CN102321639B - 基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法，其是通过融合PCR技术分别对的基孔肯雅病毒(CHIKV)结构蛋白编码基因C-E3-E2-6K-E1基因元件进行改造，然后将的上述基因改造元件克隆入昆虫细胞表达载体中，再将该重组表达载体分别转染SF9昆虫细胞，并使其分泌表达CHIKV病毒样颗粒(VLPs)。另外，本发明对CHIKV VLPs的免疫效果及对病毒特异性抗体检测进行了初步研究，为基于CHIKV VLPs的免疫学检测试剂乃至疫苗的研制奠定了基础。

Description

基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及病毒学、分子生物技术领域，具体地说涉及基孔肯雅病毒病毒病毒样颗粒的制备方法和应用。

背景技术

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)病毒经伊蚊叮咬传播，引起以发热、关节疼痛等为主要特征的自限性传染性疾病基孔肯雅热(Chikungunya fever，CHIK)。1952年在坦桑尼亚发生暴发流行中首次分离CHIKV，亚洲地区于1958年在泰国首次分离CHIKV。随后在非洲、亚洲包括印度次大陆发生了多次CHIK的暴发流行，累计报告病例超过800万。据世界卫生组织报告，全球有37个国家和地区呈地方性流行或具有潜在地方性流行风险。

CHIKV属于披膜病毒科甲病毒属的单股正链RNA病毒，基因组约含有11-12k核苷酸，基因排列顺序为5′-NCR-NS1-NS2-NS3-NS4-C-E3-E2-6K-E1-3′，共编码5个结构蛋白和4个非结构蛋白。病毒颗粒为球形，直径约为60-70nm。病毒糖蛋白E1和E2镶嵌在由脂质双层膜构成的病毒包膜上，介导病毒吸附宿主细胞并与细胞膜融合，病毒进入靶细胞是通过依赖Eps15的内吞作用实现的。根据抗原特性分类，该病毒属于Semliki森林病毒(SFV)群与o′nyong-nyong病毒基因组同源性高，存在血清学交叉反应。目前流行的CHIKV分为3个基因型，即西非型、亚洲型和东中南非洲型(ECSA)，每一基因型的病毒一般在相应的地理区域呈地方性流行，直到2005-2006年ECSA型病毒传入亚洲，引发了印度洋群岛、印度及东南亚地区CHIK大暴发。生物信息学分析显示CHIKV是由存在于非洲大陆的共同祖先进化而来，大约70-90年前传到亚洲。

CHIKV的致病机理知之甚少，病毒能够感染包括表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等，病毒复制可诱发细胞病变和凋亡[11]，诱导细胞凋亡也可能是病毒规避宿主免疫系统的机制。对临床发病数周后患者肌肉组织活检发现肌卫星细胞中存在病毒抗原，显示CHIKV可能长期存在于感染者体内。病毒感染方式影响宿主的免疫应答，经蚊叮咬感染与经注射感染病毒诱发的免疫反应显著不同。在急性期，血清中病毒载量决定促炎症细胞因子的特异性表达模式，细胞和组织破坏相关的临床症状可能和细胞因子的异常表达及细胞凋亡有关，与疾病的严重程度相关。在慢性期，IL-6和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子水平和持续性关节病相关，同时CD8+T淋巴细胞缺失或失活导致细胞免疫缺陷可能是造成疾病迁延不愈的机制之一。抗体介导的免疫增强机制也可能存在于CHIKV感染过程。

人感染CHIKV后可获得终身免疫，诱导机体产生中和抗体，抑制病毒胞外传播。基于病毒膜蛋白的病毒样颗粒和DNA疫苗能够诱导非人灵长类有效的体液和细胞免疫，诱导产生的抗血清能够保护免疫缺陷动物免受病毒感染。

CHIKV的自然宿主为人和灵长类动物，主要传播媒介为埃及伊蚊、白纹伊蚊、非洲伊蚊和带叉-泰氏伊蚊，不同蚊种在传播中的重要性不同，埃及伊蚊为家栖蚊种，传播基孔肯雅病毒能力最强。在非洲，丛林型疫源地在病毒循环中起重要作用，受感染的灵长类和其他野生动物是主要传染源，病毒主要以灵长类-蚊-灵长类的方式循环，病毒流行可长期循环存在，主要流行于雨季，旱季时减轻。在亚洲CHIKV主要以城市型模式流行，病人和隐性感染者为主要传染源，病毒主要以人-蚊-人的方式循环，流行以不定期的暴发为主。

