이지, BacMEB099)에 대해 가열이 영향이 없음을 보여주는 반면 가열 후 표준 FMDV O1-마니사 활성 성분에 대해 어떠한 신호도 검출되지 않아서, 가열 후 표준 FMDV O1 마니사에 대해 조립된 VLP가 없음을 시사하였다.
실시예 7 통상의 새끼 돼지에서 배큘로바이러스 FMD O1 마니사(개질, 공유 케이지)로 제제화된 백신의 면역원성
이 실험의 목적은 TS6 및 하나의 아데노바이러스-매개된 FMDV O1-마니사에 제제화된, 2종의 배큘로바이러스 FMD O-1 마니사 항원의 통상의 새끼 돼지에서의 안전성 및 효능을 평가하는 것이었다. 각각의 제제는 3주 간격으로 2회 주사로 투여하였다(D0 - D21). 돼지는 D0에 11-12주령이었고 2 mL 근육내 감염의 백신을 투여받았다. 국소 및 전신 반응을 모니터링하여 안전성을 평가하였다. 효능은 혈청학적(혈청-중화 역가) 모니터링(D1, D20, D43) 및 세포 매개 면역성(CMI) 검정법(D27, D43)을 통해 평가하였다.
Figure 112017039482288-pct00012
혈액 샘플은 세포 매개 면역성(CMI) 검정을 위해 D27 및 D43에 채취하였다. 샘플은 γ 인터페론(IFNγ) 분비 세포 정량, 혈장 세포 정량 또는 기억 B 세포 정량을 위해 재자극 후에 검정하였다(표 7.2 참조). 모든 정량은 ELISpot으로 수행하였다.
Figure 112017039482288-pct00013
결과는 놀랍게도 배큘로바이러스 발현된 야생형 FMDV O1 M(실시예 5 참조)과 달리, 배큘로바이러스 발현된 개질된(공유 케이지) FMDV O1 M이 새끼 돼지에서 혈청 전환을 유발시킴을 보여주었다. 하기 표 7.3에 도시한 바와 같이, 제1 백신접종(D0) 후, 혈청 전환은 D20에 2 가지 배큘로바이러스 그룹(G1 및 G2)에서 관찰되었다. 제2 백신접종 후, 부스터 효과는 양쪽 그룹(G1 및 G2)에서 관찰되었다.
Figure 112017039482288-pct00014
도 20에 도시한 바와 같이, 특이적 IgG 분비 혈장 세포가 배큘로바이러스 발현된 FMDV-VLP(개질, 공유 케이지)/TS6 백신접종 그룹(G1 및 G2) 둘 모두에서 검출되었다. 특이적 IgG 분비 혈장 세포는 G4보다는 G1 및 G2에서 유의하게 더 높았다. 특이적 IgG 분비 혈장 세포가 G3에서는 검출되지 않았다.
도 21은 높은 수의 특이적 IgG 분비 기억 B 세포가 G1 및 G2 그룹의 모든 백신접종된 돼지에서 검출되었고 특이적 IgG 분비 기억 B 세포의 약한 부분이 G3에서 검출되었으며, G4에서는 특이적 IgG 분비 기억 B 세포가 검출되지 않은 것을 보여준다.
도 22는 특이적 IFNγ 분비 세포가 G1 및 G2 > G4 > G3의 순서로 모든 백신접종 그룹에서 검출되었다. G1 및 G2 사이에 편차는 없었다. 특이적 IFNγ 분비 세포는 G3보다 G1 및 G2에서 유의하게 더 높았다.
배큘로바이러스 발현된 FMDV-VLP(개질, 공유 케이지)/TS6 백신접종 그룹(G1 및 G2) 둘 모두에서 높은 수준의 특이적 IFNγ 분비 세포, 특이적 IgG 분비 혈장 세포 및 특이적 IgG 분비 기억 B 세포는 FMDV 감염에 대한 양호한 수준의 보호성을 시사한다.
실시예 8 아시아 샤미르 BacMEB102 (야생형) & BacMEB104 (공유 케이지)
Figure 112017039482288-pct00015
결과는 BacMEB104(공유 케이지)에 대해 많은 양의 안정한 FMD VLP이 가열 후에 존재하고, VLP가 적어도 15개월까지 안정한 반면, BacMEB102(WT)는 가열 후 임의 검출가능한 VLP를 형성하지 않음을 보여주었다.
실시예 9 이라크 22 BacMEB106 (공유 케이지) 안정성
Figure 112017039482288-pct00016
공유 케이지 이라크22 VLP와 비교하여, 야생형 이라크22 VLP는 0일에 가열 후 안정하지 않았다.
