CN101270155A

CN101270155A - 通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法

Info

Publication number: CN101270155A
Application number: CNA2008101059558A
Authority: CN
Inventors: 刘在新; 曹轶梅; 卢曾军; 孙普; 李平花; 郭建宏; 谢庆阁
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2008-05-06
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2028-05-06
Also published as: CN101270155B

Abstract

本发明公开了一种通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法。本发明的在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法，包括以下步骤：1)将改造后的P12A基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C通过杆状病毒载体导入细菌内进行重组，得到重组杆状病毒A；用重组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳。本发明首次在昆虫细胞中组装成了完整的FMDV空衣壳，为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。

Description

通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法

技术领域

本发明涉及一种通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是偶蹄动物的一种急性烈性传染病，位于A类动物传染病之首，世界各国均投入了巨额经费用于该病的防治。传统疫苗在口蹄疫的防治中存在着不足，主要表现在疫苗使用的不安全性和难于进行感染动物和免疫动物的鉴别诊断；同时在灭活疫苗的生产过程中，大量增殖自然病毒，需要严格的防范病毒扩散的设施，尽管如此，仍然存在病毒逃逸和病毒灭活不完全而散毒的可能性。2007-2008年英国口蹄疫的爆发就是因为病毒逃逸所致。口蹄疫病毒(FMDV)空衣壳具有与完整病毒相同的免疫学特性，但不存在散毒的风险，因而利用各种表达系统生产FMDV的空衣壳一直是国内外研究的热点。

FMDV衣壳呈二十面体对称结构，由60个相同的原体组成，每个原体由四种非共价连接的蛋白组成，即VP4、VP2、VP3、VP1。它们由氨基端至羧基端依次连接形成P1聚蛋白。2A蛋白是FMDV的一个非结构蛋白，它的氨基端与P1聚蛋白的羧基端连接形成融合蛋白P12A。

在小RNA病毒科的所有病毒中，FMDV是对低pH值最敏感的。完整的FMDV在pH值低于7的环境下，衣壳会解离成五聚体，它是由五个原体对称组装而成。在解离过程中，RNA被释放出来，四条链中最小的一条链VP4就脱离原体。有资料表明FMDV的酸不稳定性可能和五聚体-五聚体接触面上排列的组氨酸残基有关(Acharya R，Fry E，Stuart D I，et al.The three-dimersional structure of foot and mouthdisease virus at

Nature，1989，337：709-716.Warwicker J.Model for thedifferential stabilities of rhinovirus and poliovirus to mild acidic pH based onelectrostatics calculations.J.Mol.Biol.1992，223：247-257.)。Acharya等通过对一株O型FMDV的3D结构分析表明，沿着一个原体的

边缘排列的7个组氨酸残基(VP2上H21、H65、H87和H157；VP3上H141、144和H191)离五聚体-五聚体接触面很近，以使其能与相邻的五聚体上带电残基发生相互作用。由于组氨酸残基在pH值低于7时带正电荷，这就使7个组氨酸残基和对面接触面上的组氨酸、赖氨酸和精氨酸有可能产生静电推斥作用。但是在相同区域带负电荷的残基(谷氨酸、天门冬氨酸)会屏蔽这个效应。事实上，7个氨基酸中只有2个氨基酸(VP3上H141和H144)所在位置上的组氨酸、赖氨酸和精氨酸残基的数目(5∶2)大大超过了对面五聚体-五聚体接触面

范围内谷氨酸和天门冬氨酸的残基数。Twomey等人对一株A型FMDV病毒分析发现，它也有7个组氨酸残基(其中有4个在O型上是相同的)沿着五聚体-五聚体接触面以相同的位置排列(Twomey T，France L L，Hassard S，et al.Characterization of an acid-resistant mutant of foot-and-mouth ciseasevirus.Virology，1995，206：69-75.)。同样只有2个组氨酸残基(VP3上H141和H144)和其它位置上带正电荷的氨基酸的数目(6∶2和6∶3)大大超过了对面五聚体-五聚体接触面范围内带负电荷的氨基酸的数目。Curry和Twomey等确定了决定酸不稳定性的五聚体间接触面上的氨基酸可能是H142和H145(Twomey T，France LL，Hassard S，et al.Characterization of an acid-resistant mutant of foot-and-mouthcisease virus.Virology，1995，206：69-75.Curry S，Fry E，Crowther J C，et al.Viral RNAmodulates the acid sensitivity of foot-and-mouth disease virus capsids.J.Virol.1995，69：430-438.)。在Asial型FMDV中，相对应的组氨酸在VP3上140位和143位。

杆状病毒表达系统具有表达水平高、重组蛋白具有完整的生物学功能、能进行翻译后的加工修饰和能同时表达多个基因等诸多优点，在重组蛋白的表达中广泛应用。但是由于昆虫细胞的培养基pH值在6.3左右，因此很难应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组装稳定的FMDV空衣壳蛋白。Soo-Jeong Kye等用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达了FMDV五聚体结构，电子显微镜下观察到的五聚体结构比完整的FMDV粒子小得多(Jae-Ku Oema，Jong-Hyeon Park，Kwang-Nyeong Lee，et a1.Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structuresexpressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA.Vaccine，2007，25：4112-4121.)，这种五聚体结构是FMDV空衣壳组装过程中产生的中间体，之所以没能成功地组成完整的空衣壳，主要原因可能是昆虫细胞培养基的pH值影响了空衣壳的组装。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法及空衣壳蛋白和该空衣壳蛋白的用途。

