CN107073100B - Fmdv重组疫苗及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明包括FMDV疫苗或组合物。疫苗或组合物可以是含有FMDV抗原的疫苗或组合物。本发明还包括编码和表达FMDV抗原、表位或免疫原的重组载体，其可用于保护动物、特别是绵羊、牛、山羊或猪免受FMDV感染。

Description

FMDV重组疫苗及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年9月23日提交的美国临时申请62/054,073的优先权。
发明领域
本发明涉及用于对抗动物中的口蹄疫病毒(FMDV)感染的组合物。本发明提供包含FMDV抗原的药物组合物、抗FMDV的疫苗接种方法以及用于此类方法和组合物的试剂盒。
发明背景
口蹄疫(FMD)是影响农场动物的最具毒性和传染性的疾病之一。该疾病在世界许多国家是地方性的，特别是在非洲、亚洲和南美洲。另外，疫情爆发也可以定期发生。在国家中的存在该疾病可能会由于生产力的丧失、感染畜群的体重和产奶量以及对这些国家的贸易禁运而造成非常严重的经济后果。针对该疾病采取的措施包括严格执行进口限制、卫生控制和检疫、屠宰生病的动物和使用灭活疫苗的疫苗接种程序，作为国家或区域一级的预防措施，或在疫情爆发时定期进行。
FMD的特点是其潜伏期短、传染性强、口中和蹄上形成溃疡以及有时候年轻动物的死亡。FMD影响许多动物物种，特别是牛、猪、绵羊和山羊。导致该疾病的介质(agent)是属于小核糖核酸病毒(Picornaviridae)科家族的口蹄疫病毒(Aphthovirus)属的核糖核酸(RNA)病毒(Cooper et al.,Intervirology,1978,10,165-180)。目前，已知至少有七种类型的口蹄疫病毒(FMDV)：欧洲型(A、O和C)、非洲型(SAT1、SAT2和SAT3)和亚洲型(Asia 1)。还已经区分了许多子类型(Kleid et al.Science(1981),214,1125-1129)。
FMDV是直径约25nm的裸露的二十面体病毒，其含有由约8500个核苷酸组成的具有正极性的单链RNA分子。该RNA分子包含单个开放阅读框(ORF)，其编码单个多聚蛋白，其中尤其还含有衣壳前体，也称为蛋白质P1或P88。蛋白质P1在其氨基末端被肉豆蔻酰化。在成熟过程中，蛋白质P1被蛋白酶3C切割成称为VP0、VP1和VP3的三个蛋白质(或者分别为1AB、1D和1C；Belsham G.J.，Progress in Biophysics and Molecular Biology,1993,60,241-261)。在病毒粒子中，蛋白质VP0然后被切割成两个蛋白质VP4和VP2(或者分别为1A和1B)。将蛋白质VP0转化为VP4和VP2以及形成成熟病毒粒子的机制尚不清楚。蛋白质VP1、VP2和VP3具有约26,000Da的分子量，而蛋白质VP4较小为约8,000Da。
衣壳蛋白的简单组合形成原聚体或5S分子，其是FMDV衣壳的基本组分。然后将该原聚体络合成五聚体以形成12S分子。通过组装12个12S五聚体从而构成基因组RNA分子，从而构成146S颗粒，产生病毒粒子。也可以在其内部不存在RNA分子的情况下形成病毒衣壳(以下称为“空衣壳”)。空衣壳也被称为颗粒70S。空衣壳的形成可以在病毒复制过程中自然发生，或者可以通过化学处理人工产生。
已经对天然空衣壳进行了一些研究。特别地，Rowlands等人(Rowlands et al.,J.Gen.Virol.,1975,26,227-238)已经显示，A10口蹄疫病毒体主要包含四种蛋白质VP1、VP2、VP3和VP4。相比之下，天然空衣壳(不是通过重组而是从A10口蹄疫病毒的培养物中纯化得到的)基本上含有未切割的蛋白质VP0；与A-Pando口蹄疫病毒相同的结果由Rweyemamu(Rweyemamu et al.,Archives of Virology,1979,59,69-79)描述。在Tris-EDTA存在下透析后并离心后得到的人造空衣壳不含蛋白质VP4。根据Rowlands等人，这些人造衣壳仅具有轻微的免疫原性，而如该作者注意到的，天然空衣壳仅在用甲醛处理以使其稳定后具有免疫原性，而豚鼠的天然空衣壳诱导的抗体应答则是多变的。此外，Rowlands等人和Rweyemamu等人不同意需要稳定天然空衣壳。对于Rweyemamu等人，没有用甲醛处理不会影响天然空衣壳的抗原性水平。免疫原性仅通过诱导豚鼠的中和抗体来测试。
借助于昆虫细胞中重组杆状病毒将编码该衣壳蛋白的前体P1的基因的表达与编码与大肠杆菌(E.coli)中的蛋白酶3C相关的P1的基因的表达进行比较(Grubman et al.,Vaccine,1993,11,825-829；Lewis et al.,J.Virol.,1991,65,6572-6580)。大肠杆菌中P1和3C的共表达导致空衣壳70S的组装。这两种构造的表达产物在豚鼠和猪中产生中和抗体。用P1/杆状病毒构造获得的滴度低。这些相同的表达产物诱导在猪中的部分保护。然而，受到免受该疾病侵害的保护的猪不能受到免受攻击病毒的复制感染的保护。然而，大肠杆菌表达系统不会对蛋白质进行肉豆蔻酰化，蛋白酶3C对该细胞有毒性。Lewis等人得出结论，与病毒组成有关和在动物中获得最大保护所需的衣壳结构的基本问题尚未得到回答。此外，Grubman等人认为在配制疫苗之前需要稳定空衣壳；在这一点上，他们同意关于从病毒培养物提取获得的空衣壳所遇到的问题(见上文)。
含有蛋白质P1的部分或全部的融合蛋白也已通过使用病毒载体即疱疹病毒或痘苗病毒获得。CA-A-2,047,585特别描述了用于产生融合蛋白的牛疱疹病毒，所述融合蛋白含有与该牛疱疹病毒的糖蛋白gpIII融合的口蹄疫病毒的肽序列(结合于P1的氨基酸200至213的P1的氨基酸141至158)。病毒载体也已用于表达稳定的FMDV空衣壳(US7,531,182)。最近，已将植物作为生产FMDV抗原的来源进行了调查(US 2011/0236416)。
已经发展了许多假设、研究路线和建议，试图设计有效的抗FMD的疫苗。目前市场上仅有的疫苗含有灭活病毒。存在对FMDV疫苗安全性的担忧，因为欧洲FMD的爆发与疫苗制造的缺点有关(King,A.M.Q.et al.,1981,Nature 293:479-480)。灭活的疫苗不赋予长期免疫力，因此每年需要加强免疫注射，或者在发生疫情爆发时更频繁。此外，在灭活疫苗的生产过程中存在与不完全灭活和/或病毒逃逸相关的风险(King,A.M.Q.，出处同上)。本领域的目标是构建缺乏感染性FMDV基因组的构象正确的免疫原，以制备有效且安全的疫苗。
据报道，母体来源的抗体(MDA)能够抑制小牛(2岁以下的牛)抗FMD的疫苗接种的应答(Graves,1963,Journal of Immunology 91:251-256；Brun et al.,1977,Developments in Biological Standardisation,25:117-122)。
考虑到动物(包括人，尽管很少)对FMDV的易感性，预防FMDV感染并保护动物的方法是至关重要的。因此，需要抗FMDV的更有效且稳定的疫苗。
发明概述
本发明提供了包含抗原性FMDV多肽及其片段和变体的组合物或疫苗，以及包含表达FMDV多肽及其片段和变体的重组病毒载体的组合物或疫苗。FMDV抗原及其片段和变体具有免疫原性和保护性的性质。FMDV抗原可以由昆虫细胞中的杆状病毒表达载体产生。可以修饰FMDV抗原以增强FMDV空衣壳或FMDV VLP(病毒样颗粒)的稳定性。重组病毒载体可以是表达FMDV抗原的腺病毒载体。
抗原多肽及其片段和变体或重组病毒载体可以配制成疫苗和/或药物组合物。这样的疫苗或组合物可用于对动物进行疫苗接种并给动物提供免受同源和异源FMDV毒株的感染的保护。
本发明提供了用于增强保护普通动物和母体来源的抗体阳性(MDA阳性)动物免受FMDV感染的方法。本发明还提供了包含至少一种抗原多肽或其片段或变体的试剂盒和使用说明书。
附图简要说明
以下通过举例的方式但并不旨在将本发明仅限于所描述的具体实施方案给出的发明详述，可以结合附图最好地理解，其中：
图1描绘了总结DNA和蛋白质序列的表。
图2代表表达的FMDV多聚蛋白和由3C的加工。
图3描绘了pMEB097的质粒图谱。
图4描绘了MacMEB097的电镜结果。
图5描绘了A24株的FMDV衣壳蛋白的蛋白质印迹结果。
图6A和6B描绘了BacMEB099的电镜和特异性ELISA。
图7A-7D描绘了蛋白质序列的序列比对。
图8描绘了FMDV VLP。
图9描绘了FMDV A24 Cruzeiro中和抗体平均滴度的演化。
图10描绘了FMDV A24 Cruzeiro中和抗体滴度。
图11A和11B描绘了FMDV A24 Cruzeiro中和抗体平均滴度的演变。
图12A-12C描绘了攻击后平均直肠温度的演变。
图13描绘了在存在或不存在热或酸的情况下具有或不具有共价笼突变的A24Cruzeiro VLP的EM分析。
图14描绘了加热后A24 Cruzeiro血清型的具有或不具有共价笼突变的VLP的ELISA分析。
图15描绘了在5℃下存储的具有或不具有共价笼突变的A24 Cruzeiro VLP的随时间的ELISA分析。
图16描绘了显示O1 Manisa共价笼VLP耐热的ELISA结果和EM图。
图17描绘了显示O1 Manisa共价笼VLP在酸(上)和热(下)中的稳定性的ELISA结果。
图18A描绘了疫苗接种和分析方案。图18B描绘了抗FMD Asia 1 Shamir和FMD A22Iraq的中和抗体滴度的演变。
图19A描绘了体液应答(记忆B细胞检测)方案。图19B描述了Asia Shamir共价笼和Iraq A22共价笼VLP血清学数据。
图20描绘了在第27天在接种FMDV VLP的动物中的B细胞ELISPOT测定。
图21描绘了在第43天在接种FMDV VLP的动物中的B细胞ELISPOT测定(测量B记忆细胞)。
图22描绘了在第27天在接种FMDV VLP的动物中的特异性分泌γ干扰素(IFNγ)的细胞测定。
图23描绘了第42天各组的FMDV SVN log10滴度。
图24描绘了在研究过程中的平均的FMDV VN log 10滴度(第0天至第42天)。
图25描绘了pAD3027的质粒图谱。
图26描绘了vAD3027的蛋白质印迹。
发明详述
本发明提供了包含FMDV多肽、抗原及其片段和变体的组合物和包含表达在动物中引发免疫原性应答的FMDV抗原的重组病毒载体的组合物。抗原性多肽或其片段或变体由昆虫细胞中的杆状病毒表达载体产生。重组病毒载体可以是表达FMDV抗原的腺病毒载体。表达抗原的抗原多肽或片段或变体或重组病毒载体可以配制成疫苗或药物组合物，并用于引发或刺激动物中的保护性应答。在一个实施方案中，多肽抗原是FMDV P1、VP2或3C多肽或其活性片段或变体。可以修饰FMDV抗原以增强FMDV空衣壳或FMDV VLP(病毒样颗粒)的稳定性。
认识到本发明的抗原多肽可以是全长多肽或其活性片段或变体。“活性片段”或“活性变体”是指片段或变体保留多肽的抗原性质。因此，本发明包括在动物中引发免疫原性应答的任何FMDV多肽、抗原、表位或免疫原。FMDV多肽、抗原、表位或免疫原可以是任何FMDV多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于在动物如绵羊、牛、山羊或猪中引发、诱导或刺激应答的蛋白质、肽或其片段或变体。
具体的FMDV抗原多肽包括P1、VP2和3C。FMDV是直径约25nm的无包膜二十面体病毒，含有由大约8500个核苷酸组成的具有正极性的单链RNA分子。该RNA分子包含单个开放阅读框(ORF)，其编码单个多聚蛋白，其中尤其还含有衣壳前体，也称为蛋白质P1或P88。蛋白质P1在其氨基末端被肉豆蔻酰化。在成熟过程中，蛋白质P1被蛋白酶3C切割成称为VP0、VP1和VP3的三个蛋白质(或者分别为1AB、1D和1C；Belsham G.J.,Progress in Biophysicsand Molecular Biology,1993,60,241-261)。在病毒粒子中，蛋白质VP0然后被切割成两个蛋白质VP4和VP2(或者分别为1A和1B)。蛋白质VP1、VP2和VP3具有约26,000Da的分子量，而蛋白质VP4较小为约8,000Da。FMDV序列也在US 7,527,960和US 7,531,182中进行了描述，这些文献整体并入本文。
衣壳蛋白的简单组合形成原聚体或5S分子，其是FMDV衣壳的基本组分。然后将该原聚体络合成五聚体以形成12S分子。通过组装12个12S五聚体从而构成基因组RNA分子，从而构成146S颗粒，产生病毒粒子。也可以在其内部不存在RNA分子的情况下形成病毒衣壳(以下称为“空衣壳”)。空衣壳也被称为颗粒70S。空衣壳的形成可以在病毒复制过程中自然发生，或者可以通过化学处理人工产生。
本发明涉及可以包含有效量的重组FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体的牛、绵羊、山羊或猪的疫苗或组合物，以及药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。
在一些实施方案中，疫苗还包含佐剂，例如美国专利7371395中描述的水包油(O/W)乳剂。
在其它实施方案中，佐剂包括EMULSIGEN、氢氧化铝、皂苷和CpG，或其组合。
在一些实施方案中，动物中的应答是保护性免疫应答。
“动物”是指哺乳动物、鸟类等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可以选自马科动物(例如马)、犬科动物(例如狗、狼、狐狸、丛林狼、豺)、猫科动物(例如狮子、老虎、家猫、野猫、其他大猫，和其他猫科动物，包括猎豹和猞猁)、绵羊(如绵羊)、牛科动物(如牛、奶牛)、猪(例如猪)、山羊(如山羊)、禽类(如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类动物(例如原猴亚目的猴、跗猴、猴、长臂猿、猿)和鱼。术语“动物”还包括在所有发育阶段的个体动物，包括胚胎和胎儿阶段。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。除非上下文另有明确指出，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数指示物。同样，除非上下文另有明确说明，否则“或”旨在包括“和”。
值得注意的是，在本公开中，特别是在权利要求和/或段落中，诸如“包含”(“comprises”、“comprised”、“comprising”)等的术语可以具有在美国专利法中认为属于它的含义；例如它们可以是“包括”(“includes”、“included”、“including”)等；并且例如“基本上由...组成”(“consisting essentially of”、“consists essentially of”)这些术语具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许没有明确叙述的元素，但是排除在现有技术中发现的或影响的元素本发明的基本或新颖特征的元素。
本发明的抗原多肽能够保护免受FMDV感染。也就是说，它们能够刺激动物的免疫应答。“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可以包含整个生物体，被杀死的、减毒的或活的；生物体的亚单位或一部分；含有具有免疫原性的插入物的重组载体；能够在向宿主动物呈现时诱导免疫应答的一段DNA或DNA片段；多肽、表位、半抗原或其任何组合。或者，免疫原或抗原可以包含毒素或抗毒素。
本文所用的术语“免疫原性蛋白质、多肽或肽”包括在一旦施用于宿主的意义上是免疫学活性的多肽，其能够引发针对蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地，蛋白质片段使得其具有与总蛋白基本上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文所用的“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列，其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指蛋白质的片段，其包括一个或多个表位，因此引发上述免疫应答。可以使用本领域众所周知的任何数量的表位作图技术来鉴定这样的片段。见例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)。例如，线性表位可以通过例如在固体支持物上同时合成大量的肽，肽对应于蛋白质分子的一部分，并且将肽与抗体反应，同时肽仍然附着到支持物上。这样的技术在本领域中是已知的并描述于例如美国专利No.4,708,871；Geysen et al.,1984,PNAS USA,81(13):3998-400；Geysen etal.,1985,PNAS USA,82(1):178-82中。类似地，通过例如通过例如x射线晶体学和二维核磁共振确定氨基酸的空间构象来容易地鉴定构象表位。见例如，Epitope MappingProtocols，出处同上。特别适用于T.parva的蛋白质的方法在PCT/US2004/022605中有详细的描述，其通过引用整体并入本文。
如所讨论的，本发明包括抗原多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性蛋白质、多肽或肽”进一步考虑到序列的缺失、添加和置换，只要该多肽发挥产生如本文所定义的免疫应答的功能。术语“保守变异”表示氨基酸残基由另一生物学上相似的残基替代，或者替代核酸序列中的核苷酸，使得编码的氨基酸残基不改变，或者是另一种生物学上相似的残基。在这方面，特别优选的置换一般在本质上是保守的，即在氨基酸家族内发生的置换。例如，氨基酸一般分为四个家族：(1)酸性氨基酸——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性氨基酸——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水性残基，或用一个极性残基置换另一极性残基，例如精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸酸或谷氨酰胺置换天冬酰胺等；或用结构相关氨基酸置换氨基酸的类似保守置换，其不会对生物活性产生重大影响。因此，具有与参考分子基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质的免疫原性的次要氨基酸置换的蛋白质在参考多肽的定义内。通过这些修饰产生的所有多肽都包括在本文中。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲本氨基酸，只要产生于取代的多肽的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。
术语“表位”是指特异性B细胞和/或T细胞应答的抗原或半抗原上的位点。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。可以在简单的免疫测定中鉴定识别相同表位的抗体，其显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力。
对组合物或疫苗的“免疫应答”是宿主对目的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多种作用：抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生，其特异性涉及包括在目的组合物或疫苗中的抗原。优选地，宿主将显示出治疗性或保护性的免疫应答，使得对新的感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重性降低。此类保护将通过受感染宿主通常显示的症状的减少或缺乏、受感染宿主中更快的恢复时间和/或降低的病毒滴度来证明。
合成抗原也包括在定义范围内，例如，多表位、侧翼表位和其他重组或合成衍生的抗原。见例如，Bergmann et al.,1993；Bergmann et al.,1996；Suhrbier,1997；Gardneret al.,1998。为了本发明的目的，免疫原性片段通常包括至少约3个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10-15个氨基酸或约15-25个氨基酸或更多的氨基酸。片段的长度没有关键的上限，其可以包含近乎全长的蛋白质序列，或甚至包含蛋白质的至少一个表位的融合蛋白。
因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码FMDV多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸或基本上由其组成或由其组成。编码FMDV多肽片段的多核苷酸可包含编码多肽的序列的最少15个核苷酸、约30-45个核苷酸、约45-75个、或至少57个、87个或150个连续(consecutive或contiguous)核苷酸或基本上由其组成或由其组成。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指直链或支链、单链或双链或其杂交体的RNA或DNA。该术语还包括RNA/DNA杂交体。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其它糖和连接基团如氟代核糖和硫醇盐、以及核苷酸分支。核苷酸序列可以在聚合后，例如通过缀合用标记组分进一步修饰。在该定义中包括的其他类型的修饰是帽，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，以及引入将多核苷酸连接到蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体支持物的手段。多核苷酸可以通过化学合成获得或从微生物衍生获得。
术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关联的任何多核苷酸片段。因此，基因包括如基因组序列中的内含子和外显子，或者仅仅是如cDNAs中的编码序列，和/或它们表达所需的调控序列。例如，基因还指表达mRNA或功能性RNA或编码特异性蛋白质的核酸片段，并且其包括调节序列。
本发明还包含编码FMDV抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可以是聚合物并且具有任何长度，并且可以含有任何组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包含经修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且其可以被除氨基酸之外的化学部分中断。该术语还包括已经自然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。
“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质或细胞器)是指与已经在其中组分天然存在的生物体的细胞中的其他生物组分基本上分离或纯化的组分，例如其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。
本文所用的术语“纯化”不要求绝对纯度；相反，它是作为一个相对术语。因此，例如，纯化的多肽制剂是其中多肽比在其天然环境中的多肽更富集的多肽制剂。即多肽与细胞组分是分开的。通过“基本上纯化”，旨在使得多肽代表几个实施方案，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少98％或更多的细胞组分或材料已被去除。同样，多肽可以部分纯化。“部分纯化”是指少于60％的细胞组分或材料被去除。这同样适用于多核苷酸。本文公开的多肽可以通过本领域已知的任何手段纯化。
如上所述，抗原性多肽或其片段或变体是FMDV抗原性多肽，其通过昆虫细胞中的杆状病毒表达载体体外产生或病毒载体体内产生。所公开的多核苷酸和由此编码的多肽的片段和变体也包括在本发明中。“片段”是指多核苷酸的一部分或由其编码的抗原性氨基酸序列的一部分。如本文其他地方所述，多核苷酸的片段可以编码保留天然蛋白质的生物活性并因此具有免疫原性活性的蛋白质片段。多肽序列的片段保留在动物中诱导保护性免疫应答的能力。
“变体”旨在表示基本相似的序列。对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸内在一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或天然多核苷酸在一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。也可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽与参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比来评估本发明的具体多核苷酸(即，参考多核苷酸)的变体。“变体”蛋白意在通过在天然蛋白质的一个或多个位点上缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸置换而衍生自天然蛋白质的蛋白质。本发明所涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即它们引发免疫应答的能力。
一方面，本发明提供来自绵羊、牛、山羊或猪FMDV分离物的FMDV多肽。另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的多肽及其变体或片段。
另一方面，本发明涉及改善FMDV空衣壳或FMDV VLP(病毒样颗粒)的温度和/或酸稳定性。有利地通过形成二硫桥确保空衣壳的温度和/或酸稳定性。
特别地，这种改善是通过在衣壳的结构蛋白蛋白质VP2(衍生自P1)的多肽序列中例如在氨基酸序列SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16(FMDV A24株、FMDV O1Manisa株、FMDV Iraq株或FMDV Asia株的P1)的位置179用半胱氨酸替换原始序列的氨基酸而获得的。一般来说，该氨基酸的位置在衍生自其他口蹄疫病毒的VP2蛋白中是相同的(如特别是在实施例中描述的株的情况)。含有该氨基酸的区域对应于α螺旋。为了鉴定或确认待突变的氨基酸，考虑到序列在不同FMDV之间结构中保守的事实，将该区域的氨基酸序列与序列SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16上相应的区域(例如大约十个或稍微更多(例如10-20个)氨基酸的数量级)进行比对。待突变的氨基酸位于FMDV P1(SEQ ID NO：2、4、6、8、10或16)的位置179处。按照惯例，对应于起始密码子(其在自然序列中不存在并因此是添加的)的甲硫氨酸编号为1。