실시예 10 돼지에서 아시아 샤미르 공유 케이지 & 이라크 A22 공유 케이지 혈청형 실험
이 실험의 목적은 배큘로바이러스에서 생산된, FMD 아시아1 샤미르 및 FMD A22 이라크 VLP 항원의, 일반 돼지에서의 면역원성을 평가하는 것이다. 아시아1 샤미르 항원의 2개 뱃치 및 A22 이라크 항원의 2개 뱃치를 TS6 제제에서 시험하였다. 각각의 제제는 돼지에게 3주 간격으로 2회 주사로 투여하였다(D0 - D21). 돼지는 D0 시에 8-9주령이었다. 면역원성은 혈청학적 모니터링(D-1, D20, D42) 및 세포 매개 면역성(CMI) 검정(D26, D41)을 통해 평가하였다.
Figure 112017039482288-pct00017
도 18에 도시한 바와 같이, 양쪽 균주 유래의 공유 케이지 VLP는 강력한 혈청형-특이적인, 혈청학적 반응을 유발시켰다.
VLP 아시아1 샤미르를 백신접종한 모든 돼지(G1 & G3)는 제1 백신 접종에 분명하게 혈청-반응하였고, 평균 역가는 1.20 Log10 PD50에 가까웠다. 또한, 제2 백신접종 후 분명한 부스터 효과가 존재하였고, 대부분의 돼지는 1.8 Log10 PD50의 역가를 넘었다. 대조군(G5) 및 대부분의 A22 이라크 백신접종된 돼지(G2 & G4)는 부스터 백신접종 후에도, 아시아1 샤미르에 대항하여 임의의 혈청 반응을 보이지 않았다.
VLP A22 이라크로 백신접종된 모든 돼지(G2 & G4)는 제1 백신접종에 대해 혈청 반응하였고, 평균 역가는 1.15 Log10 PD50에 가까웠다. 또한, 제2 백신접종 후 강력한 부스터 효과가 존재하였고, 대부분의 돼지는 2.0 Log10 PD50의 역가를 초과하였다. 대조군(G5) 및 대부분의 아시아1 샤미르 백신접종된 돼지(G1 & G3)는 부스터 백신접종 후에도, A22 이라크에 대항하여 임의의 혈청 반응을 보이지 않았다.
놀랍게도, 도 19에 표시한 바와 같이, 교차 반응성이 관찰되었다. 이 결과는 특이적 IFNγ 반응(세포 반응)이 아시아1 샤미르 FMDV 펩타이드 풀을 사용시 양쪽 아시아1 샤미르 VLP 그룹에서 관찰되었고, 특이적 IFNγ 반응(세포 반응)은 A22 이라크 FMDV 펩타이드 풀을 사용한 경우 A22 이라크 VLP 그룹 둘 모두에서 검출되었음을 보여주었다. 아시아1 샤미르 VLP 그룹은 A22 이라크 FMDV 펩타이드 풀을 사용시 교차-면역원성을 보였다. 특이적 혈장 세포(체액성 반응)이 양쪽 아시아1 샤미르 VLP 그룹 및 양쪽 A22 이라크 VLP 그룹에서 검출되었는데, 각각 아시아1 샤미르는 AI 코팅을 불활성화시켰고 A22 이라크는 AI 코팅을 불활성화시켰다. 아시아1 샤미르 VLP 그룹에서 교차-면역원성(혈장 세포)이 A22 이라크 불활성화된 AI 코팅에서 관찰되었다. 특이적 기억 B 세포(체액성 반응)가 양쪽 아시아1 샤미르 VLP 그룹 및 양쪽 A22 이라크 VLP 그룹에서 관찰되었고, 각각 아시아1 샤미르 AI 코팅 및 A22 이라크 AI 코팅을 갖는다. 아시아1 샤미르 VLP 그룹에서 양호한 교차-면역원성(B 세포)이 A22 이라크 AI 코팅에서 관찰되었다. A22 이라크 VLP 그룹의 일부 교차 면역원성(B 세포)가 또한 아시아1 샤미르 AI 코팅에서 관찰되었다. 취합하여, 결과들은 VLP가 이종성 챌린지에 대항하여 보호하도록 충분한 면역 반응을 유발시킬 수 있음을 시사한다.
결론적으로, TS6에 보조화시킨 4 가지 FMDV 혈청형-VLP 항원(A24, O1 마니사, 아시아1 샤미르 및 A22 이라크)은 강력한, 혈청형-특이적, 중화 항체 반응, 일관성있는 비율의 특이적 IFNγ 반응, 기억 B 세포의 존재(2개 혈청형 간 교차 반응성)와 함께 체액성 및 세포 반응을 유도시켰고, 동종성 및 이종성 FMDV 감염에 대항한 양호한 수준의 보호성을 시사하였다.
실시예 11 인간 아데노바이러스 5 매개된 재조합 FMDV의 제작
이 실험의 목표는 혈청형 A24 크루제이루에 대한 C142T 부위 돌연변이를 갖는 코돈 비최적화된 3C 프로테아제 및 코돈 최적화된 FMDV 구조 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 생성시키는 것이다. FMDV 항원은 FMDV 캡시드 전구체(VP1, VP2(H93C 부위 돌연변이, 공유 케이지를 가짐), VP3, VP4, 2A, 및 최적화된 전체 2B 코돈) 및 비최적화된 부분 3B 및 C142T 부위 돌연변이를 갖는 전체 길이 3C 프로테아제를 함유한다(서열번호 16).