本发明所提供的口蹄疫病毒空衣壳蛋白，是将P12A进行耐酸性改造得到的突变蛋白，所述耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第140-145位中的组氨酸残基均突变为酸性环境中不带正电荷的氨基酸；所述酸性环境中不带正电荷的氨基酸可为除精氨酸和赖氨酸外的其他17种氨基酸；优选亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；更优选亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。

所述P12A的VP4、VP2、VP3、VP1和2A蛋白均可来自同一毒株，也可分别来自不同的毒株。

本发明也涉及改进口蹄疫病毒空衣壳的耐酸性稳定性。通过突变病毒衣壳五聚体接触面的带正电荷的氨基酸为不带正电荷的氨基酸，有利地增加了空衣壳的酸性稳定性。

由现有的7个血清型(Asial、O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3)的口蹄疫病毒P12A蛋白进行耐酸性改造得到的耐酸性空衣壳蛋白mP12A，具体可为：

1)其氨基酸序列为序列表中的序列2，它是由氨基酸序列是自GenBankAccession Number EF149009的氨基末端第217-950位的Asial型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第140和143位(自序列表中序列2的氨基末端第429和432位)的组氨酸残基均突变为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；

2)由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AF511039的氨基末端第217-953位的O型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第141位和第144位的组氨酸残基突变为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；

3)由氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF494487的氨基末端第219-956位的A型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；

4)由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AM409325的氨基末端第217-948位的C型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第140位和第143位的组氨酸残基突变为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；

5)由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC011451的氨基末端第215-960位的SAT1型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；

6)由氨基酸序列是自GenBank Accession Number NC003992的氨基末端第215-956位的SAT2型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；

7)由氨基酸序列是自GenBank Accession Number AY593852的氨基末端第215-956位的SAT3型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

含有上述基因的重组载体和转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法。

本发明所提供的在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法，包括以下步骤：

1)将所述mP12A的编码基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C通过杆状病毒载体导入细菌内进行重组，得到重组杆状病毒A；

2)用所述重组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳。

上述方法中还包括将用所述重组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞得到的重组杆状病毒再感染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳的步骤。

mP12A的编码基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C可通过下述两种方法之一导入细菌内：

a)将mP12A的编码基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C通过同一个含有双启动子的杆状病毒载体导入细菌内，mP12A的编码基因插入所述双启动子杆状病毒载体的一个启动子下游，口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C插入所述双启动子杆状病毒载体的另一个启动子下游；

b)将mP12A的编码基因和非结构蛋白基因3C通过只含有一个启动子的杆状病毒载体导入细菌内。

所述双启动子杆状病毒载体为能在细菌内发生转座重组的载体；所述双启动子杆状病毒载体优选为pFastBac^TMDual。

pFastBac^TMDual可以同时表达两种异源蛋白，且该载体为非融合载体，可以使表达的蛋白保持天然蛋白的特性。同时，本发明应用Bac-Bac杆状病毒表达系统通过在细菌内发生转座重组制备重组杆状病毒，比传统的应用同源重组产生的重组体病毒更具优点：不需要多轮噬斑纯化，仅需2周时间就可以得到重组体杆状病毒；可以同时快速的分离多个重组体病毒。

上述细菌均指大肠杆菌。

上述昆虫细胞可为Sf9细胞系、Sf21细胞系、High Five细胞系或其它昆虫细胞系，优选为Sf9细胞系或High Five细胞系，其中，Sf9细胞的贴壁效果好。

将利用上述方法在昆虫细胞中表达的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明，mP12A基因和FMDV衣壳蛋白组装必需的非结构蛋白3C基因在昆虫细胞中均获得表达，且衣壳蛋白被3C蛋白酶成功地加工裂解。双抗体夹心ELISA和免疫荧光检测结果表明，表达的mP12A蛋白主要集中在细胞膜上，且具有很好的抗原性。通过电镜观察到重组杆状病毒在昆虫细胞内产生了直径约为30nm的空衣壳结构。

利用上述方法制备的口蹄疫病毒空衣壳也属于本发明的保护范围。

利用上述方法制备的口蹄疫病毒空衣壳可以应用于制备口蹄疫病毒疫苗或制备口蹄疫病毒诊断试剂。

本发明首次在昆虫细胞中组装成了完整的FMDV空衣壳，为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。

附图说明

图1为3C基因和P12A-1基因的琼脂糖凝胶电泳结果

图2为重组杆状病毒Bac mP12A3C-1和Bac P12A3C-1的PCR检测结果

图3为Sf9细胞转染Bac mP12A3C-1后的具体形态

图4为重组杆状病毒Bac mP12A3C-1转染High Five^TM昆虫细胞后的SDS-PAGE检测结果

图5为重组杆状病毒Bac mP12A3C-1转染High Five^TM昆虫细胞后的Westernblot检测结果

图6为重组杆状病毒Bac mP12A3C-1和Bac P12A3C-1分别感染High Five^TM细胞后的间接免疫荧光检测结果

图7为重组杆状病毒Bac mP12A3C-1和Bac P12A3C-1在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳蛋白的电镜检测结果

图8为重组杆状病毒Bac mP12A3C-2和Bac P12A3C-2在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳蛋白的电镜检测结果

图9为重组杆状病毒Bac mP12A3C-3和Bac P12A3C-3在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳蛋白的电镜检测结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明，这些实施例并不限制本发明的保护范围，所有基于本发明基本思路的修改和变形均属于本发明的保护范围。

