TWI720946B

TWI720946B - 包含改質套膜蛋白質ｅ３之類病毒粒子

Info

Publication number: TWI720946B
Application number: TW104125774A
Authority: TW
Inventors: 赤畑渉; 上野司
Original assignee: 美商Ｖｌｐ醫療股份有限公司
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2015-08-07
Publication date: 2021-03-11
Also published as: US9969986B2; CN106795513B; WO2016021209A1; TW201614067A; JP6824154B2; US20160040134A1; JP2017523796A; EP3177720A1; EP3177720B1; CN106795513A; EP3177720A4

Abstract

本發明係關於一種包含病毒結構蛋白質之類病毒粒子，該病毒結構蛋白質包含改質套膜蛋白質E3。該病毒結構蛋白質可為衍生自α病毒屬或黃病毒屬者。特別地，該病毒結構蛋白質可為衍生自屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒者。

Description

包含改質套膜蛋白質E3之類病毒粒子

本發明係關於一種包含改質套膜蛋白質E3之類病毒粒子，及其用途。

類病毒粒子(virus like particle,VLP)係模仿真實天然病毒的組織和構型但缺乏病毒基因體的多重蛋白質結構物，為潛在地產生更安全且更價廉的疫苗候選者。少數的預防性VLP系疫苗目前正全球性的商業化：GlaxoSmnithKline公司的Engerix®(B型肝炎病毒)及Cervarix®(人類乳突病毒)，以及Merck and Co.,Inc.公司的Recombivax HB®(B型肝炎病毒)及Gardasil®(人類乳突病毒)為某些實例。其他VLP系疫苗候選者正進行臨床試驗或臨床前評估，如，流感病毒、小病毒、諾瓦克(Norwalk)和各種嵌合VLP。許多其他疫苗仍侷限於小規模基礎研究，儘管其等於臨床前測試係成功的。大規模VLP製造的含意於製程調控、偵測及最適化的背景下被討論。因此主要的上游及下游的技術挑戰被鑑定及討論。隨著無論是針對治療性疫苗或預防性疫苗之嵌合VLP系技術中來自臨床試驗的最新結果以及最近的發展，成功的VLP系疫苗暢銷品(blockbusters)被簡明地呈現。

時至今日，VLP系疫苗已用於製造超過30種感染人類及其他動物的不同病毒。實例包括AAV(腺相關病毒)、H5N3(禽流感病毒)、BFDV(鸚鵡幼雛病病毒)、BTV(藍舌病病毒)、伊波拉病毒(Ebola)、腸病毒71、GHPV(鵝出血性多瘤病毒)、HBV(B型肝炎病毒)、HCV(C型肝炎病毒)、HDV(δ型肝炎病毒)、HEV(E型肝炎病毒)、HIV、HPV(人類乳突病毒)、IBDV(感染性華氏囊病)、流感病毒A、流感病毒A H1N1、流感病毒A H3N2、JC多瘤病毒屬、馬爾堡病毒(Marburg)、MS2、IPCV(印地安花生叢簇病毒)、NDV(新城病病毒)、No(諾羅病毒)Nv(諾瓦克病毒)、PhMV(酸漿花葉病毒)、多瘤病毒屬、PPV(豬小病毒)、RHDV(兔出血疾患病毒)、輪狀病毒、SARS、SIV(猴免疫缺陷病毒)、SV40(猴病毒40)、SVDV(豬水泡疾患病毒)等。(Expert Rev.Vaccines 9(10),1149-1176,2010)。

為了快速產生大量VLP或疫苗用於臨床前及臨床試驗，幾乎所有藥物開發會面臨產生高安定製造者的相同挑戰障礙。開發及鑑定安定細胞株為開發的重要部分。然而，產生具有高效價以及良好製造品質的安定細胞株時至今日仍非屬易事。

自從屈公病病毒(chikungunya virus,CHIKV)於200年再次出現於肯亞後，此α病毒已於非洲、歐洲及亞洲感染數百萬人。該疾患的嚴重性以及流行病毒的散播於缺乏疫苗或抗病療法的情況下，呈現嚴重的公共衛生健康威脅。已有報導對於流行性屈公病病毒的VLP疫苗保護非人類靈長類對抗感染(Nat Med.2010 March；16(3)：334-338)。美國專利公開案號2012/0003266揭示包含一種或多種屈公病病毒結構蛋白質的類病毒粒子(VLP)，其有用於調配對於屈公病的疫苗組成物或抗原性組成物，其誘發免疫性以感染或其至少一種症狀。專利WO2012/106356揭示改質α病毒屬或黃病毒屬之類病毒粒子(VLP)以及用於增強製造改質VLP的方法，以使用於預防或治療α病毒屬及黃病毒屬-媒介之疾患(該等引用文獻以參考方式併入本文)。

根據本申請案，提供下述者：

(1)一種包含病毒構蛋白質的類病毒粒子，該病毒結構蛋白質包含改質套膜蛋白質E3。

(2)根據(1)的類病毒粒子，其中該病毒結構蛋白質係衍生自α病毒屬或黃病毒屬。

(3)根據(2)的類病毒粒子，其中該病毒結構蛋白質係衍生自屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒。

(4)根據(3)的類病毒粒子，其中該類病毒粒子係衍生自屈公病病毒株37997或株OPY-1，或委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83。

(5)根據(1)至(4)中任一項之類病毒粒子，其中套膜蛋白質E3中的一或多個胺基酸殘基係經置換、加成及/或刪除於該病毒結構蛋白質的胺基酸序列中。

(6)根據(5)的類病毒粒子，其中該一個或多個胺基酸殘基係經置換、加成及/或刪除於套膜蛋白質E3之弗林位點(furin site)的胺基酸序列中。

(7)根據(1)至(6)中任一項之類病毒粒子，其中該病毒結構蛋白質包含殼體、套膜蛋白質E1、套膜蛋白質E2及套膜蛋白質E3。

(8)根據(1)至(7)中任一項之類病毒粒子，其中至少一抗原係插入至套膜蛋白質E3。

(9)根據(8)的類病毒粒子，其中該至少一抗原係再插入至套膜蛋白質E2。

(10)根據(8)或(9)的類病毒粒子，其中該至少一抗原係經插入至對應於序列編號：1之321及326的殘基之間，序列編號：2之殘基321及326之間或序列編號：3之殘基330及335之間。

(11)根據(8)至(10)中任一項之類病毒粒子，其中該至少一種抗原係衍生自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)環子孢子蛋白質、PD-1、PD-L1、CTLA-4、DISC1、IL-2、HER2、BTLA或HVEM。

(12)根據(11)的類病毒粒子，其中選自(NPNA)n(n=4-30)、序列編號：6至9及15至29所代表之胺基酸序列的胜肽係插入至套膜E3蛋白質。

(13)根據(8)至(12)中任一項之類病毒粒子，其中該類病毒粒子為類屈公病病毒粒子，包含下述胺基酸序列或對下述序列具有90%或更高同一性之胺基酸序列：殼體係由序列編號：31或序列編號：75所代表之胺基酸序列所組成；E1係由序列編號：32或序列編號：76所代表之胺基酸序列所組成；以及E2及E3之複合物係由序列編號33或序列編號77所代表之胺基酸序列所組成，其中至少一抗原的胺基酸序列係插入至對應於序列編號：2之殘基321及326的殘基之間。

(14)根據(8)至(12)中任一項之類病毒粒子，其中該類病毒粒子為類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，包含下述胺基酸序列或對下述序列具有90%或更高同一性之胺基酸序列：殼體係由序列編號：35所代表之胺基酸序列所組成；E1係由序列編號：36所代表之胺基酸序列所組成；以及E2及E3之複合物係由序列編號：37所代表之胺基酸序列所組成，其中至少一抗原的胺基酸序列係插入至對應於序列編號：3之殘基330及335的殘基之間。

(15)根據(8)至(12)中任一項之類病毒粒子，其中該類病毒粒子為類屈公病病毒粒子且該類病毒粒子的結構包含下述序列(1)至(4)中任一者或對下述序列(1)至(4)中任一者具有90%或更高同一性之胺基酸序列：(1)E1係由序列編號：32所代表之胺基酸序列所組成； E2與E3複合物，其中經瘧疾抗原插入，其由序列編號：46所代表之胺基酸序列所組成；以及殼體係由序列編號：31所代表之胺基酸序列所組成；(2)E1係由序列編號：32所代表之胺基酸序列所組成；E2與E3複合物，其中經PD-1抗原插入，其由序列編號：47所代表之胺基酸序列所組成；以及：殼體係由序列編號：31所代表之胺基酸序列所組成；(3)E1係由序列編號：32所代表之胺基酸序列所組成；E2與E3複合物，其中經PD-L1配體抗原插入，其由序列編號：48所代表之胺基酸序列所組成；以及殼體係由序列編號：31所代表之胺基酸序列所組成；或(4)E1係由序列編號：32所代表之胺基酸序列所組成；E2與E3複合物，其中經CTLA-4抗原插入，其由序列編號：49所代表之胺基酸序列所組成；以及殼體係由序列編號：31所代表之胺基酸序列所組成。

(16)根據(8)至(12)中任一項之類病毒粒子，其中該類病毒粒子為類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子且該類病毒粒子的結構包含下述序列(1)至(4)中任一者或對下述序列(1)至(4)中任一者具有90%或更高同一性之胺基酸序列：(1) E1係由序列編號：36所代表之胺基酸序列所組成；E2與E3複合物，其中經瘧疾抗原插入，其由序列編號：50所代表之胺基酸序列所組成；以及殼體係由序列編號：35所代表之胺基酸序列所組成；(2)E1係由序列編號：36所代表之胺基酸序列所組成；E2與E3複合物，其中經PD-1抗原插入，其由序列編號：51所代表之胺基酸序列所組成；以及殼體係由序列編號：35所代表之胺基酸序列所組成；(3)E1係由序列編號：36所代表之胺基酸序列所組成；E2與E3複合物，其中經PD-L1抗原插入，其由序列編號：52所代表之胺基酸序列所組成；以及殼體係由序列編號：35所代表之胺基酸序列所組成；或(4)E1係由序列編號：36所代表之胺基酸序列所組成；E2與E3複合物，其中經CTLA-4抗原插入，其由序列編號：53所代表之胺基酸序列所組成；以及殼體係由序列編號：35所代表之胺基酸序列所組成。

(17)根據(1)至(5)中任一項之類病毒粒子，其中位於套膜蛋白質E3之弗林裂解位點係經改變或經突變以預防弗林位點裂解。

(18)一種經單離的核酸分子，其包含編碼如(1)至(17)中任一項之類病毒粒子的核苷酸序列。

(19)一種經單離的核酸分子，其由對序列編號：38至45之任一者所代表的核苷酸序列具有90%或更高同一性之核苷酸序列所組成。

(20)如(19)之核酸分子，其中該核酸分子由序列編號：38至45之任一者所代表的核苷酸序列所組成。

(21)一種載體，其包含根據(18)至(20)中任一項之核酸分子，其中該載體視需要地包含操作性地連結至該核酸分子的表現調控序列。

(22)一種包含核酸分子的載體，其包含：序列編號：54或序列編號：55所代表之核苷酸序列，其中編碼至少一抗原的核苷酸序列係插入至序列編號：54之殘基963及969之間或序列編號：55之殘基990及1006之間；以及表現調控序列，其可操作性地連結至該核酸分子。