HEK 293 세포(ATCC)는 5% CO2 중에 37℃에서 10% 태아 소 혈청(Moregate Batch #81827101)을 보유한 MEM(Gibco #11095)에 유지시켰다. 이들 세포를 사용해 재조합 아데노바이러스 vAD3027를 구제하고 바이러스 스톡을 만들었다.
발현 플라스미드 pAD3027(도 25 참조)은 CMV 프로모터 및 SV40 폴리A 꼬리부에 연결된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드(FMDV 캡시드 단백질 서열번호 16을 코딩하는 서열번호 17)를 함유한다. 폴리뉴클레오타이드는 합성 인트론을 포함한다.
발현 클론은 게이트웨이 기술(Invitrogen)을 사용한 목적 벡터로 진입 벡터의 LR 재조합에 의해 생성시켰다. 재조합 아데노바이러스 vAD3027은 형질감염 시약으로 HEK 293 세포에서 선형 발현 클론의 형질감염에 의해 생성시켰다. 구제 후, 각 바이러스는 냉동-해동 주기를 통해 회수하고 세포 찌거기를 원심분리를 통해 정화시켰다. 계대를 위해서, 각 바이러스를 HEK 293 세포의 단층에 접종하고 감염 후 대략 3-4일 후에, 바이러스를 냉동-해동 주기로 회수하였고 원심분리로 정화시켰다. 5계대를 수행하여 -80℃에 저장시키는 바이러스 스톡을 만들었다.
재조합 클론의 서열 분석은 CMV 프로모터의 시작부터 SV40 꼬리부의 끝까지의 서열이 정확하다는 것을 확인해 주었다(서열번호 20). 면역형광발광 시험은 vAD3027의 모든 조사된 플라크가 FMDV 캡시드 단백질을 발현하는 것으로 확인되었음을 보여주었다. VP2 단백질에 대항한 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 vAD3027에 의해 발현된 VP2(완전 프로세싱된 ∼25 kDA), VP0(부분 프로세싱된 이식유전자 ∼37 kDa) 또는 P1(미프로세싱된 이식유전자 ∼80 kDa)로서 VP2의 선형 에피토프를 검출하였다(도 26 참조).
O1 마니사, 아시아 및 이라크 균주에 대한 코돈-최적화된 FMDV 개질된(공유 케이지) 캡시드 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 상기 기술된 절차에 따라서 제작하였다.
실시예 12 돼지에서 백신접종 후 다양한 구제역 바이러스(FMDV) 백신 후보물의 혈청학 평가
실시예 12.1 FMDV A24 백신의 혈청학 평가
이 실험의 목표는 돼지에서 백신접종 후 상이한 보조제와 함께(또는 없이) 인간 아데노바이러스 5-매개 FMDV 백신 및 배큘로바이러스 발현된 FMD A24 재조합 VLP(공유 케이지) 백신을 포함하는 다양한 FMDV A24 백신 제제의 면역원성을 평가하는 것이다.
60마리의 일반적으로 사육된 새끼 돼지(대략 1개월령)는 4-7마리 돼지를 각각 함유하는 9개 치료 그룹 중 하나로 각각 임의 추출하였다. 최종 그룹 조성을 하기 표 11에 제시하였다.
Figure 112017039482288-pct00018
그룹 9(대조군)를 제외하고, 각 새끼 돼지는 2 mL의 시험 백신으로, 21일 간격으로 2회 백신접종하였다. 모든 주사는 목 영역에서, 꼬리에서 귀로, 대안적으로 우측 및 좌측 측면에서, 근육내 경로(IM)를 통해 제공하였다.
혈액 샘플은 0일(백신접종 전), 7일, 15일, 21일(백신접종 전), 28일, 35일 및 42일에 모든 새끼 돼지로부터 채취하였다. 모든 새끼 돼지 유래의 42일 혈청 샘플은 혈청 바이러스 중화(SVN)에 의해 FMDV 항체에 대해 시험하였다. vAD3027 구성체 및 대조군(6-9 그룹)으로 백신접종된 것들 유래의 샘플은 모든 채취일에 SVN 검정을 실시하였다.
1-9 그룹의 모든 새끼 돼지는 실험 출발 전에 FMDV 항체에 대해 음성으로 검사되었다. 대조군의 모든 새끼 돼지는 실험 전반에서 FMDV 항체에 대해 음성이었다.