此外，来自绵羊、牛、山羊或猪的FMDV多肽的同源物意图在本发明的范围内。如本文所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能的两个多核苷酸或多肽，但在不相关的生物体中分别进化。术语“直系同源物”是指来自不同物种的两个多核苷酸或多肽，但是通过物种形成从共同祖先基因进化。通常，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内复制相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源通常具有不同的功能，但这些功能可能相关。野生型FMDV多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可以通过翻译后修饰、氨基酸序列差异或两者而不同于野生型FMDV多肽。特别地，本发明的同源物通常将表现出与全部或部分野生型FMDV多肽或多核苷酸序列具有至少80-85％、85-90％、90-95％、或95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且将表现出相似的功能。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指含有多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列的变化并且存在于天然群体(例如，病毒种类或品种)内。此类天然等位变异通常可导致多核苷酸或多肽中的1-5％的变化。可以通过对许多不同物种中的目的核酸序列进行测序来鉴定等位基因变体，其可以通过使用杂交探针来容易地进行以鉴定那些物种中相同的遗传基因座。任何和所有此类由天然等位基因变异和不改变目的基因的功能活性的核酸变异和所得的氨基酸多态性或变异意图在本发明的范围内。
如本文所用，术语“衍生物”或“变体”是指具有一个或多个保守氨基酸变异或其他次要修饰的多肽或编码多肽的核酸，使得(1)相应的多肽与野生型多肽相比具有基本相同的功能，或(2)针对多肽产生的抗体与野生型多肽具有免疫反应性。这些变体或衍生物包括对FMDV多肽一级氨基酸序列具有微小修饰的多肽，其可能导致与未修饰的对应物多肽相比具有基本相同活性的肽。这样的修饰可能是有意的，如通过定点诱变，或可能是自发的。术语“变体”进一步考虑了序列的缺失、添加和置换，只要该多肽发挥产生如本文所定义的免疫应答的功能。
术语“保守变异”表示氨基酸残基由另一生物学上相似的残基替代，或者替代核酸序列中的核苷酸，使得编码的氨基酸残基不改变，或者是另一种生物学上相似的残基。在这方面，如上所述，特别优选的置换一般在本质上是保守的。
本公开的多核苷酸包括作为遗传密码的结果而简并的序列，例如针对特定宿主的优化的密码子使用。如本文所用，“优化的”是指经遗传工程改造以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码FMDV多肽的优化的多核苷酸，FMDV蛋白基因的DNA序列可以被修饰为1)包含特定物种中被高度表达的基因所优选的密码子；2)在核苷酸碱基组成中包含基本上在所述物种中发现的A+T或G+C含量；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除引起不稳定、不适当的多聚腺苷酸化、降解和终止RNA或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。FMDV蛋白在所述物种中的表达增加可以通过利用真核生物和原核生物或特定物种中密码子使用的分布频率来实现。术语“优选密码子使用的频率”是指特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定的氨基酸时表现的偏好。存在20个天然氨基酸，其中大多数由多个密码子指定。因此，只要核苷酸序列编码的FMDV多肽的氨基酸序列在功能上没有变化，则所有简并核苷酸序列都包括在本发明中。
两个氨基酸序列之间的序列同一性可以通过NCBI(美国国家生物技术信息中心)成对blast和blosum62矩阵使用标准参数建立(见例如“美国国家生物技术中心”(NCBI,Bethesda,Md.,USA)服务器上以及在Altschul等人中提供的BLAST或BLASTX算法；因此，本文件通过术语“blast”说明使用该算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)。
就序列而言，“同一性”可以指具有相同核苷酸或氨基酸的位置数除以两个序列中的较短序列的核苷酸或氨基酸的数目，其中两个序列的比对可以根据Wilbur和Lipman算法确定。两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性可以使用Vector NTI软件包(Invitrogen，1600 Faraday Ave.，Carlsbad，CA)确定。当RNA序列被认为是相似的或具有与DNA序列的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本发明的范围内，并且可以通过DNA序列中的胸苷(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)而衍生自DNA序列。
杂交反应可以在不同“严格性”的条件下进行。增加杂交反应严格性的条件是众所周知的。见例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook et al.,1989)。
本发明还包括在载体分子或表达载体中含有的并且可操作地连接到启动子元件并任选地与增强子连接的FMDV多核苷酸。
“载体”是指包含待体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。为了预防或治疗的目的，异源多核苷酸可以包含目的序列，并且可以任选地以表达盒的形式。如本文所用，载体不需要能够在最终靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆载体和病毒载体。
术语“重组体”是指在自然界中不发生或者以自然界中未发现的排列与另一个多核苷酸连接的半合成或合成来源的多核苷酸。
“异源”意味着从与其进行比较的实体的其他部分的遗传上不同的实体衍生出来。例如，可以通过遗传工程技术将多核苷酸置于来自不同来源的质粒或载体中，并且多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出并可操作地连接到天然序列以外的编码序列的启动子是异源启动子。
本发明涉及可以包含有效量的重组FMDV抗原和药学或兽医学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或媒介物的绵羊、牛、山羊和猪疫苗或药物或免疫组合物。
本文所述的主题部分地涉及与在高度免疫原性的杆状病毒/昆虫细胞表达系统中制备的FMDV抗原相关并保护动物免受来自同源和异源FMDV毒株的攻击的组合物和方法。
组合物
本发明涉及FMDV疫苗或组合物，其可以包含有效量的重组FMDV抗原和药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。在一个实施方案中，重组FMDV抗原由昆虫细胞中的杆状病毒表达载体表达。在另一个实施方案中，FMDV疫苗或组合物包含表达FMDV抗原的重组病毒载体。
本发明的一个实施方案涉及包含FMDV空衣壳的疫苗或组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含表达FMDV空衣壳的病毒载体的疫苗或组合物。通过表达区域P1、2A/2B'/3B'和3C的cDNA获得FMDV空衣壳。FMDV空衣壳或FMDV VLP(病毒样颗粒)可以修饰以具有增强的热和/或酸(低PH)稳定性。
本发明涉及抗口蹄疫的疫苗，特别涉及改善其热和/或酸(低PH)稳定性。它还涉及制备这些疫苗的方法、抗原用于生产这些疫苗的用途和使用它们的疫苗接种方法。
本发明还涉及核苷酸序列、特别是cDNA并涉及氨基酸序列，其与病毒的天然序列相比是经修饰的。本发明还涉及经修饰的核苷酸序列的表达产物，并涉及整合这些修饰的FMDV抗原和病毒。
本发明包括在动物例如绵羊、牛、山羊或猪中引发免疫原性应答的任何FMDV多肽、抗原、表位或免疫原。FMDV多肽、抗原、表位或免疫原可以是任何FMDV多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于在动物例如绵羊、牛、山羊或猪中引发、诱导或刺激反应的蛋白质、肽或其片段。
在其中FMDV免疫组合物或疫苗是重组免疫组合物或疫苗的实施方案中，组合物或疫苗包含重组载体和药物或兽医可接受的赋形剂、载体、佐剂或媒介物；重组载体是可以包含编码FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的杆状病毒表达载体。FMDV多肽、抗原、表位或免疫原可以是VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、NS1、VP7、NS2、VP6、NS3、NS3a、P1、VP0、3C或其任何片段。
在另一个实施方案中，FMDV抗原是P1、VP0、VP3、VP1、VP2、VP4、2A、2B或3C。
在一个实施方案中，编码一种或多种FMDV抗原的核酸分子是编码FMDV P1区的cDNA和编码FMDV的FMDV 3C蛋白酶的cDNA。
在一个实施方案中，FMDV抗原可以是P1-3C多肽。在另一个实施方案中，FMDV抗原可以是单独的P1，或P1-2A/2B1。在另一个实施方案中，FMDV抗原可以是VP0-VP3。在另一个实施方案中，FMDV抗原可以是VP4-VP2。在另一个实施方案中，FMDV抗原可以是3C，或者可以是具有优化用于在昆虫细胞中表达的5'UTR的3C。在一个实施方案中，P1-2A/2B1和3C多肽可以使用单一构建体在昆虫细胞中表达，并且表达可以由一个或多个启动子序列调节。在另一个实施方案中，FMDV抗原是经修饰的P1或VP2。
在另一个实施方案中，FMDV抗原可以来源于FMDV O1 Manisa,O1 BFS或Campos,A24 Cruzeiro,Asia 1 Shamir,A Iran’96,A22 Iraq,SAT2 Saudi Arabia。
本发明涉及FMDV疫苗，其可以包含有效量的重组FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体，以及药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。
在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物可以是油包水乳剂。在另一个实施方案中，油包水乳剂可以是水包油乳剂。
本发明还包括在载体分子或表达载体中含有的并且可操作地连接到启动子元件并任选地与增强子连接的FMDV多核苷酸。
一方面，本发明提供FMDV多肽，特别是具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的绵羊、牛、山羊或猪多肽及其变体或片段。
另一方面，本发明提供了具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％与本发明的抗原多肽的序列同一性，特别是具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的多肽。
另一方面，本发明提供上述鉴定的FMDV多肽(SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16)的片段和变体，其可以容易地由本领域的技术人员使用众所周知的分子生物学技术进行制备。
变体是具有与SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的同源多肽。
FMDV多肽的免疫原性片段包括具有如SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所示的序列的FMDV多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸，或其变体。在另一个实施方案中，FMDV多肽的片段包括在全长FMDV多肽上发现的特异性抗原表位。
另一方面，本发明提供编码FMDV多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示的序列的多肽的多核苷酸。另一方面，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性百分比的多肽的多核苷酸，或保守的变体、等位变体、同源物或免疫原性片段，其包含这些多肽或这些多肽的组合之一的至少八个或至少十个连续的氨基酸。
另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20的核苷酸序列的多核苷酸或其变体。另一方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20所示序列的多核苷酸之一具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸，或其变体。
本发明的多核苷酸可以包含另外的序列，例如在同一转录单位内的另外的编码序列，控制元件例如启动子，核糖体结合位点，增强子，5'UTR，3'UTR，转录终止子，多聚腺苷酸化位点，在相同或不同启动子的控制下另外的转录单位，允许宿主细胞的克隆、表达、同源重组和转化的序列，以及可能期望提供本发明实施方案的任何此类构建体。
用于表达FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的元件有利地存在于本发明的载体中。以最小的方式，其包括起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及任选地还包含、基本上由以下组成或由以下组成：某些载体如质粒和某些病毒载体例如除痘病毒之外的其他病毒载体的多聚腺苷酸化序列。当多核苷酸编码多聚蛋白片段例如FMDV肽时，有利地在载体中将ATG置于阅读框的5'，将终止密码子置于3'。可以存在用于控制表达的其它元件，例如增强子序列、稳定序列，例如允许蛋白质分泌的内含子和信号序列。
本发明还涉及包含载体例如表达载体的制备物，例如治疗组合物。制备物可以包含一种或多种载体，例如表达载体，例如体内表达载体，包含并表达一种或多种FMDV多肽、抗原、表位或免疫原。在一个实施方案中，载体含有并表达多核苷酸，其在药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物中包含、基本上由以下组成或由以下组成：编码(并有利地表达)FMDV抗原、表位或免疫原的多核苷酸。因此，根据本发明的实施方案，制备物中的其它载体包含、基本上由以下组成或由以下组成：编码FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种其它蛋白质或其片段，并且在适当情况下载体表达FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种其它蛋白质或其片段。
根据另一个实施方案，制备物中的载体包含、基本上由以下组成或由以下组成：编码FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种蛋白质或其片段的多核苷酸，该载体表达该多核苷酸。在另一个实施方案中，制备物包含一种、两种或更多种载体，其包含编码并有利体内表达FMDV多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸。本发明还涉及包含编码和表达不同FMDV多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的载体的混合物，例如来自不同动物种类例如但不限于绵羊、牛、山羊或猪的FMDV多肽、抗原、表位或免疫原。
根据本发明的另一个实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在具体的非限制性实例中，pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke et al.,1997；Hartikka et al.,1996,Hum Gene Ther,7(10):1205-17；见例如，美国专利号5,846,946和6,451,769)可以用作插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒衍生自pVR1012并含有人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号包含Genbank登录号为HUMTPA14中的氨基酸M(1)至氨基酸S(23)。在另一个具体的非限制性实例中，用作插入多核苷酸序列的载体的质粒可以含有在Genbank登录号为U28070中的氨基酸M(24)至氨基酸A(48)的马IGF1的信号肽序列。可以在实践中参考或使用的关于DNA质粒的附加信息发现于例如美国专利号6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362中。
术语质粒涵盖包含根据本发明的多核苷酸的任何DNA转录单位和其在所需宿主或靶标的细胞中体内表达所必需的元件；并且在这方面，应注意，超螺旋或非超螺旋、环状质粒以及线性形式旨在在本发明的范围内。
每个质粒除了编码FMDV抗原、表位或免疫原的多核苷酸之外还包含或含有或基本上由其组成：任选地与异源肽序列、变体、类似物或片段融合，可操作地连接到启动子或在启动子的控制下或依赖于启动子。通常，在真核细胞中使用功能强的启动子是有利的。强启动子可以是但不限于人源或鼠源的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或任选地具有另一来源例如大鼠或豚鼠，Super启动子(Ni,M.et al.,Plant J.7,661-676,1995)。CMV-IE启动子可以包含实际的启动子部分，其可以与或可以不与增强子部分相关联。可以参考EP-A-260 148、EP-A-323 597、美国专利号5,168,062、5,385,839和4,968,615以及PCT申请号WO87/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV-IE(Boshart et al.,1985,Cell,41(2):521-30)或鼠CMV-IE。
更广义地说，启动子具有病毒、植物或细胞来源。在本发明实践中可能有用的除CMV-IE之外的强病毒启动子是SV40病毒的早/晚启动子或者Rous肉瘤病毒的LTR启动子。可用于本发明实践中的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，例如，结蛋白启动子(Kwissaet al.,2000,Vaccine,18(22):2337-44)或肌动蛋白启动子(Miyazaki et al.,1989,Gene,79(2):269-77)。
质粒可以包含其他表达控制元件。引入稳定序列，例如内含子序列，例如玉米醇脱氢酶内含子(Callis et al.Genes&Dev.1(10):1183-1200，1987年12月)、hCMV-IE(PCT申请号WO1989/01036)的第一个内含子、兔β-球蛋白基因的内含子II(van Ooyen et al.,1979,Science,206(4416):337-44)是特别有利的。在另一个实施方案中，质粒可以包含3'UTR。3'UTR可以是但不限于农杆菌(agrobacterium)胭脂碱合酶(Nos)3'UTR(Nopaline synthase:transcript mapping and DNA sequence.Depicker,A.et al.J.Mol.Appl.Genet.,1982；Bevan,NAR,1984,12(22):8711-8721)。
对于除痘病毒之外的质粒和病毒载体的多聚腺苷酸化信号(多聚A)，可以更多地使用牛生长激素(bGH)基因的多聚(A)信号(见US 5,122,458)或兔β-球蛋白基因的多聚(A)信号或SV40病毒的多聚(A)信号。
“宿主细胞”表示已被遗传改变或能够通过外源多核苷酸(例如重组质粒或载体)的施用被遗传改变的原核或真核细胞。当提到遗传改变的细胞时，该术语指原始改变的细胞和其后代。
在一个实施方案中，重组FMDV抗原在昆虫细胞中表达。
使用方法
在实施方案中，本文公开的主题涉及接种绵羊、牛、山羊或猪的方法，包括向绵羊、牛、山羊或猪施用有效量的疫苗，其可以包含有效量的重组FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体，以及药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。
在本发明的一个实施方案中，该方法包括单次施用根据本发明的乳剂配制的疫苗组合物。例如，在一个实施方案中，免疫或疫苗组合物包含表达FMDV抗原(包括多肽和VLP(病毒样颗粒)或空衣壳)的杆状病毒，或表达FMDV抗原的重组病毒载体。电镜显示用杆状病毒表达载体转化的昆虫细胞产生FMDV VLP或FMDV空衣壳，因此根据本发明的免疫学或疫苗组合物包括包含FMDV VLP或FMDV空衣壳的那些。
在本发明的另一个实施方案中，该方法包括单次施用两种异源疫苗组合物。异源疫苗或组合物可以是不同类型的疫苗，例如FMDV VLP疫苗或FMDV病毒载体疫苗。异源疫苗也可以是表达不同FMDV血清型衣壳的相同类型的疫苗，例如A24、O1 Manisa、Asia或Iraq株。
在实施方案中，本文公开的主题涉及一种接种绵羊、牛、山羊或猪的方法，包括向绵羊、牛、山羊或猪施用或在猪昆虫细胞中产生杆状病毒载体产生的FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体。
在实施方案中，本文公开的主题涉及引发免疫应答的方法，包括向绵羊、牛、山羊或猪施用包含由昆虫细胞中的杆状病毒载体产生的FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体的疫苗。
在实施方案中，本文公开的主题涉及制备疫苗或组合物的方法，其包括分离在昆虫细胞中由杆状病毒载体产生的FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体，并任选与药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物混合。
使用同源和异源FMDV株进行攻击以测试疫苗的功效。施用可以是皮下或肌内施用。施用可以是无针的(例如Pigjet或Bioject)。
在本发明的一个实施方案中，可以使用初免-加强免疫的方案，其包括使用至少一种常见多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次主要施用(primary administration)和至少一次加强施用。用于主要施用的免疫组合物或疫苗性质与用作加强免疫的免疫组合物或疫苗不同。然而，应注意，相同的组合物可用作主要施用和加强免疫。这种施用操作方案被称为“初免-加强免疫”。
根据本发明的初免-加强免疫可以包括用于表达编码抗原性多肽或其片段或变体的FMDV编码序列或其片段的重组病毒载体。具体地，病毒载体可以表达编码抗原多肽的FMDV基因或其片段。本文考虑的病毒载体包括但不限于痘病毒[例如，痘苗病毒或减毒痘苗病毒、禽痘病毒或减毒的禽痘病毒(例如，金丝雀痘、鸡痘、鸽痘(dovepox、pigeonpox)、鹑痘、ALVAC、TROVAC；见例如US 5,505,941,US 5,494,8070)、浣熊痘病毒、猪痘病毒等]、腺病毒(例如人腺病毒、犬腺病毒)、疱疹病毒(例如犬疱疹病毒、火鸡疱疹病毒、马立克氏病病毒、感染性喉气管炎病毒、猫疱疹病毒、喉气管炎病毒(ILTV)、牛疱疹病毒、猪疱疹病毒)、杆状病毒、逆转录病毒等。在另一个实施方案中，禽痘病毒表达载体可以是金丝雀痘载体，例如ALVAC。在另一个实施方案中，禽痘病毒表达载体可以是鸡痘载体，例如TROVAC。将待表达的本发明的FMDV抗原在特定痘病毒启动子的控制下插入，例如，昆虫痘病毒Amsactamoorei 42K启动子(Barcena,Lorenzo et al.,2000,J Gen Virol.,81(4):1073-85)、痘苗启动子7.5kDa(Cochran et al.,1985,J Virol,54(1):30-7)、痘苗启动子I3L(Riviere etal.,1992,J Virol,66(6):3424-34)、痘苗启动子HA(Shida,1986,Virology,150(2):451-62)、痘苗启动子ATI(Funahashi et al.,1988,J Gen Virol,69(1):35-47)、痘苗启动子H6(Taylor et al.,1988,Vaccine,6(6):504-8；Guo et al.,1989,J Virol,63(10):4189-98；Perkus et al.,1989,J Virol,63(9):3829-36)，和其他启动子。
在另一个实施方案中，禽痘病毒表达载体可以是金丝雀痘载体，例如ALVAC。FMDV抗原、表位或免疫原可以是FMDV P1-3C。FMDV病毒载体可以是金丝雀痘病毒，例如vCP2186、vCP2181或vCP2176，或鸡痘病毒如vFP2215(见US 7,527,960)。在另一个实施方案中，FMDV抗原、表位或免疫原可以在浮萍中生产(US 2011/0236416)。
在本发明的初免-加强免疫的方案的另一方面，施用包含本发明的FMDV抗原的组合物，随后施用包含在体内含有和表达FMDV抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物，或灭活的包含FMDV抗原的病毒疫苗或组合物，或含有或表达FMDV抗原的DNA质粒疫苗或组合物。同样，初免-加强免疫的方案可以包括施用包含体内含有和表达FMDV抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物，或包含FMDV抗原的灭活的病毒疫苗或组合物，或含有或表达FMDV抗原的DNA质粒疫苗或组合物，然后施用包含本发明的FMDV抗原的组合物。进一步注意到，主要和次要施用可以包含包含本发明的FMDV抗原的组合物。