人群普遍易感，在易感人群中病毒感染率可高达40-85％，隐性感染患者所占感染者的比例还不清楚，2006年印度报告130多万CHIK病例，但无症状感染的比例很低，并首次出现死亡病例。虽然直接由CHIKV引起死亡的病例很少，但是在CHIK流行期人群月报告死亡率明显高于非流行期，提示基孔肯亚热可能增加其他疾病的病死率。CHIK流行造成当地严重的公共卫生负担，在印度洋地区发生的大暴发中患者平均误工时间为35天，多于60％患者发病急性期过后有约18个月的持续性关节痛。除了经输血传播外，没有人传人的报道，孕妇围产期后期感染病毒可发生母婴传播引起新生儿感染，但没有经母乳传播病毒的证据。在蚊中病毒可通过交配由雄蚊传播给雌蚊，也可以经卵传播给幼蚊。在登革热和基孔肯亚热共同流行地区常有人同时感染CHIKV和登革病毒。

感染CHIKV后，从出现临床症状开始，病毒血症期大约为7天[29-30]，病毒血症期的感染者进入具有传播媒介地区可导致地方性流行甚至大暴发。最典型的例子是2004年肯尼亚CHIK暴发，病毒输入亚州，适应了当地蚊媒并传播，引发了大暴发，迄今报告病例超过300万。意大利、法国等非流行地区出现本土传播，造成暴发。控制措施严格的新加坡也由于输入性病例曾数次引起本土大规模暴发，但由于及时明确传播媒介，采取妥善措施，使疫情迅速得到控制。在我国，曾经在云南、海南等地患者、媒介生物和蝙蝠中分离到疑似CHIKV病毒，并在人以及部分哺乳动物血清中检测到抗体，首个明确的输入性病例是2008年由斯里兰卡传入的，属印度洋流行株，没有引起本地传播，但是2010年在广东省东莞地区发生了较大规模的暴发，报告200多病例。

和其他RNA病毒相似，CHIKV可以通过基因的多样性和改变宿主来实现适应性进化。城市型流行的病毒基因组核苷酸替代突变的发生率明显高于丛林型动物间流行的病毒，可能两种疫源地病毒传播模式和进化机制不完全相同。2005年ECSA型CHIKV传入亚洲，病毒包膜蛋白E1发生A226V替代突变，白蚊伊蚊取代埃及伊蚊成为主要媒介，引发了大暴发。E1-A226V没有改变病毒的毒力，但是增加了CHIKV对白蚊伊蚊的感染性，提高了病毒在白蚊伊蚊中扩增和传播的能力，缩短了病毒在媒介中的外潜伏期，外潜伏期的缩短使感染了病毒的伊蚊更快的具有传染性。埃及伊蚊对CHIKV高度易感，吸食带毒血液2天后蚊虫唾液即具有感染性，但是对于E1-226V突变株，白蚊伊蚊的传播效率略高于埃及伊蚊。另外，CHIKV E2蛋白G60D的替换突变也是影响两种蚊媒病毒感染性的重要因素，但是对于E1-A226V突变株对白蚊伊蚊的感染性影响轻微，E2-I211T突变则显著影响E1-A226V突变株对白蚊伊蚊感染性，相反对埃及伊蚊没有明显的影响。因此，进行病毒的分子遗传学特性以及蚊媒种类监测对于加强疫情预测和控制具有重要的意义。

随着全球化进展，物流人流的交换更加快捷频繁，非本土动、植物引入日益增多，一些媒介昆虫分布的地理界限被打破，能够在很短的时间内进行长距离迁移，如果能够适应当地的环境，就会形成一个新的分布区域。在过去50年，伊蚊在全球的分布范围不断扩大，白蚊伊蚊已经扩散到全球所有的大陆并适应了大部分地区的环境。在我国，埃及伊蚊主要分布于台湾南部、海南以及福建、广东和广西的部份沿海地区，云南边境地区也发现该蚊存在。白纹伊蚊的分布范围广泛，北至辽宁，西北至陕西，西南至西藏，北纬34°以南更常见。一些虫媒病毒存在对不同地域蚊虫的易感性不同的现象，在传播虫媒病毒的效率上也存在差异，某特异蚊媒群落可能具有较高的媒介能力。其他国家多起病原输入，适应媒介，引起暴发的先例，为我国虫媒传染病防治敲响了警钟。国内存在多种多样的媒介传播体系，如果新的病原引入，就有疫情暴发流行的可能，传染病疫情报告不完整不及时更增加这种风险。为了减少风险，医疗卫生部门应该增强识别、诊断和报告CHIK的能力和意识。