以将氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF149009的氨基末端第217-950位的Asial型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第140位和第143位的组氨酸残基突变为均突变为亮氨酸；以将氨基酸序列是自GenBank Accession Number AF511039的氨基末端第217-953位的O型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第141位和第144位的组氨酸残基均突变为缬氨酸；以将氨基酸序列是自GenBank Accession NumberEF494487的氨基末端第219-956位的A型FMDV的P12A蛋白进行耐酸性改造得到的突变蛋白，该耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为缬氨酸和异亮氨酸为例，阐明完整的FMDV空衣壳的制备方法。

实施例1、口蹄疫病毒空衣壳在昆虫细胞中的组装

一、目的基因的克隆

1、RNA的提取和反转录

按照RNeasy Mini Kit的操作说明书，分别从Asia I/JS/05株(国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室，参考文献：Arch Virol，2007，152：1699-1708 Comparisons of the complete genomes of two Chineseisolates of a recent foot-and-mouth disease type Asia 1 virus。GenBank序列号：EF149009)、O/Akesu/58和A/XJ/KT/58株(国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室，参考文献：Arch Virol，2007，152：2079-2085Thecomplete genome sequence of foot-and-mouth disease virus O/Akseu/58strainand its some molecular characteristics。GenBank序列号：AF511039和AJ131665)的FMDV适应细胞毒中提取细胞的总RNA，将得到的总RNA用引物5’-CTTACTCGTGGTGTGGTTCGGGGTCGATG-3’反转录得到FMDV的cDNA。实验过程中，所有器皿和试剂均经0.1％的DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液进行去RNase处理。

2、目的基因的克隆

按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0操作说明书，分别以步骤1反转录得到的Asia I/JS/05株的FMDV的cDNA、O/Akesu/58株的FMDV的cDNA和A/XJ/KT/58株的FMDV的cDNA为模板，以3CF：5’-AGGCCATGGAGAGTGGTGCCCCACCGACTGA-3’和3CR：5’-AGGGTACCTTACTCGTGGTGTGGTTCGGGGTCGATG-3’为引物，PCR扩增衣壳蛋白组装必需的非结构蛋白基因3C。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，均得到大小为639bp的3C基因片段。

以步骤1反转录得到的Asia I/JS/05株的FMDV的cDNA为模板，以P1F：5’AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3’和IP1R：5’-GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3’为引物，PCR扩增FMDV衣壳蛋白基因P12A-1；以步骤1反转录得到的O/Akesu/58株的FMDV的cDNA为模板，以P1F：5’AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3’和OP1R：5’-GATTCTAGATTATCCGGGGTTGGACTCAACGTCTCCTG-3’为引物，PCR扩增FMDV衣壳蛋白基因P12A-2；以步骤1反转录得到的A/XJ/KT/58株的FMDV的cDNA为模板，以P1F：5’AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3’和AP1R：5’-GATTCTAGATTACCCGGGGTTGGACTCAACGTCTCCTG-3’为引物，PCR扩增FMDV衣壳蛋白基因P12A-3。分别对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到预期大小约为2200bp的P12A-1基因片段、P12A-2基因片段和P12A-3基因片段。

FMDV衣壳蛋白基因P12A-1、P12A-2和P12A-3的突变改造用连接PCR进行。以步骤1扩增得到的Asia I/JS/05株的FMDV的cDNA为模板，以P1F：

5’-AGGGGATCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3’和MP1R：

5’-GAGTCCAGTGTCCCACTCAGACAAAATGCACAATGCAGCCCGCTCCGGGTCCGCTGG-3’为引物，扩增得到突变改造的P12A-1基因的上游片段；以

MP1F：5’-GACCCGGAGCGGGCTGCATTGTGCATTTTGTCTGAGTGGGACACTGGACTCAATTCTAA-3’和P1R：5’-GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3’为引物，扩增得到突变改造的P12A-1基因的下游片段；以步骤1扩增得到的O/Akesu/58株的FMDV的cDNA为模板，以P1F：5’-AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3’和MOP1R：5’-CAACCCTGTGTCCCACTCAGCAACAATGCAAACTGCAGCCGCTTCAGGTGTTTTCGG-3’为引物，扩增得到突变改造的P12A-2基因的上游片段；以

MOP1F：5’-GAAAACACCTGAAGCGGCTGCAGTTTGCATTGTTTGGCTGAGTGGGACACAGGGTTG-3’

和P1R：5’-GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3’引物，扩增得到突变改造的P12A-2基因的下游片段；以步骤1扩增得到的A/XJ/KT/58株的FMDV的cDNA为模板，以P1F：5’-AGGGGATTCCATGGGCAACACTGGAAGCATCATTAAC-3’和MAP1R：5’-CAACCCTGTGTCCCACTCAGCAACGATGATGCATTGCAGCTTTCTCAGGCGTGTCCGG-3’为引物，扩增得到突变改造的P12A-3基因的上游片段；以