初免-加强免疫操作方案包括使用至少一种共同多肽和/或其变体或片段的至少一次初始施用和至少一次加强施用。用于初始施用的疫苗在性质上可能与用作晚期加强疫苗的疫苗不同。初始施用可以包括一次或多次施用。类似地，加强施用可以包括一次或多次施用。
用于作为哺乳动物的靶物种的组合物的剂量体积，例如，基于病毒载体(例如基于非痘病毒-病毒-载体的组合物)的绵羊、牛、山羊或猪组合物的剂量体积通常为约0.1至约5.0ml、约0.1至约3.0ml、约0.5ml至约2.5ml。
疫苗的功效可以在最后一次免疫接种后约2-4周内通过用FMDV强毒株攻击动物(例如绵羊、牛、山羊或猪)来进行测试，有利地是FMDV O1 Manisa,O1 BFS或Campos,A24Cruzeiro,Asia 1 Shamir,A Iran’96,A22 Iraq,SAT2 Saudi Arabia株。
其他株可能包括FMDV株A10-61,A5,A12,A24/Cruzeiro,C3/Indaial,O1,C1-SantaPau,C1-C5,A22/550/Azerbaijan/65,SAT1-SAT3,A,A/TNC/71/94,A/IND/2/68,A/IND/3/77,A/IND/5/68,A/IND/7/82,A/IND/16/82,A/IND/17/77,A/IND/17/82,A/IND/19/76,A/IND/20/82,A/IND/22/82,A/IND/25/81,A/IND/26/82,A/IND/54/79,A/IND/57/79,A/IND/73/79,A/IND/85/79,A/IND/86/79,A/APA/25/84,A/APN/41/84,A/APS/44/05,A/APS/50/05,A/APS/55/05,A/APS/66/05,A/APS/68/05,A/BIM/46/95,A/GUM/33/84,A/ORS/66/84,A/ORS/75/88,A/TNAn/60/947/Asia/1,A/IRN/05,Asia/IRN/05,O/HK/2001,O/UKG/3952/2001,O/UKG/4141/2001,Asia 1/HNK/CHA/05(GenBank登录号EF149010，通过引用并入本文),Asia I/XJ(Li,ZhiYong et al.Chin Sci Bull,2007),HK/70(Chin Sci Bull,2006,51(17):2072―2078),O/UKG/7039/2001,O/UKG/9161/2001,O/UKG/7299/2001,O/UKG/4014/2001,O/UKG/4998/2001,O/UKG/9443/2001,O/UKG/5470/2001,O/UKG/5681/2001,O/ES/2001,HKN/2002,O5India,O/BKF/2/92,K/37/84/A,KEN/1/76/A,GAM/51/98/A,A10/Holland,O/KEN/1/91,O/IND49/97,O/IND65/98,O/IND64/98,O/IND48/98,O/IND47/98,O/IND82/97,O/IND81/99,O/IND81/98,O/IND79/97,O/IND78/97,O/IND75/97,O/IND74/97,O/IND70/97,O/IND66/98,O/IND63/97,O/IND61/97,O/IND57/98,O/IND56/98,O/IND55/98,O/IND54/98,O/IND469/98,O/IND465/97,O/IND464/97,O/IND424/97,O/IND423/97,O/IND420/97,O/IND414/97,O/IND411/97,O/IND410/97,O/IND409/97,O/IND407/97,O/IND399/97,O/IND39/97,O/IND391/97,O/IND38/97,O/IND384/97,O/IND380/97,O/IND37/97,O/IND352/97,O/IND33/97,O/IND31/97,O/IND296/97,O/IND23/99,O/IND463/97,O/IND461/97,O/IND427/98,O/IND28/97,O/IND287/99,O/IND285/99,O/IND282/99,O/IND281/97,O/IND27/97,O/IND278/97,O/IND256/99,O/IND249/99,O/IND210/99,O/IND208/99,O/IND207/99,O/IND205/99,O/IND185/99,O/IND175/99,O/IND170/97,O/IND164/99,O/IND160/99,O/IND153/99,O/IND148/99,O/IND146/99,O/SKR/2000,A22/India/17/77。
这些FMDV毒株的进一步细节可以在欧洲生物信息学信息(EMBL-EBI)网页上找到，并且所有相关的核苷酸序列通过引用并入本文。本发明人考虑到本文列出的所有FMDV株和尚待鉴定的所有FMDV株可以根据本公开内容的教导来表达，以产生例如有效的疫苗组合物。使用同源和异源株进行攻击以测试疫苗的功效。可以皮内、皮下、喷雾、鼻内、眼内、气管内、和/或口服对动物进行攻击。
初始-加强施用可以有利地相隔1至6周、例如相隔约3周进行。根据一个实施方案，还设想了有利地使用基于病毒载体的疫苗的半年加强免疫或年度加强免疫。在第一次施用时，动物有利地为至少6至8周龄。
包含在初免-加强免疫操作方案中使用的本发明的重组抗原多肽的组合物包含在药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂、佐剂或赋形剂中。本发明的操作方案保护动物免受绵羊、牛、山羊或猪FMDV的感染和/或预防感染动物的疾病进展。
本领域技术人员应当理解，本文的公开内容以示例的方式提供，并且本发明不限于此。根据本文的公开内容和本领域的知识，本领域技术人员可以确定每次注射操作方案使用的施用次数、施用途径和剂量，而无需任何过度的实验。
本发明考虑了至少一种施用动物有效量的根据本发明制备的治疗组合物。动物可能是男性、女性、怀孕女性和新生儿。该施用可以通过各种途径，包括但不限于肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或通过鼻内或口服施用。根据本发明的治疗组合物还可以通过无针装置(例如使用Pigjet，Dermojet，Biojector，Avijet(Merial,GA,USA)，Vetjet或Vitajet装置(Bioject,Oregon,USA))施用。施用质粒组合物的另一种方法是使用电穿孔(见例如Tollefsen et al.,2002；Tollefsen et al.,2003；Babiuk et al.,2002；PCT申请号WO99/01158)。在另一个实施方案中，通过基因枪或金颗粒轰击将治疗组合物递送至动物。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗有效量的用于在靶细胞中递送和表达FMDV抗原或表位的制剂的施用。治疗有效量的确定是本领域普通技术人员的常规实验。在一个实施方案中，制剂包含表达载体，其包含表达FMDV抗原或表位的多核苷酸和药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂有助于转染或将多核苷酸转移至宿主动物的其它手段和/或改善宿主中载体或蛋白质的保存。
在一个实施方案中，本文公开的主题提供了用于感染和接种动物之间的区分(DIVA)的检测方法。
本文公开了本发明的疫苗或组合物的使用允许检测动物中的FMDV感染。本文公开了本发明的疫苗或组合物的使用允许通过区分感染和接种的动物(DIVA)来检测动物中的感染。本文公开了一种使用FMDV非结构蛋白(例如FMDV 3ABC或3D特异性ELISA)来诊断动物中FMDV感染的方法。
制品
在实施方案中，本文公开的主题涉及用于进行引发或诱导免疫应答的方法的试剂盒，该试剂盒可以包含任何一种重组FMDV免疫组合物或疫苗，或灭活的FMDV免疫组合物或疫苗，重组FMDV病毒组合物或疫苗，以及执行该方法的说明书。
本发明的另一个实施方案是用于在动物中进行诱导抗FMDV的免疫或保护性应答的方法的试剂盒，其包括包含本发明的FMDV抗原的组合物或疫苗和重组FMDV病毒免疫组合物或疫苗，以及用于进行用于在动物中引发免疫应答的有效量的递送方法的说明书。
本发明的另一个实施方案是用于在动物中进行诱导抗FMDV的免疫或保护性应答的方法的试剂盒，其包含本发明的FMDV抗原的组合物或疫苗和灭活的FMDV免疫组合物或疫苗，以及执行用于在动物中引发免疫应答的有效量的递送方法的说明书。
本发明的另一方面涉及如上的根据本发明的初免-加强免疫接种的试剂盒。该试剂盒可以包含至少两个小瓶：含有根据本发明的初次接种疫苗或组合物的第一小瓶和含有根据本发明的加强免疫接种疫苗或组合物的第二小瓶。该试剂盒可有利地含有另外的第一或第二小瓶用于另外的初次接种或另外的加强疫苗接种。
以下实施方案包括在本发明中。在实施方案中，公开了包含FMDV抗原或其片段或变体以及药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物的组合物。在另一个实施方案中，公开了包含表达FMDV抗原的重组病毒载体和药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物的组合物。在另一个实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体包括包含绵羊、牛、山羊或猪FMDV抗原的至少15个氨基酸的免疫原性片段的上述组合物。在实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体部分纯化的上述组合物。在实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体基本上纯化的上述组合物。
在实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体是绵羊、牛、山羊或猪FMDV多肽的上述组合物。在实施方案中，公开了其中FMDV多肽是P1-3C多肽、P1多肽、VP0多肽、VP1多肽、VP3多肽、VP2多肽、VP4多肽、2A多肽、2B1多肽或3C多肽的上述组合物。在实施方案中，公开了其中FMDV抗原或其片段或变体具有与SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16中所示的序列具有至少80％的序列同一性的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中FMDV抗原由与SEQ ID NO：3、7、9、11、14、15、17、18、19或20所示的序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码的上述组合物。在一个实施方案中，公开了其中药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物是油包水乳剂或水包油乳剂的上述组合物。在另一个实施方案中，公开了一种使对绵羊、牛、山羊或猪FMDV敏感的动物接种疫苗的方法，包括将上述组合物施用于动物。在实施方案中，公开了一种疫苗接种对包含初免-加强免疫的方案的绵羊、牛、山羊或猪FMDV敏感的动物的方法。在实施方案中，在昆虫细胞中表达的基本上纯化的抗原性多肽，其中多肽包含：与具有SEQ ID NO：1、2、4、5、6、8、10、12、13或16所示序列的多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方案中，动物优选为绵羊、牛、猪或山羊。在一个实施方案中，公开了一种在动物中诊断FMDV感染的方法。在另一个实施方案中，公开了用于初次加强免疫接种的试剂盒包含至少两个小瓶，其中第一小瓶含有包含FMDV抗原或其片段或变体的组合物和第二小瓶含有含有或表达FMDV抗原的重组病毒载体。
药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或佐剂或赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如，药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明方法的其它药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学上可接受的载体或媒介物或佐剂或赋形剂可以是促进载体(或体外由本发明载体表达的蛋白质)施用的任何化合物或化合物的组合；有利地，载体、媒介物或赋形剂可以促进该载体(或蛋白质)的转染和/或改善保存。这里在一般说明书中讨论并且还可以由本领域技术人员的技术人员阅读本公开结合本领域的知识来确定剂量和剂量体积，无需任何过度的实验。
含有有利但仅适用于质粒的季铵盐的阳离子脂质有利的是具有下式的那些：
Figure BDA0001275380070000291
其中R 1是具有12至18个碳原子的饱和或不饱和直链脂族基团，R 2是另一个含有2或3个碳原子的脂族基团，X是胺基或羟基，例如DMRIE。在另一个实施方案中，阳离子脂质可以与中性脂质例如DOPE结合。
在这些阳离子脂质中，优选DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地与中性脂质、有利地DOPE(二油酰-磷脂酰乙醇胺；Behr，1994)结合，以形成DMRIE-DOPE。
有利地，与施用该制剂或在施用制剂之前不久，与佐剂的质粒混合物即时和有利地同时形成；例如，在施用之前不久或之前，形成质粒-佐剂混合物，有利地是在施用混合物之前给予足够的时间以形成复合物，例如，在施用前约10至约60分钟，例如施用前约30分钟。
当DOPE存在时，DMRIE:DOPE摩尔比有利地为约95:约5至约5:约95，更有利地约1：约1，例如1:1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂：质粒重量比可以在约50:约1至约1:约10，例如约10:约1至约1:约5，以及约1:约1至约1:约2，例如1:1和1:2。
在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物可以是油包水乳剂。合适的油包水乳剂的实例包括在4℃下稳定且流动的油基油包水型疫苗乳剂，其含有：含有6至50v/v％抗原的水相，优选12至25v/v％，50至94v/v％的油相，其总共或部分含有不可代谢的油(例如矿物油如石蜡油)和/或可代谢的油(例如植物油，或脂肪酸、多元醇或醇酯)，0.2至20p/v％的表面活性剂，优选3至8p/v％，后者全部或部分，或聚甘油酯的混合物，所述聚甘油酯优选为聚甘油(聚)蓖麻醇酸酯，或聚氧乙烯蓖麻油或氢化聚氧乙烯蓖麻油。可用于油包水乳剂中的表面活性剂的实例包括乙氧基化脱水山梨醇酯(例如，可从AppliChem,Inc.,Cheshire,CT获得的聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN
Figure BDA0001275380070000301
)和脱水山梨糖醇酯(例如，可从Sigma Aldrich,St.Louis,MO获得的脱水山梨糖醇单油酸酯(SPAN
Figure BDA0001275380070000302
))。此外，关于油包水乳剂，还见美国专利号6,919,084，例如其实施例8，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，含抗原的水相包含含有一种或多种缓冲剂的盐溶液。合适的缓冲溶液的实例是磷酸盐缓冲盐水。在有利的实施方案中，油包水乳剂可以是水/油/水(W/O/W)三相乳剂(美国专利号6,358,500)。其它合适的乳剂的实例描述在美国专利7,371,395中。
根据本发明的免疫组合物和疫苗可以包含或基本上由一种或多种佐剂组成。用于实施本发明的合适的佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸、马来酸酐和烯基衍生物聚合物的聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或多个非甲基化CpG的寡脱氧核糖核苷酸序列单位(Klinman et al.,1996,PNAS USA,93(7):2879-83；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如由M.Powell,M.Newman,Plenum Press出版的“Vaccine Design,The Subunit andAdjuvant Approach”1995,6:147,183的第147页上描述的SPT乳剂和同一出版物的第183页上描述的乳剂MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如，DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在引用并引入本文的任何文献中讨论的其他佐剂，或(9)其任何组合或混合物。
特别适用于病毒载体的水包油乳剂(3)可以基于：轻质液体石蜡油(欧洲药典型)，类异戊二烯油如角鲨烷，角鲨烯，烯烃低聚产生的油，例如，异丁烯或癸烯，具有直链烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇，二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或支链、脂肪醇或酸的脂，特别是异硬脂酸酯。
油与乳化剂组合使用以形成乳剂。乳化剂可以是非离子表面活性剂，例如：一方面脱水山梨醇的酯，二缩甘露醇(例如，脱水甘油醇油酸酯)，甘油，聚甘油或丙二醇，另一方面是油酸，异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸，所述酯任选地是乙氧基化的，或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，例如Pluronic，例如L121。
在(1)类佐剂聚合物中，优选交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别是由糖或多元醇的多烯基醚交联。这些化合物以卡波姆(Pharmeuropa，vol.8，no.2，1996年6月)的名义已知。本领域技术人员还可以参考美国专利No.2,909,462，其提供通过具有至少三个羟基，优选不超过八个这样的基团的多羟基化合物交联的这种丙烯酸类聚合物，至少三个羟基的氢原子是由具有至少两个碳原子的不饱和的脂族基团替代。优选的基团是含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团。不饱和基团还可以含有其它取代基，例如甲基。以名称Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)销售的产品特别适合。它们由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，参考了Carbopol 974P、934P和971P。
关于马来酸酐-链烯基衍生物共聚物，优选为直链或交联的乙烯-马来酸酐共聚物的EMA(Monsanto)，它们例如通过二乙烯基醚交联。还参考J.Fields et al.,1960。
关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下式的基本单元形成：
Figure BDA0001275380070000321
其中：
-R1和R2可以相同或不同，表示H或CH3
-x＝0或1，优选x＝1
-y＝1或2，x+y＝2。
对于EMA，x＝0和y＝2，对于卡波姆，x＝y＝1。
这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)中，并且可以通过苏打(NaOH)将pH调节至7.3至7.4，以提供表达载体可以被纳入在其中的佐剂溶液。最终免疫学或疫苗组合物中的聚合物浓度可以在约0.01至约1.5％w/v、约0.05至约1％w/v和约0.1至约0.4％w/v。
细胞因子(5)可以是免疫学或疫苗组合物中的蛋白质形式，或者可以在宿主中与免疫原或表位一起共表达。优选通过与表达免疫原或表位的相同载体或其分开的载体与细胞因子的共表达。
本发明包括制备这种组合物；例如通过将活性组分，有利地在一起并与佐剂、载体、细胞因子和/或稀释剂混合。
可用于本发明的细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)、聚肌苷酸和聚胞苷酸、胞苷-磷酸-鸟苷寡脱氧核苷酸(CpG ODN)和转化生长因子β(TGFβ)。应当理解，可以与本发明的免疫学或疫苗组合物共同施用和/或依次施用细胞因子。因此，例如，本发明的疫苗还可以含有外源核酸分子，其在体内表达合适的细胞因子，例如与待接种的该宿主匹配的细胞因子，或其中将引发免疫应答(对于例如，用于施用于牛的制剂的牛细胞因子)。
在具体实施方案中，佐剂可包括TS6、TS7、TS8和TS9乳剂(US 7,371,395)；LR3和LR4(US7,691,368)；TSAP(US20110129494)；TRIGENTM(Newport Labs)；合成dsRNA(例如poly-IC，poly-ICLC
Figure BDA0001275380070000331
)；和MONTANIDETM佐剂(W/O、W/O/W、O/W、IMS和凝胶；全部由SEPPIC生产)。
在基于杆状病毒/昆虫细胞表达的多肽的免疫组合物和/或疫苗的情况下，剂量可以包括，大约1μg至大约2000μg、大约50μg至大约1000μg和大约100μg至大约500μg的FMDV抗原、表位或免疫原。剂量可以包括大约102至大约1020、大约103至大约1018、大约104至大约1016、大约105至大约1012的VLP。在基于表达FMDV抗原的病毒载体的免疫组合物和/或疫苗的情况下，剂量可以包括，大约103TCID50至1015TCID50(50％组织培养感染剂量)、大约103TCID50至1014TCID50、大约103TCID50至1013TCID50、大约103TCID50至1012TCID50。剂量体积可以为大约0.1ml至大约10ml，有利地为大约0.2ml至大约5ml。
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
DNA插入片段、质粒和重组病毒载体或杆状病毒载体的构建使用J.Sambrook等人描述的标准分子生物学技术进行(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)。
实施例1在杆状病毒/昆虫细胞系统中构建和表达FMDV抗原
血清型A FMDV的阳性株RNA基因组由侧翼为两个非编码区的单个ORF(1662个氨基酸)组成。ORF拥有3部分。第一部分是多聚蛋白P1-2A，其在成熟和切割后导致4种衣壳组分(VP4、VP2、VP3和VP1)的表达。第二部分是含有2个蛋白质(2B和2C)的P2，其涉及RNA合成和细胞膜囊泡的大量产生。第三部分是含有4个蛋白质(3A、3B、3C和3D)的P3。3C是参与多聚蛋白切割的主要蛋白质。3D是另一种蛋白酶，而3A/3B参与膜锚定、发病机制、RNA合成和衣壳化。P1-2A和3C对于构成FMDV衣壳颗粒或FMDV VLP的所有蛋白质的表达和切割是必需的(见图2)。潜在的功能结构域如下表1所示。
表1 GenBank登录号AAT01711所注释的潜在功能结构域
Figure BDA0001275380070000341
实施例1.1构建含有编码FMDV A24Cruzeiro株的在VP2中具有突变(H93C)的多聚蛋白的多核苷酸的质粒pMEB097，用于产生二硫桥(+优化的翻译起始背景)和产生相应的重组杆状病毒BacMEB097
质粒pMEB097的产生
将含有编码FMDV A24Cruzeiro株的多聚蛋白的野生型多核苷酸的质粒pMEB096突变以产生质粒pMEB097。质粒pMEB097含有编码在VP2(H93C)或P1(H179C)中含有突变的经修饰的多聚蛋白(SEQ ID NO：2)的多核苷酸(SEQ ID NO：3)。经修饰的聚蛋白(SEQ ID NO：2)含有置换，所述置换是在VP2的位置93或P1的位置179上的组氨酸被半胱氨酸置换。
重组杆状病毒BacMEB097的产生
使用质粒pMEB097(见图3)通过同源重组产生重组杆状病毒，其在多角体蛋白启动子的控制下编码FMDV A24Cruzeiro株的FMDV P1/2A/2B'3B'/3C基因(在VP2的位置93上具有半胱氨酸)。根据制造商的操作方案(Baculogold，Pharmingen)，用质粒pMEB097和Bsu36I三切割(triple-cut)线性化AcNPV DNA共同转染来自ATCC的草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda，Sf)9昆虫细胞。来自共转染上清的重组杆状病毒被噬斑纯化两次。在28℃下以25cm2单层瓶规模扩增5个克隆(第1代)。在Sf9昆虫细胞中扩增5个克隆，并使用对FMDV A24血清型特异的单克隆抗体通过蛋白质印迹法分析重组克隆。克隆2显示出良好的表达水平。在28℃下以锥形瓶中50mL规模(悬浮液)以105rpm将该克隆进一步扩增(第2代)。进行200mL规模的第三代(第3代)，以获得用于蛋白质表达的病毒原液(virus stock)。然后通过噬斑测定滴定该病毒原液。使用补充有2％FCS的SF900III培养基获得病毒原液。滴定后重组杆状病毒(第3代)用于无血清培养基中的蛋白质生产。
杆状病毒BacMEB097的表达分析
在1pfu/ml的感染复数(MOI)下，通过产生的杆状病毒BacMEB097和通过BacMEB084(作为无突变的参照)感染昆虫细胞(Sf9-Invitrogen)。在28℃下4天过程中，在没有FCS的Sf900II培养基中以105rpm生长昆虫细胞。上清浓缩为大约四分之一，并如以下进行处理：A＝无处理；B＝1h，56℃；C＝加入HCl达到低于5的pH。
通过电镜评估衣壳蛋白到VLP的正确装配(见图4的“A”栏)。25-30nm的颗粒显示出非常均匀的圆形到二十面体形状，经常的尺寸为31nm，并通过染料的穿透进行表征，并因此被解释为FMDV样。颗粒数估计为约108/ml。
此外，如在56℃处理1小时(“B”栏)和通过培养基的酸化(“C”栏)后所见的，随着BacMEB097中突变所带来的二硫桥形成，VLP的稳定性明显增加。
通过使用特异于FMDV A24血清型的单克隆抗体通过蛋白质印迹分析上清证实了FMDV蛋白质的身份(见图5)。