人感染CHIKV，潜伏期2-12天，一般为3-7天，临床以突起发热、可达39-40℃，头痛、疲乏、恶心、呕吐、肌痛、出疹和关节痛为主要特征。热程一般为3-7天，部分病人呈双相热，大部分病人关节痛在1-3周获得缓解，但是部分患者的关节炎等慢性症状可持续数月至数年，有呈风湿性关节炎症状持续15年的报道。CHIKV感染多呈对称性累及远端关节，老年人、有风湿性或外伤性关节病的人易转为慢性关节病，青少年患者较少有慢性风湿性关节炎的表现。无规律复发，关节失能是CHIKV引起关节病的主要特征。极少数病例还会出现神经系统症状，视觉改变和出血等症状。

目前用于诊断基孔肯亚热的实验室方法主要有病毒分离、核酸检测和血清学检测。按照我国卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》的规定，病毒分离应在BSL-3级实验室中进行，灭活血清、核酸和血清学检测可在BSL-2级实验室中。

人感染CHIKV后有短暂的高病毒血症期，通常第二天即可检测到，血清中病毒载量常可达109PFU/ml。处于病毒血症期的标本可以用C6/36、Vero细胞或接种动物进行病毒分离。分离到病毒是实验室确诊CHIK的金标准，但是费时长。一般2天内采集的标本进行病毒分离最敏感，发病5天后仍可分离到病毒但敏感性降低。检测到病毒特异性核酸也可以达到实验室确诊的目的，近年来已有针对不同靶点的多种检测方案发表，具有较高敏感性和特异性，但仅适用于病毒血症期的标本。

血清学方法包括空斑减少中和实验、免疫荧光法、胶体金免疫层析和ELISA等。虽然有很多实验室建立了检测病毒特异性抗体的方法，但是商业化检测试剂盒很少，德国欧蒙公司(EUROIMMUNAG)的基于病毒感染细胞制备抗原片的的间接免疫荧光法，该方法的建立需要高等级生物安全实验室等硬件条件并存在一定的生物安全隐患，美国CTK生物技术公司的胶体金法快速检测IgM抗体是基于CHIKV单个蛋白抗原。

CHIKV感染一般发病2天以后ELISA方法可以检测到IgM抗体，可持续数周到3个月，IgG可在恢复期血清标本中检测到，可持续存在数年。但是有报道指出在发病前3天难以检测到特异性抗体，有的患者发病一周后才能检测出，因此结合病毒感染各项指标的动态变化，发病5天内的急性期患者血清标本应首先开展病毒核酸检测，若早期血清标本特异性抗体检测阴性，应继续采集标本开展多次检测。同时研究发现，不同的检测试剂盒对不同病毒株引发的流行检测敏感性不同。双份血清检测中，如果恢复期较急性期血清中病毒特异性抗体有4倍或以上升高则能够进行实验室确诊。

免疫学方法检测到病毒抗原，也具有实验室确诊的意义，相关的报道较少。有利用直接ELISA的方法检测患者血清中抗原的敏感性和特异性可达85％和89％，检测脑脊液样本中抗原可达80％和87％，较检测其中IgM(48％)和IgG(63％)抗体更敏感。病毒样颗粒(VLPs)是一种不含病毒核酸的假病毒颗粒，完全没有感染性成分，只是具有灭活病毒或减毒活疫苗病毒颗粒衣壳的真实构象，它以一个更接近真实构象的形式呈递病毒抗原，更容易被机体免疫系统识别，并且没有病毒毒力回复或病毒基因重组或重配的可能。正是基于其具有免疫原性强及安全等特点，VLPs成为人们探索理想的病毒性病原体疫苗和免疫学检测试剂首选。由于E2及E1蛋白均为糖蛋白，而E.coli表达系统本身具有局限性，即缺少蛋白质后修饰功能，使得表达产物不能糖基化。因此，在真核表达系统中表达有利于蛋白功能的实现。