(23)一種醫藥組成物，其包含(a)根據(1)至(17)中任一項之類病毒粒子、根據(18)至(20)中任一項之核酸分子及/或根據(21)或(22)之載體；以及(b)醫藥可接受載劑。

(24)一種疫苗組成物，其包含根據(1)至(17)中任一項之類病毒粒子及醫藥可接受載劑。

(25)一種製造根據(1)至(17)中任一項之類病毒粒子的方法，其包含下述步驟：培養經(21)或(22)之載體轉染的細胞以表現該類病毒粒子；以及純化所產生的粒子。

(26)一種增強類病毒粒子製造的方法，該類病毒粒子包含病毒結構蛋白質及至少一抗原，該方法包含(1)將該至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3，以及(2)單離其中經至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3之類病毒粒子。

(27)根據(26)的方法，其中該步驟(1)係藉由包含製備核酸分子的方法達成，該核酸分子包含編碼其中經至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3之類病毒粒子的核苷酸序列；以及使用細胞使該核酸分子表現。

(28)根據(26)或(27)的方法，其中該類病毒粒子為根據(1)至(17)中任一項之類病毒粒子。

(29)一種治療或預防癌、神經疾患、感染疾患或瘧疾；製造抗體對抗於哺乳動物中之至少一抗原；調節免疫反應；免疫刺激；抑制至少一抗原之功能；或於巨噬細胞呈現抗原的方法，包含對有需要的個體投藥根據(1)至(17)中任一項之類病毒粒子、根據(18)至(20)中任一項之核酸分子及/或根據(21)或(22)之載體。

(30)一種根據(1)至(17)中任一項之類病毒粒子、根據(18)至(20)中任一項之核酸分子及/或根據(21)或(22)之載體的用途，其係用於製造醫藥組成物或套組用以治療或預防癌、神經疾患、感染疾患或瘧疾；製造抗體對抗於哺乳動物中之至少一抗原；調節免疫反應；免疫刺激；抑制至少一抗原之功能；或於巨噬細胞呈現抗原。

(31)一種表現類病毒粒子的細胞株，其中該類病毒粒子包含病毒結構蛋白質，該病毒結構蛋白質包含對套膜蛋白質E3中之弗林位點的胺基酸序列的改變/突變。

(32)根據(31)的細胞株，對弗林位點的胺基酸序列的改變為對Ile-Glu/Asp-Gly-Arg或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的改變。

(33)根據(31)或(32)的細胞株，其中該細胞株為安定細胞株。

(34)一種用於製造表現類病毒粒子的細胞株的方法，其包含下列步驟：以包含編碼病毒結構蛋白質的核酸分子的載體轉染細胞株，該病毒結構蛋白質於套膜蛋白質E3中之弗林位點係經改變為特異性蛋白酶辨識位點。

(35)根據(34)的方法，其中該弗林位點係經改變為因子Xa或腸激酶(enterokinase)辨識位點。

(36)根據(34)或(35)的方法，其中該方法提供安定的細胞株。

(37)一種製造成熟類病毒粒子的方法，其包含下列步驟：i)產生藉由根據(31)至(33)中任一項之細胞株所製造的未成熟類病毒粒子；以及ii)自該未成熟類病毒粒子移除E3。

(38)根據(37)的方法，其中該E3係藉由蛋白酶移除。

(39)根據(38)的方法，其中該蛋白酶為因子Xa或腸激酶。

(40)根據(31)的細胞株，其中該類病毒粒子為根據(1)至(17)中任一項之類病毒粒子。

第一態樣中，本申請案提供包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子。

第二態樣中，本申請案提供包含或由核苷酸序列所組成的核酸分子，該核苷酸序列編碼包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子。

第三態樣中，本申請案提供醫藥組成物及包含該醫藥組成物的套組，其中該醫藥組成物包含(i)包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子及/或(ii)包含或由核苷酸序列所組成之核酸分子，該核苷酸序列編碼包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子。

第四態樣中，本申請案提供製造包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子的方法，包含培養經表現該類病毒粒子的載體轉染的細胞；以及純化由該細胞產生的粒子。

第五態樣中，本申請案提供增強包含具有改質套膜蛋白質E3的病毒結構蛋白質的類病毒粒子之製造的方法。一具體例中，該類病毒粒子包含病毒結構蛋白質以及至少一種外源性抗原，包含：(1)將該至少一種外源性抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3，以及(2)單離其中經至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3之類病毒粒子。

第六態樣中，本申請案提供(i)包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子及/或(ii)由編碼包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子的核苷酸序列所組成的核酸分子的用途，用於製造醫藥組成物或套組用以治療或預防癌、神經疾患、感染疾患或瘧疾；製造抗體對抗於哺乳動物中之至少一抗原；調節免疫反應；免疫刺激；抑制至少一抗原之功能；或於巨噬細胞呈現抗原。

所有態樣中，套膜蛋白質E3可經改質為包含至少一抗原或對弗林位點的胺基酸序列的改變/突變。

第七態樣中，本申請案提供表現病毒結構蛋白質且可產生類病毒粒子的細胞株，其中該病毒結構蛋白質包含於弗林位點的胺基酸序列的改變/突變點，以及其製造方法。

第八態樣中，本申請案提供用於製造成熟類病毒粒子的方法，其包含下述步驟：i)產生藉由上述細胞株所製造之未成熟類病毒粒子；ii)自該未成熟類病毒粒子移除E3。

第1圖顯示CHIKV或VEEV病毒結構蛋白質的結構。

第2圖顯示具有改質E3與E2套膜蛋白質的病毒結構蛋白質之表現載體的代表性結構。

第3圖顯示西方墨漬法的結果。NAPA的CSP重複序列，其為衍生自惡性瘧原蟲環子抱子蛋白質的抗原，係插入至委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)(株TC-83)的類病毒粒子的E2或E3。表現於293F細胞的抗原-衍生VEEV類病毒粒子係使用小鼠抗-VEEV抗體(1：1000)藉由西方墨漬法確認。

74：瘧疾CSP重複抗原(重複x6)

76：瘧疾CSP重複抗原(重複X14)

78：瘧疾CSP重複抗原(重複X25)

該圖中，“74”表示經插入之抗原為6XNPNA，“76”表示經插入之抗原為14XNPNA，以及“78”表示經插入之抗原為25XNPNA；以及“21”表示抗原經插入至E2以及“26”表示抗原經插入至E3。

第4圖顯示西方墨漬法的結果。小鼠瘧疾CSP重複抗原係經插入至委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)(株TC-83)的類病毒粒子的E2或E3。表現於293F細胞的抗原-衍生VEEV類病毒粒子係使用小鼠抗-VEEV抗體藉由西方墨漬法確認。該圖中，“261.25”表示包含其中經小鼠瘧疾CSP重複抗原插入之E2的VEEV VLP，以及“261.66”表示包含其中經小鼠瘧疾CSP重複抗原插入之E3的VEEV VLP。

第5圖顯示西方墨漬法的結果。CSP重複序列、瘧疾pfs25功能域1抗原決定基或瘧疾pfs25功能域2抗原決定基(epitope)係插入至委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)(株TC-83)的類病毒粒子的E2或E3。表現於293F細胞的抗原-衍生VEEV類病毒粒子係使用小鼠抗-VEEV抗體藉由西方墨漬法確認。該圖中，“74”表示經插入之抗原為瘧疾CSP重複抗原決定基，“302R”表示經插入之抗原為瘧疾pfs25功能域1抗原決定基，以及“303R”表示經插入之抗原為瘧疾pfs25功能域2抗原決定基；以及“21”表示抗原插入至E2以及“66”表示抗原插入至E3。

第6圖顯示西方墨漬法的結果。PD-1抗原決定基或PD-L1抗原決定基係插入至屈公病病毒(CHIKV)(株37997)的類病毒粒子的E2或E3。表現於293F細胞的抗原-插入CHIKV類病毒粒子係使用小鼠抗-CHIKV抗體藉由西方墨漬法確認。該圖中，“274.11”表示包含其中經PD-1抗原決定基插入之E2的CHIKV VLP，“274.56”表示包含其中經小鼠PD-1抗原決定基插入之E3的CHIKV VLP，“299.15”表示包含其中經PD-L1抗原決定基插入之E2的CHIKV VLP，以及“299.56”表示包含其中經小鼠PD-L1抗原決定基插入之E3的CHIKV VLP。

第7圖顯示西方墨漬法的結果。瘧疾CSP重複抗原決定基係插入至屈公病病毒(CHIKV)(株37997)的類病毒粒子的E2或E3。表現於293F細胞的抗原-插入CHIKV類病毒粒子係使用小鼠抗-CHIKV抗體藉由西方墨漬法確認。該圖中，“74.11”表示包含其中經瘧疾CSP重複抗原決定基插入之E2的CHIKV VLP，“74.16”表示包含其中經插入小鼠瘧疾CSP抗原決定基之E3的CHIKV VLP。

第8圖顯示來自瞬時轉染之關於CHIKV未成熟構築體之西方墨漬法的結果。

第9圖顯示來自瞬時轉染之關於VEEV未成熟構築體之西方墨漬法的結果。

第10圖顯示當抗原插入至E3及插入至E2與E3二者(雙重)時，製造出DISC1_451、_452及_454-經插入之VLP的西方墨漬結果。

第11圖及第12圖顯示當該等抗原插入至E3時，製造出人類IL-2野生型、人類IL-2突變體、小鼠IL-2野生型及小鼠IL-2突變體-經插入之VLP的西方墨漬結果。

第13圖顯示PCR的結果，表示以對照VLP免疫的10隻小鼠中，9隻小鼠受到瘧疾感染；以包含經瘧疾CSP 4X重複插入之套膜蛋白質E2與E3二者的屈公病病毒VLP(261.261 VLP)免疫的10隻小鼠中，9隻小鼠未受到瘧疾感染；以及以包含經瘧疾CSP 14X重複插入之套膜蛋白質E2與E3二者的屈公病病毒VLP免疫的10隻小鼠中，9隻小鼠未受到瘧疾感染。

第14圖顯示ELISA的結果，表示E3-經插入以及E2-與E3-經插入之VLP具有效價較高於E2-經插入之VLP。

第15圖顯示西方墨漬，表示製造出hHER2-經插入之VLP。

第16圖顯示ELISA的結果，表示E2-與E3-經插入之VLP具有效價較高於E2-經插入之VLP。

第17圖顯示藉由使用包含hBTLA抗原之 CHIKV-VLP獲得單株抗體。

第18圖顯示西方墨漬法的結果，表示當該等抗原插入至E3時，製造出經人類hHVEM插入的VLP。

第19圖顯示表現於其E3套膜蛋白質的弗林位點經改質的未成熟屈公病病毒VLP的細胞株，即使培養3個月後仍能產生未成熟VLP。

第20圖顯示經小鼠PD-L1插入的VLP有效地保護小鼠免於腫瘤。

第21圖顯示西方墨漬法結果，表示製備出經CHIKV-VLP CSP重複抗原插入的VLPs。

第22圖顯示經瘧疾CSP重複抗原76插入的VLP於小鼠中刺激抗CSP抗原抗體的製造。

(1)包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子

此態樣中，套膜蛋白質E3可經改質為包含至少一抗原或對弗林位點(Arg-X-X-Arg)的胺基酸序列的改變/突變。

用語“Arg-X-X-Arg”表示弗林(furin)的最低裂解位點以及“X-X”包括任二個胺基酸。

類病毒粒子係由同時組裝至特別結構的一種或多種病毒結構蛋白質所構成。

使用於本申請案的病毒結構蛋白質可為任何病毒結構蛋白質，只要其表現弗林位點。

第七態樣中，本申請案提供細胞株，特別是表現類病毒粒子的安定的細胞株，其中該類病毒粒子包含對弗林位點的胺基酸序列的改變/突變點(Arg-X-X-Arg)，以及提供其製造方法。對弗林位點的胺基酸的改變的實例包括改變為Ile-Glu/Asp-Gly-Arg或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。