MAP1F：5’-GGACACGCCTGAGAAAGCTGCAGTTTGCATCATCGCTGAGTGGGACACAGGGTTG-3’和

P1R：5’-GATTCTAGATTACCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCTG-3’引物，扩增得到突变改造的P12A-3基因的下游片段。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到大小均为1360bp的突变改造的P12A-1、P12A-2和P12A-3基因的上游片段和920bp的突变改造的P12A-1、P12A-2和P12A-3基因的下游片段。再分别以上述扩增得到的1360bp的突变改造的P12A-1、P12A-2和P12A-3基因的上游片段和920bp的突变改造的P12A-1、P12A-2和P12A-3基因的下游片段为模板，以P1F和P1R为引物，扩增得到突变改造的P12A-1、P12A-2和P12A-3基因；对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，得到大小均约为2200bp的突变改造的P12A-1、P12A-2和P12A-3基因，分别将其命名为mP12A-1、mP12A-2和mP12A-3。

3、目的基因的鉴定

将上述步骤2扩增得到的3C基因、mP12A-1基因、mP12A-2基因、mP12A-3基因、P12A-1基因、P12A-2基因和P12A-3基因分别与pGEM-T载体(Promega公司)4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的大肠杆菌感受态细胞均匀涂布于含有Amp的LB琼脂平板上，挑取单个菌落，以质粒快速提取试剂盒分别小量提取质粒，进行酶切和PCR鉴定，将PCR鉴定结果为阳性的重组质粒送上海生工生物工程技术有限公司进行测序，将测序正确的重组质粒分别命名为pGEM-3C、pGEM-mP12A-1、pGEM-mP12A-2、pGEM-mP12A-3、pGEM-P12A-1、pGEM-P12A-2和pGEM-P12A-3。mP12A-1的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其所编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其中，自其氨基末端第429位和432位为亮氨酸(即VP3的自其氨基末端第140位和143位为亮氨酸)；mP12A-2所编码的氨基酸序列是将自GenBank Accession Number AF511039的自氨基末端第217-953位的O型FMDV的P12A蛋白中VP3的自氨基末端第141位和第144位的组氨酸残基均突变为缬氨酸所得；mP12A-3所编码的氨基酸序列是将自GenBank AccessionNumber EF494487的自氨基末端第219-956位的A型FMDV的P12A蛋白中VP3的自氨基末端第142位和第145位的组氨酸残基突变为异亮氨酸和缬氨酸所得；3C的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示；P12A-1所编码的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

二、重组转移载体的构建

将实步骤一构建的重组质粒pGEM-3C经Nco I和Kpn I酶切后，与经同样酶切处理的pFastBac^TMDual(Invitrogen公司)连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的大肠杆菌感受态细胞均匀涂布于含有Amp的LB琼脂平板上，挑取单个菌落，以质粒快速提取试剂盒小量制备质粒，进行PCR、酶切和电泳检测，结果表明，获得大小为639bp的酶切片段，将PCR鉴定为结果为阳性的重组质粒命名为pFastDual-3C。以重组质粒pFastDual-3C为模板，以3CR和3CF为引物，进行PCR扩增，结果也获得639bp的片段，与预期大小相符，表明3C基因已经与转移载体pFastBac^TMDual(Invitrogen公司)正确连接，置于杆状病毒P₁₀启动子的控制之下。

将步骤一构建的重组质粒pGEM-P12A-1和pGEM-mP12A-1、pGEM-P12A-2和pGEM-mP12A-2、pGEM-P12A-3和pGEM-mP12A-3分别用BamHI和XbaI酶切后，与用同样酶切处理的重组质粒pFastDual-3C连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的大肠杆菌感受态细胞均匀涂布于含有Amp的LB琼脂平板上，挑取单个菌落，提取质粒，进行PCR、酶切和电泳检测。电泳结果如图1所示。其中，M为DNA分子量标准，泳道1和2为3C基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道3为P12A-1基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。将PCR鉴定为阳性的重组质粒分别命名为pFastDual-mP12A3C-1、pFastDual-mP12A3C-2、pFastDual-mP12A3C-3、pFastDual-P12A3C-1、pFastDual-P12A3C-2和pFastDual-P12A3C-3。分别以重组质粒pFastDual-mP12A3C-1、pFastDual-mP12A3C-2、pFastDual-mP12A3C-3为模板，以P1F和P1R为引物，分别进行PCR扩增，结果均获得约2200bp的片段，与预期大小相符，表明基因mP12A-1、mP12A-2和mP12A-3已经与转移载体pFastBac^TMDual(Invitrogen公司)正确连接，并置于杆状病毒P_H启动子的控制之下。

三、重组杆粒的获得

将步骤二获得的重组质粒pFastDual-mP12A3C-1、pFastDual-mP12A3C-2、pFastDual-mP12A3C-3、pFastDual-P12A3C-1、pFastDual-P12A3C-2和pFastDual-P12A3C-3分别转化大肠杆菌DH10Bac^TM(Invitrogen公司)感受态细胞，取1μL上述感受态细胞涂布于LB选择培养平板上(卡那霉素50μg/mL、庆大霉素7μg/mL、四环素10μg/mL、IPTG 40μg/mL、Bluo-gal 100μg/mL)，37℃培养48h后挑选白色菌落，接种于液体LB培养基上，37℃振摇12h，用S.N.A.P.^TMMidiPrep Kit试剂盒(Invitrogen公司)分别提取杆粒pFastDual-mP12A3C-1、pFastDual-mP12A3C-2、pFastDual-mP12A3C-3、pFastDual-P12A3C-1、pFastDual-P12A3C-2和pFastDual-P12A3C-3的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。分别以所得三种杆粒的DNA为模板，以M13 Forward(-40)5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’和M13Reverse 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’为引物，进行PCR扩增。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体的检测结果如图2所示。其中，M为DNA分子量标准，1和2为野生型杆粒的PCR检测结果，3和4为重组杆粒pFastDual-mP12A3C-1的PCR检测结果，5和6为重组杆粒pFastDual-P12A3C-1的PCR检测结果。