发明内容

本发明的第一目的是提供编码基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备。

本发明的第二目的是提供基孔肯雅病毒病毒样颗粒的应用。

为了实现本发明目的，本发明的编码基孔肯雅病毒病毒样颗粒的基因，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。例如在Seq ID No.1中3374核苷酸由C变为T导致1125位氨基酸由Ala变为Val，或在序列的末端添加序列如编码6个组氨酸的标签。

本发明还提供含有编码基孔肯雅病毒病毒样颗粒的基因的载体。优选地，所述载体为昆虫细胞表达载体。更优选地，所述载体为pAcGP67B。

本发明还提供含有上述重组载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为昆虫细胞。更优选地，所述宿主细胞为SF9细胞。

本发明还提供上述基因编码的基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法，前述的基因克隆到杆状病毒表达载体中，到的重组表达载体与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞，并使其分泌表达基孔肯雅病毒病毒样颗粒，具体包括如下步骤：

1)采用RT-PCR技术从SD08pan株(全基因序列发布于GenBank，编号GU199351)中获得基孔肯雅病毒结构蛋白C-E3-E2-6K-E1编码基因元件；2)步骤1)获得的将基孔肯雅病毒的C-E3-E2-6K-E1基因元件分别克隆入杆状病毒表达载体中；3)用2)中得到的重组表达载体与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞，并使其分泌表达基孔肯雅病毒病毒样颗粒。

具体地，本发明一方面提供了经基因特性分析和分泌表达设计而改造的CHIKV的C-E3-E2-6K-E1基因元件，其是采用RT-PCR技术获得了SD08pan株的C-E3-E2-6K-E1蛋白编码基因序列。SD08Pan株与近年来引发印度洋地区大流行的CHIKV属同一基因型，是我国在首个输入性病例中成功分离病毒的毒株，其基因序列已经发布于GenBank。为了实现CHIKV VLPs的分泌表达，本发明对CHIKV的C-E3-E2-6K-E1基因元件进行分泌表达设计并通过分子克隆技术在C-E3-E2-6K-E1基因5’段引入GP67B信号肽编码序列。

本发明的另一方面，提供了能够分泌表达CHIKV VLPs重组载体。其是通过特异的限制性酶切位点BamHI及NotI，将上述的基孔肯雅病毒基因元件克隆入表达载体pAcGP67B(BD，USA)中。

进一步地，本发明将上述重组表达与杆状病毒线性DNA(″BaculoGold^TM baculovirus DNA″，Pharmingen，San Diego，CA)载体转染SF9细胞，5天后收获转染细胞及表达上清，即为第一代重组杆状病毒。按照1∶10的比例将第一代杆状病毒感染新鲜准备单层SF9细胞。5天后收获转染细胞及表达上清，即为第二代重组杆状病毒。同此，收获第三代重组杆状病毒。经间接免疫荧光IFA检测，CHIKV基因C-E3-E2-6K-E1在细胞内均获得表达。以第三代病毒为种子感染悬浮培养的SF9细胞，感染复数(multiply of infection，MOI)约为1～2。通过和Western blot方法检测检测表达上清，CHIKVVLPs有效分泌到上清中。

本发明的还提供了一种基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法。其是将上述的上述携带有CHIKV结构蛋白编码基因的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，4～5天后收获细胞上清，离心去除细胞碎片后进行高倍浓缩，采用20-60％蔗糖密度梯度离心法对VLPs进行纯化，并利用SDS-PAGE及Western blot对纯化的VLPs进行鉴定。

进一步地，本发明用所制备的VLPs免疫Balb/c小鼠，能产生抗CHIKV的特异抗体，且抗体具有一定的中和活性，为基孔肯雅病毒疫苗研制奠定了基础。

另一方面，本发明用所制备的VLPs包被96孔ELISA板后，加入适当稀释的患者血清样本，结合商业化的辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体，能够特异性检测出临床样本中CHIKV特异性IgG抗体。

再一方面，本发明用所制备的VLPs免疫昆明鼠，制备高免疫多克隆腹水，能产生抗CHIKV的特异抗体，且抗体具有一定的中和活性，纯化后标记辣根过氧化物酶，结合商业化的抗人μ链多克隆抗体包被的96孔ELISA板，加入适当稀释的患者血清样本，加入纯化的VLPS和所制备的辣根过氧化物酶标记的多克隆腹水，能够特异性检测出临床样本中CHIKV特异性IgG抗体。