总之，用转移质粒pMEB097产生的杆状病毒BacMEB097在Sf9昆虫细胞中诱导FMDV衣壳的表达和加工。这些FMDV表达衣壳自动组装成具有FMDV样病毒粒子的特征形态的VLP。与通过BacMEB084获得的VLP(含有编码FMDV A24Cruzeiro株的多聚蛋白的野生型多核苷酸的质粒pMEB096)相比，涉及形成二硫桥的突变增加了VLP的稳定性(热处理或酸化后)。
实施例1.2构建含有编码FMDV O1manisa株的在VP2中具有突变(S93C)的多聚蛋白的多核苷酸的质粒pMEB099，用于产生二硫桥(+优化的翻译起始背景)和产生表达FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒BacMEB099
将含有编码FMDV O1 manisa株的多聚蛋白的野生型多核苷酸的质粒pMEB095突变以产生质粒pMEB099。质粒pMEB099含有编码在VP2(S93C)或P1(S179C)中含有突变的经修饰的多聚蛋白(SEQ ID NO：6)的多核苷酸(SEQ ID NO：7)。经修饰的多聚蛋白(SEQ ID NO：6)含有置换，所述置换是在VP2的位置93或P1的位置179上的丝氨酸被半胱氨酸置换。
根据针对BacMEB097的实施例1.1的步骤进行重组杆状病毒BacMEB099的产生和表达。在0.5pfu/ml的感染复数(MOI)下，通过杆状病毒BacMEB099感染昆虫细胞(Sf9-Inv)。在28℃下4天过程中，在没有FCS的Sf900II培养基中以105rpm生长昆虫细胞。在上清液处理后进行蛋白质生产：浓缩并且56℃加热1小时或不加热(以观察共价笼突变的效果)。通过电镜和特异性ELISA直接分析处理的上清(见图6)。
结果(图6A和6B)显示用ELISA方法获得了显著滴度。该ELISA特异于VLP，表明在BacMEB099感染后存在VLP。
通过电镜评估衣壳蛋白到VLP中的正确装配(图6B)。25-30nm的颗粒显示出非常均匀的圆形到二十面体形状，经常的尺寸为31nm，并通过染料的穿透进行表征，并因此被解释为FMDV样。颗粒数估计为约108/ml。
总之，用转移质粒pMEB099产生的杆状病毒BacMEB099在Sf9昆虫细胞中诱导FMDV衣壳的表达和加工。这些FMDV表达衣壳自动组装成具有FMDV样病毒粒子的特征形态的VLP。
实施例1.3构建在VP2中具有突变的含有编码FMDV Iraq株的多聚蛋白的多核苷酸的质粒pMEB106和含有编码FMDV Asia株的多聚蛋白的多核苷酸的质粒pMEB104，用于产生二硫桥(+优化翻译起始背
景)和产生表达FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒
根据实施例1.1中概括的步骤构建含有编码FMDV Iraq株的在P1中含有突变(在位置179上的C)的经修饰的多聚蛋白(SEQ ID NO：8)的多核苷酸(SEQ ID NO：9)和编码FMDVAsia株的在P1中含有突变(在位置179上的C)的经修饰的多聚蛋白(SEQ ID NO：10)的质粒的多核苷酸(SEQ ID NO：11)。
根据针对BacMEB097的实施例1.1中的步骤进行表达经修饰的FMDV Iraq株的多聚蛋白(SEQ ID NO：8)和FMDV Asia株的多聚蛋白(SEQ ID NO：10)的重组杆状病毒的产生和表达。
用转移质粒pMEB106产生的杆状病毒BacMEB106在Sf9昆虫细胞中诱导FMDV衣壳的表达和加工。用转移质粒pMEB104产生的杆状病毒BacMEB104在Sf9昆虫细胞中诱导FMDV衣壳的表达和加工。这些FMDV表达衣壳自动组装成具有FMDV样病毒粒子的特征形态的VLP。
实施例2杆状病毒表达的“笼化”FMDV VLP的稳定性
证明了大规模(150升)生产FMDV VLP的能力。当以150L批次、制备规模生长时，获得了良好的杆状病毒表达共价笼和野生型A24FMDV-VLP滴度(log10CCID50 7.14/mL)(CCID：细胞培养感染剂量)。出乎意料的是，甚至在加热样品后，存在大量稳定的FMD VLP(2.14log10 CCID50/ml加热的相对于2.19log10 CCID50/ml未加热的)(见图8)。此外，如图8所示，EM计数显示来自4L和150L批次的VLP的数量极好。
实施例3用杆状病毒、浮萍和金丝雀痘表达FMDV接种牛，随后强毒攻击
该研究的目的是在牛中测试在TS6佐剂中配制的3种实验性FMD A24Cruzeiro抗原抗FMD强毒攻击的功效。
将含有浮萍(Lemna)(浮萍(duckweed)，见US2011/0236416)、杆状病毒或vCP(金丝雀痘病毒)表达抗原的疫苗在D0施用于牛(表2.1)。根据相关的欧洲药典专著，通过在D21进行的强毒FMDV A24Cruzeiro攻击，然后临床监测牛，评估疫苗保护(表2.2)。对照中的FMD病变验证了攻击。杆状病毒接种组中的两只动物被完全保护免受损伤，表示完全保护，而另外三只表现出非常有限的病变延伸，表示部分保护。G2和G3中的动物全部呈现损伤，尽管病变的强度不同。中和滴定数据显示在图9和图10中。接种三周后(D21)，在G2的所有小牛中观察到明显的血清转换。在G1和G3中，观察到很少或没有血清转换。该日期的对照为阴性。所有小牛在攻击后强烈血清转换(D25或D28)。血清反应在D28比在D25看起来更强，并且G2中接种疫苗的动物显著强于对照组。这一观察结果表明在G2中接种疫苗的致敏效应。结果表明，与其他两组相比，杆状病毒FMDV A24(野生型A24)疫苗接种组提供了最高的SN滴度，并提供了保护免受强毒FMDV A24 Cruzeiro的攻击。
表2.1疫苗接种方案
Figure BDA0001275380070000391
表2.2攻击研究设计
Figure BDA0001275380070000392
实施例4在FMDV攻击研究中不同实验性FMD A24Cruzeiro疫苗(杆状病毒表达野生型FMDV)在牛中保护的评估
该研究的目的是在牛中测试在TS6/皂苷佐剂中配制的3种实验性FMD A24Cruzeiro抗原抗FMD强毒攻击的功效。将含有以杆状病毒(BacMEB084，过滤的或未过滤的)或金丝雀痘病毒表达的FMD A24 Cruzeiro抗原的疫苗在D0施用于牛。针对在D21进行的强毒FMDV A24 Cruzeiro攻击评估了疫苗保护(根据相关的欧洲药典专著)。
表3.1疫苗接种方案
Figure BDA0001275380070000393
Figure BDA0001275380070000401
A24BAC过滤的*：杆状病毒感染滴度8.71log10CCID50/ml
A24BAC未过滤的**：杆状病毒感染滴度5.58log10CCID50/ml,108VLP
vCP2166***：杆状病毒感染滴度8.8log10CCID50/ml
表3.2在尸检时观察到的FMD蹄损伤概况和保护百分比
Figure BDA0001275380070000402
两种杆状病毒疫苗在全部和四分之一疫苗剂量下在100％的动物中被证明是保护性的。过滤的杆状病毒疫苗在1/16疫苗剂量下在60％的动物中仍然是保护性的。金丝雀痘病毒疫苗在全部剂量下在80％的动物中被证明是保护性的。图11A、11B和图12C显示了随时间的FMDV A24Cruzeiro抗体滴度的图和表。结果显示接种3周后(D21)，所有接种疫苗的小牛均观察到明显的血清转换。杆状病毒接种组(G1-G2-G3和G5-G6)之间存在剂量/作用关系。对照组在两个日期均为阴性。所有接种疫苗的小牛在攻击后强烈血清转换(D25和D28)。D28的血清反应比D25更强烈。对照中的血清转换相当弱。图12A和12B显示了温度随时间的演变。结果表明，仅对照呈现显著的温度升高。疫苗没有增加直肠温度。
使用这些数据，使用逻辑回归和
Figure BDA0001275380070000412
方法计算PD50。逻辑回归方法估计疫苗A的强度>16PD50。Karber方法估计疫苗A的强度>26PD50。虽然估计之间存在差异，但两种方法都表明疫苗A具有非常显著和实质的功效。鉴于临床结果，对疫苗B的类似估计也表明疫苗B具有很大的功效。
实施例5使用杆状病毒的实验性FMDV制剂在仔猪中的免疫原性
该研究的目的是评估在杆状病毒中表达并配制在TS6或TS6+皂苷中的4种FMDV抗原的免疫原性。疫苗按照以下比例制备(表4.1)。
表4.1疫苗配方
Figure BDA0001275380070000411
所研究的抗原不同在于血清型(A24 Cruzeiro或O1-Manisa)、生产方法(昆虫细胞或蚕)或插入物(标准或共价笼)。术语“共价笼”是指在FMDV P1肽中产生非天然存在的二硫键，其通过半胱氨酸残基的置换来实现。评估在仔猪中进行，肌内疫苗接种两次，间隔21天。在每次疫苗接种后监测仔猪的全身反应，并监测D1、D20和D42的FMDV-A24或FMDV-O1M中和抗体滴度。
表4.2疫苗接种分组
组 猪数 活性成分(AI) 插入物 AI培养物 佐剂
G1 7 A24 Cruzeiro 野生型 SF9细胞 TS6
G2 7 A24 Cruzeiro 野生型 SF9细胞 TS6+皂苷
G3 7 A24 Cruzeiro 共价笼 SF9细胞 TS6+皂苷
G4 7 A24 Cruzeiro 野生型 蚕 TS6+皂苷
G5 7 O1-Manisa 野生型 SF9细胞 TS6+皂苷
G6 7 - - - -
在G5中的任何动物中，O1-Manisa杆状病毒表达的抗原都没有引起血清转换。这些数据首次表明含有“共价笼”突变的杆状病毒产生的FMDV亚单位是免疫原性的(见下表5)。此外，这里的数据强烈地表明，与未经修饰的野生型FMDV相比，“笼化”FMDV亚单位显著更具生产性、有效和稳定。此外，基于蚕的疫苗似乎没有比其他所测试的疫苗含有更多的抗原。
表5
Figure BDA0001275380070000421
*：滴度≥1.35log10PD50；sd**：标准差。
总之，如表5的结果所示，所有SF9细胞培养的杆状病毒表达的A24 VLP(组G1、G2和G3)产生显著的“加强”效应(即第二剂量显著增加血清转换动物的数量)。相比之下，家蚕培养的A24 VLP似乎已经引起了初始和持续的血清学应答，而没有引起明显的加强效应。
实施例6杆状病毒表达的A24 FMDV VLP的酸和热稳定性
A24 FMDV VLP进行酸和热处理，并使用EM(图13)和ELISA分析(图14)评估其稳定性。如图中所示，共价笼VLPs而不是野生型VLP显著抵抗低pH和热。此外，如图15和表6所示，在5℃下储存时，相对于野生型对应物，共价笼VLP随时间显著更稳定。
表6 A24 VLP的稳定性(共价笼vs.野生型)
Figure BDA0001275380070000431
总之，来自具有“共价笼突变”的A24 Cruzeiro血清型的VLP的稳定性对于抵抗加热或酸化处理是非常有效的。存储18周后共价笼稳定VLP。现在已经显示出几种FMDV血清型通过引入共价笼突变而被有效地稳定，包括：A24 Cruzeiro；O1 Manisa(图16，EM&图17，ELISA)；Asia 1 Shamir；和A22 Iraq。图17显示加热对稳定的VLP(共价笼，BacMEB099)没有影响，而加热后标准FMDV O1-Manisa活性成分没有检测到信号，表明加热后标准FMDV O1Manisa没有组装的VLP。
实施例7在普通仔猪中用杆状病毒FMD O1 Manisa(经修饰的，共价笼)配制的疫苗的免疫原性
该研究的目的是评估配制在TS6中的两种杆状病毒FMD O1-Manisa抗原和一种腺病毒载体FMDV O1-Manisa在普通猪中的安全性和有效性。每种制剂以分开三周注射两次施用(D0
Figure BDA0001275380070000432
D21)。猪在D0为11-12周龄，接受2mL肌内感染疫苗。通过监测局部和全身反应来评估安全性。通过血清学(血清中和滴度)监测(D1、D20、D43)和细胞介导的免疫(CMI)测定(D27、D43)评估功效。
表7.1抗原和疫苗的特征
Figure BDA0001275380070000441
在D27和D43收集血液样品用于细胞介导免疫(CMI)测定。对分泌γ干扰素(IFNγ)的细胞定量、血浆细胞定量或记忆B细胞定量进行再刺激后，测定样品(见表7.2)。所有定量均由ELISpot进行。
表7.2 CMI测定
Figure BDA0001275380070000442
+：已测试；NT：未测试
结果显示，出乎意料的是，与杆状病毒表达的野生型FMDV O1 M(见实施例5)不同，杆状病毒表达的修饰(共价笼)FMDV O1 M的在仔猪中引起了血清转换。如下表7.3所示，在第一次接种疫苗(D0)后，在D20的2个杆状病毒组(G1和G2)中观察到血清转换。在第二次接种后，观察到两个组(G1和G2)中的加强效应。
表7.3仔猪中杆状病毒FMD O1 Manisa的血清学研究
Figure BDA0001275380070000451
如图20所示，在两种杆状病毒表达的FMDV-VLP(经修饰的，共价笼)/TS6接种组(G1和G2)中检测到特异性分泌IgG的浆细胞。特异性分泌IgG的浆细胞在G1和G2中显著高于在G4中。在G3中没有检测到特异性分泌IgG的浆细胞。
图21显示，在G1组和G2组的所有接种疫苗的猪中检测到大量特异性分泌IgG的记忆B细胞，在G3中检测到少部分的特异性分泌IgG的记忆B细胞，并且在G4中没有检测到特异性分泌IgG的记忆B细胞。
图22显示，以G1和G2>G4>G3的顺序，在所有接种的组中检测到特异性分泌IFNγ的细胞。G1和G2之间没有区别。特异性分泌IFNγ的细胞在G1和G2中显著高于在G3中。
在两种杆状病毒表达的FMDV-VLP(修饰的共价笼)/TS6接种组(G1和G2)中高水平的特异性分泌IFNγ的细胞、特异性分泌IgG的浆细胞和特异性分泌IgG的记忆B细胞表明良好保护免受FMDV感染的水平。
实施例8Asia Shamir BacMEB102(野生型)&BacMEB104(共价笼)
表8通过EM测量的Asia Shamir VLP(BacMEB102，野生型和BacMEB104，共价笼)的稳定性
Figure BDA0001275380070000452
结果表明，加热后存在大量稳定的BacMEB104(共价笼)的FMD VLP，VLP在高达至少15个月内稳定，而BacMEB102(WT)加热后未形成任何可检测的VLP。
实施例9Iraq 22 BacMEB106(共价笼)的稳定性
表9加热后通过EM测量的Iraq 22 VLP(BacMEB105，野生型和BacMEB106，共价笼)的稳定性
Figure BDA0001275380070000461
与共价笼Iraq 22VLP相比，野生型Iraq 22VLP在D0加热后不稳定。
实施例10猪中Asia Shamir共价笼&Iraq A22共价笼的血清学研究
该研究的目的是评估在杆状病毒中产生的FMD Asia1 Shamir和FMD A22 IraqVLP抗原在普通猪的免疫原性。在TS6制剂中测试了两批Asia1 Shamir抗原和两批A22 Iraq抗原。每种制剂以分开三周注射两次施用(D0-D21)给猪。猪在D0为8-9周龄。通过血清学监测(D-1、D20、D42)和细胞介导的免疫(CMI)测定(D26、D41)评估免疫原性。
表10 Asia Shamir VLP(BacMEB104，共价笼)和A22 Iraq VLP(BacMEB106，共价笼)，在D0和D21的两次注射的疫苗接种方案
组 抗原 佐剂
G1(n＝5) Asia1 Shamir VLP CC TS6
G2(n＝5) A22 Iraq VLP CC TS6
G3(n＝4) Asia1 Shamir VLP CC TS6
G4(n＝4) A22 Iraq VLP CC TS6
G5(n＝2) 未进行疫苗接种 -
如图18所示，来自两个株的共价笼VLP引起强烈的血清型特异性血清学应答。
所有用VLP Asia1 Shamir(G1&G3)接种的猪对第一次疫苗接种有明显的血清应答，平均滴度接近1.20 Log10 PD50。此外，第二次疫苗接种后有明显的加强效应，大部分猪的滴度超过1.8 Log10 PD50。即使在加强免疫接种后，对照组(G5)和大多数A22 Iraq接种的猪(G2&G4)也没有显示对Asia1 Shamir的任何血清应答。
所有接种VLP A22 Iraq(G2&G4)接种的猪对第一次疫苗接种有血清应答，平均滴度接近1.15 Log10 PD50。此外，第二次疫苗接种后有很强的加强效应，大部分猪的滴度超过2.0 Log10 PD50。即使在加强免疫接种后，对照组(G5)和大多数Asia1 Shamir接种的猪(G1&G3)对A22 Iraq没有显示任何血清应答。
出乎意料的是，如图19所示，观察到交叉反应性。结果已经表明，当使用Asia1Shamir FMDV肽库时，在两个Asia1 Shamir VLP组中均检测到特异性IFNγ应答(细胞应答)，并且当使用A22 Iraq FMDV肽库时，在两个A22 Iraq VLP组中均检测到特异性IFNγ应答(细胞应答)。Asia1 Shamir VLP组在使用A22 Iraq FMDV肽库时表现出交叉免疫原性。用Asia1 Shamir灭活的AI涂层和A22 Iraq灭活的AI涂层在两个Asia1 Shamiar VLP组中和在两个A22 Iraq VLP组中分别检测到特异性浆细胞(体液应答)。用A22 Iraq灭活的AI涂层观察到在Asia1 Shamir VLP组中的交叉免疫原性(浆细胞)。用Asia1 Shamir AI涂层和A22Iraq AI涂层在两个Asia1 Shamiar VLP组中和在两个A22 Iraq VLP组中分别检测到特异性记忆B细胞(体液应答)。用A22 Iraq AI涂层观察到在Asia1 Shamir VLP组中的良好的交叉免疫原性(B细胞)。用Asia1 Shamir AI涂层也观察到在A22 Iraq VLP组中的一些交叉免疫原性(B细胞)。总之，结果表明VLP可以引发足够的免疫应答来保护免受异源性攻击。
总之，在TS6中佐剂化的4种FMDV血清型-VLP抗原(A24、O1Manisa、Asia1 Shamir和A22I Iraq)诱导了体液和细胞应答，其为强烈的血清型特异性中和抗体应答，具有一定比例的特异性IFNγ应答，存在记忆B细胞(在2种血清型之间具有交叉反应性)，表明良好保护免受同源和异源FMDV感染的水平。
实施例11人腺病毒5载体化的重组FMDV的构建
该研究的目的是产生针对血清型A24Cruzeiro的腺病毒重组体，所述腺病毒重组体表达密码子优化的FMDV结构蛋白和非优化的具有C142T位点突变的3C蛋白酶。FMDV抗原含有FMDV衣壳前体(密码子优化的VP1、VP2(具有H93C位点突变，共价笼)、VP3、VP4、2A和全长2B)和非优化的部分3B和具有C142T位点突变的全长3C蛋白酶(SEQ ID NO：16)。
将HEK 293细胞(ATCC)在37℃、5％CO2中保持在含有10％胎牛血清(Moregate批次#81827101)的MEM(Gibco#11095)中。这些细胞被用于拯救重组腺病毒vAD3027并制备病毒原液。
表达质粒pAD3027(见图25)含有与CMV启动子和SV40多聚A尾连接的密码子优化的多核苷酸(编码FMDV衣壳蛋白质SEQ ID NO：16的SEQ ID NO：17)。多核苷酸包括合成的内含子。
使用Gateway技术(Invitrogen)，通过入门载体与目的载体的LR重组产生表达克隆。通过用转染试剂在HEK 293细胞中转染线性化表达克隆产生重组腺病毒vAD3027。拯救后，通过冻融循环收获每种病毒，并通过离心澄清细胞碎片。为了传代，将每种病毒接种到单层HEK 293细胞中，感染后约3-4天，通过冻融循环收获病毒并通过离心澄清。进行5次传代以制备病毒原液，储存于-80℃。
重组克隆的序列分析已经证实了从CMV启动子的开始到SV40尾部的末端的序列是正确的(SEQ ID NO：20)。免疫荧光测试显示，所有检查的vAD3027的噬斑均表达FMDV衣壳蛋白。使用针对VP2蛋白的抗体的蛋白质印迹检测到VP2的线性表位，如由vAD3027表达的VP2(完全加工
Figure BDA0001275380070000481
25kDA)、VP0(部分加工的转基因
Figure BDA0001275380070000482
37kDa)或P1(未加工的转基因
Figure BDA0001275380070000483
80kDa)(见图26)。
根据上述步骤构建了表达用于O1 Manisa、Asia和Iraq株的密码子优化的FMDV经修饰的(共价笼)衣壳蛋白的腺病毒重组体。
实施例12疫苗接种猪后各种口蹄疫病毒(FMDV)疫苗候选者的血清学评估
实施例12.1 FMDV A24疫苗的血清学评估
该研究的目的是评估猪中接种疫苗后的各种FMDV A24疫苗制剂的免疫原性，包括人腺病毒5载体化的FMDV疫苗和杆状病毒表达的FMD A24重组VLP(共价笼)疫苗与不同佐剂联合使用(或不含佐剂)。
六十只常规饲养的仔猪(约1个月龄)各自随机分入九种处理组之一中，每组含有4-7只猪。所得组的组成呈现于下表11中。
表11人腺病毒5载体化的FMDV疫苗和杆状病毒表达FMD A24重组VLP疫苗，在D0和D21的两次注射的疫苗接种方案
Figure BDA0001275380070000491
TV：测试疫苗。
BacA24VLP1：杆状病毒表达FMD A24重组VLP(共价笼)疫苗。
vAD30272：人腺病毒5载体化的FMDV A24(共价笼)疫苗。
*第8组在D0接受TV7并且在D21接受TV1。
**每只仔猪的靶剂量为：对于用BacA24VLP接种的仔猪，活性成分为0.6ml中103.9VLP，而对于用vAD3027构建体接种的仔猪，其为1010.35TCID50。
除了第9组(对照组)，用2ml测试疫苗以21天间隔两次接种每只仔猪。所有注射在颈部区域、尾侧至耳朵中(交替地在右侧和左侧上)通过肌内途径(IM)给予。
在第0天(疫苗接种前)、第7、15、21天(接种疫苗之前)、第28、35和42天，从所有仔猪收集血液样品。通过血清病毒中和法(SVN)测试来自所有仔猪的第42天血清样品的FMDV抗体。在所有收集天对来自那些用vAD3027构建体和对照(6-9组)接种疫苗的样品进行SVN测定。
在研究开始之前，第1-9组的所有仔猪均测试为FMDV抗体阴性。在整个研究过程中，所有对照仔猪均为FMDV抗体阴性。
FMDV SVN结果显示于图23中。结果表明，FMD A24重组VLP疫苗和人腺病毒5载体化的FMDV疫苗均在动物中诱导免疫应答。在低剂量的103.9VLP中，FMD A24重组VLP疫苗在动物中诱导良好的免疫应答。与接种低剂量FMD A24重组VLP疫苗的疫苗接种方案相比，按照两个剂量的疫苗接种方案接种人腺病毒5载体化的FMDV疫苗的动物(第6-7组)具有更高的抗体应答。出乎意料的是，与使用相同疫苗的初免-加强免疫相比，用病毒载体化的FMDV疫苗和BacA24 VLP疫苗的异源初免-加强免疫的方案表现出更强的免疫应答。
图24显示在研究过程中第6-9组的FMDV抗体滴度(第0天-第42天)。到第15天(第一次疫苗接种后2周)为止，来自第8组的所有vAD3027疫苗接种者血清转换为FMDV。第6-7组中的仔猪血清转换率为29-57％。此外，与第6-7组中相比，第8组中的平均抗体滴度/组(具有病毒载体化的FMDV疫苗和BacA24 VLP疫苗的异源初免-加强免疫方案)更高。
在第42天收集的样品中，在来自所有组的所有动物中测定对腺病毒的抗体应答(SVN)。结果以Log10的形式报告，≤0.6Log10的值被认为是血清抗体阴性。
结果表明，用BacA24VLP配制的疫苗接种的所有对照和仔猪在第42天通过SN抗体滴度对腺病毒呈阴性(≤0.6Log10)。在第6和7组中的用vAD3027接种的所有动物均有血清转换，滴度范围为1.8-3.0，而第8组中的50％的仔猪血清转换。总体而言，第6组中的动物对腺病毒具有更高的抗体应答。
实施例12.2FMDV O1 Manisa、Asia和Iraq疫苗的血清学评估
该研究的目的是评估猪中接种疫苗后的各种FMDV O1 Manisa、Asia和Iraq疫苗制剂的免疫原性，包括人腺病毒5载体化的FMDV疫苗和杆状病毒表达的FMD O1 Manisa、Asia和Iraq重组VLP(共价笼)疫苗与不同的佐剂联合使用(或不含佐剂)。
研究设计如实施例12.1中所述。如实施例12.1中所述，在不同阶段取来自疫苗接种动物的血液样品，并测试血清学。结果表明，本发明的组合物或疫苗是具有免疫原性的并且在动物中提供保护。
实施例14在普通猪和牛以及MDA阳性猪和牛中疫苗接种后各种口蹄疫病毒(FMDV)疫苗候选者的血清学评估
该研究的目的是评估在普通猪或牛中两种异源疫苗的初免-加强免疫施用(两次施用)或两种异源疫苗同时施用(一次施用)以增加免疫应答，以及在MDA阳性猪和牛中的施用以克服MDA并增加免疫应答。异源疫苗可以是不同类型的疫苗，例如表达来自相同FMDV血清型的衣壳的FMDV VLP疫苗或FMDV病毒载体疫苗。异源疫苗也可以是表达不同FMDV血清型(例如A24、O1 Manisa、Asia和Iraq株)衣壳的相同类型的疫苗。异源疫苗也可以是表达不同FMDV血清型(例如A24、O1 Manisa、Asia和Iraq株)的衣壳的不同类型的疫苗。异源疫苗也可以是不同类型的疫苗，即FMDV VLP疫苗或FMDV病毒载体疫苗，其表达不同FMDV血清型(例如A24、O1 Manisa、Asia和Iraq株)的衣壳。
在一个组中，普通猪或牛用FMDV VLP疫苗以3-5周的间隔接种两次，然后接种重组病毒FMDV疫苗，或者用重组病毒FMDV疫苗致敏，并用FMDV VLP疫苗加强免疫。在另一个组中，普通猪或牛用FMDV VLP和重组病毒FMDV疫苗同时接种一次。
在一个组中，MDA阳性猪或牛用FMDV VLP疫苗以3-5周的间隔接种两次，然后用重组病毒FMDV疫苗接种疫苗，或者用重组病毒FMDV疫苗致敏，并用FMDV VLP疫苗加强免疫。在另一个组中，MDA阳性猪或牛用FMDV VLP和重组病毒FMDV疫苗同时接种一次。
在接种疫苗后，动物用同源或异源FMDV株攻击。
通过在普通动物或MDV阳性动物中的疫苗接种攻击来评估组合物或疫苗保护免受FMDV病原体感染的功效。通过临床观察和/或组织和血液中特异性病原体的病毒载量来评估保护作用。在不同阶段取接种疫苗的动物的血液样品，并进行血清学检测。结果表明，本发明的组合物或疫苗是具有免疫原性的，并且在普通动物和MDV阳性动物中提供保护。
***
在详细描述了本发明的优选实施方案之后，应当理解的是，由上述实施例限定的本发明不限于以上说明书中阐述的特定细节，因为在不脱离本发明的精神或范围的情况下其可能存在许多明显的变化。
本文引用或参考的所有文件(“本文引用的文件”)以及本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文提及或在此引用作为参考的任何文档中包含的任何产品任何制造商说明书、描述、产品规格和产品单在此通过引用并入本文，并且可以用于本发明的实践中。
序列表
<110> Merial, Inc.