FMDV SVN 결과는 도 23에 도시하였다. 결과는 FMD A24 재조합 VLP 백신 및 인간 아데노바이러스 5-매개 FMDV 백신 둘 모두가 동물에서 면역 반응을 유도시켰음을 입증하였다. 103.9 VLP의 저용량에서, FMD A24 재조합 VLP 백신은 동물에서 양호한 면역 반응을 유도하였다. 인간 아데노바이러스 5-매개 FMDV 백신(6-7 그룹)으로 백신접종한 동물은 저용량 FMD A24 재조합 VLP 백신으로 백신접종된 것보다 2용량 백신접종 계획 후 더 높은 항체 반응을 가졌다. 놀랍게도, 바이러스 매개 FMDV 백신 및 BacA24 VLP 백신을 사용한 이종성 프라임-부스트 계획은 동일한 백신을 사용한 프라임-부스트보다 더 강력한 면역 반응을 입증해 주었다.
도 24는 실험 과정(0일 - 42일) 동안 6-9 그룹에서 FMDV 항체 역가를 보여준다. 15일(제1 백신접종 후 2주)까지, 모든 vAD3027을 FMDV로 혈청전환된 8그룹으로부터 백신접종한다. 6-7 그룹은 29-57%의 새끼 돼지가 혈청전환되었다. 또한, 그룹 당 평균 항체 역가는 6-7 그룹과 비교하여 8 그룹에서 더 높았다(바이러스 매개된 FMDV 백신 및 BacA24 VLP 백신을 사용한 이종성 프라임-부스트 계획).
아데노바이러스(SVN)에 대한 항체 반응은 42일에 채취된 샘플의 모든 그룹 유래의 모든 동물에서 확인되었다. 결과를 Log10으로 기록하였고 ≤ 0.6 Log10의 값은 혈청 항체에 대해 음성으로 간주되었다.
이 결과는 BacA24VLP 제제화된 백신으로 백신접종된 모든 대조군 및 새끼 돼지가 42일에 SN 항체 역가에 의해 아데노바이러스에 음성인 것으로 확인되었다(≤ 0.6 Log10). 그룹 6 및 7의 vAD3027로 백신접종된 모든 동물은 1.8 내지 3.0 범위의 역가로 혈청전환된데 반해, 그룹 8은 50% 새끼 돼지가 혈청전환되었다. 전체적으로, 그룹 6의 동물은 아데노바이러스에 대해 보다 높은 항체 반응을 가졌다.
실시예 12.2 FMDV O1 마니사, 아시아 및 이라크 백신의 혈청학 평가
실험의 목표는 돼지에서 백신접종 후 상이한 보조제와 함께(또는 없이) 인간 아데노바이러스 5-매개 FMDV 백신 및 배큘로바이러스 발현된 FMD O1 마니사, 아시아 및 이라크 재조합 VLP(공유 케이지) 백신을 포함한 다양한 FMDV O1 마니사, 아시아 및 이라크 백신 제제의 면역원성을 평가하는 것이다.
실험 디자인은 실시예 12.1에 기술하였다. 백신접종한 동물 유래의 혈액 샘플은 실시예 12.1에 기술된 바와 같이 다양한 단계에서 채취하였고 혈청학에 대해 검사되었다. 결과는 본 발명의 조성물 또는 백신이 면역원성이고 동물에서 보호성을 제공함을 보여준다.
실시예 14 통상의 돼지 및 소 및 MDA-양성 돼지 및 소에서 백신접종 후 다양한 구제역 바이러스 (FMDV) 백신 후보물의 혈청학 평가 및 효능
실험의 목표는 면역 반응을 증가시키기 위해, 통상의 돼지 또는 소에서 그리고 또한 MDA를 극복하고 면역 반응을 증가시키기 위해 MDA-양성 돼지 및 소에서, 2종의 이종성 백신의 프라임-부스트 투여(2회 투여) 또는 2종 이종성 백신의 동시 투여(1회 투여)를 평가하는 것이다. 이종성 백신은 동일한 FMDV 혈청형 유래의 캡시드를 발현하는 FMDV 바이러스 벡터 백신 또는 FMDV VLP 백신 등과 같은 상이한 유형의 백신일 수 있다. 이종성 백신은 또한, 예컨대 A24, O1 마니사, 아시아 또는 이라크 균주 등과 같은 상이한 FMDV 혈청형의 캡시드를 발현하는 동일 유형의 백신일 수 있다. 이종성 백신은 또한 A24, O1 마니사, 아시아 또는 이라크 균주 등과 같은 상이한 FMDV 혈청형의 캡시드를 발현하는 상이한 유형의 백신일 수 있다. 이종성 백신은 또한 상이한 유형의 백신, 즉, 예컨대 A24, O1 마니사, 아시아 또는 이라크 균주 등과 같은, 상이한 FMDV 혈청형의 캡시드를 발현하는 FMDV VLP 백신 또는 FMDV 바이러스 벡터 백신일 수 있다.
한 그룹에서, 통상의 돼지 또는 소는 FMDV VLP 백신과 후속하여 재조합 바이러스 FMDV 백신, 또는 재조합 바이러스 FMDV 백신으로 프라이밍하고 FMDV VLP 백신으로 부스트하여, 3-5주의 간격으로 2회 백신접종된다. 다른 그룹에서, 통상의 돼지 또는 소는 동시에 FMDV VLP 및 재조합 바이러스 FMDV 백신 둘 모두로 1회 백신접종된다.