本发明首次在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中分泌表达CHIKVVLPs，并对免疫效果和对临床血清样本免疫学检测中的应用进行初步研究，为基于VLPs的疫苗和免疫学检测试剂研制奠定了基础。

本发明中建立了基于CHIKV全部结构蛋白重组表达装配而成的VLPs的免疫学检测方法无论是在生物安全特性、免疫原性以及抗原结构特性方面均具有前者无可比拟的优势。目前，国内研究中尚未发现有在真核系统中分泌表达基孔肯雅病毒病毒样颗粒研究的报道。

附图说明

图1是本发明带有GP67B信号肽编码序列及C-E3-E2-6K-E1基因全长的pAc-GP67B-CHIKV C-E1重组载体结构示意图。

图2是本发明含有pAc-GP67B-CHIKV C-E1重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞的免疫荧光鉴定图，其中A和B分别代表携带和未携带重组CHIKV结构蛋白基因的杆状病毒感染的SF9细胞与商业化CHIKV抗血清的反应结果。

图3A是本发明将含有pAc-GP67B-CHIKV C-E1重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞后的表达上清经浓缩和超速离心纯化后，进行SDS-PAGE和用商业化CHIKV特异性抗血清血清进行western blot检测结果，其中泳道1是商业化预染色的蛋白质分量标识物，泳道2为纯化后CHIKV VLPs，其中分子量约为50kDa的条带代表CHIKV膜蛋白E2和E1，分子量约为30kDa的条带代表CHIKV衣壳蛋白。

图3B是本发明将含有pAc-GP67B-CHIKV C-E1重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞后的表达上清经浓缩和超速离心纯化后，和用商业化CHIKV特异性抗血清血清进行western blot检测结果，其中泳道1是商业化预染色的蛋白质分量标识物，泳道2为不含CHIKV重组结构蛋白编码基因的杆状病毒感染SF9细胞上清浓缩物，泳道3为浓缩超离纯化后的CHIKV VLPs。

图4是本发明超速离心纯化后CHIKV VLPs的透射电镜鉴定图。

图5是本发明CHIKV VLPs及PBS免疫Balb/C小鼠后，IFA法检测小鼠血清抗CHIKV IgG检测结果比较，A为VLPs免疫Balb/C小鼠血清经1∶320稀释后IFA检测CHIKV抗原片的结果，B为PBS免疫Balb/C小鼠血清经1∶10稀释后阴性对照IFA检测CHIKV抗原片的结果。

图6是本发明CHIKV VLPs及PBS免疫Balb/C小鼠后，微量中和法检测小鼠血清中抗CHIKV特异性中和性抗体的检测结果比较，^*P＜0.01，具有显著性统计学差异。

图7本发明CHIKV VLPs免疫昆明鼠后，ELISA检测所制备多克隆腹水CHIKV特异性抗体的检测结果与PBS阴性对照比较。

图8是本发明CHIKV VLPs免疫昆明鼠后，微量中和法检测多克隆腹水中抗CHIKV特异性中和性抗体水平与PBS比较的检测结果，^*P＜0.01，具有显著性统计学差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1CHIKVC-E3-E2-6K-E1基因元件的改造

一、CHIKV的培养及细胞总RNA提取

将CHIKV SD08Pan株(根据Kui Zheng等，Genetic analysis ofchikungunya viruses imported to mainland China in 2008，VirologyJournal 2010，7：8公开的方法分离)毒种液分别接种于贴壁长满的Vero细胞，待细胞病变达+++～++++时，采用Trizol试剂法提取细胞总RNA。

LS试剂为美国Invitrogen公司产品。

二、CHIKV C-E3-E2-6K-E1基因元件的改造

采用Thermo Script^TM RT-PCR System(美国Invitrogen)将CHIKV的RNA反转录合成cDNA第一链。通过PCR的方法对基因进行改造，引入限制性酶切位点，BamHI(GGATCC)及NotI(GCGGCCGC)。

PCR所用引物如下：(请提供序列)

pAcgpCHIKC-BamHI-F1：

ATTGGGATCCATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC

pAcgpCHIKE1-NotI-R1：

AACAAGCGGCCGCTTAGTGCCTGCTGAACGACACG

PCR体系及条件(采用罗氏试剂盒：PCR Grade Nucleotide Mix)