结果表明，野生型杆粒PCR扩增产物的大小为300bp，重组型杆粒PCR扩增产物的大小为5401bp。将插入mP12A-1基因和3C基因的重组杆粒命名为BacmP12A3C-1，将插入mP12A-2基因和3C基因的重组杆粒命名为Bac mP12A3C-2，将插入mP12A-3基因和3C基因的重组杆粒命名为Bac mP12A3C-3，将插入P12A-1基因和3C基因的重组杆粒命名为Bac P12A3C-1，将插入P12A-2基因和3C基因的重组杆粒命名为Bac P12A3C-2，将插入P12A-3基因和3C基因的重组杆粒命名为Bac P12A3C-3。

四、重组杆状病毒的获得

用S.N.A.P.^TMMidiPrep Kit试剂盒提取重组杆粒Bac mP12A3C-1、BacmP12A3C-2、Bac mP12A3C-3和Bac P12A3C-1、Bac P12A3C-2、Bac P12A3C-3的DNA，分别将提取得到的高纯度的杆粒DNA 1μg用

转染试剂转染对数生长期的Sf9细胞(Invitrogen公司)。转染Bac mP12A3C-1、Bac mP12A3C-2、BacmP12A3C-3后Sf9细胞逐渐发生改变，倒置显微镜下观察到细胞发生典型病变后，收获细胞培养上清，此为第一代病毒，4℃保存备用。Sf9细胞转染Bac mP12A3C-1后的具体形态如图3所示。其中，A为未转染重组杆状病毒的正常Sf9细胞的形态，B为转染重组杆状病毒Bac mP12A3C-1后Sf9细胞的形态，C为转染重组杆状病毒Bac P12A3C-1后Sf9细胞的形态。

五、重组蛋白的表达与检测

1、SDS-PAGE和Western blot检测

将上述步骤四获得的第一代重组杆状病毒Bac mP12A3C-1、Bac mP12A3C-2和Bac mP12A3C-3分别在Sf9细胞中进行扩增，用噬斑法确定滴度后，分别以10个感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)的上述两种重组病毒接种对数生长期的HighFive^TM昆虫细胞(Invitrogen公司)，72h后收获细胞及培养上清。将收获的细胞用细胞裂解液裂解后，进行SDS-PAGE检测，培养上清则直接用于SDS-PAGE检测，同时以未接种重组病毒的High Five^TM昆虫细胞以及转染Bac P12A3C-1、Bac P12A3C-2和Bac P12A3C-3的High Five^TM昆虫细胞裂解液作为对照。将电泳蛋白带转印至硝酸纤维素膜上，PBST洗涤硝酸纤维素膜后，用3％的BSA 37℃封闭45min，再用PBST洗涤后分别加入Asia I型FMDV感染猪血清(Asia I/JS/05株免疫猪得到的血清)、O型FMDV感染牛血清(O/Akesu/58株免疫牛得到的血清)和A型FMDV感染牛血清(A/XJ/KT/58株免疫牛得到的血清)于37℃作用1h，PBST洗涤后加入1∶20000稀释的HRP-兔抗猪IgG 37℃作用1h。充分洗涤，加入DAB-H₂O₂显色，观察特异性条带。

SDS-PAGE检测结果如图4所示，其中，M为14-116KDa的蛋白分子量标准，1为重组杆状病毒Bac P12A3C-1转染High Five^TM昆虫细胞后培养上清的SDS-PAGE检测结果，2和3为重组杆状病毒Bac mP12A3C-1转染High Five^TM昆虫细胞后培养上清的SDS-PAGE检测结果，4为未转染任何重组杆状病毒的正常High Five^TM昆虫细胞裂解液的SDS-PAGE检测结果，5为转染野生型杆状病毒的High Five^TM昆虫细胞裂解液的SDS-PAGE检测结果，6为转染野生型杆状病毒的High Five^TM昆虫细胞培养上清的SDS-PAGE检测结果，7为重组杆状病毒Bac mP12A3C-1转染High Five^TM昆虫细胞后细胞裂解液的SDS-PAGE检测结果，8为重组杆状病毒Bac P12A3C-1转染High Five^TM昆虫细胞后细胞裂解液的SDS-PAGE检测结果。

SDS-PAGE检测结果表明，重组杆状病毒感染细胞的培养上清比作为对照的野生型杆状病毒感染细胞的培养上清在80kDa(P1)、47kDa(VP31)、33kDa(VP0)、24kDa(VP3)和23kDa(VP1)处多出条带，说明mP12A-1、mP12A-2、mP12A-3基因和3C基因均在昆虫细胞中获得表达，且mP12A-1蛋白、mP12A-2蛋白和mP12A-3蛋白均被3C蛋白酶成功地加工裂解。

对上述表达产物进行Western blot分析，结果出现了5条反应条带(P1、VP31、VP0、VP3和VP1)，Western blot检测结果如图5所示。其中，1和2为重组杆状病毒Bac mP12A3C-1转染High Five^TM昆虫细胞后的Western blot检测结果，3和4为重组杆状病毒Bac P12A3C-1转染High Five^TM昆虫细胞后的Western blot检测结果。结果表明，表达产物能与FMDV阳性血清发生反应，且具有很高的特异性。