한 그룹에서, MDA-양성인 돼지 또는 소는 FMDV VLP 백신 및 후속하여 재조합 바이러스 FMDV 백신으로 3-5주의 기간에 2회 백신접종되거나, 또는 재조합 바이러스 FMDV 백신으로 프라이밍되고 FMDV VLP 백신으로 부스트된다. 다른 그룹에서, MDA-양성인 돼지 또는 소는 동시에 FMDV VLP 및 재조합 바이러스 FMDV 백신 둘 모두로 1회 백신접종된다.
동물은 백신접종 후 동종성 또는 이종성 FMDV 균주로 챌린지된다.
조성물 또는 백신에 의해 유도된 보호 효능은 통상의 동물 또는 MDV-양성 동물에서 백신접종 챌린지에 의해 FMDV 병원체에 대해 평가된다. 보호 효과는 조직 및 혈액에서 특이적 병원체의 바이러스 적재 및/또는 임상적 관찰로 평가된다. 백신접종된 동물 유래의 혈액 샘플은 다양한 단계에서 채취되어 혈청학 검사된다. 그 결과는 본 발명의 조성물 또는 백신이 면역원성이고 통상의 동물 및 MDV-양성 동물에서 보호성을 제공함을 보여준다.
본 발명의 상세한 바람직한 실시형태에서 설명한 바와 같이, 상기 실시예에 의해 정의된 본 발명은 많은 분명한 이의 변이들이 본 발명의 범주 또는 정신을 벗어나지 않고 가능하므로 상기 설명에 기재된 구체적인 설명에 국한되는 것이 아님을 이해해야 한다.
본원에서 인용하거나 또는 참조한 모든 문헌들("본원의 인용 문헌"), 및 본원의 인용 문헌에서 인용하거나 또는 참조한 모든 문서는 임의의 제조사 지시서, 설명서, 제품 사양서, 및 본원 또는 본원에서 참조하여 편입시킨 임의 문서에서 언급된 임의 제품에 대한 제품 시트와 함께, 참조하여 본원에 편입되고, 본 발명의 실시에서 채택될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Merial, Inc. AUDONNET, Jean-Christophe MEBATSION, Teshome HANNAS, Zahia CHIANG, Yu-Wei WIDENER, Justin <120> FMDV RECOMBINANT VACCINES AND USES THEREOF <130> MER 14-244 <150> 62/054,073 <151> 2014-09-23 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2333 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Wild-type polyprotein of A24 Cruzeiro Strain (GenBank AAT01711) <400> 1 Met Asn Thr Thr Asp Cys Phe Ile Ala Leu Val His Ala Ile Arg Glu 1 5 10 15 Ile Arg Ala Phe Phe Leu Pro Arg Ala Thr Gly Arg Met Glu Phe Thr 20 25 30 Leu His Asn Gly Glu Arg Lys Val Phe Tyr Ser Arg Pro Asn Asn His 35 40 45 Asp Asn Cys Trp Leu Asn Thr Ile Leu Gln Leu Phe Arg Tyr Val Gly 50 55 60 Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Asp Ser Pro Glu Asn Leu Thr Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ile Glu Gln Leu Glu Glu Leu Thr Gly Leu Glu Leu His Glu 85 90 95 Gly Gly Pro Pro Ala Leu Val Ile Trp Asn Ile Lys His Leu Leu His 100 105 110 Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Glu Val Cys Met Val Asp 115 120 125 Gly Thr Asn Met Cys Leu Ala Asp Phe His 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tgctcgctga caagaaaacc gaggaaacca cactgctcga ggatcgcatc 300 ctgaccacaa ggaacggcca caccacatcc accacacagt cttcagtggg agtcacccac 360 gggtacagca cagaggaaga ccatgtggcc ggcccaaata cctctggact ggaaacacgc 420 gtggtccagg ccgagcggtt ttacaagaaa tatctgttcg actggaccac agataaggcc 480 tttggccacc tggagaaact ggaactccct tcagatcacc atggcgtgtt cggatgtctg 540 gtcgactcct acgcctatat gcgcaacggc tgggatgtgg aagtctccgc cgtgggaaac 600 cagtttaatg gaggatgcct gctcgtggct atggtcccag agtggaagga attcgacacc 660 agggagaaat accagctgac actctttcct caccagttca tctcccccag aacaaacatg 720 accgcccata ttaccgtgcc atacctgggc gtcaatcgct acgaccagta taagaaacac 780 aagccttgga ccctggtggt catggtggtc tcacccctca cagtgaacaa tacctccgcc 840 gctcagatca aagtctacgc caacattgct cccacctatg tgcacgtcgc cggggaactg 900 ccatccaagg agggcatctt ccctgtggcc tgtgctgacg ggtacggagg gctggtcacc 960 acagacccca agaccgccga tccagcttac ggcaaagtgt ataacccccc aaggaccaat 1020 taccccggaa gattcacaaa cctgctcgat gtggccgagg cttgcccaac ctttctgtgt 1080 ttcgacgatg gaaagcctta cgtgaccaca agaacagacg atacccgact gctcgccaag 1140 ttcgacctga gcctcgccgc taaacacatg tctaacacct acctgtcagg gatcgcccag 1200 tactataccc agtattccgg cacaattaat ctgcatttta tgttcacagg atctaccgac 1260 tcaaaggcca gatacatggt ggcttatatc cctcccggag tcgaaacacc acctgacacc 1320 cctgagcgag ctgctcactg catccatgcc gaatgggata ccgggctgaa ctccaagttt 1380 acattcagca ttccctacgt gtctgccgct gactacgcct ataccgctag cgatacagcc 1440 gagaccatca acgtgcaggg gtgggtctgt atctaccaga ttacccacgg caaagccgaa 1500 aatgacacac tggtggtctc tgtgtcagcc gggaaggact tcgagctgcg actccccatc 1560 gatccacgac agcagaccac agctaccgga