体系：ddH₂O 35μl；10×缓冲液5μl；DMSO 2.5μl；2.5mM eachdNTP 2μl；10μM引物F、R各2μl；模板1μl；酶0.5μl。

条件：

实施例2能够分泌表达CHIKV VLPs的重组载体的构建及鉴定

一、CHIKV VLPs的重组载体的构建

将实施例1中经过PCR扩增的片段经BamHI和NotI双酶切后回收目的片段，与经同样双酶切的pAcGP67B载体定向连接，连接产物转化E.coli DH5α(美国Stratagene公司产品)感受态细胞，挑取单克隆接种含有抗生素的LB培养基进行37℃振荡培养12小时，质粒经小量制备后酶切及测序鉴定。选取鉴定正确的质粒分别命名为pAcGP67B-CHIKV C-E1(图1)。

二、重组载体与杆状病毒线性DNA共转染SF9昆虫细胞

转染前2小时用sf-900II无抗生素培养基(Gibco)将SF9细胞(ATCC，CRL-1711，购自美国典型培养物保藏中心)传至6孔板中，待细胞贴壁后转染。将0.5μg杆状病毒线性DNA(BD，USA)和2μgpAcGP67B-CHIKV C-E1重组质粒混合后，室温孵育5min，加入100μl无抗生素无血清sf-900II培养基，另取一管加入100μl无抗生素无血清sf-900II培养基并加入9μl cellfectin(Invitrogen，USA)混匀，然后将两管溶液混合，并轻轻混匀，室温孵育30分钟后加入800μl无抗生素无血清sf-900II培养基轻轻混匀，取出细胞，小心去掉细胞培养上清，然后将上述含有重组质粒、杆状病毒线性DNA和转染试剂的混合液轻轻加入6孔板细胞上，27℃孵育5hr后去除，加入正常昆虫细胞生长培养基。

转染一周后收入转染细胞上清，即为第一代重组杆状病毒。按照1∶10的比例用第一代重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，观察细胞病变情况，约在4-5天的时候收获细胞上清保存，即为第二代重组杆状病毒，收获细胞进行间接免疫荧光检测，依上述程序可同样制备具有更高重组病毒滴度的第三代重组杆状病毒毒种。

三、CHIKV VLPs的间接免疫荧光鉴定

将用第一代重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞上清轻轻吸出暂时保存于4℃。将细胞吹下后用PBS洗2遍。细胞重悬于PBS中，制备抗原片，丙酮固定10min。以基孔肯雅病毒异性抗血清(欧蒙公司，德国)为一抗(1∶10)，FITC标记的抗人多克隆抗体为二抗(1∶100；Sigma)，荧光显微镜下观察抗原片。结果在荧光显微镜下能观察到特异荧光，正常SF9细胞不与抗血清反应。结果如图2所示。

实施例3CHIKV VLPs的制备、鉴定及免疫原性实验

一、CHIKV VLPs的制备及鉴定

将收获的第三代重组杆状病毒毒种感染2L悬浮培养的SF9细胞细胞密度约为10⁸/mL，感染三天后，每12小时观察细胞病变情况，当20-30％细胞产生病变时，收获细胞培养上清，高倍浓缩至约100mL后采用15％蔗糖垫层进行30000g超速离心4h沉淀VLPs。用3mL含300mM NaCl的PBS溶液重悬沉淀，采用20％-60％蔗糖密度梯度离心法对VLPs进行纯化，抽取各层条带进行SDS-PAGE和Western blot检测。

取40μl分离物加10μl 5×蛋白上样缓冲液，95℃加热10min，进行SDS-PAGE电泳，其中一块凝胶进行考马斯亮蓝染色，另一块凝胶经半干电转法，将蛋白转移到PDVF膜上，以CHIKV特异性多克隆抗血清为一抗(1∶10)，HRP标记的羊抗人血清为二抗(1∶1000，美国Sigma)，DAB显色。结果如图3A所示CHIKV VLPs的SDS-PAGE鉴定图中，约50kDa大小的条带与CHIKV E2和E1蛋白预期大小一致，约30kDa大小的条带与CHIKV C蛋白预期大小一致。这一电泳分析结果与图3B中CHIKV特异性抗血清检测的western-blot条带一致，显示在30kDa和50kDa大小的位置出现特异性条带，而阴性对照细胞中没有相应条带。