2、间接免疫荧光检测

用重组杆状病毒Bac mP12A3C-1、Bac mP12A3C-2、Bac mP12A3C-3、BacP12A3C-1、Bac P12A3C-2和Bac P12A3C-3分别感染High Five^TM细胞，12h后，用3.7％的多聚甲醛固定细胞10min，用含有1％BSA的PBS洗涤2次，再用50mmol/L NH₄Cl淬灭10min。分别加入Asia I型FMDV兔抗血清(Asia I/JS/05株免疫兔得到的血清)、O型FMDV兔抗血清(O/Akesu/58株免疫兔得到的血清)和A型FMDV兔抗血清(A/XJ/KT/58株免疫兔得到的血清)于37℃作用40min。用含有1％BSA的PBS洗涤后加入荧光素标记的羊抗兔抗血清于37℃作用15-30min。PBS洗涤后用甘油封片，荧光显微镜观察。

间接免疫荧光检测结果如图6所示。其中，A1和A2分别为重组杆状病毒BacmP12A3C-1和Bac P12A3C-1感染High Five^TM细胞后的间接免疫荧光检测结果，B为野生型杆状病毒感染High Five^TM细胞后的间接免疫荧光检测结果。

间接免疫荧光检测结果表明，重组杆状病毒Bac mP12A3C-1、Bac mP12A3C-2、Bac mP12A3C-3、Bac P12A3C-1、Bac P12A3C-2和Bac P12A3C-3感染的昆虫细胞显示强荧光信号，并且荧光主要集中在细胞膜上，而野生型杆状病毒感染的HighFive^TM昆虫细胞荧光信号为阴性，表明mP12A-1、mP12A-2、mP12A-3基因和P12A-1、P12A-2、P12A-3基因在High Five^TM昆虫细胞中均获得表达。

六、空衣壳结构电镜观察

将上述步骤四获得的重组杆状病毒Bac mP12A3C-1、Bac mP12A3C-2、BacmP12A3C-3培养至第3代后分别感染High Five^TM细胞，96h后细胞病变完全，离心收集细胞，加细胞裂解液裂解后，离心取上清20μL，磷钨酸负染色后置电子显微镜下观察空衣壳结构。

电镜观察结果如图7、图8和图9所示。其中，图7A、图8A和图9A分别为改造后的P12A基因(即mP12A-1、mP12A-2和mP12A-3基因)在昆虫细胞中表达后组装为完整的空衣壳，图7B、图8B和图9B分别为未改造的P12A基因(即P12A-1、P12A-2和P12A-3基因)在昆虫细胞中表达后观察不到空衣壳。结果表明，通过耐酸性改造的重组杆状病毒Bac mP12A3C-1、Bac mP12A3C-2、Bac mP12A3C-3在感染细胞中产生了直径约为30nm的空衣壳结构，呈正六边形，大小和形状与FMDV 75S衣壳结构相似，而重组杆状病毒Bac P12A3C-1、Bac P12A3C-2、Bac P12A3C-3在感染细胞中不能得到FMDV空衣壳。

序列表

<160>4

<210>1

<211>2208

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgggcaaca ctggaagcat cattaacaac tactacatgc agcagtacca gaactccatg 60