AUDONNET, Jean-Christophe
MEBATSION, Teshome
HANNAS, Zahia
CHIANG, Yu-Wei
WIDENER, Justin
<120> FMDV重组疫苗及其用途
<130> MER 14-244
<150> 62/054,073
<151> 2014-09-23
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A24 Cruzeiro株的野生型多聚蛋白(GenBank AAT01711)
<400> 1
Met Asn Thr Thr Asp Cys Phe Ile Ala Leu Val His Ala Ile Arg Glu
1 5 10 15
Ile Arg Ala Phe Phe Leu Pro Arg Ala Thr Gly Arg Met Glu Phe Thr
20 25 30
Leu His Asn Gly Glu Arg Lys Val Phe Tyr Ser Arg Pro Asn Asn His
35 40 45
Asp Asn Cys Trp Leu Asn Thr Ile Leu Gln Leu Phe Arg Tyr Val Gly
50 55 60
Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Asp Ser Pro Glu Asn Leu Thr Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ile Glu Gln Leu Glu Glu Leu Thr Gly Leu Glu Leu His Glu
85 90 95
Gly Gly Pro Pro Ala Leu Val Ile Trp Asn Ile Lys His Leu Leu His
100 105 110
Thr Gly Ile Gly Thr Ala Ser Arg Pro Ser Glu Val Cys Met Val Asp
115 120 125
Gly Thr Asn Met Cys Leu Ala Asp Phe His Ala Gly Ile Phe Leu Lys
130 135 140
Gly Gln Glu His Ala Val Phe Ala Cys Val Thr Ser Asn Gly Trp Tyr
145 150 155 160
Ala Ile Asp Asp Glu Asp Phe Tyr Pro Trp Thr Pro Asp Pro Ser Asp
165 170 175
Val Leu Val Phe Val Pro Tyr Asp Gln Glu Pro Leu Asn Gly Glu Trp
180 185 190
Lys Thr Lys Val Gln Gln Lys Leu Lys Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro
195 200 205
Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn
210 215 220
Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly
225 230 235 240
Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr
245 250 255
Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu
260 265 270
Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys
275 280 285
Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg
290 295 300
Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly Val Thr His
305 310 315 320
Gly Tyr Ser Thr Glu Glu Asp His Val Ala Gly Pro Asn Thr Ser Gly
325 330 335
Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu Arg Phe Tyr Lys Lys Tyr Leu
340 345 350
Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Ala Phe Gly His Leu Glu Lys Leu Glu
355 360 365
Leu Pro Ser Asp His His Gly Val Phe Gly His Leu Val Asp Ser Tyr
370 375 380
Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val Glu Val Ser Ala Val Gly Asn
385 390 395 400
Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Met Val Pro Glu Trp Lys
405 410 415
Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln
420 425 430
Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Thr Val Pro Tyr
435 440 445
Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Lys His Lys Pro Trp Thr
450 455 460
Leu Val Val Met Val Val Ser Pro Leu Thr Val Asn Asn Thr Ser Ala
465 470 475 480
Ala Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile Ala Pro Thr Tyr Val His Val
485 490 495
Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ala
500 505 510
Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro
515 520 525
Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn Pro Pro Arg Thr Asn Tyr Pro Gly Arg
530 535 540
Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Cys
545 550 555 560
Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr Val Thr Thr Arg Thr Asp Asp Thr Arg
565 570 575
Leu Leu Ala Lys Phe Asp Leu Ser Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn
580 585 590
Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Ala Gln Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr
595 600 605
Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg
610 615 620
Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro Gly Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr
625 630 635 640
Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile His Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu
645 650 655
Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr
660 665 670
Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr Ile Asn Val Gln Gly Trp
675 680 685
Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly Lys Ala Glu Asn Asp Thr Leu
690 695 700
Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile
705 710 715 720
Asp Pro Arg Gln Gln Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val
725 730 735
Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg
740 745 750
His His Thr Asp Ile Gly Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Gln
755 760 765
Ser Leu Ser Pro Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His
770 775 780
Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp
785 790 795 800
Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn
805 810 815
Gly Ala Pro Glu Ser Ala Leu Leu Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr
820 825 830
Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His
835 840 845
Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly
850 855 860
Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val
865 870 875 880
Lys Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Asp Ala
885 890 895
Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro
900 905 910
Arg Pro Leu Leu Ala Ile Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln
915 920 925
Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys
930 935 940
Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe Phe Phe Ser Asp
945 950 955 960
Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val Asp Thr Ile Asn Gln Met Gln
965 970 975
Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly Pro Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser
980 985 990
Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly Val Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu
995 1000 1005
Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys Leu Ile Lys Leu Leu Ser Arg
1010 1015 1020
Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala Arg Ser Lys Asp Pro Val
1025 1030 1035
Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly Leu Glu Ile Leu Asp
1040 1045 1050
Ser Thr Phe Val Val Lys Lys Ile Ser Asp Ser Leu Ser Ser Leu
1055 1060 1065
Phe His Val Pro Ala Pro Val Phe Ser Phe Gly Ala Pro Ile Leu
1070 1075 1080
Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Ala Ser Ser Phe Phe Arg Ser Thr
1085 1090 1095
Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala Glu Lys Gln Leu Lys Ala Arg Asp
1100 1105 1110
Ile Asn Asp Ile Phe Ala Ile Leu Lys Asn Gly Glu Trp Leu Val
1115 1120 1125
Lys Leu Ile Leu Ala Ile Arg Asp Trp Ile Lys Ala Trp Ile Ala
1130 1135 1140
Ser Glu Glu Lys Phe Val Thr Thr Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile
1145 1150 1155
Leu Glu Lys Gln Arg Asp Leu Asn Asp Pro Ser Lys Tyr Lys Glu
1160 1165 1170
Ala Lys Glu Trp Leu Asp Asn Ala Arg Gln Ala Cys Leu Lys Ser
1175 1180 1185
Gly Asn Val His Ile Ala Asn Leu Cys Lys Val Val Ala Pro Ala
1190 1195 1200
Pro Ser Arg Ser Arg Pro Glu Pro Val Val Val Cys Leu Arg Gly
1205 1210 1215
Lys Ser Gly Gln Gly Lys Ser Phe Leu Ala Asn Val Leu Ala Gln
1220 1225 1230
Ala Ile Ser Thr His Phe Thr Gly Arg Thr Asp Ser Val Trp Tyr
1235 1240 1245
Cys Pro Pro Asp Pro Asp His Phe Asp Gly Tyr Asn Gln Gln Thr
1250 1255 1260
Val Val Val Met Asp Asp Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp
1265 1270 1275
Phe Lys Tyr Phe Ala Gln Met Val Ser Thr Thr Gly Phe Ile Pro
1280 1285 1290
Pro Met Ala Ser Leu Glu Asp Lys Gly Lys Pro Phe Asn Ser Lys
1295 1300 1305
Val Ile Ile Ala Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Phe Thr Pro Arg
1310 1315 1320
Thr Met Val Cys Pro Asp Ala Leu Asn Arg Arg Phe His Phe Asp
1325 1330 1335
Ile Asp Val Ser Ala Lys Asp Gly Tyr Lys Ile Asn Asn Lys Leu
1340 1345 1350
Asp Ile Ile Lys Ala Leu Glu Asp Thr His Thr Asn Pro Val Ala
1355 1360 1365
Met Phe Gln Tyr Asp Cys Ala Leu Leu Asn Gly Met Ala Val Glu
1370 1375 1380
Met Lys Arg Met Gln Gln Asp Met Phe Lys Pro Gln Pro Pro Leu
1385 1390 1395
Gln Asn Val Tyr Gln Leu Val Gln Glu Val Ile Glu Arg Val Glu
1400 1405 1410
Leu His Glu Lys Val Ser Ser His Pro Ile Phe Lys Gln Ile Ser
1415 1420 1425
Ile Pro Ser Gln Lys Ser Val Leu Tyr Phe Leu Ile Glu Lys Gly
1430 1435 1440
Gln His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp
1445 1450 1455
Ser Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Ile Gln Gln Thr Ser Phe
1460 1465 1470
Val Lys Arg Ala Phe Lys Arg Leu Lys Glu Asn Phe Glu Ile Val
1475 1480 1485
Ala Leu Cys Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile Met Ile Arg
1490 1495 1500
Glu Thr Arg Lys Arg Gln Lys Met Val Asp Asp Ala Val Ser Glu
1505 1510 1515
Tyr Ile Glu Arg Ala Asn Ile Thr Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asp
1520 1525 1530
Glu Ala Glu Lys Asn Pro Leu Glu Thr Ser Gly Ala Ser Thr Val
1535 1540 1545
Gly Phe Arg Glu Arg Pro Leu Pro Gly Gln Lys Ala Arg Asn Asp
1550 1555 1560
Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gln Pro Ala Glu Glu Gln Pro Gln Ala
1565 1570 1575
Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys
1580 1585 1590
Val Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro
1595 1600 1605
Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val
1610 1615 1620
Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala
1625 1630 1635
Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala
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Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Leu Val Met Gly Asn Thr Lys Pro
1655 1660 1665
Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala
1670 1675 1680
Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe
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Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr
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Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly
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1730 1735 1740
Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala Arg
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Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp
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Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala
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Tyr Lys Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu
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Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val
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Lys Gly Asp Thr Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Phe Arg
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Arg Cys Ala Ala Asp Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Val Leu Gly
1940 1945 1950
Thr Ala Asn Ala Pro Leu Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly Val
1955 1960 1965
Asp Gly Leu Asp Ala Met Glu Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro
1970 1975 1980
Trp Ala Leu Gln Gly Lys Arg Arg Gly Ala Leu Ile Asp Phe Glu
1985 1990 1995
Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu Met
2000 2005 2010
Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys Asp
2015 2020 2025
Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly Lys Thr Arg Ile
2030 2035 2040
Val Asp Val Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr Arg Met Met
2045 2050 2055
Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly Pro Gln
2060 2065 2070
Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln Arg
2075 2080 2085
Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp
2090 2095 2100
Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Ile
2105 2110 2115
Met Phe Glu Glu Val Phe Arg Thr Glu Phe Gly Phe His Pro Asn
2120 2125 2130
Ala Glu Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala Tyr
2135 2140 2145
Glu Asn Lys Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys
2150 2155 2160
Ser Ala Thr Ser Ile Ile Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr Val
2165 2170 2175
Leu Tyr Ala Leu Arg Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr
2180 2185 2190
Tyr Thr Met Ile Ser Tyr Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser Asp
2195 2200 2205
Tyr Asp Leu Asp Phe Glu Ala Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu
2210 2215 2220
Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val
2225 2230 2235
Leu Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg His Phe
2240 2245 2250
His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys Pro Val Met Ala Ser
2255 2260 2265
Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe Ala Arg Arg Gly Thr Ile
2270 2275 2280
Gln Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Val His Ser Gly
2285 2290 2295
Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly Leu Phe
2300 2305 2310
Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn Ala
2315 2320 2325
Val Cys Gly Asp Ala
2330
<210> 2
<211> 1126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A24 Cruzeiro株在VP2(H93C)或P1(H179C)中经修饰的多聚蛋白
<400> 2
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
20 25 30
Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr
100 105 110
Gln Ser Ser Val Gly Val Thr His Gly Tyr Ser Thr Glu Glu Asp His
115 120 125
Val Ala Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala
130 135 140
Glu Arg Phe Tyr Lys Lys Tyr Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Ala
145 150 155 160
Phe Gly His Leu Glu Lys Leu Glu Leu Pro Ser Asp His His Gly Val
165 170 175
Phe Gly Cys Leu Val Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp
180 185 190
Val Glu Val Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu
195 200 205
Val Ala Met Val Pro Glu Trp Lys Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr
210 215 220
Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met
225 230 235 240
Thr Ala His Ile Thr Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln
245 250 255
Tyr Lys Lys His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro
260 265 270
Leu Thr Val Asn Asn Thr Ser Ala Ala Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn
275 280 285
Ile Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu
290 295 300
Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr
305 310 315 320
Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn Pro
325 330 335
Pro Arg Thr Asn Tyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala
340 345 350
Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Cys Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr Val
355 360 365
Thr Thr Arg Thr Asp Asp Thr Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Leu Ser
370 375 380
Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Ala Gln
385 390 395 400
Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr
405 410 415
Gly Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro
420 425 430
Gly Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile
435 440 445
His Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile
450 455 460
Pro Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala
465 470 475 480
Glu Thr Ile Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His
485 490 495
Gly Lys Ala Glu Asn Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys
500 505 510
Asp Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile Asp Pro Arg Gln Gln Thr Thr Ala
515 520 525
Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly
530 535 540
Gly Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr Asp Ile Gly Phe Ile
545 550 555 560
Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Gln Ser Leu Ser Pro Thr His Val Ile
565 570 575
Asp Leu Met Gln Ala His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg
580 585 590
Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu
595 600 605
Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ser Ala Leu Leu
610 615 620
Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu
625 630 635 640
Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn
645 650 655
Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met
660 665 670
Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn
675 680 685
Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Asp Ala Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met
690 695 700
Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Glu Val
705 710 715 720
Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln
725 730 735
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
740 745 750
Pro Gly Pro Phe Phe Phe Ala Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu
755 760 765
Val Asp Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly
770 775 780
Pro Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly
785 790 795 800
Val Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys
805 810 815
Leu Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala
820 825 830
Arg Ser Lys Asp Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly
835 840 845
Leu Glu Arg Gln Arg Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln
850 855 860
Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val
865 870 875 880
Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val
885 890 895
Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr
900 905 910
Glu Ser Gly Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn
915 920 925
Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys
930 935 940
Cys Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu
945 950 955 960
Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr
965 970 975
Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln
980 985 990
Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg
995 1000 1005
Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala Arg Met Lys
1010 1015 1020
Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Val Asn Asn Ala Asp Val Gly
1025 1030 1035
Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val
1040 1045 1050
Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys
1055 1060 1065
Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys
1070 1075 1080
Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly
1085 1090 1095
Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu
1100 1105 1110
Arg Met Lys Ala His Val Asp Pro Glu Pro Gln His Glu
1115 1120 1125
<210> 3
<211> 3378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码A24的经修饰的多聚蛋白的多核苷酸
<400> 3
atgggtgctg gccagtcctc ccctgctacc ggttcccaga accagtccgg caacaccggt 60
tccatcatca acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccagctggga 120
gacaacgcta tctccggtgg ttccaacgag ggttccaccg acaccacctc tacccacacc 180
accaacaccc agaacaacga ctggttctcc aagctggctt cctccgcttt caccggcctg 240
ttcggtgctc tgctggctga caagaaaacc gaggaaacca ccctgctcga ggaccgtatc 300
ctgaccaccc gtaacggtca caccacttcc accacccagt cctccgtggg cgtgacccac 360
ggttactcca ccgaagagga ccacgtggcc ggtcctaaca cctccggcct ggaaacccgt 420
gtggtgcagg ctgagcgctt ctacaagaag tacctgttcg actggaccac cgacaaggct 480
ttcggtcacc tggaaaagct ggaactgccc tccgaccacc acggcgtgtt cggatgcctg 540
gtggactcct acgcttacat gcgtaacggc tgggacgtgg aggtgtccgc tgtgggcaac 600
cagttcaacg gtggttgcct gctggtggct atggtgcccg agtggaagga atttgacacc 660
cgcgagaagt accagctgac cctgttcccc caccagttca tctccccccg taccaacatg 720
accgctcaca tcaccgtgcc ctacctgggc gtgaaccgtt acgaccagta caagaagcac 780
aagccctgga ccctggtggt catggtggtg tcccccctga ccgtgaacaa cacctccgct 840
gctcagatca aggtgtacgc taacatcgct cccacctacg tgcacgtcgc cggagagctg 900
ccctccaagg aaggcatctt ccccgtcgct tgcgctgacg gttacggtgg cctggtcacc 960
accgacccca agaccgctga ccccgcttac ggcaaggtgt acaacccccc tcgcaccaac 1020
taccccggtc gtttcaccaa cctgctggac gtggccgagg cttgccccac cttcctgtgc 1080
ttcgacgacg gcaagcccta cgtgaccacc aggaccgacg acacccgtct gctggctaag 1140
ttcgacctgt ccctggctgc taagcacatg tccaacacct acctgtccgg tatcgctcag 1200
tactacaccc agtactccgg caccatcaac ctgcacttca tgttcaccgg ctccaccgac 1260
tccaaggctc gttacatggt ggcttacatc ccccctggtg tcgagactcc ccccgacact 1320
cctgagcgtg ctgctcactg catccacgct gagtgggaca ccggcctgaa ctccaagttc 1380
accttctcca tcccttacgt gtccgctgct gactacgcgt acaccgcttc cgacaccgct 1440
gagactatca acgtgcaggg ctgggtctgc atctaccaga tcacccacgg caaggctgag 1500
aacgacaccc tggtcgtgtc cgtgtccgcc ggcaaggact tcgagctgcg tctgcccatc 1560
gaccctcgtc agcagaccac cgctaccggc gagtctgctg acccagtgac caccaccgtg 1620
gagaactacg gtggcgagac tcagatccag cgtcgtcacc acaccgacat cggtttcatc 1680
atggaccgct tcgtgaagat ccagtccctg tcccctaccc acgtgatcga cctgatgcag 1740
gctcaccagc acggactcgt gggtgctctc ctgcgtgctg ctacctacta cttctccgac 1800
ctggaaatcg tcgtgcgtca cgagggcaac ctgacctggg tgcccaacgg tgctcctgag 1860
tccgctctgc tgaacacctc caaccccacc gcttacaaca aggctccctt cacccgtctg 1920
gctctgcctt acaccgctcc ccaccgtgtg ctggctaccg tgtacaacgg cacctccaag 1980
tacgctgtgg gcggttccgg tcgtcgtggc gacatgggtt ccctggccgc tcgtgtggtc 2040
aagcagctgc ccgcttcctt caactacggt gctatcaagg ctgacgctat ccacgagctg 2100
ttggtgcgta tgaagcgtgc tgagctgtac tgcccccgtc ccctgctggc tatcgaggtg 2160
tcctcccagg accgtcacaa gcagaagatc atcgctcccg ctaagcagct gctgaacttc 2220
gacctgctga agctggctgg cgacgtcgag tccaaccccg gtcccttctt cttcgctgac 2280
gtgcgttcca acttctctaa gctggtggac actatcaacc agatgcaaga ggacatgtcc 2340
accaagcacg gtcccgactt caaccgtctg gtgtccgctt tcgaggaact ggctaccggc 2400
gtgaaggcta tccgtaccgg cctggacgag gctaagccct ggtacaagct gatcaagctg 2460
ctgtcccgtc tgtcctgcat ggctgctgtg gctgctcgtt ccaaggaccc cgtgctggtg 2520
gccatcatgc tggccgacac cggcttggag cgccagcgtc ccctgaaggt ccgcgctaag 2580
ctgccccagc aggaaggccc ttacgctggt cccctcgagc gtcagaagcc tctgaaggtc 2640