gagtccgctg accctgtgac cacaaccgtc 1620 gaaaactacg gcggagagac ccagattcag cgccggcacc atacagacat cggctttatt 1680 atggatcgct tcgtgaagat ccagtccctg agccccaccc acgtgattga cctcatgcag 1740 gctcaccagc atggactggt gggagctctg ctccgagctg ctacctacta tttctccgat 1800 ctggaaatcg tggtccggca tgagggaaac ctgacctggg tgcctaatgg ggcccccgag 1860 tcagctctgc tcaacacatc caatcccacc gcctacaaca aagctccatt caccagactg 1920 gccctcccat atacagctcc tcaccgagtg ctggctaccg tctacaatgg cacaagcaag 1980 tatgctgtgg gaggctctgg aaggagaggg gacatgggca gcctcgctgc tcgagtggtc 2040 aagcagctgc cagcttcttt caactacgga gccatcaaag ccgatgctat tcacgaactg 2100 ctcgtgcgaa tgaagcgcgc cgagctgtat tgccccaggc cactgctcgc catcgaggtg 2160 tccagccagg acagacataa gcagaaaatc attgccccag ctaagcagct gctcaacttt 2220 gacctgctca aactggccgg agatgtggaa agcaatcctg ggcccttctt tttcgccgac 2280 gtgaggtcca acttcagcaa actggtcgac accatcaatc agatgcagga ggatatgtca 2340 accaagcacg gccccgactt taaccggctg gtgtccgcct tcgaggaact cgctaccggc 2400 gtgaaggcca tcaggacagg actggacgag gccaaaccat ggtacaagct gatcaagctg 2460 ctctctcgcc tctcatgtat ggctgctgtg gctgctcgga gcaaggaccc cgtgctggtc 2520 gccatcatgc tcgctgacac cggcctggag attctcgatt ctacatttgt ggtcaagaaa 2580 atctctgact cactgtcttc actcttccac gtgccagccc ctgtcttttc cttcggagct 2640 ccaattctgc tcgctggact ggtgaaagtc gcctccagct ttttccggtc caccccagag 2700 gacctggaaa gggccgagaa gcagcgtcag agacctctga aagtgagagc taagctccca 2760 cagcaggaag gaccttacgc tggcccgttg gagagacaga aaccgctgaa agtgaaagca 2820 aaagccccgg tcgtcaagga aggaccttac gagggaccgg tgaagaagcc tgtcgctttg 2880 aaagtgaaag ctaagaactt gatagtcact gagagtggtg ccccaccgac cgacttgcaa 2940 aagatggtca tgggcaacac aaagcctgtt gagctcatcc ttgacgggaa gacagtagcc 3000 atctgttgtg ctactggagt gtttggcact gcttacctcg tgcctcgtca tcttttcgca 3060 gagaagtatg acaagatcat gctggatggc agagccatga cagacagtga ctacagagtg 3120 tttgagtttg agattaaagt aaaaggacag gacatgctct cagacgctgc gctcatggtg 3180 ctccaccgtg ggaaccgcgt gagagatatc acgaaacact ttcgtgatac agcaagaatg 3240 aagaaaggca cccccgtcgt cggtgtggtc aacaacgccg acgttgggag actgattttc 3300 tctggtgagg ccctcaccta caaggatatt gtagtgacca tggacggaga caccatgcct 3360 ggcctctttg cctacaaagc cgccaccaag gcaggctact gtggaggagc cgttctcgcc 3420 aaggacgggg ccgacacttt catcgtcggc actcactccg caggaggcaa tggagttgga 3480 tactgctcat gcgtttccag gtccatgctt ctcagaatga aggcacacgt tgaccctgaa 3540 ccacaacacg ag 3552 <210> 18 <211> 745 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CMV promoter <400> 18 tttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 60 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 240 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 300 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 360 tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 420 ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 480 actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 540 ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc 600 atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggccggg 660 aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg ccaagagtga cgtaagtacc gcctatagag 720 tctataggcc cacccccttg gcttc 745 <210> 19 <211> 104 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic enhancer <400> 19 cttgaggtgt ggcaggcttg agatctggcc atacacttga gtgacaatga catccacttt 60 gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc agcc 104 <210> 20 <211> 4579 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CMV promoter -synthetic enhancer- codon optimized FMDV capsid gene - SV40 PolyA in vAD3027 <400> 20 tttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 60 