gacacgcaac ttggagataa tgctatcagc ggaggctcca acgagggttc cacggacacc 120

acatccacac acacaaacaa cacccaaaac aatgattggt tctcacgctt ggccaactcg 180

gcctttagcg gactgtttgg tgctcttttg gctgacaaga aaacggagga gacaactctg 240

cttgaagacc gcattctcac caccagaaat ggccacacga cgtcgacgac acagtcgagt 300

gttggcgtaa catatggtta cgctgtggct gaagacgcgg tatctgggcc taacacctca 360

ggcctggaga cccgcgtaac acaggctgaa cggttcttca agaaacacct gtttgactgg 420

acgccggatt tgtcatttgg acactgtcac tacttggaac tcccctctga acacaagggc 480

gtgtttggca gcctcatgag ctcttatgct tacatgagga acgggtggga cgttgaggtg 540

accgctgttg gaaatcagtt caatggtggt tgtctcctcg tcgcactcgt gccggagctg 600

ataaagctcg gcacgcggca gaagtatcag ttaaccctct tcccacacca gttcattaac 660

ccgcgcacta acatgacggc tcacattaac gtgccgtacg tgggtgtcaa caggtacgac 720

cagtacgagc tccacaaacc gtggacgctt gtggtgatgg tggtggcccc gcttaccgtc 780

aaaactggtg gttctgaaca gatcaaggtc tacatgaatg cagcgccgac ctacgtgcac 840

gtggcaggag aactgccctc gaaagagggg atagttcctg tggcgtgtgt ggacggttac 900

ggcaacatgg taaccacgga cccgaagacg gctgaccccg tctacgggaa agtgtctaac 960

ccccccagaa caagcttccc tgggcgtttc acaaacttcc ttgatgtagc ggaggcgtgt 1020

ccgaccttcc tccgcttcgg agaagtacca tttgtgaaga cggtgaactc tggtgaccgc 1080

ttgcttgcca agtttgacgt gtccctcgct gcggggcaca tgtccaacac ctacttggca 1140

ggtttggcac agtactacac acagtacagc ggcactatga atatccactt catgttcacc 1200

ggacccacgg atgccaaagc ccgctacatg gtggcttaca tacctcctgg tatgacaccg 1260

ccagcggacc cggagcgggc tgcattgtgc attttgtctg agtgggacac tggactcaat 1320

tctaaattta ccttttctat cccttacctt tctgctgcag actatgctta cactgcttct 1380

gacgtggctg agaccacgag tgtgcaggga tgggtgtgta tttaccagat cacccacggt 1440

aaagctgaag gtgacgcgct ggtcgtgtcc gtcagcgctg gcaaggactt tgagtttcga 1500

ctaccggtgg atgcccgcca acagactacc accaccggcg agtccgcaga cccagtcacc 1560

accacggttg agaactacgg aggagaaacc cagacggccc gacggcttca cactgatgtc 1620

gccttcgttc tcgacaggtt cgtgaaactc acccagccca agagcaccca aacccttgat 1680

ctcatgcaga tcccctcaca cacactggtc ggggcgcttc tccggtctgc gacgtactac 1740

ttctcagatc tggaggttgc gctcgtccac acaggaccgg tcacgtgggt gcccaatggt 1800

gcgcctaaga ccgccttgaa caaccacacc aacccgactg cctaccagaa gcagcctatc 1860

acccgcttgg cactccccta caccgctccc caccgtgtgc tgtcaacagt gtacaacggg 1920

aagacaacgt acggagaaga atcctcgcgg cgtgatgatc ttgccgccct cgcacgcaga 1980

gtgagcaacc ggctgcccac ttccttcaac tacggcgctg tgaaggccga caccatcacg 2040

gagctgttga tccgcatgaa gcgtgcggaa acatactgcc ccaggccctt gctggctctt 2100

gacaccacac aagaccgccg taaacaggag atcattgcac ctgagaaaca gactttgaac 2160

tttgacctac tcaagttggc aggagacgtg gagtccaacc ctgggtaa 2208

<210>2

<211>735

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(429)

<223>Xaa＝Leu或Ile或Val或Ala或Asp或Gly或Met或Phe或Asn或Cys或Glu或Gln或Pro或Ser或Thr或Tyr或Trp

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(432)

<400>2

Met Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr

1 5 10 15

Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly

20 25 30

Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr

35 40 45

Gln Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ser Gly

50 55 60

Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu

65 70 75 80

Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr

85 90 95

Thr Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp

100 105 110

Ala Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr Gln

115 120 125

Ala Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asp Leu

130 135 140

Ser Phe Gly His Cys His Tyr Leu Glu Leu Pro Ser Glu His Lys Gly

145 150 155 160

Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp

165 170 175

Asp Val Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu

180 185 190

Leu Val Ala Leu Val Pro Glu Leu Ile Lys Leu Gly Thr Arg Gln Lys

195 200 205

Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn

210 215 220

Met Thr Ala His Ile Asn Val Pro Tyr Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp

225 230 235 240

Gln Tyr Glu Leu His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala

245 250 255

Pro Leu Thr Val Lys Thr Gly Gly Ser Glu Gln Ile Lys Val Tyr Met

260 265 270

Asn Ala Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys

275 280 285

Glu Gly Ile Val Pro Val Ala Cys Val Asp Gly Tyr Gly Asn Met Val

290 295 300

Thr Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Pro Pro Arg Thr Ser Phe Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val

325 330 335

Ala Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg Phe Gly Glu Val Pro Phe Val

340 345 350

Lys Thr Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser

355 360 365

Leu Ala Ala Gly His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Gly Leu Ala Gln

370 375 380

Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Met Asn Ile His Phe Met Phe Thr

385 390 395 400

Gly Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro

405 410 415

Gly Met Thr Pro Pro Ala Asp Pro Glu Arg Ala Ala Xaa Cys Ile Xaa

420 425 430

Ser Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro

435 440 445

Tyr Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Val Ala Glu

450 455 460

Thr Thr Ser Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly

465 470 475 480

Lys Ala Glu Gly Asp Ala Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp

485 490 495

Phe Glu Phe Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Gln Gln Thr Thr Thr Thr

500 505 510

Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly

515 520 525

Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp Val Ala Phe Val Leu

530 535 540

Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Gln Pro Lys Ser Thr Gln Thr Leu Asp

545 550 555 560

Leu Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser

565 570 575

Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Leu Val His Thr Gly

580 585 590

Pro Val Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Lys Thr Ala Leu Asn Asn

595 600 605

His Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Ile Thr Arg Leu Ala

610 615 620

Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ser Thr Val Tyr Asn Gly

625 630 635 640

Lys Thr Thr Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Asp Asp Leu Ala Ala

645 650 655

Leu Ala Arg Arg Val Ser Asn Arg Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly

660 665 670

Ala Val Lys Ala Asp Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg

675 680 685

Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln

690 695 700

Asp Arg Arg Lys Gln GluIleIle Ala Pro Glu Lys Gln Thr Leu Asn

705 710 715 720

Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

725 730 735

<210>3

<211>735

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Met Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr

1 5 10 15

Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly

20 25 30

Ser Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Asn Asn Thr

35 40 45

Gln Asn Asn Asp Trp Phe Ser Arg Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ser Gly

50 55 60

Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu

65 70 75 80

Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr

85 90 95

Thr Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Glu Asp

100 105 110

Ala Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr Gln

115 120 125

Ala Glu Arg Phe Phe Lys Lys His Leu Phe Asp Trp Thr Pro Asp Leu

130 135 140

Ser Phe Gly His Cys His Tyr Leu Glu Leu Pro Ser Glu His Lys Gly

145 150 155 160

Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp

165 170 175

Asp Val Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu

180 185 190

Leu Val Ala Leu Val Pro Glu Leu Ile Lys Leu Gly Thr Arg Gln Lys

195 200 205

Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn

210 215 220

Met Thr Ala His Ile Asn Val Pro Tyr Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp

225 230 235 240

Gln Tyr Glu Leu His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala

245 250 255

Pro Leu Thr Val Lys Thr Gly Gly Ser Glu Gln Ile Lys Val Tyr Met

260 265 270

Asn Ala Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys

275 280 285

Glu Gly Ile Val Pro Val Ala Cys Val Asp Gly Tyr Gly Asn Met Val

290 295 300

Thr Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Pro Pro Arg Thr Ser Phe Pro Gly Arg Phe Thr Asn Phe Leu Asp Val

325 330 335

Ala Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Arg Phe Gly Glu Val Pro Phe Val

340 345 350

Lys Thr Val Asn Ser Gly Asp Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser

355 360 365

Leu Ala Ala Gly His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Gly Leu Ala Gln

370 375 380

Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Met Asn Ile His Phe Met Phe Thr

385 390 395 400

Gly Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro

405 410 415

Gly Met Thr Pro Pro Ala Asp Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile His

420 425 430

Ser Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro

435 440 445

Tyr Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Val Ala Glu

450 455 460

Thr Thr Ser Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly

465 470 475 480

Lys Ala Glu Gly Asp Ala Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp

485 490 495

Phe Glu Phe Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Gln Gln Thr Thr Thr Thr

500 505 510

Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly

515 520 525

Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr Asp Val Ala Phe Val Leu

530 535 540

Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Gln Pro Lys Ser Thr Gln Thr Leu Asp

545 550 555 560

Leu Met Gln Ile Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser

565 570 575

Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Val Ala Leu Val His Thr Gly

580 585 590

Pro Val Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Lys Thr Ala Leu Asn Asn

595 600 605

His Thr Asn Pro Thr Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Ile Thr Arg Leu Ala

610 615 620

Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ser Thr Val Tyr Asn Gly

625 630 635 640

Lys Thr Thr Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Asp Asp Leu Ala Ala

645 650 655

Leu Ala Arg Arg Val Ser Asn Arg Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly

660 665 670

Ala Val Lys Ala Asp Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg

675 680 685

Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr Gln

690 695 700

Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Thr Leu Asn

705 710 715 720

Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

725 730 735

<210>4

<211>642

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

agtggtgccc caccgactga cttgcaaaag atggtcatgg gcaacaccaa gcctgttgag 60

ctcatcctcg acggcaagac ggtagccatc tgctgcgcta ccggagtctt tggtactgcc 120

tacctcgagc ctcgtcacct tttcgcagag aagtacgaca agatcatgct ggacggcaga 180

gccatgacag acagtgacta cagagtgttt gagtttgaga ttaaagtaaa aggacaggac 240

atgctctcag acgccgcact catggtgctc caccgtggga atcgcgtgcg tgacatcacg 300

aagcacttcc gtgatgtagc caagatgaag aaaggaaccc ccgtcgttgg tgtgattaac 360

aacgccgacg ttgggagact gattttctct ggtgaggccc taacctacaa agacattgta 420

gtgtgcatgg acggagacac catgcctggg ctttttgcct acaaggccgt caccagggcg 480

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Claims

1、一种空衣壳蛋白，是将口蹄疫病毒的P12A进行耐酸性改造得到的突变蛋白；所述耐酸性改造是将口蹄疫病毒的P12A中VP3的自氨基末端第140-145位中的组氨酸残基突变为酸性环境中不带正电荷的氨基酸；

所述酸性环境中不带正电荷的氨基酸为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；优选为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；更优选为亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；

所述P12A的VP4、VP2、VP3、VP1和2A蛋白均来自口蹄疫病毒的同一毒株，或分别来自口蹄疫病毒的不同毒株。

2、根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述空衣壳蛋白为下述七种蛋白之一：

1)其氨基酸序列为序列表中的序列2；

3、权利要求1或2所述蛋白的编码基因。

4、含有权利要求3所述基因的重组载体和转基因细胞系。

5、一种在昆虫细胞中表达口蹄疫病毒空衣壳的方法，包括以下步骤：

1)将权利要求3所述的基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C通过杆状病毒载体导入细菌内进行重组，得到重组杆状病毒A；

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将用所述重组杆状病毒A的DNA转染昆虫细胞得到的重组杆状病毒再感染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳的步骤。

所述昆虫细胞为Sf9细胞系、sf21细胞系或High Five细胞系；

所述权利要求5中的细胞系优选为Sf9细胞系；

所述权利要求6中的细胞系优选为High Five细胞系。

7、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述权利要求3所述的基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C可通过同一个含有双启动子的杆状病毒载体导入细菌内，权利要求3所述的基因插入所述双启动子杆状病毒载体的一个启动子下游，所述口蹄疫病毒的非结构蛋白基因3C插入所述双启动子杆状病毒载体的另一个启动子下游；

所述细菌优选为大肠杆菌。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述双启动子杆状病毒载体为能在细菌内发生转座重组的载体；所述双启动子杆状病毒载体优选为pFastBac^TMDual。

9、利用权利要求8所述方法制备的口蹄疫病毒空衣壳。

10、权利要求9所述的口蹄疫病毒空衣壳在制备口蹄疫病毒疫苗或制备口蹄疫病毒诊断试剂中的应用。