一具體例中，本申請案提供表現類病毒粒子之細胞株的製造方法，其中該類病毒粒子的弗林位點係經改變為蛋白酶辨識位點。此具體例中，藉由此方法所產生的細胞株可為安定的細胞株。例如，藉由此具體例所獲得之安定的細胞株可於相對長時間(如超過三個月)維持表現能力及產生VLP。

一具體例中，本申請案提供藉由上述細胞株所製造之未成熟類病毒粒子。

第八態樣中，本申請案提供製造成熟類病毒粒子的方法，其包含下述步驟：i)提供藉由上述細胞株所製造的未成熟類病毒粒子；ii)自該未成熟病毒粒子移除E3。

一具體例中，未成熟類類病毒粒子中的E3係藉由蛋白酶辨識位點的分解而移除。一具體例中，該未成熟類病毒粒子中的E3係藉由蛋白酶移除。蛋白酶的實例包括，但不限於，Arg-C蛋白酶、Asp-N內肽酶、Asp-N內肽酶+N-終端Glu、BNPS-糞臭素(Skatole)、凋亡蛋白酶 (Caspase)1至凋亡蛋白酶10、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶(Clostripain)(梭菌肽酶B)、CNBr、腸激酶、因子Xa、甲酸、麩胺醯基內肽酶、顆粒酶(Granzyme)B、羥基胺、氧碘苯甲酸(Iodosobenzoic acid)、LysC、LysN、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)、嗜中性彈力酶、胃蛋白酶、脯胺酸-內肽酶、PreScission蛋白酶(PSP)、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、菸草蝕紋病毒蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)、凝血酶及胰蛋白酶。蛋白酶之較佳實例包括因子Xa、腸激酶及PreScission蛋白酶(PSP)，尤其是因子Xa及腸激酶(例如，腸激酶(腸肽酶)，輕鏈)。

另一態樣中，本申請案提供包含套膜蛋白質E3的類病毒粒子，，其中套膜蛋白質E3經改質為包含至少一抗原。該至少一抗原可為非衍生自該病毒結構蛋白質所衍生來源之病毒之胜肽或為衍生自與提供該病毒結構蛋白質者為相同病毒之胜肽。

本申請案亦提供可藉由改質上述粒子而製備之上文所述類病毒粒子的衍生物。改質的實例包括，但不限於，一或多個胺基酸殘基的加成、刪除或置換。

本申請案所提供之粒子可為由下述所組成或包含下述者之粒子i)至少一種病毒結構蛋白質及ii)至少一抗原，其中該至少一抗原係插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3。該至少一種病毒結構蛋白質可由同時組裝以形成粒子的一種或多種蛋白質或肽所組成。一具體例中，由本申請案所提供之粒子具有至少10nm的直徑，例如，至少20nm，較佳為至少50nm。一具體例中，粒子的分子量係自100kDa至100,000kDa，較佳自400kDa至30,000kDa。

一或多個胺基酸殘基可經置換、加成及/或刪除於該病毒結構蛋白質的胺基酸序列中，以允許包含其中經至少一抗原插入之套膜蛋白質E3的類病毒粒子的表現。

一較佳具體例中，包含至少一抗原於套膜蛋白質E3中之由本申請案所提供之類病毒粒子，相較於包含該至少一抗原於套膜蛋白質E2中之類病毒粒子，可更有效率地表現於真核細胞中(例如，293細胞)。

使用於本申請案之病毒結構蛋白質可為衍生自α病毒屬或黃病毒屬的病毒結構蛋白質。因此，藉由本申請案所提供之粒子可為包括衍生自α病毒屬或黃病毒屬的類病毒粒子的類病毒粒子。

α病毒屬及黃病毒屬的實例包括，但不限於，奧拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest virus(BFV))、比巴魯病毒(Bebaru virus)、卡巴斯病毒(Cabassou virus)、屈公病病毒(CHIKV)、東方馬腦病毒(EEEV)、艾拉特病毒(Eilat virus)、沼澤地病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、蓋塔病毒(Getah virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、馬亞羅病毒(Mayaro virus)、米崔病毒(Me Tri virus)、米德爾堡病毒(Middelburg virus)、莫斯達斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎布病毒 (Mucambo virus)、恩杜穆病毒(Ndumu virus)、歐尼恩病毒(O'nyong-nyong virus)、皮舒納病毒(Pixuna virus)、里奧內格羅病毒(Rio Negro virus)、羅斯河病毒(Ross River virus(RRV))、鮭魚胰腺疾病病毒(Salmon pancreas disease virus)、西門利啟森林病毒(Semliki Forest virus)、辛得比斯病毒(Sindbis virus)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、圖納特病毒(Tonate virus)、特羅卡拉病毒(Trocara virus)、烏納病毒(Una virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus(WEEV))、瓦塔病毒(Whataroa virus)、西尼羅河病毒(West Nile virus)、登革熱病毒(dengue virus)、蜱傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus)及黃熱病毒。

由本申請案所提供之粒子可為衍生自屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒的類病毒粒子。屈公病病毒可為屈公病病毒株37997或株OPY-1。委內瑞拉馬腦炎病毒可為委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83。

病毒結構蛋白質可為殼體蛋白質、套膜蛋白質、其片段或其複合物。因此，使用於本申請案之病毒結構蛋白質可包含或由殼體蛋白質及/或套膜蛋白質及/或其片段或其衍生物所組成。一具體例中，由本申請案所提供之類病毒粒子包含或由殼體、E3、E2及E1蛋白質所組成，以及抗原係插入至E3。例如，由本申請案所提供之類病毒粒子可藉由組裝240殼體、240 E1蛋白質、240 E2蛋白質及240 E3蛋白質所形成，其中抗原係插入至各E3蛋白質。

於生理條件下，E3可於弗林裂解後自E2解離。一具體例中，位於E3的弗林裂解位點可經突變以預防弗林位點裂解。例如，抗原可插入至弗林裂解位點以於弗林裂解位點中導入突變。此具體例中，所提供的類病毒粒子可包含或由殼體、E3、E2及E1蛋白質所組成，其中E3係結合至E2以形成單一蛋白質且抗原係插入至E3區。例如，由本申請案所提供之類病毒粒子可藉由組裝240殼體、240 E1蛋白質、各E2經E3結合的240蛋白質而形成，且抗原係插入至各E3區。

抗原可為能藉由抗體結合或當其呈現於MHC分子時能藉由T細胞受體(TCR)結合的分子。抗原可涵蓋B-細胞抗原決定基及T-細胞抗原決定基。美國專利公開案US 2013/0251744，2013年2月15日申請，其全部內容並入本文作為參考文獻，其揭示的抗原可使用於本申請案。使用於本申請案的抗原實例包括，但不限於，過敏原、自體-抗原、不完全抗原、癌抗原、感染疾患抗原及小的有機分子、其片段及衍生物。

抗原可為天然發生及/或經改質的蛋白質、其片段、或天然發生的蛋白質的衍生物或其片段。於本申請案所提供的粒子中使用作為抗原之天然發生及/或經改質的蛋白質的片段可根據天然發生及/或經改質蛋白質的胺基酸序列及/或其三級結構而選擇。例如，使用作為抗原的片段可包含或由位於天然發生的蛋白質的表面的片段所組成。較佳地，對抗含於本申請案所提供的粒子中之抗原的抗體可抑制抗原的功能。抗原(例如，天然發生的蛋白質的片段)可為10至300個胺基酸殘基(例如，10至120、10至30或15至30個胺基酸殘基)長度。天然發生的蛋白質的衍生物或其片段可藉由加成、刪除或置換天然發生的蛋白質或其片段中的一個或數個胺基酸而製備。一具體例中，天然發生的蛋白質的衍生物或其片段對於對應的天然發生的蛋白質或其片段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列同一性。一具體例中，天然發生的蛋白質的衍生物或其片段為突變體，其中基於對應的天然發生的蛋白質或其片段，至多10%的胺基酸係經刪除、取代及/或加成。

一具體例中，抗原或抗原決定基(例如，天然發生的蛋白質的片段)可經選擇以使當抗原之N-終端殘基及C-終端殘基之間的空間距離係於抗原或含有該抗原的天然發生的蛋白質或源自其等之經改質胜肽的結晶測定時，該距離為30Å或更少。例如，使用於本申請案所提供之粒子的抗原可使用包括PyMOL(例如，PyMOL v0.99：http：/www.pymol.org)的免費軟體而設計。一具體例中，抗原之N-終端殘基及C-終端殘基之間的空間距離為30Å(埃(angstrom))或更少、20Å或更少、或10Å或更少(例如，自5Å至15Å、自5Å至12Å、自5Å至11Å、自5Å至10Å、自5Å至8Å、自8Å至15Å、自8Å至13Å、自8Å至12Å、自8Å至11Å、自9Å至12Å、自9Å至11Å、自9Å至10Å或自10Å至11Å)。

一具體例中，可使用於本申請案之抗原或抗原決定基可為瘧疾抗原、PD-1抗原、PD-1配體抗原、CTLA-4抗原、IL-2抗原DISC1抗原、HER2抗原、BTLA抗原、HVEM抗原、PCSK9抗原或DPP-4抗原。

如使用於本文，“瘧疾抗原”意指衍生自瘧原蟲的抗原或抗原決定基。瘧原蟲可選擇自任何已知的瘧原蟲(Plasmodium(P.))屬，例如，惡性瘧原蟲(P.falciparum)、三日瘧原蟲(P.malariae)、蛋形瘧原蟲(P.ovale)、間日瘧原蟲(P.vivax)、諾氏虐原蟲(P.knowlesi)、柏氏虐原蟲(P.berghei)、夏氏虐原蟲(P.chabaudi)及約氏瘧原蟲(P.yoelii)。

一具體例中，瘧疾抗原為惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質B細胞抗原決定基(後文中，稱為CSP蛋白質、瘧疾CSP蛋白質或CSP)。惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質B細胞抗原決定基的實例可為NPNA的重複序列，包括(NPNA)4-30(亦即4xNPNA、5xNPNA、6xNPNA、7xNPNA、8xNPNA、9xNPNA、10xNPNA、11xNPNA、12xNPNA、13xNPNA14xNPNA、15xNPNA、16xNPNA、17xNPNA、18xNPNA、19xNPNA、20xNPNA、21xNPNA、22xNPNA、23xNPNA、24xNPNA、25xNPNA、26xNPNA、27xNPNA、28xNPNA、29xNPNA或30xNPNA)。

一具體例中，瘧疾抗原為包括(QGPGAP)3-12的約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)環子孢子蛋白質B細胞抗原決定基。

一具體例中，瘧疾抗原為包括(ANGAGNQPG) 1-12的間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)環子孢子蛋白質B細胞抗原決定基。

一具體例中，瘧疾抗原為包括(NAAG)4-30的三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)環子孢子蛋白質B細胞抗原決定基。