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 240 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 300 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 360 tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 420 ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 480 actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 540 ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc 600 atccacgctg ttttgacctc catagaagac 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cgtggctatg gtcccagagt 1500 ggaaggaatt cgacaccagg gagaaatacc agctgacact ctttcctcac cagttcatct 1560 cccccagaac aaacatgacc gcccatatta ccgtgccata cctgggcgtc aatcgctacg 1620 accagtataa gaaacacaag ccttggaccc tggtggtcat ggtggtctca cccctcacag 1680 tgaacaatac ctccgccgct cagatcaaag tctacgccaa cattgctccc acctatgtgc 1740 acgtcgccgg ggaactgcca tccaaggagg gcatcttccc tgtggcctgt gctgacgggt 1800 acggagggct ggtcaccaca gaccccaaga ccgccgatcc agcttacggc aaagtgtata 1860 accccccaag gaccaattac cccggaagat tcacaaacct gctcgatgtg gccgaggctt 1920 gcccaacctt tctgtgtttc gacgatggaa agccttacgt gaccacaaga acagacgata 1980 cccgactgct cgccaagttc gacctgagcc tcgccgctaa acacatgtct aacacctacc 2040 tgtcagggat cgcccagtac tatacccagt attccggcac aattaatctg cattttatgt 2100 tcacaggatc taccgactca aaggccagat acatggtggc ttatatccct cccggagtcg 2160 aaacaccacc tgacacccct gagcgagctg ctcactgcat ccatgccgaa tgggataccg 2220 ggctgaactc caagtttaca ttcagcattc cctacgtgtc tgccgctgac tacgcctata 2280 ccgctagcga tacagccgag accatcaacg tgcaggggtg ggtctgtatc taccagatta 2340 cccacggcaa agccgaaaat gacacactgg tggtctctgt gtcagccggg aaggacttcg 2400 agctgcgact ccccatcgat ccacgacagc agaccacagc taccggagag tccgctgacc 2460 ctgtgaccac aaccgtcgaa aactacggcg gagagaccca gattcagcgc cggcaccata 2520 cagacatcgg ctttattatg gatcgcttcg tgaagatcca gtccctgagc cccacccacg 2580 tgattgacct catgcaggct caccagcatg gactggtggg agctctgctc cgagctgcta 2640 cctactattt ctccgatctg gaaatcgtgg tccggcatga gggaaacctg acctgggtgc 2700 ctaatggggc ccccgagtca gctctgctca acacatccaa tcccaccgcc tacaacaaag 2760 ctccattcac cagactggcc ctcccatata cagctcctca ccgagtgctg gctaccgtct 2820 acaatggcac aagcaagtat gctgtgggag gctctggaag gagaggggac atgggcagcc 2880 tcgctgctcg agtggtcaag cagctgccag cttctttcaa ctacggagcc atcaaagccg 2940 atgctattca cgaactgctc gtgcgaatga agcgcgccga gctgtattgc cccaggccac 3000 tgctcgccat cgaggtgtcc agccaggaca gacataagca gaaaatcatt gccccagcta 3060 agcagctgct caactttgac ctgctcaaac tggccggaga tgtggaaagc aatcctgggc 3120 ccttcttttt cgccgacgtg aggtccaact tcagcaaact ggtcgacacc atcaatcaga 3180 tgcaggagga tatgtcaacc aagcacggcc ccgactttaa ccggctggtg tccgccttcg 3240 aggaactcgc taccggcgtg aaggccatca ggacaggact ggacgaggcc aaaccatggt 3300 acaagctgat caagctgctc tctcgcctct catgtatggc tgctgtggct gctcggagca 3360 aggaccccgt gctggtcgcc atcatgctcg ctgacaccgg cctggagatt ctcgattcta 3420 catttgtggt caagaaaatc tctgactcac tgtcttcact cttccacgtg ccagcccctg 3480 tcttttcctt cggagctcca attctgctcg ctggactggt gaaagtcgcc tccagctttt 3540 tccggtccac cccagaggac ctggaaaggg ccgagaagca gcgtcagaga cctctgaaag 3600 tgagagctaa gctcccacag caggaaggac cttacgctgg cccgttggag agacagaaac 3660 cgctgaaagt gaaagcaaaa gccccggtcg tcaaggaagg accttacgag ggaccggtga 3720 agaagcctgt cgctttgaaa gtgaaagcta agaacttgat agtcactgag agtggtgccc 3780 caccgaccga cttgcaaaag atggtcatgg gcaacacaaa gcctgttgag ctcatccttg 3840 acgggaagac agtagccatc tgttgtgcta ctggagtgtt tggcactgct tacctcgtgc 3900 ctcgtcatct tttcgcagag aagtatgaca agatcatgct ggatggcaga gccatgacag 3960 acagtgacta cagagtgttt gagtttgaga ttaaagtaaa aggacaggac atgctctcag 4020 acgctgcgct catggtgctc caccgtggga accgcgtgag agatatcacg aaacactttc 4080 gtgatacagc aagaatgaag