二、CHIKV VLPs初步免疫原性实验

1、免疫方案：4-6周龄Balb/c小鼠，在0、7、28天注射CHIKV VLPs，1×PBS作为阴性对照。

2、IFA检测血清抗CHIKV抗体。

a.抗原片：CHIKV感染Vero细胞，经丙酮固定；

b.将收集的小鼠血清用5％的脱脂奶进行稀释，从1∶10开始，作2倍系列稀释，按20μl/孔加入抗原片中，37℃孵育30min，PBST洗板6次；

c.加入二抗：FITC标记的羊抗鼠IgG用5％脱脂奶按1∶100稀释，20μl/孔，37℃孵育30min，PBST洗板6次；

d.荧光显微镜观察特异性荧光(图4)，图4为CHIKV VLPs、及PBS免疫Balb/C小鼠后，鼠血清抗CHIKV IgG检测结果比较，其中PBS为PBS免疫Balb/C小鼠阴性对照，CHIKV VLPs代表CHIKV VLPs免疫Balb/C小鼠。

3、中和试验检测血清的中和活性

a.将Vero细胞传代至96孔板，待细胞长至单层；

b.将收集的小鼠免疫血清于56℃灭活30min，过0.45μm滤膜；

c.将灭活血清用Eagle’s维持液(含1％FBS，1％P.S，1％G，2％Na⁺)从1∶5开始，依次作2倍的倍比稀释，与100TCID50的CHIKV按1∶1混合，37℃温育1h；

d.吸出96孔板中的培养液，用维持液洗1次；

e.按200μl/孔加入中和血清，每个稀释度作4个复孔；

f.37℃，5％CO₂条件培养，逐日观察病变，共观察7天；

g.以四个复孔均不出现可观察到的细胞病变的血清稀释度作为抗体中和效价，结果如图5所示，CHIKV VLPs能诱导宿主动物产生中和活性的抗体。

三、CHIKV VLPs多克隆高免腹水的制备

1、免疫昆明鼠：4-6周龄昆明鼠，在0、7、14、28、35和42天注射CHIKV VLPs，1×PBS作为阴性对照。首次注射采用完全福氏佐剂，其余免疫均采用非完全福氏佐剂。血清中抗体滴度超过1∶6400时注射S180细胞，每天观察腹水生长情况及时收集腹水。

2、ELSIA检测腹水中抗CHIKV抗体

a.抗原包被：以纯化的灭火CHIKV为抗原，按200ng/孔加入96孔板中，4℃过夜；

b.每孔加入300μl无菌PBS配制的5％脱脂奶，37℃封闭2h，PBST洗板3次；

c.将收集的腹水用5％的脱脂奶进行稀释，从1∶100开始，作4倍系列稀释，按100μl/孔加入96孔板中，37℃孵育1h，PBST洗板6次；

d.加入二抗：HRP标记的羊抗鼠IgG用5％脱脂奶按1∶2000稀释，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板6次；

e.显色：加底物A液、B液(购自万泰生物药业)每孔50μl，避光放置10min。2N H2S0450μl终止反应。

f.酶标仪检测A450，结果如图6所示。图6为CHIKV VLPs及PBS免疫昆明鼠后，腹水中抗CHIKV IgG检测结果比较，其中PBS为PBS免疫Balb/C小鼠阴性对照，CHIKV-VLPs代表CHIKV VLPs免疫昆明鼠腹水。

3、中和试验检测腹水中的中和抗体活性。操作过程同上实施例3中和试验检测血清的中和活性的方法。如图7所示腹水中的多克隆抗体具有特异中和CHIKV病毒的活性。

实施例4基于CHIKV VLPs的免疫学检测

1、临床样本收集。目前我国不存在CHIKV流行，临床血清样本很少，如表1所示本发明中收集到近年来由马来西亚、斯里兰卡等国输入我国的基孔肯雅热病例的血清样本12份，从德国欧蒙公司购买的CHIKV感染者标准血清10份，肾综合征出血热患者血清30份，健康人血清30份用于对基于CHIKV VLPs的免疫学检测方法进行评价。