一具體例中，瘧疾抗原為惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質T細胞抗原決定基。惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質T細胞抗原決定基的實例可為EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(序列編號：4)。亦可使用(EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)1-6作為瘧疾抗原。

一具體例中，瘧疾抗原為約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)環子孢子蛋白質T細胞抗原決定基，其為YNRNIVNRLLGDALNGPEEK(序列編號：5)。亦可使用(YNRNIVNRLLGDALNGPEEK)1-6作為瘧疾抗原。

如使用於本文，用語“PD-1抗原”意指衍生自PD-1的抗原或抗原決定基。較佳地，PD-1為人類PD-1。衍生自PD-1的抗原可為PD-1的片段或PD-1的片段的衍生物。

如使用於本文，用語“PD-1配體抗原”意指衍生自PD-1的配體的抗原或抗原決定基。PD-1的配體的實例包括，但不限於，PD-L1及PD-L2。較佳地，PD-1的配體為人類PD-L1或人類PD-L2.。衍生自PD-L1的抗原可為PD-L1或PD-L2的片段；或PD-L1或PD-L2的片段的衍生物。

使用作為抗原的PD-1抗原的實例包括，但不限於，lnwyrmspsnqtdklaaf(序列編號：6)、mlnwyrmspsnqtdklaafs(序列編號：7)、vlnwyrmspsnqtdklaafp(序列編號：8)、gaislhpkakiees(序列編號：9)、cgaislhpkakieec(序列編號：10)、VLNWYRMSPSNQTDKLAAF(序列編號：11)、GAISLAPKAQIKES(序列編號：12)、RNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVT(序列編號：13)及RNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVT(序列編號：14)。使用作為抗原之PD-1配體抗原的實例包括，但不限於，ciisyggadyc(序列編號：15)、CMISYGGADYC(序列編號：16)、LQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVN(序列編號：17)、LQDAGVYRAMISYGGADYKRITVKVN(序列編號：18)、DLAALIVYWEMEDKNIIQFVH(序列編號：19)、DLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGG(序列編號：20)、FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVE(序列編號：21)、Lqdagvycciisyggadykritlkvn(序列編號：22)、lqdagvyaaiisyggadykritlkvn(序列編號：23)、dllalvvywekedeqviqfva(序列編號：24)、dllalvvywekedeqviqfvagg(序列編號：25)及ftitapkdlyvveygsnvtmecrfpve(序列編號：26)。

如使用於本文，用語“CTLA-4抗原"意指衍生自CTLA-4(細胞毒性T-淋巴球相關抗原4)的抗原或抗原決定基。較佳地，CTLA-4為人類CTLA-4。衍生自CTLA-4 的抗原可為CTLA-4的片段或CTLA-4的片段的衍生物。

使用作為抗原之CTLA-4抗原的實例包括，但不限於，ggkvelmypppyfvgmgg(序列編號：27)、cattftekntvgfldypfc(序列編號：28)及attftekntvgfldypf(序列編號：29)。

如使用於本文，用語“DISC1抗原"意指衍生自DISC1的抗原或抗原決定基。使用作為抗原的DUISC1抗原的實例包括，但不限於，SGGLLIQSLQLQEARGELSVEDERQMDDLEGGS(DISC1_451)(序列編號：105)、SGGEARGELSVEDERQMDDLEGGS(DISC1_452)(序列編號：106)及SGGEARGELSVEGGS(DISC1_454)(序列編號：107)。

如使用於本文，用語“HER2抗原"意指衍生自HER2的抗原或抗原決定基。使用作為抗原的HER2抗原的實例包括，但不限於，SGGVTYNTDTFESMPGGS(序列編號：108)、SGGEYVNARHCLPGGS(序列編號：109)、SGGYVNARHCLGGS(序列編號：110)、SGGYVNARHGLGGS(序列編號：111)、SGGKFPDEEGACQPCPIGGS(序列編號：112)、SGGKFPDEEGACQPGGS(序列編號：113)、SGGKDPPFCVGGS(序列編號：114)、SGGYKDPPFCVAGGS(序列編號：115)及SGGYKDPPFCVGGS(序列編號：116)。

如使用於本文，用語"BTLA抗原"意指衍生自BTLA的抗原或抗原決定基。使用作為抗原的BTLA抗原的實例包括，但不限於，SGGCKLNGTTCGGS(序列編號： 132)。

如使用於本文，用語"HVEM抗原"意指衍生自HVEM的抗原或抗原決定基。使用作為抗原的HVEM抗原的實例包括，但不限於，SGGCVKEASGELTGTVCGGS(序列編號：133)、SGGCYRVKEASGELTGTVSEPCGGS(序列編號：134)、SGGCSRNSSRTENAVCGGS(序列編號：135)及SGGCQMSDPAMGLRSRNCGGS(序列編號：136)。

藉由本申請案所提供之粒子中，病毒結構蛋白質及抗原可經由存在於該病毒結構蛋白質之至少一第一附接位點以及存在於該抗原之至少一第二附接位點而連接。

如使用於本文，“第一附接位點”及“第二附接位點”之各者意指多於一種物質彼此連接之位點。

病毒結構蛋白質及抗原可直接或間接融合。一具體例中，一或二個連接子可插入抗原及病毒結構蛋白質的N-終端殘基之間及/或抗原及病毒結構蛋白質的C-終端殘基之間。

抗原或病毒結構蛋白質可藉由短的連接子截短及置換。某些具體例中，抗原或病毒結構蛋白質包括一或多種肽連接子。典型地，連接子由2至25個胺基酸所組成(例如，2、3、4、5或6個胺基酸)。通常，其長度為2至15個胺基酸，然而於某些環境中，其可僅為一個，如單一甘胺酸殘基。

一具體例中，核酸分子，其中編碼該病毒結構蛋白質的多核苷酸係與編碼該抗原的多核苷酸基因性地融合，表現於宿主細胞中(例如，哺乳動物細胞(例如，293F細胞))，以使第一附接位點及第二附接位點經由肽鍵連接。此情況中，該病毒結構蛋白質及該抗原係經由肽鍵連接。關於此具體例，第一附接位點及/或第二附接位點可由原始蛋白質或抗原經基因性地改質。例如，第一附接位點係由該病毒結構蛋白質改質使得該蛋白質經由包括SG、GS、SGG、GGS及SGSG的連接子胜肽與抗原接合。當該病毒結構蛋白質為化學性地與抗原接合時，該第一附接位點及該第二附接位點可經由為化學化合物的化學交聯子而連接。交聯子的實例包括，但不限於，SMPH、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA以及可自Pierce化學公司取得之其他交聯子。

較佳地，抗原可藉由基因工程的方式連接至屈公病病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質而製造出融合蛋白質。

使用於本申請案之屈公病病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質可為屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒的套膜蛋白質或殼體或一種或多種套膜蛋白質及/或殼體蛋白質的複合物。

屈公病病毒的實例包括，但不限於，病毒株37997及病毒株LR2006 OPY-1。

委內瑞拉馬腦炎病毒的實例包括，但不限於，病毒株 TC-83。

使用於本申請案之屈公病病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質可為天然發生的病毒結構蛋白質或其改質蛋白質。改質蛋白質可為天然發生的病毒結構蛋白質的片段。一具體例中，該改質蛋白質對天然發生的病毒殼體及/或套膜蛋白質具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列同一性。一具體例中，改質蛋白質為突變體，其中基於天然發生的殼體及/或套膜蛋白質，至多10%的胺基酸經刪除、取代及/或加成。例如，K64A或K64N突變可導入至使用於本申請案之委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質的殼體。

屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質可包含或由殼體、E3、E2及E1蛋白質所組成。E3及E2蛋白質可一起表現使得E2及E3可形成一個蛋白質。

屈公病病毒結構蛋白質的實例包括，但不限於，屈公病病毒株37997的殼體-E3-E2-E1以及屈公病病毒LR2006 OPY-1的殼體-E3-E2-E1。

委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質的實例包括，但不限於，委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83的殼體-E3-E2-E1。

例示性屈公病病毒結構蛋白質序列係提供於Genbank Accession No.ABX40006.1，其如下述(序列編號：1)：

另一例示性屈公病病毒結構蛋白質序列係提供於Genbank Accession No.ABX40011.1，其如下述(序列編號：2)：

例示性委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質係如下述(序列編號：3)：

一具體例中，第一附接位點包含胺基，較佳為離胺酸殘基的胺基。一具體例中，第二附接位點包含氫硫基，較佳為半胱氨酸的氫硫基。

根據本申請案，可提供包含屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質及至少一抗原的類屈公病病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，其中至少一抗原係插入至該病毒結構蛋白質的E3，以及該屈公病病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質與抗原係表現為融合蛋白質。該抗原可直接或間接插入至該病毒結構蛋白質的E3。

屈公病病毒以及委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質由E1、E2、6K及E3所組成。6K通常於組裝過程中自然地裂解且自VLP移除。成熟的VLP由殼體、E1及E2所組成(參照第1圖)。本說明書及申請專利範圍中， “病毒結構蛋白質”不僅意指具有6K者也意指6K經移除後者。

使用於操作實例之CHIKV及VEEV病毒株之6K序列係如下述：

CHIKV OPY-1株，6K：序列編號：1的749-809aa atyqeaaiylwneqqplfwlqaliplaalivlcnclrllpcccktlaflavmsvgahtvsa(序列編號：137)

CHIKV 37997株，6K：序列編號：2的749-809aa atyyeaaaylwneqqplfwlqaliplaalivlcnclkllpcccktlaflavmsigahtvsa(序列編號：138)

VEEV TC-83株，6K：序列編號：3的758-813aa ettwesldhlwnnnqqmfwiqlliplaalivvtrllrcvccvvpflvmagaagaga(序列編號：139)

關於屈公病病毒結構蛋白質，至少一抗原可經插入，取代序列編號：1或2之自322R至325R的弗林位點(RKRR)。例如，關於屈公病病毒結構蛋白質，至少一抗原係插入至序列編號：1或2之殘基321-位置的H及326-位置的S之間；序列編號：1或2之殘基320-位置的P及326-位置的S之間；或序列編號：1或2之殘基319-位置的S及326-位置的S之間。VLP_CHI 0.56載體(序列編號：30)可使用於製備類屈公病病毒粒子，其中該抗原係插入至序列編號：1或2的殘基321及326之間。當抗原係插入至序列編號：1或2的殘基322及326之間時，由本申請案所提供之類病毒粒子可為由E2及E3的複合物、殼體及 E1所組成之類屈公病病毒粒子，且其中至少一抗原係插入至E3區域，以及其中該殼體由序列編號：31(或序列編號：75)代表的胺基酸序列所組成；E1由序列編號：32或序列編號：76代表的胺基酸序列所組成；以及E2及E3的複合物由序列編號：33或序列編號：77代表的胺基酸序列所組成，限制條件為該至少一抗原的胺基酸序列係插入至對應於序列編號：1或2的321及326的殘基之間。