aaaggcaccc ccgtcgtcgg tgtggtcaac aacgccgacg 4140 ttgggagact gattttctct ggtgaggccc tcacctacaa ggatattgta gtgaccatgg 4200 acggagacac catgcctggc ctctttgcct acaaagccgc caccaaggca ggctactgtg 4260 gaggagccgt tctcgccaag gacggggccg acactttcat cgtcggcact cactccgcag 4320 gaggcaatgg agttggatac tgctcatgcg tttccaggtc catgcttctc agaatgaagg 4380 cacacgttga ccctgaacca caacacgagt agtaggcggc cgctctagac tagctagaaa 4440 gatccgggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 4500 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 4560 atgtatctta tcatgtctg 4579

Claims (28)

  1. 재조합 바이러스 벡터에 의해 발현되는 구제역 바이러스(FMDV) 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는, 구제역 백신용 조성물로서, FMDV 항원은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 16 의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고, 재조합 바이러스 벡터는 배큘로바이러스 벡터인, 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, FMDV 항원은 FMDV 바이러스-유사 입자 (VLP, virus-like particle) 를 형성하는 것인 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, FMDV 항원은 서열번호 3, 7, 9, 11, 또는 17 의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, FMDV 항원은 바이러스-유사 입자 (VLP, virus-like particle) 의 열 및 산 안정성을 제공하는 비천연 발생 이황화 브릿지를 형성하는 것인 조성물.
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서, 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제 또는 비히클을 더 포함하는 것인 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. FMDV 바이러스-유사 입자 (VLP, virus-like particle) 를 발현하는 형질전환된 곤충 세포로서, FMDV 바이러스-유사 입자 (VLP, virus-like particle) 는 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 16 의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 곤충 세포는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질전환되고, 상기 재조합 바이러스 벡터는 배큘로바이러스 벡터인, 곤충 세포.
  16. 1 이상의 FMDV 항원을 코딩하고 발현하는 1 이상의 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 재조합 바이러스 벡터로서, FMDV 항원은 서열번호 2, 6, 8, 10 또는 16 의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고, 재조합 바이러스 벡터는 배큘로바이러스 벡터인, 재조합 바이러스 벡터.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제 16 항에 있어서, FMDV 항원은 서열번호 3, 7, 9, 11, 또는 17 의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것인 재조합 바이러스 벡터.
  20. 제 15 항의 곤충 세포에서 발현된 FMDV 바이러스-유사 입자 (VLP, virus-like particle) 로서, 세포 성분의 적어도 60%가 제거되도록 정제된 것인, FMDV 바이러스-유사 입자 (VLP, virus-like particle).
  21. 삭제
  22. FMDV 감염에 감수성인 인간을 제외한 동물을 백신접종하거나 또는 FMDV에 대항해 인간을 제외한 동물에서 면역 반응을 유발시키는 방법으로서, 제 1 항, 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항 및 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물의 적어도 1회의 투여를 포함하는 것인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 방법은 프라임-부스트 투여 계획을 포함하는 것인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 프라임-부스트 계획은 구제역 바이러스(FMDV) 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 프라임-투여, 및 FMDV로부터 동물을 보호하고/하거나 감염된 동물에서 질환 진행을 예방하기 위해, 생체 내에서 FMDV 항원을 발현하기 위한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 부스트 투여를 포함하는 것인 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 프라임-부스트 계획은 생체 내에서 FMDV 항원을 발현하기 위한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 프라임-투여, 및 FMDV로부터 동물을 보호하고/하거나 감염된 동물에서 질환 진행을 예방하기 위해 구제역 바이러스(FMDV) 항원 또는 FMDV 항원을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 부스트 투여를 포함하는 것인 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 방법은 동일하거나 또는 상이한 FMDV 조성물 또는 백신의 1회 이상의 투여를 포함하는 것인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, FMDV 조성물 또는 백신은 시험관 내에서 발현된 FMDV 바이러스-유사 입자 (VLP, virus-like particle) 및 생체내에서 FMDV 항원을 발현시키는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
  28. 제 22 항에 있어서, 방법은 FMDV 감염에 대항하여 모체 이행 항체-양성(MDA-양성) 동물을 보호하는 것인 방법.
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