aaggctaagg ctcccgtggt caaggaagga ccctacgagg gacccgtgaa gaagcccgtc 2700
gctctcaagg ttaaggccaa gaacctgatc gtgaccgagt ccggtgctcc tcccaccgac 2760
ctgcaaaaga tggtcatggg caacaccaag cccgtggagc tgatcctgga cggcaagacc 2820
gtggctatct gctgcgctac cggtgttttc ggcaccgctt acctggtgcc ccgtcacctg 2880
ttcgctgaga agtacgacaa gatcatgctg gacggtcgtg ctatgaccga ctccgactac 2940
cgtgtgttcg agttcgagat caaggtcaag ggccaggaca tgctgtccga cgctgctctg 3000
atggtgctgc accgtggcaa ccgtgtgcgt gacatcacca agcacttccg tgacaccgct 3060
cgtatgaaga agggcacccc cgtcgtcggt gtcgtgaaca acgctgacgt gggtcgtctg 3120
atcttctccg gcgaggctct gacctacaag gacatcgtcg tgtgcatgga cggcgacacc 3180
atgcccggac tgttcgctta caaggctgct accaaggctg gttactgcgg tggtgctgtg 3240
ctggccaagg acggtgctga caccttcatc gtgggcaccc actccgctgg tggcaacggt 3300
gtcggttact gctcctgcgt gtcccgttcc atgctgctgc gcatgaaggc tcacgtggac 3360
cccgagcccc agcacgag 3378
<210> 4
<211> 1126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A24 Cruzeiro株的未经修饰的多聚蛋白
<400> 4
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
20 25 30
Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr
100 105 110
Gln Ser Ser Val Gly Val Thr His Gly Tyr Ser Thr Glu Glu Asp His
115 120 125
Val Ala Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala
130 135 140
Glu Arg Phe Tyr Lys Lys Tyr Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Ala
145 150 155 160
Phe Gly His Leu Glu Lys Leu Glu Leu Pro Ser Asp His His Gly Val
165 170 175
Phe Gly His Leu Val Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp
180 185 190
Val Glu Val Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu
195 200 205
Val Ala Met Val Pro Glu Trp Lys Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr
210 215 220
Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met
225 230 235 240
Thr Ala His Ile Thr Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln
245 250 255
Tyr Lys Lys His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro
260 265 270
Leu Thr Val Asn Asn Thr Ser Ala Ala Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn
275 280 285
Ile Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu
290 295 300
Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr
305 310 315 320
Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn Pro
325 330 335
Pro Arg Thr Asn Tyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala
340 345 350
Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Cys Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr Val
355 360 365
Thr Thr Arg Thr Asp Asp Thr Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Leu Ser
370 375 380
Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Ala Gln
385 390 395 400
Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr
405 410 415
Gly Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro
420 425 430
Gly Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile
435 440 445
His Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile
450 455 460
Pro Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala
465 470 475 480
Glu Thr Ile Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His
485 490 495
Gly Lys Ala Glu Asn Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys
500 505 510
Asp Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile Asp Pro Arg Gln Gln Thr Thr Ala
515 520 525
Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly
530 535 540
Gly Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr Asp Ile Gly Phe Ile
545 550 555 560
Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Gln Ser Leu Ser Pro Thr His Val Ile
565 570 575
Asp Leu Met Gln Ala His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg
580 585 590
Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu
595 600 605
Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ser Ala Leu Leu
610 615 620
Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu
625 630 635 640
Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn
645 650 655
Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met
660 665 670
Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn
675 680 685
Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Asp Ala Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met
690 695 700
Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Glu Val
705 710 715 720
Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln
725 730 735
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
740 745 750
Pro Gly Pro Phe Phe Phe Ala Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu
755 760 765
Val Asp Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly
770 775 780
Pro Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly
785 790 795 800
Val Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys
805 810 815
Leu Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala
820 825 830
Arg Ser Lys Asp Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly
835 840 845
Leu Glu Arg Gln Arg Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln
850 855 860
Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val
865 870 875 880
Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val
885 890 895
Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr
900 905 910
Glu Ser Gly Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn
915 920 925
Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys
930 935 940
Cys Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu
945 950 955 960
Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr
965 970 975
Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln
980 985 990
Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg
995 1000 1005
Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala Arg Met Lys
1010 1015 1020
Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Val Asn Asn Ala Asp Val Gly
1025 1030 1035
Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val
1040 1045 1050
Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys
1055 1060 1065
Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys
1070 1075 1080
Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly
1085 1090 1095
Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu
1100 1105 1110
Arg Met Lys Ala His Val Asp Pro Glu Pro Gln His Glu
1115 1120 1125
<210> 5
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMDV O1 manisa株的野生型多聚蛋白(GenBank AAT01766)
<400> 5
Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn
20 25 30
Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Thr Ser Gly Gly Ser Asn
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn
50 55 60
Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu
85 90 95
Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln
100 105 110
Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val
115 120 125
Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Ala Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Phe Phe Lys Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe
145 150 155 160
Gly Arg Cys His Leu Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val Tyr
165 170 175
Gly Ser Leu Thr Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val
180 185 190
Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val
195 200 205
Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Ile Gln Lys Arg Glu Leu Tyr Gln
210 215 220
Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr
225 230 235 240
Ala His Ile Thr Val Pro Phe Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr
245 250 255
Lys Val His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu
260 265 270
Thr Val Asn Ser Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile
275 280 285
Ala Pro Thr Asn Val His Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu Gly
290 295 300
Ile Phe Pro Val Ala Cys Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr
305 310 315 320
Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro Pro
325 330 335
Arg Asn Met Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala Glu
340 345 350
Ala Cys Pro Thr Phe Leu His Phe Glu Gly Asp Val Pro Tyr Val Thr
355 360 365
Thr Lys Thr Asp Ser Asp Arg Val Leu Ala Gln Phe Asp Leu Ser Leu
370 375 380
Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala Gln Tyr
385 390 395 400
Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly
405 410 415
Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro Pro Gly
420 425 430
Met Glu Pro Pro Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala His Cys Ile His Ala
435 440 445
Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro Tyr
450 455 460
Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr
465 470 475 480
Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly Lys
485 490 495
Ala Asp Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys Asp Phe
500 505 510
Glu Leu Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Thr Gln Thr Thr Ser Ala Gly
515 520 525
Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu
530 535 540
Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp
545 550 555 560
Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu
565 570 575
Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala
580 585 590
Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn
595 600 605
Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr
610 615 620
Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu
625 630 635 640
Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn
645 650 655
Ser Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln
660 665 670
Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Ala Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr
675 680 685
Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys
690 695 700
Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Asp
705 710 715 720
Gln Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu
725 730 735
<210> 6
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMDV O1 manisa株在VP2(S93C)或P1(S179C)中经修饰的多聚蛋白
<400> 6
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
20 25 30
Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Thr Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr
100 105 110
Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe
115 120 125
Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Ala Gln Ala
130 135 140
Glu Arg Phe Phe Lys Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro
145 150 155 160
Phe Gly Arg Cys His Leu Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Cys Leu Thr Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp
180 185 190
Val Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu
195 200 205
Val Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Ile Gln Lys Arg Glu Leu Tyr
210 215 220
Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met
225 230 235 240
Thr Ala His Ile Thr Val Pro Phe Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln
245 250 255
Tyr Lys Val His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro
260 265 270
Leu Thr Val Asn Ser Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn
275 280 285
Ile Ala Pro Thr Asn Val His Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu
290 295 300
Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr
305 310 315 320
Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro
325 330 335
Pro Arg Asn Met Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val Ala
340 345 350
Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu His Phe Glu Gly Asp Val Pro Tyr Val
355 360 365
Thr Thr Lys Thr Asp Ser Asp Arg Val Leu Ala Gln Phe Asp Leu Ser
370 375 380
Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala Gln
385 390 395 400
Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr
405 410 415
Gly Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro Pro
420 425 430
Gly Met Glu Pro Pro Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala His Cys Ile His
435 440 445
Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro
450 455 460
Tyr Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu
465 470 475 480
Thr Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly
485 490 495
Lys Ala Asp Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys Asp
500 505 510
Phe Glu Leu Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Thr Gln Thr Thr Ser Ala
515 520 525
Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly
530 535 540
Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu
545 550 555 560
Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp
565 570 575
Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr
580 585 590
Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly
595 600 605
Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn
610 615 620
Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala
625 630 635 640
Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly
645 650 655
Asn Ser Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu
660 665 670
Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Ala Leu Pro Thr Ser Phe Asn
675 680 685
Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met
690 695 700
Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro
705 710 715 720
Asp Gln Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu
725 730 735
Leu
<210> 7
<211> 2211
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码FMDV O1 manisa株的经修饰的多聚蛋白的多核苷酸
<400> 7
atgggtgctg gccagtcctc ccccgctacc ggttcccaga accagtccgg caacaccggt 60
tccatcatca acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccagctgggc 120
gacaacgcta cctccggtgg ttccaacgag ggttccaccg acaccacctc tacccacacc 180
accaacaccc agaacaacga ctggttctcc aagctggctt cctccgcttt ctccggcctg 240
ttcggtgctc tgctggctga caagaagacc gaggaaacca ccctgctcga ggaccgtatc 300
ctgaccaccc gtaacggtca caccacctcc accacccagt cctccgtggg tgtcacctac 360
ggttacgcta ccgctgagga cttcgtgtcc ggtcccaaca cctccggcct ggaaacccgt 420
gtggctcagg ctgagcgctt cttcaagacc cacctgttcg actgggtcac ctccgacccc 480
ttcggtcgtt gccacctgtt ggagctgccc accgaccaca agggcgtgta cggttgcctg 540
accgactcct acgcttacat gcgtaacggc tgggacgtgg aagtgaccgc tgtgggcaac 600
cagttcaacg gtggttgcct gctggtggct atggtgcccg agctgtgctc catccagaag 660
cgcgagctgt accagctgac cctgttcccc caccagttca tcaacccccg taccaacatg 720
accgctcaca tcaccgtgcc cttcgtgggc gtgaaccgtt acgaccagta caaggtgcac 780
aagccctgga ccctggtcgt gatggtggtg gctcccctga ccgtgaactc cgagggtgct 840
ccccagatca aggtgtacgc taacatcgct cccaccaacg tgcacgtggc cggcgagttc 900
ccatccaagg aaggcatctt ccccgtcgct tgctccgacg gttacggtgg cctggtcacc 960
actgacccca agaccgctga ccccgcttac ggcaaggtgt tcaacccccc tcgtaacatg 1020
ctgcccggtc gtttcaccaa cttcttggac gtggccgagg cttgccccac cttcctgcac 1080
ttcgagggcg acgtgcccta cgtgaccacc aagactgact ccgaccgtgt gctggctcag 1140
ttcgacctgt ccctggctgc taagcacatg tccaacactt tcttggctgg cctggctcag 1200
tactacaccc agtactccgg caccatcaac ctgcacttca tgttcaccgg tcccaccgac 1260
gctaaggctc gttacatgat cgcttacgct ccccctggca tggaaccccc caagacccca 1320
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ttctccatcc cttacctgtc cgctgctgac tacgcctaca ccgcttccga caccgctgag 1440
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gacgctctgg tggtgctggc ttccgctggc aaggacttcg agctgcgtct gcccgtggac 1560
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aactacggtg gcgagactca ggtgcagcgt cgtcagcaca ccgacgtgtc cttcatcctg 1680
gaccgtttcg tgaaggtcac ccccaaggac cagatcaacg tgctggacct gatgcagacc 1740
cccgctcaca ccctcgtggg cgctctgctg cgtaccgcta cctactactt cgctgacctg 1800
gaagtggctg tgaagcacga gggcaacctg acctgggtgc ccaacggtgc tcccgaggct 1860
gctctggaca acaccactaa ccccaccgct taccacaagg ctcctctgac ccgtctggct 1920
ctgccttaca ctgctcccca ccgcgtgctg gctaccgtgt acaacggcaa ctctaagtac 1980
ggcgacggca ccgtggctaa cgtgcgtggc gatctgcagg tcctggctca gaaggctgct 2040
cgcgctctgc ccacctcctt caactacggt gctatcaagg ctacccgtgt gaccgagctg 2100
ctgtaccgta tgaagcgtgc tgagacttac tgcccccgtc ccctgctggc tatccaccct 2160
gaccaggctc gtcacaagca aaagatcgtg gctcccgtga agcagctgct g 2211
<210> 8
<211> 1126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMDV Iraq株的经修饰的多聚蛋白
<400> 8
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
20 25 30
Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr
100 105 110
Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ser Thr Gln Glu Asp His
115 120 125
Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala
130 135 140
Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asp Lys Ala
145 150 155 160
Phe Gly His Leu Glu Lys Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Cys Leu Val Asp Ser Phe Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp
180 185 190
Val Glu Val Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu
195 200 205
Val Ala Met Val Pro Glu Trp Lys Glu Phe Thr Pro Arg Glu Lys Tyr
210 215 220
Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met
225 230 235 240
Thr Ala His Ile Val Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln
245 250 255
Tyr Lys Lys His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro
260 265 270
Leu Thr Thr Asn Thr Val Ser Ala Gly Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn
275 280 285
Ile Ala Pro Thr His Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu
290 295 300
Gly Ile Val Pro Val Ala Cys Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr
305 310 315 320
Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Met Val Tyr Asn Pro
325 330 335
Pro Arg Thr Asn Tyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala
340 345 350
Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Cys Phe Asp Glu Gly Lys Pro Tyr Val
355 360 365
Val Thr Arg Thr Asp Glu Gln Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser
370 375 380
Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Ala Gln
385 390 395 400
Tyr Tyr Ala Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr
405 410 415
Gly Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Val Pro Pro
420 425 430
Gly Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr Pro Glu Lys Ala Ala His Cys Ile
435 440 445
His Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile
450 455 460
Pro Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Val Ala
465 470 475 480
Glu Thr Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His
485 490 495
Gly Lys Ala Glu Gln Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys
500 505 510
Asp Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile Asp Pro Arg Ser Gln Thr Thr Thr
515 520 525
Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly
530 535 540
Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Thr Phe Ile
545 550 555 560
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565 570 575
Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg
580 585 590
Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Asp
595 600 605
Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Ser
610 615 620
Asn Thr Gly Asn Pro Thr Ala Tyr Leu Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu
625 630 635 640
Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn
645 650 655
Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Gly Gly Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu
660 665 670
Gly Pro Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn
675 680 685
Phe Gly Ala Ile Gln Ala Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met
690 695 700
Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Glu Val
705 710 715 720
Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln
725 730 735
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
740 745 750
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755 760 765
Val Asp Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly
770 775 780
Pro Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly
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Val Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys
805 810 815
Leu Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala
820 825 830
Arg Ser Lys Asp Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly
835 840 845
Leu Glu Arg Gln Arg Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln
850 855 860
Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val
865 870 875 880
Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val
885 890 895
Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr
900 905 910
Glu Ser Gly Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn
915 920 925
Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys
930 935 940
Cys Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu
945 950 955 960
Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr
965 970 975
Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln
980 985 990
Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg
995 1000 1005
Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala Arg Met Lys
1010 1015 1020
Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Val Asn Asn Ala Asp Val Gly
1025 1030 1035
Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val
1040 1045 1050
Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys
1055 1060 1065
Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys
1070 1075 1080
Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly
1085 1090 1095
Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu
1100 1105 1110
Arg Met Lys Ala His Val Asp Pro Glu Pro Gln His Glu
1115 1120 1125
<210> 9