委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質，至少一抗原可經插入，取代序列編號：3的自331R至334R的弗林位點(RKRR)。例如，關於委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質，至少一抗原係插入至序列編號：3的330-位置的G及335-位置的S之間；序列編號：3的329-位置的P及335-位置的S之間；或序列編號：3的328-位置的C及335-位置的S之間。VLP_VEEV 0.66載體(序列編號：34)可使用於製備類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，其中該抗原係插入至序列編號：3的殘基330及335之間。當抗原插入至序列編號：3的殘基330及335之間時，由本申請案所提供之類病毒粒子可為由E2及E3的複合物、殼體及E1所組成之類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，以及其中至少一抗原係插入至E3區域，以及其中殼體由序列編號：35代表的胺基酸序列所組成；E1由序列編號：36代表的胺基酸序列所組成；以及E2及E3的複合物由序列編號：37代表的胺基酸序列所組成，限制條件為該至少一抗原的胺基酸序列係插入至序列編號：3的殘基330及335之間。

一具體例中，至少一選自下列的抗原係插入至屈公病病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質的E3：衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原、衍生自PD-1的抗原、衍生自PD-L1的抗原、衍生自CTLA-4的抗原、衍生自IL-2的抗原、衍生自DISC1的抗原、衍生自HER2的抗原、衍生自BTLA的抗原、衍生自HVEM的抗原、衍生自PCSK9或衍生自DPP-4的抗原。

融合蛋白質可使用所屬技術領域習知的技術表現。各種表現系統可使用於融合蛋白質的表現。例如，融合蛋白質可表現於293F細胞、Sf9細胞、大腸桿菌(E.coli)、昆蟲細胞或棒狀病毒。

衍生自屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的蛋白質可為天然發生的病毒蛋白質或其改質蛋白質。

當衍生自病毒的蛋白質與衍生自抗原的蛋白質接合時，可使用包括SG、GS、SGG、GGS、SGSG及TRGGS的連接子胜肽。衍生自病毒的蛋白質(以下稱為“PFV”)與衍生自抗原的蛋白質(以下稱為“PFA”)接合的實例包括，但不限於：PFV-SG-PFA-GS-PFV；PFV-SG-PFA-GGS-PFV；PFV-SSG-PFA-GS-PFV；PFV-SGG-PFA-GGS-PFV；PFV-SGSG-PFA-GS-PFV；及PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV。

一具體例中，本申請案提供包含衍生自屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的蛋白質與衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質、PD-1、PD-L1、CTLA-4、衍生自IL-2的抗原、衍生自DISC1的抗原、衍生自HER2的抗原、衍生自BTLA的抗原、衍生自HVEM的抗原、衍生自PCSK9的抗原及衍生自DPP-4的抗原的蛋白質的融合蛋白質之類病毒粒子，其中該類病毒粒子係藉由將包含核酸分子的表現載體轉染至哺乳動物細胞(例如，293F細胞)而製備，該核酸分子包含由序列編號：38至45代表的核苷酸序列。關於此具體例，改質融合蛋白質可藉由將包含核酸分子的表現載體轉染至哺乳動物細胞(例如，293F細胞)而製備，該核酸分子包含對序列編號：38至45具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列同一性的核苷酸序列。

一具體例中，本申請案提供包含或由下列組成的類病毒粒子：屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的一或多種殼體；屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的一或多種E1；屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的一或多種E2；以及屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的一或多種E3，其中各E2係結合至各E3，以及選自下列所成群組的抗原係插入至屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的E3：衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原、衍生自PD-1的抗原、衍生自PD-1(例如，PD-L1、PD-L2)的配體的抗原、衍生自CTLA-4的抗原、衍生自IL-2的抗原、衍生自DISC1的抗原、衍生自HER2的抗原、衍生自BTLA的抗原、衍生自HVEM的抗原、衍生自PCSK9的抗原以及衍生自DPP-4的抗原。例如，本申請案提供包含或由下列所組成的類病毒粒子：屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的240種殼體；屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的240種E1；以及屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的240種E2；屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的240種E3，其中各E2係結合至各E3，以及選自下列所成群組的抗原係插入至屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的E3：衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原、衍生自PD-1的抗原、衍生自PD-1(例如，PD-L1、PD-L2)的配體的抗原、衍生自CTLA-4的抗原、衍生自IL-2的抗原、衍生自DISC1的抗原、衍生自HER2的抗原、衍生自BTLA的抗原、衍生自HVEM的抗原、衍生自PCSK9的抗原以及衍生自DPP-4的抗原。

類病毒粒子可作用為抗原的載體，其可投藥至人類身體。可作用為抗原載體之CHIKV VLP的實例包括，但不限於，包含或由E2及E3的複合物、殼體及E1 所組成之類屈公病病毒粒子，其中殼體由序列編號：31(或序列編號：75)代表的胺基酸序列所組成；E1由序列編號：32(或序列編號：76)代表的胺基酸序列所組成；以及E2及E3的複合物由序列編號：33(或序列編號：77)代表的胺基酸序列所組成，限制條件為該至少一抗原的胺基酸序列係插入至對應於序列編號：1或序列編號：2的321及326的殘基之間。可作用為抗原載體之VEEV VLP的實例包括，但不限於，包含或由E2及E3的複合物、殼體及E1所組成之類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，其中殼體由序列編號：35代表的胺基酸序列所組成；E1由序列編號：36代表的胺基酸序列所組成；E2及E3的複合物由序列編號：36代表的胺基酸序列所組成序列編號：37，限制條件為該至少一抗原的胺基酸序列係插入至對應於序列編號：3的330及335的殘基之間。

包含屈公病病毒結構蛋白質及衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原、衍生自PD-1的抗原、衍生自PD-L1的抗原、衍生自CTLA-4的抗原、衍生自IL-2的抗原、衍生自DISC1的抗原、衍生自HER2的抗原、衍生自BTLA的抗原、衍生自HVEM的抗原、衍生自PCSK9的抗原以及衍生自DPP-4的抗原之類屈公病病毒粒子的實例包括，但不限於，經至少一抗原插入之E2及E3的複合物、殼體及E1所組成之類屈公病病毒粒子，以及其中至少一抗原係插入至E3區域，以及其中經至少一抗原插入之殼體、E1、E2及E3的複合物之各者的胺基酸序列係如下述： (1)E1的胺基酸序列由序列編號：32代表；經瘧疾抗原插入的E2及E3的複合物的胺基酸序列由序列編號：46代表；以及殼體的胺基酸序列由序列編號：31代表；(2)E1的胺基酸序列由序列編號：32代表；經PD-1抗原插入的E2及E3的複合物的胺基酸序列由序列編號：47代表；以及殼體的胺基酸序列由序列編號：31代表；(3)E1的胺基酸序列由序列編號：32代表；經PD-L1抗原插入的E2及E3的複合物的胺基酸序列由序列編號：48代表；以及殼體的胺基酸序列由序列編號：31代表；或(4)E1的胺基酸序列由序列編號：32代表；經CTLA-4抗原插入的E2及E3的複合物的胺基酸序列由序列編號：49代表；以及殼體的胺基酸序列由序列編號：31代表。

包含委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質及及衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原、衍生自PD-1的抗原、衍生自PD-L1的抗原、衍生自CTLA-4的抗原、衍生自IL-2的抗原、衍生自DISC1的抗原、衍生自HER2 的抗原、衍生自BTLA的抗原、衍生自HVEM的抗原、衍生自PCSK9的抗原以及衍生自DPP-4的抗原之類病毒粒子的實例包括，但不限於，由經至少一抗原插入之E2及E3的複合物、殼體及E1所組成之類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，以及其中至少一抗原係插入至E3區域，以及其中經至少一抗原插入之殼體、E1、E2及E3的複合物之各者的胺基酸序列係如下述：(1)E1的胺基酸序列由序列編號：36代表；經瘧疾抗原插入的E2及E3的複合物的胺基酸序列由序列編號：50代表；以及殼體的胺基酸序列由序列編號：35代表；(2)E1的胺基酸序列由序列編號：36代表；經PD-1抗原插入的E2及E3的複合物的胺基酸序列由序列編號：51代表；以及殼體的胺基酸序列由序列編號：35代表；(3)E1的胺基酸序列由序列編號：36代表；經PD-L1抗原插入的E2及E3的複合物的胺基酸序列由序列編號：52代表；以及殼體的胺基酸序列由序列編號：35代表；或(4)E1的胺基酸序列由序列編號：36代表；經CLTLA-4抗原插入的E2及E3的複合物的胺基酸序列由序列編號：53代表；以及殼體的胺基酸序列由序列編號：35代表。

再者，關於此等具體例，屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的改質殼體、屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的改質E1及/或屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的改質E2及E3的複合物可使用於類病毒粒子。例如，屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的改質殼體對序列編號：31(或序列編號：75)或序列編號：35所代表的胺基酸序列可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列同一性；屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的改質E1對序列編號：32(或序列編號：76)或序列編號：36所代表的胺基酸序列可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列同一性；及/或屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的改質E2及E3的複合物對序列編號：33(或序列編號：77)或序列編號：37所代表的胺基酸序列可具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列同一性。再者，改質殼體、E1及/或E2及E3的複合物可為突變體，基於序列編號：31(或序列編號：75)或序列編號：35所代表的胺基酸序列所組成的殼體；序列編號：32(或序列編號：76)或序列編號：36所代表的胺基酸序列所組成的E1；及/或序列編號：33(或序列編號：77)或序列編號：37所代表的胺基酸序列所組成的E2及E3的複合物，其中至多10%的胺基酸殘基係經刪除、取代及/或加成。

類病毒粒子可藉由將包含具有編碼類病毒粒子的核苷酸序列的DNA分子的表現載體導入至細胞(例如，293F細胞)，培養該細胞以及使用離心自該條件化培養基回收該類病毒粒子而製備。

(2)核苷酸、載體

第二態樣中，本申請案提供包含或由編碼包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子的核苷酸序列所組成的核酸分子。

可藉由改質上述核酸分子而製備之上述核酸分子的衍生物亦藉由本申請案提供。衍生物可由核苷酸序列所組成，該核苷酸序列與上述核酸分子的核苷酸序列具有70%、80%、90%、95%或98%或更高的序列同一性。

藉由本申請案所提供之核酸分子可為經單離之編碼包含具有套膜蛋白質E3的病毒結構蛋白質的類病毒粒子(例如，類屈公病病毒粒子、類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子)的核酸分子。一具體例中，該類病毒粒子包含病毒結構蛋白質以及至少一抗原，其中該至少一抗原係插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3。

所屬技術領域中具有通常知識者可基於編碼序列編號：54至55所代表的殼體及/或套膜的屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質的核苷酸序列來製備上述之本申請案所提供的核酸分子。

一具體例中，編碼抗原的核苷酸序列可插入至編碼屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒的病毒結構蛋白質的E3的核苷酸序列。例如，編碼抗原的核苷酸序列係插入至序列編號：54的殘基963及969之間(對於CHIKV)或序列編號：55的殘基990及1006之間(對於VEEV)以製備由編碼包含套膜蛋白質E3的類病毒粒子的核苷酸序列所組成的核酸分子，其中套膜蛋白質E3係經改質以包含至少一抗原。藉由本申請案所提供的核酸分子的實例包括，但不限於，由序列編號：38至45之任一者所代表的核苷酸序列所組成的核酸分子。亦提供由與序列編號：38至45代表的核苷酸序列具有70%、80%、90%、95%或98%或更高的序列同一性的核苷酸序列所組成的核酸分子。

一具體例中，本申請案提供包含如上所述核酸分子的載體，其中該載體視需要地包含可操作性地連接至該核酸分子的調控序列。使用於本文之載體可改變啟動子，包括增強子序列、多腺苷酸化信號及抗生素耐性基因。例如，提供載體包含由序列編號：54或序列編號：55代表的核苷酸序列所組成的核酸分子，其中編碼至少一抗原的核苷酸序列係插入至序列編號：54的殘基963及969之間(對於CHIKV VLP)或序列編號：55的殘基990及1006之間(對於VEEV-VLP)；以及可操作性地連接至該核酸分子的表現調控序列。