表1所收集血清样本数量及组成

2、基于CHIKV VLPs的间接ELISA方法检测临床血清样本中特异性IgG抗体，与依据德国欧蒙公司商业化检测试剂盒IIFA-IgG进行比较。

a.抗原包被：表达纯化的CHIKV VLPs为抗原，按200ng/孔加入96孔板中，4℃过夜；

b.每孔加入300μl无菌PBS配制的5％脱脂奶，37℃封闭2h，PBST洗板3次；

c.将收集的临床血清样本用5％的脱脂奶按1∶100进行稀释，按100μl/孔加入96孔板中，37℃孵育1h，PBST洗板6次；

d.加入二抗：HRP标记的羊抗人IgG用5％脱脂奶按1∶1000稀释，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板6次；

e.显色：加底物A液、B液(购自万泰生物药业)每孔50μl，避光放置10min。2N H₂S0₄50μl终止反应。

f.酶标仪检测A₄₅₀，临界值设为三个阴性对照孔A₄₅₀值的均数加3倍标准差。检测结果如表2所示，具有较高的灵敏性和特异性，各项性能指标与欧蒙公司商业化IgG检测试剂盒高度相关，kappa值为0.87(表3)，检测灵敏性优于基于间接免疫荧光法的欧蒙公司商业化IgG检测试剂盒。

表2CHIKV VLPs IgG-ELISA与欧蒙公司IIFA-IgG检测结果

表3与商业化试剂盒相比VLPs IgG-ELISA性能指标

检测方法	VLPs-IgG-ELISA
		灵敏度	100.00％
特异性	93.75％
		假阳性率	6.25％
假阴性率	0.00％

阳性预测值	100.00％
		阴性预测值	81.82％
准确度	95.12％
		Kappa值	0.87

3、基于CHIKV VLPs的MacELISA方法检测临床血清样本中特异性IgM抗体，与依据德国欧蒙公司商业化检测试剂盒IIFA-IgM进行比较。

a.抗原包被：Sigma公司抗人μ链多克隆抗体按500ng/孔加入96孔板中，4℃过夜；

b.每孔加入300μl无菌PBS配制的5％脱脂奶，37℃封闭2h，PBST洗板3次；

c.将收集的临床血清样本用5％的脱脂奶按1∶100进行稀释，按100μl/孔加入96孔板中，37℃孵育1h，PBST洗板6次；

d.加入CHIKV VLPs抗原100μl、200ng/孔，37℃孵育1h，PBST洗板6次；

e.加入HRP标记的经CHIKV VLPs免疫制备的鼠腹水纯化后的多克隆抗体，用5％脱脂奶按1∶200稀释，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗板6次；

e.显色：加底物A液、B液(购自万泰生物药业)每孔50μl，避光放置10min。2N H₂SO₄50μl终止反应。

f.酶标仪检测A₄₅₀，临界值设为三个阴性对照孔A₄₅₀值的均数加3倍标准差。检测结果如表4所示，基于VLPs MacELISA具有较高的灵敏性和特异性，各项性能指标与欧蒙公司商业化IgM检测试剂盒高度相关，kappa值为0.90(表5)，检测灵敏性优于基于间接免疫荧光法的欧蒙公司商业化IgG检测试剂盒。

表4VLPs-MacELISA与欧蒙公司IIFA-IgM检测试剂的检测结果

表5与商业化试剂盒相比MacELISA检测临床样本性能指标

检测方法	VLPs-MacELISA
		灵敏度	94.44％
特异性	96.88％
		假阳性率	3.13％
假阴性率	1.59％
		阳性预测值	98.41％
阴性预测值	89.47％
		准确度	96.34％
Kappa值	0.90

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种基因编码的基孔肯雅病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，将所述基因克隆到杆状病毒表达载体pAcGP67B中，得到的重组表达载体与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞SF9细胞，并使其分泌表达基孔肯雅病毒病毒样颗粒；

其中，所述基因为Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因克隆自基孔肯雅病毒SD08Pan株。

3.基因编码的基孔肯雅病毒病毒样颗粒在制备预防基孔肯雅病毒所引起的疾病的药物中的应用，其中，所述基孔肯雅病毒病毒样颗粒由权利要求1所述制备方法制得。

4.基因编码的基孔肯雅病毒病毒样颗粒在制备检测基孔肯雅病毒所感染的免疫学诊断试剂中的应用，其中，所述基孔肯雅病毒病毒样颗粒由权利要求1所述制备方法制得。

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