<211> 3378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码FMDV Iraq株的经修饰的多聚蛋白的多核苷酸
<400> 9
atgggtgctg gccagtcctc ccccgctacc ggttcccaga accagtccgg caacaccggt 60
tccatcatca acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccaactcggc 120
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accgctcaca tcgtggtgcc ctacctgggt gtcaaccgtt acgaccagta caagaagcac 780
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ccttccaaag aaggcatcgt ccccgtcgct tgctccgacg gttacggtgg cctggtcacc 960
accgacccca agaccgctga ccccgtgtac ggcatggtgt acaacccccc tcgcaccaac 1020
taccccggtc gtttcaccaa cctgctggac gtggccgagg cttgccccac cttcctgtgc 1080
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gctctgccct acaccgctcc ccaccgtgtg ctggctaccg tgtacaacgg cacctccaag 1980
tactccgctg gtggcaccgg tcgtcgtggc gacttgggtc ctctggctgc tcgtgtggct 2040
gctcagctgc ccgcttcctt caacttcggt gctatccagg ctaccaccat ccacgaactc 2100
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gctctcaagg tcaaggccaa gaacctgatc gtgaccgagt ccggtgctcc ccccaccgac 2760
ctgcaaaaga tggtcatggg caacaccaag cccgtcgagc tgatcctgga cggcaagacc 2820
gtggctatct gctgcgctac cggcgtgttc ggtactgctt acctggtgcc ccgtcacctg 2880
ttcgctgaga agtacgacaa gatcatgctg gacggtcgtg ctatgaccga ctccgactac 2940
cgtgtgttcg agttcgagat caaagtcaag ggccaggaca tgctgtccga cgctgctctg 3000
atggtgctgc accgtggcaa ccgtgtgcgt gacatcacca agcacttccg tgacaccgct 3060
cgtatgaaga agggcacccc cgtcgtcggt gtcgtgaaca acgctgacgt gggtcgtctg 3120
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ctggctaagg acggtgctga caccttcatc gtgggcaccc actccgctgg cggaaacggt 3300
gtcggttact gctcctgcgt gtcccgttcc atgctgctgc gcatgaaggc tcacgtggac 3360
cccgagcccc agcacgag 3378
<210> 10
<211> 1122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMDV Asia株的经修饰的多聚蛋白
<400> 10
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
20 25 30
Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asn Leu Ala
145 150 155 160
Phe Gly His Cys Tyr Tyr Leu Glu Leu Pro Thr Glu His Lys Gly Val
165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
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Thr Ala His Ile Asn Val Pro Tyr Val Gly Ile Asn Arg Tyr Asp Gln
245 250 255
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260 265 270
Leu Thr Val Lys Thr Gly Gly Ser Glu Gln Ile Lys Val Tyr Met Asn
275 280 285
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290 295 300
Gly Ile Val Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Asn Met Val Thr
305 310 315 320
Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro
325 330 335
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Val Ala Glu Thr
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Leu Val His Thr Gly Pro
595 600 605
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe
740 745 750
Phe Phe Ala Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val Asp Thr Ile
755 760 765
Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly Pro Asp Phe Asn
770 775 780
Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly Val Lys Ala Ile
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly Leu Glu Arg Gln
835 840 845
Arg Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr
850 855 860
Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala
865 870 875 880
Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val
885 890 895
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Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu Lys
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980 985 990
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1010 1015 1020
Val Val Gly Val Val Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe
1025 1030 1035
Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp
1040 1045 1050
Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Lys
1055 1060 1065
Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp
1070 1075 1080
Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly
1085 1090 1095
Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu Arg Met Lys Ala
1100 1105 1110
His Val Asp Pro Glu Pro Gln His Glu
1115 1120
<210> 11
<211> 3366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码FMDV Asia株的经修饰的蛋白的多核苷酸
<400> 11
atgggtgctg gccagtcctc ccctgctacc ggttcccaga accagtccgg caacaccggt 60
tccatcatca acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccagctcggc 120
gacaacgcta tctccggtgg ttccaacgag ggttccaccg acaccacctc cacccacacc 180
aacaacaccc agaacaacga ctggttctcc cgtctggctt cctccgcttt ctccggcctg 240
ttcggtgctc tgctggctga caagaagacc gaggaaacca ccctgctcga ggaccgtatc 300
ctgaccaccc gtaacggtca caccacctct accacccagt cctctgtggg tgtcacctac 360
ggttacgctg tggctgagga cgctgtgtcc ggtcccaaca cctccggcct ggaaacccgt 420
gtgcagcagg ctgagcgctt cttcaagaag cacctgttcg actggacccc caacctggct 480
ttcggtcact gctactacct cgagctgccc accgagcaca agggcgtgta cggttgcctg 540
atgggctcct acgcttacat gcgtaacggc tgggacatcg aagtgaccgc tgtgggcaac 600
cagttcaacg gtggttgcct gctggtggct ctggtgcccg agctgaaaga actggacacc 660
cgtcagaagt accagctgac cctgttcccc caccagttca tcaacccccg taccaacatg 720
accgctcaca tcaacgtgcc ctacgtgggt atcaaccgtt acgaccagta cgctctgcac 780
aagccctgga ccctggtcgt gatggtggtg gctcccctga ccgtcaagac cggtggctcc 840
gagcagatca aggtgtacat gaacgctgct cccacctacg tgcacgtggc cggcgagctg 900
ccctccaaag aaggcatcgt ccccgtcgct tgcgctgacg gttacggcaa catggtcacc 960
accgacccca agaccgctga ccccgtgtac ggcaaggtgt tcaacccccc tcgtaccaac 1020
ctgcccggtc gttttaccaa cttcctcgac gtggccgagg cttgccccac cttcctgcgt 1080
ttcggcgagg tccccttcgt caagactgtg aactccggcg accgtctgct ggctaagttc 1140
gacgtgtccc tggctgctgg tcacatgtcc aacacctacc tggctggcct ggctcagtac 1200
tacacccagt actccggcac catgaacgtc cacttcatgt tcaccggtcc caccgacgct 1260
aaggctcgtt acatggtggc ttacgtgccc cctggcatga ccccccctac cgaccctgaa 1320
cacgctgctc actgcatcca ctccgagtgg gacaccggcc tgaactccaa gttcaccttc 1380
tccatccctt acctgtccgc tgctgactac gcctacaccg cttccgatgt cgccgagact 1440
acctccgtgc agggctgggt ttgcatctac cagatcaccc acggcaaggc tgagggcgac 1500
gctctggtgg tgtccgtgtc cgctggcaag gacttcgagt tccgtctgcc cgtggacgct 1560
cgtcagcaga ccaccaccac cggcgagtcc gctgacccag tgaccaccac cgtggaaaac 1620
tacggtggcg agactcagac cgctcgtcgc ctgcacaccg acgtggcctt catcctggac 1680
cgtttcgtga agctgaccgc tcccaagaac atccagaccc tggacctgat gcagatcccc 1740
tcccacaccc tcgtgggcgc tctgctgcgt tccgctacct actacttctc cgacctggaa 1800
gtcgctctgg tccacaccgg tcccgtgacc tgggtgccca acggtgctcc caaggacgct 1860
ctgaacaacc agaccaaccc caccgcttac cagaagcagc ccatcacccg cctggctctg 1920
ccttacaccg ctccccaccg tgtcctggct actgtgtaca acggcaagac cgcttacggc 1980
gaaaccacct cccgtcgtgg cgacatggct gctctggctc agcgtctgtc cgctcgtctg 2040
cccacctcct tcaactacgg tgctgtgaag gctgacacca tcaccgagct gctgatccgt 2100
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cgtcgcaagc aagagatcat cgctcccgag aagcaggtcc tgaacttcga cctgctgaag 2220
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cacgag 3366
<210> 12
<211> 1126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMDV Iraq株的野生型多聚蛋白
<400> 12
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
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Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
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Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser
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Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu
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115 120 125
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210 215 220
Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met
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<210> 13
<211> 1122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMDV Asia株的野生型多聚蛋白
<400> 13
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
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Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
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565 570 575
Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser Ala
580 585 590
Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Leu Val His Thr Gly Pro
595 600 605
Val Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Lys Asp Ala Leu Asn Asn Gln
610 615 620
Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Ile Thr Arg Leu Ala Leu
625 630 635 640
Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Lys
645 650 655
Thr Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Ser Arg Arg Gly Asp Met Ala Ala Leu
660 665 670
Ala Gln Arg Leu Ser Ala Arg Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala
675 680 685
Val Lys Ala Asp Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg Ala
690 695 700
Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln Asp
705 710 715 720
Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Val Leu Asn Phe
725 730 735
Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Phe
740 745 750
Phe Phe Ala Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val Asp Thr Ile
755 760 765
Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly Pro Asp Phe Asn
770 775 780
Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly Val Lys Ala Ile
785 790 795 800
Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys Leu Ile Lys Leu
805 810 815
Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala Arg Ser Lys Asp
820 825 830
Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly Leu Glu Arg Gln
835 840 845
Arg Pro Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr
850 855 860
Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala
865 870 875 880
Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val
885 890 895
Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala
900 905 910
Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro Val
915 920 925
Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala Thr Gly
930 935 940
Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu Lys
945 950 955 960
Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr Asp Ser Asp Tyr
965 970 975
Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asp Met Leu Ser
980 985 990
Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile
995 1000 1005
Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala Arg Met Lys Lys Gly Thr Pro
1010 1015 1020
Val Val Gly Val Val Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe
1025 1030 1035
Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp
1040 1045 1050
Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Lys
1055 1060 1065
Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp
1070 1075 1080
Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly
1085 1090 1095
Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu Arg Met Lys Ala
1100 1105 1110
His Val Asp Pro Glu Pro Gln His Glu
1115 1120
<210> 14
<211> 3378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码FMDV Iraq株的野生型多聚蛋白的多核苷酸
<400> 14
atgggtgctg gccagtcctc ccccgctacc ggttcccaga accagtccgg caacaccggt 60
tccatcatca acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccaactcggc 120
gacaacgcta tctccggtgg ttccaacgag ggttccaccg acaccacctc tacccacacc 180
accaacaccc agaacaacga ctggttctcc aagctggctt cctccgcttt ctccggcctg 240
ttcggtgctc tgctggctga caagaagacc gaggaaacca ccctgctcga ggaccgtatc 300
ctgaccaccc gtaacggtca caccacctcc accacccagt cctccgtggg tgttacctac 360
ggttactcca cccaagagga ccacgtgtcc ggtcccaaca cctccggcct ggaaacccgt 420
gtggtgcagg ctgagcgctt cttcaagaag cacctgttcg actggacccc cgacaaggct 480
ttcggtcacc tcgagaagct cgagctgccc accgaccaca agggcgtgta cggtcacctg 540
gtggacagct tcgcttacat gcgtaacggc tgggacgtcg aggtgtccgc tgtgggcaac 600
cagttcaacg gtggttgcct gctggtggct atggtgcccg agtggaaaga attcacccct 660
cgcgagaagt accagctgac cctgttcccc caccagttca tctccccccg taccaacatg 720
accgctcaca tcgtggtgcc ctacctgggt gtcaaccgtt acgaccagta caagaagcac 780
aagccctgga ccctggtggt tatggtggtg tctcccctga ccactaacac cgtgtccgct 840
ggccagatca aggtgtacgc taacatcgct cccacccacg tgcacgtcgc gggcgagctg 900
ccttccaaag aaggcatcgt ccccgtcgct tgctccgacg gttacggtgg cctggtcacc 960
accgacccca agaccgctga ccccgtgtac ggcatggtgt acaacccccc tcgcaccaac 1020
taccccggtc gtttcaccaa cctgctggac gtggccgagg cttgccccac cttcctgtgc 1080
ttcgacgagg gcaagcccta cgtggtcacc cgtaccgacg agcagcgtct gctggctaag 1140
ttcgacgtgt ccctggctgc taagcacatg tccaacacct acctgtccgg tatcgctcag 1200
tactacgccc agtactccgg caccatcaac ctgcacttca tgttcaccgg ctccaccgat 1260
tccaaggctc gttacatggt ggcttacgtg ccccctggtg tcgagactcc ccccgacacc 1320
cctgagaagg ctgctcactg catccacgct gagtgggaca ccggcctgaa ctccaagttc 1380
accttctcca tcccttacgt gtccgccgct gactacgctt acaccgcttc cgacgtcgcc 1440
gagactacca acgtgcaggg ctgggtctgc atctaccaga tcacccacgg caaggctgag 1500
caggacaccc tggtcgtgtc cgtgtctgct ggcaaggact tcgaactccg tctgcccatc 1560
gacccccgtt cccagaccac caccaccggc gagtctgccg accctgtgac caccaccgtg 1620
gaaaactacg gtggcgagac tcaggtgcag cgtcgtcagc acaccgacgt gaccttcatc 1680
atggaccgtt tcgtgaagat ccagaacctg aaccctaccc acgtgatcga cctgatgcag 1740
actcaccagc acggcctcgt gggcgctctg ctgcgtgctg ctacctacta cttctccgac 1800
ctcgagatcg tcgtccgtca cgacggcaac ctgacctggg tgcccaacgg tgctcccgag 1860
gctgctctgt ctaacaccgg caaccccacc gcttacctga aggctccctt cacccgtctg 1920
gctctgccct acaccgctcc ccaccgtgtg ctggctaccg tgtacaacgg cacctccaag 1980
tactccgctg gtggcaccgg tcgtcgtggc gacttgggtc ctctggctgc tcgtgtggct 2040
gctcagctgc ccgcttcctt caacttcggt gctatccagg ctaccaccat ccacgaactc 2100
ctcgtgcgta tgaagcgtgc tgagctgtac tgcccccgtc ccctgctggc tgtggaagtg 2160
tcctcccagg accgtcacaa gcagaagatc atcgctcccg ctaagcagct gctgaacttc 2220
gacctgctga agctggctgg cgacgtggaa tccaaccccg gtcccttctt cttcgctgac 2280
gtgcgttcca acttctctaa gctggtggac actatcaacc agatgcaaga ggacatgtcc 2340
accaagcacg gtcccgactt caaccgtctg gtgtccgctt tcgaggaact ggctaccggt 2400
gtcaaggcta tccgtaccgg cctggacgag gctaagccct ggtacaagct gatcaagctg 2460
ctgtcccgtc tgtcctgcat ggctgctgtc gctgctcgtt ccaaggaccc cgtgctggtc 2520
gctatcatgc tggccgacac cggcttggag cgtcagcgtc ctctgaaagt ccgcgctaag 2580
ctgccccagc aagagggccc gtacgctggt cccctcgagc gtcagaagcc cctgaaggtt 2640
aaagccaagg ctcccgtggt caaagaaggc ccatacgagg gtcccgtgaa gaagcccgtc 2700
gctctcaagg tcaaggccaa gaacctgatc gtgaccgagt ccggtgctcc ccccaccgac 2760
ctgcaaaaga tggtcatggg caacaccaag cccgtcgagc tgatcctgga cggcaagacc 2820
gtggctatct gctgcgctac cggcgtgttc ggtactgctt acctggtgcc ccgtcacctg 2880
ttcgctgaga agtacgacaa gatcatgctg gacggtcgtg ctatgaccga ctccgactac 2940
cgtgtgttcg agttcgagat caaagtcaag ggccaggaca tgctgtccga cgctgctctg 3000
atggtgctgc accgtggcaa ccgtgtgcgt gacatcacca agcacttccg tgacaccgct 3060
cgtatgaaga agggcacccc cgtcgtcggt gtcgtgaaca acgctgacgt gggtcgtctg 3120
atcttctccg gcgaggctct gacctacaag gacatcgtcg tgtgcatgga tggcgacacc 3180
atgcctggcc tgttcgctta caaggctgct accaaggctg gttactgcgg tggtgctgtc 3240
ctggctaagg acggtgctga caccttcatc gtgggcaccc actccgctgg cggaaacggt 3300
gtcggttact gctcctgcgt gtcccgttcc atgctgctgc gcatgaaggc tcacgtggac 3360
cccgagcccc agcacgag 3378
<210> 15
<211> 3366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码FMDV Asia株的野生型多聚蛋白的多核苷酸
<400> 15
atgggtgctg gccagtcctc ccctgctacc ggttcccaga accagtccgg caacaccggt 60
tccatcatca acaactacta catgcagcag taccagaact ccatggacac ccagctcggc 120
gacaacgcta tctccggtgg ttccaacgag ggttccaccg acaccacctc cacccacacc 180
aacaacaccc agaacaacga ctggttctcc cgtctggctt cctccgcttt ctccggcctg 240
ttcggtgctc tgctggctga caagaagacc gaggaaacca ccctgctcga ggaccgtatc 300
ctgaccaccc gtaacggtca caccacctct accacccagt cctctgtggg tgtcacctac 360
ggttacgctg tggctgagga cgctgtgtcc ggtcccaaca cctccggcct ggaaacccgt 420
gtgcagcagg ctgagcgctt cttcaagaag cacctgttcg actggacccc caacctggct 480
ttcggtcact gctactacct cgagctgccc accgagcaca agggcgtgta cggttccctg 540
atgggctcct acgcttacat gcgtaacggc tgggacatcg aagtgaccgc tgtgggcaac 600
cagttcaacg gtggttgcct gctggtggct ctggtgcccg agctgaaaga actggacacc 660
cgtcagaagt accagctgac cctgttcccc caccagttca tcaacccccg taccaacatg 720
accgctcaca tcaacgtgcc ctacgtgggt atcaaccgtt acgaccagta cgctctgcac 780
aagccctgga ccctggtcgt gatggtggtg gctcccctga ccgtcaagac cggtggctcc 840
gagcagatca aggtgtacat gaacgctgct cccacctacg tgcacgtggc cggcgagctg 900
ccctccaaag aaggcatcgt ccccgtcgct tgcgctgacg gttacggcaa catggtcacc 960
accgacccca agaccgctga ccccgtgtac ggcaaggtgt tcaacccccc tcgtaccaac 1020
ctgcccggtc gttttaccaa cttcctcgac gtggccgagg cttgccccac cttcctgcgt 1080
ttcggcgagg tccccttcgt caagactgtg aactccggcg accgtctgct ggctaagttc 1140
gacgtgtccc tggctgctgg tcacatgtcc aacacctacc tggctggcct ggctcagtac 1200
tacacccagt actccggcac catgaacgtc cacttcatgt tcaccggtcc caccgacgct 1260
aaggctcgtt acatggtggc ttacgtgccc cctggcatga ccccccctac cgaccctgaa 1320
cacgctgctc actgcatcca ctccgagtgg gacaccggcc tgaactccaa gttcaccttc 1380
tccatccctt acctgtccgc tgctgactac gcctacaccg cttccgatgt cgccgagact 1440
acctccgtgc agggctgggt ttgcatctac cagatcaccc acggcaaggc tgagggcgac 1500
gctctggtgg tgtccgtgtc cgctggcaag gacttcgagt tccgtctgcc cgtggacgct 1560
cgtcagcaga ccaccaccac cggcgagtcc gctgacccag tgaccaccac cgtggaaaac 1620
tacggtggcg agactcagac cgctcgtcgc ctgcacaccg acgtggcctt catcctggac 1680
cgtttcgtga agctgaccgc tcccaagaac atccagaccc tggacctgat gcagatcccc 1740
tcccacaccc tcgtgggcgc tctgctgcgt tccgctacct actacttctc cgacctggaa 1800
gtcgctctgg tccacaccgg tcccgtgacc tgggtgccca acggtgctcc caaggacgct 1860
ctgaacaacc agaccaaccc caccgcttac cagaagcagc ccatcacccg cctggctctg 1920
ccttacaccg ctccccaccg tgtcctggct actgtgtaca acggcaagac cgcttacggc 1980
gaaaccacct cccgtcgtgg cgacatggct gctctggctc agcgtctgtc cgctcgtctg 2040
cccacctcct tcaactacgg tgctgtgaag gctgacacca tcaccgagct gctgatccgt 2100
atgaagcgtg ctgagactta ctgcccccgt cccctgctgg ctctggacac cacccaggac 2160
cgtcgcaagc aagagatcat cgctcccgag aagcaggtcc tgaacttcga cctgctgaag 2220
ctggctggcg acgtcgagtc caaccccggt cccttcttct tcgctgacgt gcgttccaac 2280
ttctccaagc tggtggacac catcaaccag atgcaagagg acatgtccac caagcacggt 2340
cccgacttca accgtctggt gtccgctttc gaggaactgg ctaccggtgt caaggctatc 2400
cgtaccggcc tggacgaggc taagccctgg tacaagctga tcaagctgct gtcccgtctg 2460
tcctgcatgg ctgctgtcgc tgctcgttcc aaggaccccg tgctggtcgc tatcatgctg 2520
gccgacaccg gcttggagcg ccagcgtcct ctgaaggttc gcgctaagct gcctcagcaa 2580
gagggacctt acgctggtcc cctcgagcgt cagaagcccc tgaaggtcaa ggctaaggct 2640
cccgtggtca aagaaggccc ctacgagggt cccgtgaaga agcccgtcgc tctcaaggtc 2700
aaggccaaga acctgatcgt gaccgagtcc ggtgctcccc ccaccgacct gcaaaagatg 2760
gtcatgggca acaccaagcc cgtcgagctg atcctggacg gaaagaccgt ggctatctgc 2820
tgcgctaccg gcgtgttcgg aaccgcttac ctggtgcccc gtcacctgtt cgctgagaag 2880
tacgacaaga tcatgctgga cggtcgtgct atgaccgact ccgactaccg tgtgttcgag 2940
ttcgagatca aggtcaaggg ccaggacatg ctctccgacg ctgctctgat ggtgctgcac 3000
cgtggcaacc gtgtgcgtga catcaccaag cacttccgtg acaccgctcg tatgaagaag 3060
ggcacccccg tcgtcggtgt cgtgaacaac gctgacgtgg gtcgtctgat cttctccggc 3120
gaggctctga cctacaagga catcgtcgtg tgcatggacg gcgataccat gcctggcctg 3180
ttcgcttaca aggctgctac caaggctggt tactgcggtg gtgctgtgct ggccaaggac 3240
ggtgctgaca ccttcatcgt gggcacccac tccgctggtg gcaacggtgt cggttactgc 3300
tcctgcgtgt cccgttccat gctgctgcgt atgaaggctc acgtggaccc cgagccccag 3360
cacgag 3366
<210> 16
<211> 1184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺病毒中的FMDV衣壳蛋白
<400> 16
Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser
1 5 10 15
Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln
20 25 30
Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln
50 55 60
Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu
65 70 75 80
Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr
100 105 110
Gln Ser Ser Val Gly Val Thr His Gly Tyr Ser Thr Glu Glu Asp His
115 120 125
Val Ala Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala
130 135 140
Glu Arg Phe Tyr Lys Lys Tyr Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Ala
145 150 155 160
Phe Gly His Leu Glu Lys Leu Glu Leu Pro Ser Asp His His Gly Val
165 170 175
Phe Gly Cys Leu Val Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp
180 185 190
Val Glu Val Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu
195 200 205
Val Ala Met Val Pro Glu Trp Lys Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr
210 215 220
Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met
225 230 235 240
Thr Ala His Ile Thr Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln
245 250 255
Tyr Lys Lys His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro
260 265 270
Leu Thr Val Asn Asn Thr Ser Ala Ala Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn
275 280 285
Ile Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu
290 295 300
Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr
305 310 315 320
Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn Pro
325 330 335
Pro Arg Thr Asn Tyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala
340 345 350
Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Cys Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr Val
355 360 365
Thr Thr Arg Thr Asp Asp Thr Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Leu Ser
370 375 380
Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Ala Gln
385 390 395 400
Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr
405 410 415
Gly Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro
420 425 430
Gly Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile
435 440 445
His Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile
450 455 460
Pro Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala
465 470 475 480
Glu Thr Ile Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His
485 490 495
Gly Lys Ala Glu Asn Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys
500 505 510
Asp Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile Asp Pro Arg Gln Gln Thr Thr Ala
515 520 525
Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly
530 535 540
Gly Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr Asp Ile Gly Phe Ile
545 550 555 560
Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Gln Ser Leu Ser Pro Thr His Val Ile
565 570 575
Asp Leu Met Gln Ala His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg
580 585 590
Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu
595 600 605
Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ser Ala Leu Leu
610 615 620
Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu
625 630 635 640
Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn
645 650 655
Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met
660 665 670
Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn
675 680 685
Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Asp Ala Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met
690 695 700
Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Glu Val
705 710 715 720
Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln
725 730 735
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
740 745 750
Pro Gly Pro Phe Phe Phe Ala Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu
755 760 765
Val Asp Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly
770 775 780
Pro Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly
785 790 795 800
Val Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys
805 810 815
Leu Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala
820 825 830
Arg Ser Lys Asp Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly
835 840 845
Leu Glu Ile Leu Asp Ser Thr Phe Val Val Lys Lys Ile Ser Asp Ser
850 855 860
Leu Ser Ser Leu Phe His Val Pro Ala Pro Val Phe Ser Phe Gly Ala
865 870 875 880
Pro Ile Leu Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Ala Ser Ser Phe Phe Arg
885 890 895
Ser Thr Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala Glu Lys Gln Arg Gln Arg Pro
900 905 910
Leu Lys Val Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly
915 920 925
Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val
930 935 940
Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu
945 950 955 960
Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala Pro Pro
965 970 975
Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro Val Glu Leu
980 985 990
Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala Thr Gly Val Phe
995 1000 1005
Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu Lys Tyr
1010 1015 1020
Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr Asp Ser Asp Tyr
1025 1030 1035
Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asp Met Leu
1040 1045 1050
Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg Val Arg
1055 1060 1065
Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala Arg Met Lys Lys Gly
1070 1075 1080
Thr Pro Val Val Gly Val Val Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu
1085 1090 1095
Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Thr
1100 1105 1110
Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Ala
1115 1120 1125
Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly
1130 1135 1140
Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly
1145 1150 1155
Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Leu Arg Met
1160 1165 1170
Lys Ala His Val Asp Pro Glu Pro Gln His Glu
1175 1180
<210> 17
<211> 3552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码FMDV衣壳前体的密码子优化的多核苷酸
<400> 17
atgggggctg ggcagtcctc tcccgccaca ggctcacaga atcagtcagg caacacaggg 60
tctattatca acaattatta tatgcagcag taccagaact ccatggacac ccagctggga 120
gataacgcca tctccggcgg aagcaatgag gggtccacag acaccacaag cacccacacc 180
acaaacacac agaacaatga ttggttcagc aagctggcct ccagcgcttt taccggactc 240
ttcggggccc tgctcgctga caagaaaacc gaggaaacca cactgctcga ggatcgcatc 300
ctgaccacaa ggaacggcca caccacatcc accacacagt cttcagtggg agtcacccac 360
gggtacagca cagaggaaga ccatgtggcc ggcccaaata cctctggact ggaaacacgc 420
gtggtccagg ccgagcggtt ttacaagaaa tatctgttcg actggaccac agataaggcc 480
tttggccacc tggagaaact ggaactccct tcagatcacc atggcgtgtt cggatgtctg 540
gtcgactcct acgcctatat gcgcaacggc tgggatgtgg aagtctccgc cgtgggaaac 600
cagtttaatg gaggatgcct gctcgtggct atggtcccag agtggaagga attcgacacc 660
agggagaaat accagctgac actctttcct caccagttca tctcccccag aacaaacatg 720
accgcccata ttaccgtgcc atacctgggc gtcaatcgct acgaccagta taagaaacac 780
aagccttgga ccctggtggt catggtggtc tcacccctca cagtgaacaa tacctccgcc 840
gctcagatca aagtctacgc caacattgct cccacctatg tgcacgtcgc cggggaactg 900
ccatccaagg agggcatctt ccctgtggcc tgtgctgacg ggtacggagg gctggtcacc 960
acagacccca agaccgccga tccagcttac ggcaaagtgt ataacccccc aaggaccaat 1020
taccccggaa gattcacaaa cctgctcgat gtggccgagg cttgcccaac ctttctgtgt 1080
ttcgacgatg gaaagcctta cgtgaccaca agaacagacg atacccgact gctcgccaag 1140
ttcgacctga gcctcgccgc taaacacatg tctaacacct acctgtcagg gatcgcccag 1200
tactataccc agtattccgg cacaattaat ctgcatttta tgttcacagg atctaccgac 1260
tcaaaggcca gatacatggt ggcttatatc cctcccggag tcgaaacacc acctgacacc 1320
cctgagcgag ctgctcactg catccatgcc gaatgggata ccgggctgaa ctccaagttt 1380
acattcagca ttccctacgt gtctgccgct gactacgcct ataccgctag cgatacagcc 1440
gagaccatca acgtgcaggg gtgggtctgt atctaccaga ttacccacgg caaagccgaa 1500
aatgacacac tggtggtctc tgtgtcagcc gggaaggact tcgagctgcg actccccatc 1560
gatccacgac agcagaccac agctaccgga gagtccgctg accctgtgac cacaaccgtc 1620
gaaaactacg gcggagagac ccagattcag cgccggcacc atacagacat cggctttatt 1680
atggatcgct tcgtgaagat ccagtccctg agccccaccc acgtgattga cctcatgcag 1740
gctcaccagc atggactggt gggagctctg ctccgagctg ctacctacta tttctccgat 1800
ctggaaatcg tggtccggca tgagggaaac ctgacctggg tgcctaatgg ggcccccgag 1860
tcagctctgc tcaacacatc caatcccacc gcctacaaca aagctccatt caccagactg 1920
gccctcccat atacagctcc tcaccgagtg ctggctaccg tctacaatgg cacaagcaag 1980
tatgctgtgg gaggctctgg aaggagaggg gacatgggca gcctcgctgc tcgagtggtc 2040
aagcagctgc cagcttcttt caactacgga gccatcaaag ccgatgctat tcacgaactg 2100
ctcgtgcgaa tgaagcgcgc cgagctgtat tgccccaggc cactgctcgc catcgaggtg 2160
tccagccagg acagacataa gcagaaaatc attgccccag ctaagcagct gctcaacttt 2220
gacctgctca aactggccgg agatgtggaa agcaatcctg ggcccttctt tttcgccgac 2280
gtgaggtcca acttcagcaa actggtcgac accatcaatc agatgcagga ggatatgtca 2340
accaagcacg gccccgactt taaccggctg gtgtccgcct tcgaggaact cgctaccggc 2400
gtgaaggcca tcaggacagg actggacgag gccaaaccat ggtacaagct gatcaagctg 2460
ctctctcgcc tctcatgtat ggctgctgtg gctgctcgga gcaaggaccc cgtgctggtc 2520
gccatcatgc tcgctgacac cggcctggag attctcgatt ctacatttgt ggtcaagaaa 2580
atctctgact cactgtcttc actcttccac gtgccagccc ctgtcttttc cttcggagct 2640
ccaattctgc tcgctggact ggtgaaagtc gcctccagct ttttccggtc caccccagag 2700
gacctggaaa gggccgagaa gcagcgtcag agacctctga aagtgagagc taagctccca 2760
cagcaggaag gaccttacgc tggcccgttg gagagacaga aaccgctgaa agtgaaagca 2820
aaagccccgg tcgtcaagga aggaccttac gagggaccgg tgaagaagcc tgtcgctttg 2880
aaagtgaaag ctaagaactt gatagtcact gagagtggtg ccccaccgac cgacttgcaa 2940
aagatggtca tgggcaacac aaagcctgtt gagctcatcc ttgacgggaa gacagtagcc 3000
atctgttgtg ctactggagt gtttggcact gcttacctcg tgcctcgtca tcttttcgca 3060
gagaagtatg acaagatcat gctggatggc agagccatga cagacagtga ctacagagtg 3120
tttgagtttg agattaaagt aaaaggacag gacatgctct cagacgctgc gctcatggtg 3180
ctccaccgtg ggaaccgcgt gagagatatc acgaaacact ttcgtgatac agcaagaatg 3240
aagaaaggca cccccgtcgt cggtgtggtc aacaacgccg acgttgggag actgattttc 3300
tctggtgagg ccctcaccta caaggatatt gtagtgacca tggacggaga caccatgcct 3360
ggcctctttg cctacaaagc cgccaccaag gcaggctact gtggaggagc cgttctcgcc 3420
aaggacgggg ccgacacttt catcgtcggc actcactccg caggaggcaa tggagttgga 3480
tactgctcat gcgtttccag gtccatgctt ctcagaatga aggcacacgt tgaccctgaa 3540
ccacaacacg ag 3552
<210> 18
<211> 745
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV启动子
<400> 18
tttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 60
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 240
gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 300
tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 360
tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 420
ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 480
actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 540
ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc 600
atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggccggg 660
aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg ccaagagtga cgtaagtacc gcctatagag 720
tctataggcc cacccccttg gcttc 745
<210> 19
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的增强子
<400> 19
cttgaggtgt ggcaggcttg agatctggcc atacacttga gtgacaatga catccacttt 60
gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc agcc 104
<210> 20
<211> 4579
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在vAD3027中的CMV启动子 -合成的增强子- 密码子优化的FMDV衣壳基因 -
SV40多聚A
<400> 20
tttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 60
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 240
gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 300
tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 360
tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 420
ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 480
actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 540
ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc 600
atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggccggg 660
aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg ccaagagtga cgtaagtacc gcctatagag 720
tctataggcc cacccccttg gcttccttga ggtgtggcag gcttgagatc tggccataca 780
cttgagtgac aatgacatcc actttgcctt tctctccaca ggtgtccact cccaggtcca 840
actgcagccg cggccgcatg ggggctgggc agtcctctcc cgccacaggc tcacagaatc 900
agtcaggcaa cacagggtct attatcaaca attattatat gcagcagtac cagaactcca 960
tggacaccca gctgggagat aacgccatct ccggcggaag caatgagggg tccacagaca 1020
ccacaagcac ccacaccaca aacacacaga acaatgattg gttcagcaag ctggcctcca 1080
gcgcttttac cggactcttc ggggccctgc tcgctgacaa gaaaaccgag gaaaccacac 1140
tgctcgagga tcgcatcctg accacaagga acggccacac cacatccacc acacagtctt 1200
cagtgggagt cacccacggg tacagcacag aggaagacca tgtggccggc ccaaatacct 1260
ctggactgga aacacgcgtg gtccaggccg agcggtttta caagaaatat ctgttcgact 1320
ggaccacaga taaggccttt ggccacctgg agaaactgga actcccttca gatcaccatg 1380
gcgtgttcgg atgtctggtc gactcctacg cctatatgcg caacggctgg gatgtggaag 1440
tctccgccgt gggaaaccag tttaatggag gatgcctgct cgtggctatg gtcccagagt 1500
ggaaggaatt cgacaccagg gagaaatacc agctgacact ctttcctcac cagttcatct 1560
cccccagaac aaacatgacc gcccatatta ccgtgccata cctgggcgtc aatcgctacg 1620
accagtataa gaaacacaag ccttggaccc tggtggtcat ggtggtctca cccctcacag 1680
tgaacaatac ctccgccgct cagatcaaag tctacgccaa cattgctccc acctatgtgc 1740
acgtcgccgg ggaactgcca tccaaggagg gcatcttccc tgtggcctgt gctgacgggt 1800
acggagggct ggtcaccaca gaccccaaga ccgccgatcc agcttacggc aaagtgtata 1860
accccccaag gaccaattac cccggaagat tcacaaacct gctcgatgtg gccgaggctt 1920
gcccaacctt tctgtgtttc gacgatggaa agccttacgt gaccacaaga acagacgata 1980
cccgactgct cgccaagttc gacctgagcc tcgccgctaa acacatgtct aacacctacc 2040
tgtcagggat cgcccagtac tatacccagt attccggcac aattaatctg cattttatgt 2100
tcacaggatc taccgactca aaggccagat acatggtggc ttatatccct cccggagtcg 2160
aaacaccacc tgacacccct gagcgagctg ctcactgcat ccatgccgaa tgggataccg 2220
ggctgaactc caagtttaca ttcagcattc cctacgtgtc tgccgctgac tacgcctata 2280
ccgctagcga tacagccgag accatcaacg tgcaggggtg ggtctgtatc taccagatta 2340
cccacggcaa agccgaaaat gacacactgg tggtctctgt gtcagccggg aaggacttcg 2400
agctgcgact ccccatcgat ccacgacagc agaccacagc taccggagag tccgctgacc 2460
ctgtgaccac aaccgtcgaa aactacggcg gagagaccca gattcagcgc cggcaccata 2520
cagacatcgg ctttattatg gatcgcttcg tgaagatcca gtccctgagc cccacccacg 2580
tgattgacct catgcaggct caccagcatg gactggtggg agctctgctc cgagctgcta 2640
cctactattt ctccgatctg gaaatcgtgg tccggcatga gggaaacctg acctgggtgc 2700
ctaatggggc ccccgagtca gctctgctca acacatccaa tcccaccgcc tacaacaaag 2760
ctccattcac cagactggcc ctcccatata cagctcctca ccgagtgctg gctaccgtct 2820
acaatggcac aagcaagtat gctgtgggag gctctggaag gagaggggac atgggcagcc 2880
tcgctgctcg agtggtcaag cagctgccag cttctttcaa ctacggagcc atcaaagccg 2940
atgctattca cgaactgctc gtgcgaatga agcgcgccga gctgtattgc cccaggccac 3000
tgctcgccat cgaggtgtcc agccaggaca gacataagca gaaaatcatt gccccagcta 3060
agcagctgct caactttgac ctgctcaaac tggccggaga tgtggaaagc aatcctgggc 3120
ccttcttttt cgccgacgtg aggtccaact tcagcaaact ggtcgacacc atcaatcaga 3180
tgcaggagga tatgtcaacc aagcacggcc ccgactttaa ccggctggtg tccgccttcg 3240
aggaactcgc taccggcgtg aaggccatca ggacaggact ggacgaggcc aaaccatggt 3300
acaagctgat caagctgctc tctcgcctct catgtatggc tgctgtggct gctcggagca 3360
aggaccccgt gctggtcgcc atcatgctcg ctgacaccgg cctggagatt ctcgattcta 3420
catttgtggt caagaaaatc tctgactcac tgtcttcact cttccacgtg ccagcccctg 3480
tcttttcctt cggagctcca attctgctcg ctggactggt gaaagtcgcc tccagctttt 3540
tccggtccac cccagaggac ctggaaaggg ccgagaagca gcgtcagaga cctctgaaag 3600
tgagagctaa gctcccacag caggaaggac cttacgctgg cccgttggag agacagaaac 3660
cgctgaaagt gaaagcaaaa gccccggtcg tcaaggaagg accttacgag ggaccggtga 3720
agaagcctgt cgctttgaaa gtgaaagcta agaacttgat agtcactgag agtggtgccc 3780
caccgaccga cttgcaaaag atggtcatgg gcaacacaaa gcctgttgag ctcatccttg 3840
acgggaagac agtagccatc tgttgtgcta ctggagtgtt tggcactgct tacctcgtgc 3900
ctcgtcatct tttcgcagag aagtatgaca agatcatgct ggatggcaga gccatgacag 3960
acagtgacta cagagtgttt gagtttgaga ttaaagtaaa aggacaggac atgctctcag 4020
acgctgcgct catggtgctc caccgtggga accgcgtgag agatatcacg aaacactttc 4080
gtgatacagc aagaatgaag aaaggcaccc ccgtcgtcgg tgtggtcaac aacgccgacg 4140
ttgggagact gattttctct ggtgaggccc tcacctacaa ggatattgta gtgaccatgg 4200
acggagacac catgcctggc ctctttgcct acaaagccgc caccaaggca ggctactgtg 4260
gaggagccgt tctcgccaag gacggggccg acactttcat cgtcggcact cactccgcag 4320
gaggcaatgg agttggatac tgctcatgcg tttccaggtc catgcttctc agaatgaagg 4380
cacacgttga ccctgaacca caacacgagt agtaggcggc cgctctagac tagctagaaa 4440
gatccgggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 4500
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 4560
atgtatctta tcatgtctg 4579

Claims (17)

1.组合物或疫苗，其包含口蹄疫病毒FMDV抗原或表达FMDV抗原的重组病毒载体，其中FMDV抗原由杆状病毒载体表达，并且进一步地，其中FMDV抗原为具有SEQ ID NO：2、6、8、10或16所示氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列在氨基酸179的位置处包含半胱氨酸置换，所述置换形成非天然存在的二硫桥，其增强热和酸稳定性。
2.权利要求1的组合物或疫苗，其中FMDV抗原形成FMDV VLP或空衣壳。
3.权利要求1或2的组合物或疫苗，其中FMDV抗原由在昆虫细胞中的杆状病毒载体进行表达。
4.权利要求1或2的组合物或疫苗，其中FMDV抗原是经修饰的P1多肽。
5.权利要求1或2的组合物或疫苗，其中FMDV抗原由具有SEQ ID NO：3、7、9、11、17或20所示序列的多核苷酸编码。
6.权利要求1或2的组合物或疫苗，其中该组合物或疫苗还包含药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或媒介物。
7.稳定转化的昆虫细胞，其表达由杆状病毒载体表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码FMDV抗原，其中FMDV抗原为具有SEQ ID NO：2、6、8、10或16所示氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列在氨基酸179的位置处包含半胱氨酸置换。
8.重组病毒载体，其包含一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码和表达一种或多种FMDV抗原，其中FMDV抗原为具有SEQ ID NO：2、6、8、10或16所示氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列在氨基酸179的位置处包含半胱氨酸置换，并且其中FMDV抗原由杆状病毒载体表达。
9.权利要求8的重组病毒载体，其中FMDV抗原由具有SEQ ID NO：3、7、9、11、17或20所示序列的多核苷酸编码。
10.在昆虫细胞中表达的基本上纯化的FMDV空衣壳或FMDV VLP，其中FMDV空衣壳或VLP包含具有SEQ ID NO：2、6、8、10或16所示氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列在氨基酸179的位置处包含半胱氨酸置换，其中FMDV VLP由杆状病毒载体表达。
11.权利要求8或9的病毒载体或权利要求10的FMDV空衣壳或VLP在制备用于接种易于感染FMDV的动物的方法中的组合物或在制备用于在动物中引起针对FMDV的免疫应答的方法中的组合物中的用途，所述方法包括至少一次施用所述组合物。
12.权利要求11的用途，其中所述方法包括初免-加强免疫的施用方案。
13.权利要求12的用途，其中初免-加强免疫的方案包括初次施用根据权利要求1的组合物，以及加强施用包含包括用于体内表达FMDV抗原的多核苷酸的重组病毒载体的组合物，以保护动物免受FMDV感染和/或预防感染动物的疾病进展。
14.权利要求12的用途，其中初免-加强免疫的方案包括初次施用包含包括用于体内表达FMDV抗原的多核苷酸的重组病毒载体的组合物，以及加强施用根据权利要求1的组合物，以保护动物免受FMDV感染和/或预防感染动物的疾病进展。
15.权利要求11的用途，其中所述方法包括相同或不同FMDV组合物或疫苗的一次或多次施用。
16.权利要求15的用途，其中FMDV组合物或疫苗包含体外表达的FMDV VLP或空衣壳和体内表达FMDV抗原的病毒载体。
17.权利要求1-6中任一项的组合物、权利要求8或9的病毒载体或权利要求10的FMDV空衣壳或VLP在制备用于接种易于感染FMDV的动物的药物或在制备用于在动物中引起针对FMDV的免疫应答的药物中的用途。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017044890A1 (en) * 2015-09-10 2017-03-16 Academia Sinica Bird flu vaccine combination comprising virus-like particles and novel adjuvants
MA42640B1 (fr) 2015-11-23 2021-06-30 Merial Inc Protéines de fusion de dmdv et e2 et leurs utilisations
TWI760322B (zh) 2016-01-29 2022-04-11 美商百靈佳殷格翰動物保健美國有限公司 重組腺病毒載體裝載之fmdv疫苗及其用途
US10172933B2 (en) 2016-10-31 2019-01-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Mosaic vaccines for serotype a foot-and-mouth disease virus
US11179457B2 (en) * 2017-07-12 2021-11-23 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Senecavirus a immunogenic compositions and methods thereof
CN108103034B (zh) * 2017-12-15 2022-06-24 云南农业大学动物医学院 同时表达A型、O型和Asia-1型口蹄疫病毒VP1基因重组腺病毒、构建方法及应用
CN108530522B (zh) * 2018-03-14 2021-09-17 中华人民共和国汕头海关 一种重组的OmpK多表位多肽、构建方法及其应用
CN110467654B (zh) * 2018-05-11 2022-08-09 普莱柯生物工程股份有限公司 口蹄疫病毒样颗粒抗原、其制备的疫苗组合物及其制备方法和应用
CN111233984B (zh) * 2018-11-29 2022-08-12 普莱柯生物工程股份有限公司 一种o型口蹄疫病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用
CN114423779A (zh) * 2019-06-28 2022-04-29 株式会社准绳生命科学 口蹄疫病毒疫苗组合物
CN116348133A (zh) * 2020-10-22 2023-06-27 英特维特国际股份有限公司 杆状病毒表达载体
US20230149528A1 (en) * 2021-08-18 2023-05-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Development of mosaic vaccines against foot and mouth disease virus serotype o
KR20240049581A (ko) * 2021-08-20 2024-04-16 인터벳 인터내셔널 비.브이. 구제역 바이러스 바이러스-유사 입자의 생성 방법
WO2023021168A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Intervet International B.V. Method of producing a foot and mouth disease virus virus-like particle
WO2023020737A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Intervet International B.V. Fmdv virus-like particle with stabilizing mutation
WO2023020738A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 The Pirbright Institute Fmdv virus-like particle with double stabilizing mutation
KR102513632B1 (ko) * 2021-11-30 2023-03-28 주식회사 왓슨알앤디 구제역 바이러스 유사 입자를 생산하기 위한 백신 플랫폼
US20230255886A1 (en) * 2022-02-16 2023-08-17 Chemical & Schutz High Performance Lubricants, S.A. De C.V. Self-emulsionable mineral oil as a vehicle in vaccines for poultry
CN117304277B (zh) * 2023-09-26 2024-03-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒vp4蛋白t细胞表位多肽及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000251A1 (fr) * 2000-06-29 2002-01-03 Merial Vaccin contre la fievre aphteuse
CN101270155A (zh) * 2008-05-06 2008-09-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法
CN103687614A (zh) * 2010-03-12 2014-03-26 梅里亚有限公司 口蹄疫病毒重组疫苗和其使用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA915593B (en) 1990-07-24 1993-03-31 Novagene Inc Herpesvirus-based viral vector which expresses a foot and mounth disease virus epitope on the surface of virus-infected cells and on the surface of virus particles,and vaccine against foot and mounth disease containing the same
BRPI0512421B8 (pt) * 2004-06-25 2022-06-28 Merial Ltd Recombinantes de avipox expressando genes do vírus da doença febre aftosa
EP1951297A2 (en) 2005-11-10 2008-08-06 GenVec, Inc. Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine
PT2707385T (pt) * 2011-05-13 2017-12-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigénios de f de rsv pré-fusão
SG11201407995RA (en) * 2012-06-18 2015-01-29 Novartis Ag Stabilized gp120
US9738689B2 (en) * 2013-03-13 2017-08-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion RSV F proteins and their use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000251A1 (fr) * 2000-06-29 2002-01-03 Merial Vaccin contre la fievre aphteuse
CN101270155A (zh) * 2008-05-06 2008-09-24 中国农业科学院兰州兽医研究所 通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法
CN103687614A (zh) * 2010-03-12 2014-03-26 梅里亚有限公司 口蹄疫病毒重组疫苗和其使用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An adenovirus vectored mucosal adjuvant augments protection of mice immunized intranasally with an adenovirus-vectored foot-and-mouth disease virus subunit vaccine;Diana M. Alejo等;《Vaccine》;20130401;第31卷(第18期);第2302-2309页 *
B. Mohana Subramanian等.Development of foot-and-mouth disease virus (FMDV) serotype O virus-like-particles (VLPs) vaccine and evaluation of its potency.《Antiviral Research》.2012,第96卷(第3期),第288-295页. *
Claudine Porta等.Efficient production of foot-and-mouth disease virus empty capsids in insect cells following down regulation of 3C protease activity.《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》.2012,第187卷(第2期),第406-412页. *
Development of foot-and-mouth disease virus (FMDV) serotype O virus-like-particles (VLPs) vaccine and evaluation of its potency;B. Mohana Subramanian等;《Antiviral Research》;20121006;第96卷(第3期);第288-295页 *
Efficient production of foot-and-mouth disease virus empty capsids in insect cells following down regulation of 3C protease activity;Claudine Porta等;《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》;20121119;第187卷(第2期);第402-416页 *
Recombinant adenovirus expressing type Asia1 foot-and-mouth disease virus capsid proteins induces protective immunity against homologous virus challenge in mice;Guohui Zhou等;《Research in Veterinary Science》;20130601;第94卷(第3期);第796-802页 *

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