表現調控序列的實例包括，但不限於，啟動子，如CMV啟動子、嗜菌體lambda PL啟動子、大腸桿菌(E.coli)之lac、phoA及tac啟動子、SV40之早期及晚期啟動子以及反轉錄病毒LTR的啟動子。

此具體例中，包含可操作性地連接至上述核酸分子的表現調控序列的載體可使用作為用以製備藉由本申請案所提供之粒子的表現載體。

該等表現載體可由所屬技術領域中具有通常知識者根據專利WO2012/006180而製備，其全部內容以參考方式併入本文。

可使用於表現包含衍生自屈公病病毒(CHIKV)蛋白質及抗原的融合蛋白質之類病毒粒子的載體的實例包括顯示於VLP_CHI 0.56載體(序列編號：30)的載體。

基於VLP_CHI 0.56載體(序列編號：30)，所屬技術領域中具有通常知識者可製備載體，該等載體可使用於表現包含衍生自屈公病病毒(CHIKV)的蛋白質及所期望抗原的融合蛋白質的類病毒粒子。例如，當所屬技術領中具有通常知識者製備包含瘧疾抗原(Sggnpnanpnanpnanpnanpnanpnaggs(序列編號：56))-經插入的E3的CHIKV VLP，基於VLP_CHI 0.56載體，所屬技術領中具有通常知識者可製備如下述之載體(序列編號：57)其中編碼抗原之核苷酸係下加底線。

可使用於表現包含衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的蛋白質及抗原的融合蛋白質的類病毒粒子的載體的實例包括顯示於VLP_VEEV 0.66載體(序列編號：34)的載體。

基於VLP_VEEV 0.66載體(序列編號：34)，所屬技術領中具有通常知識者可製備可使用於表現類病毒粒子的載體，該類病毒粒子包含衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的蛋白質及抗原的融合蛋白質。例如，當所屬技術領中具有通常知識者製備包含瘧疾抗原(SGG-qgpgapqgpgapqgpgapqgpgap-GGS(序列編號：58))-經插入的E3，基於VLP_VEEV 0.66載體，製備VEEV VLP時，所屬技術領中具有通常知識者可製備如下所述載體(序列編號：59)其中編碼抗原之核苷酸係下加底線。

使用於表現其中經編碼至少一抗原的核苷酸序列插入至其E2及E3區的病毒結構蛋白質的質體載體的代表性結構係示於第2圖。

對序列編號：57及59代表的核苷酸序列的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%核苷酸序列同一性的核酸分子以及可為突變體之基於具有序列編號：57及59代表的核苷酸序列的核酸分子，其中至多10%胺基酸係經刪除、取代及/或加成的核酸分子亦藉由本申請案提供。

如上所述之VLP可藉由安定的細胞株製備。安定的細胞株可藉使用如上所述載體以及根據傳統步驟而製備。例如，下述步驟可應用於產生安定的細胞株：

1. 以含有如潮黴素B之選擇標記的VLP表現載體轉染如293F細胞之細胞。

2. 培養經轉染細胞一日。

3. 於含有如潮黴素為150至200ug/ml之選擇培養基培養經轉染細胞1至2週。

4. 選擇於選擇培養基中可生長且分裂至少一次的細胞。

5. 單離單一細胞且藉由西方墨漬法確認VLP於上清液的表現。

(3)醫藥組成物，套組

第三態樣中，本申請案提供醫藥組成物及包含該醫藥組成物之套組，其中該醫藥組成物包含(i)包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子及/或(ii)由編碼包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子的核苷酸序列所組成的核酸分子。

一具體例中，本申請案提供醫藥組成物及包含該醫藥組成物之套組，其中該醫藥組成物包含如上所述的α病毒屬或黃病毒屬的類病毒粒子(例如，類屈公病病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子)或如上所述的核酸分子；以及醫藥可接受載劑。該組成物中，α病毒屬或黃病毒屬的類病毒粒子量以及核酸分子的量可為該醫藥組成物之0.00001-1w/w%。

藉由本申請案所提供之粒子(例如，CHIKV VLP或VEEV VLP)的劑量可為1-500μg/日。

如上所述，一具體例中，使用於藉由本申請案所提供之醫藥組成物中類病毒粒子所含有之抗原可衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IL-2、DISC1、HER2、BTLA、HVEM、PCSK9或DPP-4。

醫藥組成物可進一步包含佐劑。佐劑的實例包括，但不限於，Ribi溶液(Sigma Adjuvant system,Sigma-Aldrich)。藉由本申請案所提供之醫藥組成物可含有緩衝劑如磷酸氫二鈉水合物、磷酸二氫鈉及氯化鈉；以及防腐劑如硫柳汞。一具體例中，該醫藥組成物為水溶液，含有0.001-1w/w%之包含病毒結構蛋白質及抗原(例如，衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質、PD-1或PD-L1)的粒子(例如，CHIKV VLP或VEEV VLP)、1-10w/w%的緩衝劑、0.01-1w/w%的佐劑以及0.00001-0.001w/w%的防腐劑。

所屬技術領中具有通常知識者可使用傳統技術製備醫藥組成物。例如，包含病毒結構蛋白質及抗原(例如，衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質、PD-1、PD-L1、 CTLA-4、IL-2、DISC1、HER2、BTLA、HVEM、PCSK9或DPP-4的抗原)的粒子(例如，CHIKV VLP或VEEV VLP)係與具有生理pH(例如，pH 5-9，如pH7)的緩衝溶液混合以製備醫藥組成物。

一具體例中，該醫藥組成物為包含粒子的疫苗或免疫刺激劑，該粒子包含具有改質套膜蛋白質E3的病毒結構蛋白質。一具體例中，該類病毒粒子包含病毒結構蛋白質及抗原(例如，衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IL-2、DISC1、HER2、BTLA、HVEM、PCSK9或DPP-4的抗原)。例如，藉由本申請案所提供之疫苗組成物可使用於免疫療法；治療或預防癌；治療或預防感染疾患；或治療或預防瘧疾。

一具體例中，醫藥組成物為含核酸分子的DNA疫苗，該核酸分子包含用於表現粒子的核苷酸序列，該粒子包含具有改質套膜蛋白質E3的病毒結構蛋白質。一具體例，該類病毒粒子包含病毒結構蛋白質及外源性抗原(例如，衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質、PD-1、PD-L1、CTLA-4、IL-2、DISC1、HER2、BTLA、HVEM、PCSK9或DPP-4的抗原)。一具體例中，藉由本申請案所提供之DNA疫苗包含含有寡核苷酸的CpG。

於本申請案之第三態樣中所提供之醫藥組成物可投藥一或多次。當本申請案之第三態樣中所提供之醫藥組成物投藥多於一次時，本申請案之第一態樣中所提供的不同粒子(例如，CHIKV VLP或VEEV VLP)可使用於各次投藥。一具體例中，係應用使用本申請案之第一態樣中所提供之CHIKV VLP之免疫與使用本申請案之第一態樣中所提供之VEEV VLP之免疫的組合。例如，本申請案之第一態樣中所提供之CHIKV VLP可使用於第1次免疫以及本申請案之第一態樣中所提供之VEEV VLP可使用第2次免疫，或本申請案之第一態樣中所提供之VEEV VLP可使用於第1次免疫以及本申請案之第一態樣中所提供之CHIKV VLP可使用於第2次免疫。

所屬技術領中具有通常知識者可決定使用本申請案所提供之組成物或疫苗之免疫的時間點。例如，第2次免疫係於第1次免疫後1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週後進行。

一具體例中，本申請案提供套組包含(a)包含本申請案之第一態樣中所提供之粒子之醫藥組成物；以及(b)包含本申請案之第一態樣中所提供之粒子之另一醫藥組成物，其中含於(a)的粒子為不同於含於(b)的粒子之類病毒粒子。此具體例中，含於(a)的粒子可為類屈公病病毒粒子以及含於(b)的粒子可為類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子。

一具體例中，本申請案提供套組包含(a)包含本申請案之第一態樣中所提供之粒子之醫藥組成物；以及(b)包含本申請案之第一態樣中所提供之粒子之另一醫藥組成物，(c)一或多種醫藥組成物，其各包含本申請案之第一態樣中所提供的粒子，其中(a)係使用於啟動免疫(priming immunization)以及(b)及(c)係使用於增幅免疫(boosting immunization)；以及含於(a)的粒子係不同於含於(b)的粒子的類病毒粒子；以及含於(c)的粒子係不同於含於(a)及(b)的粒子，或相同於含於(a)及(b)的粒子。

含於上述套組之個別的醫藥組成物可同時地、分別地或依序地投藥。

本申請案之第一態樣中所提供之α病毒屬或黃病毒屬(例如，屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒)的類病毒粒子或本申請案之第二態樣中所提供之核酸分子可使用於本申請案之第三態樣所提供之醫藥組成物。

例如，類屈公病病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子包含或由下列所組成：屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的一或多種(例如，240)殼體；屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的一或多種(例如，240)E1；屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的一或多種(例如，240)E2；以及屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的一或多種(例如，240)E3，其中各E2係結合至各E3，以及抗原係插入至屈公病病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒 (VEEV)的E3，可使用於製備本申請案之第三態樣中所提供之組成物或疫苗。其中經抗原插入的E2及E3的複合物可由序列編號：46至49之任一者所代表的胺基酸序列所組成；E1可由序列編號：32(或序列編號：76)所代表的胺基酸序列所組成；以及殼體可由序列編號：31(或序列編號：75)所代表的胺基酸序列所組成；或其中經抗原插入的E2及E3的複合物可由序列編號：50至53之任一者所代表的胺基酸序列所組成；E1可由序列編號：35所代表的胺基酸序列所組成；以及殼體可由序列編號：36所代表的胺基酸序列所組成。

(4)製造類病毒粒子的方法

第四態樣中，本請案提供製造包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子的方法，包含：培養經載體轉染之細胞以表現類病毒粒子；以及純化該粒子。

藉由本申請案之第一態樣中所提供之類病毒粒子可藉由本申請案之第四態樣所提供之方法製造。

一具體例中，抗原可為衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原、衍生自PD-1的抗原、衍生自PD-L1的抗原、或衍生自CTLA-4的抗原、衍生自IL-2的抗原、衍生自DISC1的抗原、衍生自HER2的抗原、衍生自BTLA的抗原、衍生自HVEM的抗原、衍生自PCSK9的抗原、或衍生自DPP-4的抗原。

各種宿主-載體系統可使用於類病毒粒子的表現。真核細胞可使用於藉由本申請案之第四態樣所提供之方法，包括，但不限於，昆蟲細胞(例如，sf9細胞、H5細胞)、酵母菌細胞(例如，釀酒酵母(S.cerevisiae))及哺乳動物細胞(例如，CHO細胞、人類胚胎腎(HEK)293F細胞)。使用於本申請案之第四態樣中所提供之方法的載體包含編碼欲表現之類病毒粒子的核酸分子。細胞可使用傳統方法(例如，脂質轉染法、電穿孔法)以載體轉染。所屬技術領中具有通常知識者可根據藉由本申請案第四態樣中所提供之方法所使用之細胞，選擇培養基或具有DNA甲基轉移酶抑制劑及組織蛋白(histone)脫醯酶抑制劑如丁酸鈉之培養基。轉染後，可於細胞及/或培養上清液中製造類病毒粒子。類病毒粒子可使用離心自培養上清液回收及純化。

例如，細胞係以含有編碼CHIKV結構蛋白質殼體、6K、E1、E2及E3的基因的載體轉染，其中E3係經改質以含有所期望之抗原。經表現載體轉染之細胞製造蛋白質且該等蛋白質同時組裝以形成可自培養基回收的VLP。6K蛋白質作用為信號序列用以傳送E1蛋白質至內質網，其於該處藉由宿主信號肽酶處理且其不組裝至病毒粒子。

(5)類病毒粒子製造的增強方法

第五態樣中，本申請案提供類病毒粒子製造的增強方法，該類病毒粒子包含改質套膜蛋白質E3。一具體例中，該類病毒粒子包含病毒結構蛋白質以及至少一抗原，該方法包含(1)將至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3，以及(2)單離其中經至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3之類病毒粒子。

至少一抗原可插入至E3的合適位置。一較佳具體例中，至少一抗原係插入至弗林裂解位點，其係存在於病毒結構蛋白質(例如，CHIKV結構蛋白質、VEEV結構蛋白質)的E3使得包含抗原-經插入的E3的類病毒粒子，當相較於包含其中經至少一抗原插入至E2的類病毒粒子的表現時，可更有效率地表現。

例如，關於屈公病病毒結構蛋白質，至少一抗原係插入至序列編號：1或2之殘基321-位置的H及336-位置的S之間；序列編號：1或2之殘基320-位置的P及326-位置的S之間；或序列編號：1或2之殘基319-位置的S及326-位置的S之間。

例如，關於委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質，至少一抗原係插入至序列編號：3之330-位置的G及335-位置的S之間；序列編號：3之329-位置的P及335-位置的S之間；或序列編號：3之328-位置的C及335-位置的S之間。

將至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3的步驟可藉由製備包含編碼其中經至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3之類病毒粒子的核苷酸序列的核酸分子而達成；以及使用如昆蟲細胞(例如，sf9細胞、H5細胞)、酵母菌細胞(例如，釀酒酵母(S.cerevisiae))及哺乳動物細胞(例如，CHO細胞、人類胚胎腎(HEK)293F細胞)之細胞使核酸分子表現。

單離其中經至少一抗原插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E3之類病毒粒子的步驟可藉由使用離心純化該類病毒粒子而達成。

(6)所揭示之類病毒粒子的用途

第六態樣中，本申請案提供(i)包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子及/或(ii)編碼包含改質套膜蛋白質E3的類病毒粒子的核苷酸所組成之核酸分子的用途，用以製造醫藥組成物或套組，用於治療或預防癌、神經疾患、感染疾患或瘧疾；製造抗體對抗於哺乳動物中之至少一抗原；調節免疫反應；免疫刺激；抑制至少一抗原之功能；或於巨噬細胞呈現抗原。

醫藥組成物可以肌內(i.m.)、皮內(i.c.)、皮下(s.c.)、皮膚內(i.d.)或腹膜內(i.p.)投藥至哺乳動物(例如，人類)。

一具體例中，醫藥組成物為疫苗，其可應用於免疫療法。一具體例中，當衍生自PD-1、PD-L1、CTLA-4、HER2、BTLA或HVEM的抗原係使用於製造類病毒粒子，該類病毒粒子可使用於治療癌或自體免疫疾患。一具體例中，當衍生自PD-1或PD-L1的抗原係使用於製造類病毒粒子時，該類病毒粒子可使用於治療或預防感染疾患。一具體例中，當抗原係衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質時，該類病毒粒子可使用於治療或預防瘧疾。一具體例中，當衍生自DISC1的抗原係使用於製造類病毒粒子時，該類病毒粒子可使用於治療或預防神經疾患。一具體例中，當抗原係衍生自PCSK9或DPP-4時，該類病毒粒子可使用於治療或預防生活型態慢性疾患。

可治療之癌的實例包括，但不限於，黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、乳癌、大腸癌及非小細胞肺癌。癌之其他實例包括，但不限於，骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭癌或頸癌、皮膚或眼內的惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門部的癌、胃癌、睪丸癌、輸卵管的惡性腫瘤、子宮內膜的惡性腫瘤、子宮頸的惡性腫瘤、陰道的惡性腫瘤、陰唇的惡性腫瘤、何金氏症(Hodgkin's Disease)、非何金氏淋巴癌、食道的癌、小腸的癌、內分泌系統的癌、甲狀腺的癌、副甲狀腺的癌、腎上腺的癌、軟組織的肉瘤、尿道的癌、陰莖的癌、慢性或急性白血病包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、兒童的實體腫瘤、淋巴細胞淋巴癌、膀胱的癌、腎臟或尿道的癌、腎盂的惡性腫瘤、中樞神經系統(CNS)的贅瘤、原發性CNS淋巴癌、腫瘤新生、脊椎軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鳞狀細胞癌、T-細胞淋巴癌、環境誘發癌症包括由石棉所誘發者、以及其組合。

可治療之感染疾患之實例包括，但不限於，HIV、流感、疱疹、梨形鞭毛蟲(Giardia)、瘧疾、利什曼蟲(Leishmania)、由肝炎病毒(A、B及C)、疱疹病毒(e.g.，VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II及CMV、艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus))、α病毒、腺病毒、流感病毒、黃病毒、艾科病毒(echovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、克沙奇病毒(coxsackie virus)、冠病毒(cornovirus)、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、輪狀病毒(rotavirus)、麻疹病毒(measles virus)、德國麻疹病毒(rubella virus)、微小病毒(parvovirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳突病毒(papillomavirus)、軟疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒(rabies virus)、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒(arboviral encephalitis virus)所引起的病原性感染，由細菌衣原體(bacteria Chlamydia)、利克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌屬(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎鏈球菌(pneumonococci)、腦膜炎雙球菌(meningococci)及淋球菌(conococci)、克雷柏氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、退伍軍人桿菌(legionella)、白喉桿菌(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、芽孢桿菌(bacilli)、霍亂弧菌(cholera)、破傷風桿菌(tetanus)、肉毒桿菌(botulism)、炭疽菌(anthrax)、疫病菌 (plague)、鉤端螺旋體病菌(leptospirosis)及萊姆症細菌(Lymes disease bacteria)所引起的病原性感染，由真菌念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌(Aspergillus)(煙麴菌(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴(Mucorales)(毛黴菌(mucor)、梨尖毛黴(absidia)、根黴毛黴(rhizophus))、申克士孢子絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生黴菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西婦求黴菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球黴菌(Coccidioides immitis)及組織漿菌(Histoplasma capsulatum)所引起的病原性感染，以及由寄生蟲赤痢變形蟲(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里變形蟲(Naegleria fowleri)、棘型變形蟲屬(Acanthamoeba sp.)、藍氏甲第鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、果氏巴貝蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓漿蟲(Toxoplasma gondi)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)所引起的病原性感染。

可治療之神經疾患之實例包括，但不限於，阿茲海默症(Alzheimer disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、癲癇(epilepsy)或精神分裂症(Schizophrenia)。

可治療之生活型態慢性疾患之實例，不限於，糖尿病或高血脂症。

當包含病毒結構蛋白質及抗原(例如，衍生自惡性瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原、衍生自PD-1的抗原、衍生自PD-L1的抗原、衍生自CTLA-4的抗原、衍生自IL-2的抗原、衍生自DISC1的抗原、衍生自HER2的抗原、衍生自BTLA的抗原、衍生自HVEM的抗原、衍生自PCSK9的抗原及衍生自DPP-4的抗原)的醫藥組成物投藥至哺乳動物(例如，人類)時，於哺乳動物的血液中製造出對抗抗原的抗體。所製造的抗體可調節免疫反應；顯示免疫刺激性效果；或抑制抗原的功能。

所製造的抗體可使用傳統技術予以人源化。使用本申請案之第一態樣中所提供之粒子，可製備單株抗體或多株抗體。一具體例中，本申請案提供製造抗體的方法，包含對非-人類哺乳動物投藥本申請案之第一態樣中所提供之粒子以及人源化哺乳動物所製造的抗體。

如使用於本文，用語“抗體”意指能結合抗原決定基或抗原性決定位(determinant)的分子。該用語意圖包括抗體及其抗原-結合片段，包括單鏈抗體。該等抗體包括人類抗原結合抗體片段且包括，但不限於，Fab、Fab'及F(ab')2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、雙硫-連接Fvs(sdFv)及包含VL或VH功能域的片段。抗體可來自任何動物源包括鳥類即哺乳動物類。較佳地，抗體為哺乳動物的，例如人類、鼠、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬等，或其他合適的動物，例如雞。如使用於本文，“人類”抗體包括具有人類免疫球蛋白的胺基酸序列的抗體且包括自人類免疫球蛋白庫或自經一種或多種人類免疫球蛋白基因轉殖且不表現內源性免疫球蛋白的動物所單離的抗體，例如美國專利第5,939,598號所揭示者，其全部內容以參考方式併入本文。

本申請案將參考下述實施例詳細說明，然而，其不意圖限制本申請案的範疇。

實施例實施例1：製備包含經插入至該病毒結構蛋白質之套膜蛋白質E3的瘧疾CSP重複抗原之委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)-類病毒粒子(VLP)

使用下述瘧疾CSP蛋白質的多肽製備包含瘧疾CSP重複抗原之VEEV-VLP。對於抗原，SGG為N終端連結子以及GGS為C終端連結子。

74(NPNA胺基酸序列之6重複)Sggnpnanpnanpnanpnanpnanpnaggs(序列編號：56)

(Tccggaggaaacccgaatgccaatcccaacgcgaaccccaatgctaacccaaatgccaacccaaacgccaaccccaacgctggtggatcc)(序列編號：60)

76(NPNA胺基酸序列之14重複)Sggnpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnaggs(序列編號：61)

(序列編號：62)

78(NPNA胺基酸序列之25重複)

(序列編號：63)

(序列編號：64)

個別的多核苷酸係經插入至編碼序列編號：3之518-位置的Ser及519-位置之Ser的密碼子之間以構築質體(後文分別指稱pVEEV-74.21、pVEEV-76.21及pVEEV-78.21)用以表現其中經個別的抗原插入至委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之E2的VEEV-VLP。類似地，個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：3之330-位的Gly及335-位置的Ser的密碼子之間以構築質體(後文分別指稱pVEEV-74.26、pVEEV-76.26及pVEEV-78.26)，用以表現其中經個別的抗原插入至委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之 E3的VEEV-VLP。

293F細胞(Lifetechnology)係以180μg之各質體(亦即，分別為pVEEV-74.21、pVEEV-76.21、pVEEV-78.2、pVEEV-74.26、pVEEV-76.26及pVEEV-78.26)使用PEI(GE Healthcare)轉染。轉染4日後，收集條件化培養基且於3000rpm離心15分鐘使其與細胞分離。使用0.45μm過慮器過濾上清液以獲得類病毒粒子。類病毒粒子使用TFF管柱濃縮且使用QXL管柱純化(GE Healthcare)以獲得經純化的類病毒粒子。當動物以類病毒粒子免疫時，經純化的類病毒粒子係使用旋轉管柱(分子量-截留：100kDa)進一步濃縮以製備用於免疫的類病毒粒子。

包含與VEEV結構多肽接合之CSP重複抗原74、76或78之VLP的製造係使用抗-VEEV抗體藉由西方墨漬法確認(參照第3圖)。如見於第3圖，相較於當抗原插入至E2時，當抗原插入至E3時更有效率地製造抗原-經插入VLP。

實施例2：製備包含經插入至該病毒結構蛋白質之套膜蛋白質E3的瘧疾CSP重複抗原之委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)-類病毒粒子(VLP)

使用下述小鼠瘧疾CSP蛋白質的多肽製備包含小鼠瘧疾CSP重複抗原的VEEV-VLP。對於抗原，SGG係N終端連結子以及GGS係C終端連結子。

261("qgpgap"之重複)SGG-qgpgapqgpgapqgpgapqgpgap-GGS(序列編號：58)

Tccggaggacagggacctggcgctcctcagggaccaggggcaccacagggcccaggcgccccacaggggcctggggcccctgggggatcc(序列編號：65)

多核苷酸係插入至編碼序列編號：3之518-位置的Ser及519-位置的Ser的密碼子之間以構築質體(後文指稱為pVEEV-261.25)，用以表現其中經抗原插入至委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質的E2的VEEV-VLP。類似地，編碼胜肽之多核苷酸係插入至編碼序列編號：3之330-位置的Gly及335-位置的Ser的密碼子之間以構築質體(後文指稱為pVEEV-261.66)，用以表現其中經抗原插入至委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質的E3的VEEV-VLP。

293F細胞(Lifetechnology)係以180μg之各質體(亦即，分別為pVEEV-261.25及pVEEV-261.66)使用PEI(GE Healthcare)轉染。轉染4日後，收集條件化培養基且於3000rpm離心15分鐘使其與細胞分離。使用0.45μm過慮器過濾上清液以獲得類病毒粒子。類病毒粒子使用TFF管柱濃縮且使用QXL管柱純化(GE Healthcare)以獲得經純化的類病毒粒子。當動物以類病毒粒子免疫時，經純化的類病毒粒子係使用旋轉管柱(分子量-截留：100kDa)進一步濃縮以製備用於免疫的類病毒粒子。

包含與VEEV結構多肽接合之CSP重複抗原261之VLP的表現係使用抗-VEEV抗體藉由西方墨漬法確認(參照第4圖)。如見於第4圖，相較於當抗原插入至 E2時，當抗原插入至E3時更有效率地製造抗原-經插入VLP。

實施例3：製備包含經插入至該病毒結構蛋白質之套膜蛋白質E3之瘧疾抗原的委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)-類病毒粒子(VLP)

使用下述衍生自瘧疾蛋白質的多肽製備包含瘧疾CSP重複抗原的VEEV-VLP。對於抗原，SGG係N終端連結子(TCCGGAGGA於核序列)以及GGS係C終端連結子(GGAGGATCC於核序列)。

74(NPNA胺基酸序列的6重複)sggnpnanpnanpnanpnanpnanpnaggs(序列編號：56)

302R(衍生自pfs25的抗原)SGG-cikidgnpvsyac-GGS(序列編號：66)

tccggagggtgcatcaagatcgacggcaaccccgtgtcctacgcctgcgggggatcc303R(衍生自pfs25的抗原)(序列編號：67)

SGG-cildtsnpvktgvc-GGS(序列編號：68)

tccggaggctgcatcctggacaccagcaaccccgtgaaaaccggcgtgtgtggcggatcc(序列編號：69)

個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：3之518-位置的Ser及519-位置的Ser的密碼子之間以構築質體(後文分別指稱為pVEEV-74.21、pVEEV-302R.21及pVEEV-303R.21)，用以表現其中經個別抗原插入至委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質的E2的VEEV-VLP。類似地，個別的多核苷酸多核苷酸係插入至編碼序列編號：35 330-位置的Gly以及335-位置的Ser的密碼子之間以構築質體(後文分別指稱為pVEEV-74.66、pVEEV-302R.66及pVEEV-303R.66)，用以表現其中經個別抗原插入至委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質的E3的VEEV-VLP。

293F細胞(Lifetechnology)係以180μg之各質體(亦即，分別為pVEEV-74.21、pVEEV-302R.21、pVEEV-303R.2、pVEEV-74.66、pVEEV-302R.66及pVEEV-303R.66)使用PEI(GE Healthcare)轉染。轉染4日後，收集條件化培養基且於3000rpm離心15分鐘使其與細胞分離。使用0.45μm過慮器過濾上清液以獲得類病毒粒子。類病毒粒子使用TFF管柱濃縮且使用QXL管柱純化(GE Healthcare)以獲得經純化的類病毒粒子。當動物以類病毒粒子免疫時，經純化的類病毒粒子係使用旋轉管柱(分子量-截留：100kDa)進一步濃縮以製備用於免疫的類病毒粒子。

包含接合至VEEV結構多肽之抗原74、302R或303R之VLP的表現係使用抗-VEEV抗體藉由西方墨漬法確認(參照第5圖)。如見於第5圖，相較於當抗原插入至E2時，當抗原插入至E3時更有效率地製造抗原-經插入 VLP。

實施例4：製備包含病毒結構蛋白質及PD-1抗原或PD-1配體抗原的屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子

使用下述PD-1或PD-L1的多肽製備包含PD-1抗原或PD-1配體抗原的CHIKV-VLP。對於抗原，SGG係N終端連結子(TCCGGAGGA於核序列)以及GGS係C終端連結子(GGAGGATCC於核序列)。

1. 299(小鼠PD-L1序列)：附接連結子之小鼠PD-L1功能域3S的片段序列，其使用為抗原：

核序列

tccggaggatgcatcatcagctacggcggagccgactacggaggatcc(序列編號：70)

胺基酸序列

SGG-ciisyggadyC-GGS(序列編號：71)

2. 274(小鼠PD-1序列)：附接連結子之小鼠PD-1功能域2短型的片段序列，其使用為抗原：

核序列

tccggaggaggcgccatcagcctgcaccccaaggccaagatcgaggaatctggaggatcc(序列編號：72)

胺基酸序列

SGG-gaislhpkakiees-GS(序列編號：73)

個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之531-位置的Ser及532-位置的Asn的密碼子之間以構築質體(後文分別指稱pCHIKV-299.15及pCHIKV-274.11)，用以表現其中經PD-1-衍生肽或PD-L1-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E2的屈公病病毒結構蛋白質。類似地，個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體(後文分別指稱pCHIKV-299.56及pCHIKV-274.56)，用以表現其中經PD-1-衍生肽或PD-L1-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。

293F細胞(Lifetechnology)係以180μg之各質體(亦即，分別為pCHIKV-274.11、pCHIKV-299.15、pCHIKV-274.56及pCHIKV-299.56)使用PEI(GE Healthcare)轉染。轉染4日後，收集條件化培養基且於3000rpm離心15分鐘使其與細胞分離。使用0.45μm過慮器過濾上清液以獲得類病毒粒子。類病毒粒子使用TFF管柱濃縮且使用QXL管柱純化(GE Healthcare)以獲得經純化的類病毒粒子。當動物以類病毒粒子免疫時，經純化的類病毒粒子係使用旋轉管柱(分子量-截留：100kDa)進一步濃縮以製備用於免疫的類病毒粒子。

包含接合至CHIKV結構多肽之抗原274或299之VLP的表現係使用抗-CHIKV抗體藉由西方墨漬法確認(參照第6圖)。如見於第6圖，相較於當抗原插入至E2時，當抗原插入至E3時更有效率地製造抗原-經插入VLP。

實施例5：製備包含病毒結構蛋白質及瘧疾抗原的屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子

使用下述瘧疾CSP蛋白質的多肽製備包含瘧疾CSP重複抗原的CHIKV-VLP。對於抗原，SGG係N終端連結子(TCCGGAGGA於核序列)以及GGS係C終端連結子(GGAGGATCC於核序列)。

CSP重複抗原74(NPNA胺基酸序列之6重複)sggnpnanpnanpnanpnanpnanpnaggs(序列編號：56)

多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之531-位置的Ser及532-位置的Asn的密碼子之間以構築質體(後文指稱為pCHIKV-74.11)，用以表現其中經瘧疾CSP重複抗原插入至屈公病病毒結構蛋白質E2的屈公病病毒結構蛋白質。類似地，瘧疾CSP重複抗原係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體(後文指稱為pCHIKV-74.16)，用以表現其中經瘧疾CSP重複抗原插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。

293F細胞(Lifetechnology)係以180μg之各質體(亦即，分別為pCHIKV-74.11及pCHIKV-74.16)使用PEI(GE Healthcare)轉染。轉染4日後，收集條件化培養基且於3000rpm離心15分鐘使其與細胞分離。使用0.45μm過慮器過濾上清液以獲得類病毒粒子。類病毒粒子使用TFF管柱濃縮且使用QXL管柱純化(GE Healthcare)以獲得經純化的類病毒粒子。當動物以類病毒粒子免疫時，經純化的類病毒粒子係使用旋轉管柱(分子量-截留：100kDa)進一步濃縮以製備用於免疫的類病毒粒子。

包含接合至CHIKV結構多肽之VLP74的VLP表現係使用抗-CHIKV抗體藉由西方墨漬法確認(參照第7圖)。如見於第7圖，相較於當抗原插入至E2時，當抗原插入至E3時更有效率地製造抗原-經插入VLP。

實施例6：製備包含病毒結構蛋白質及CTLA-4抗原的屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子

使用下述CTLA-4蛋白質的多肽製備包含CTLA-4抗原的CHIKV-VLP。對於抗原，SGG係N終端連結子(TCCGGAGGA於核序列)以及GGS係C終端連結子(GGAGGATCC於核序列)。

mCTLA4_ver2 sggggkvelmypppyfvgmggggs(序列編號：74)

tccggaggcggcggcaaggtggaactcatgtacccaccgccatactttgtgggcatgggcggcggcggatcc(序列編號：78)

mCTLA4_ver4 sggcattftekntvgfldypfcggs(序列編號：79)

tccggaggctgtgccacgacattcacagagaagaatacagtgggcttcctagattaccccttctgcggcggatcc(序列編號：80)

mCTLA4_ver5 sggattftekntvgfldypfggs(序列編號：81)

tccggaggcgccacgacattcacagagaagaatacagtgggcttcctagattaccccttcggcggatcc(序列編號：82)

多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體用以表現其中經mCTLA-4抗原插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。

293F細胞(Lifetechnology)係以180μg之各質體使用PEI(GE Healthcare)轉染。轉染4日後，收集條件化培養基且於3000rpm離心15分鐘使其與細胞分離。使用0.45μm過慮器過濾上清液以獲得類病毒粒子。類病毒粒子使用TFF管柱濃縮且使用QXL管柱純化(GE Healthcare)以獲得經純化的類病毒粒子。當動物以類病毒粒子免疫時，經純化的類病毒粒子係使用旋轉管柱(分子量-截留：100kDa)進一步濃縮以製備用於免疫的類病毒粒子。

包含接合至CHIKV結構蛋白質的mCTLA-4_ver2、4及5的VLP的表現係使用抗-CHIKV猴血清藉由西方墨漬法確認。

實施例7：製備成熟CHIKV VLP

使用可表現其中於CHIKV的E3區域末端之弗林位點RQRR經SGGGS置換的CHIUKVKV病毒結構蛋白質的CHIKV-P2 VLP表現質體；可表現其中於CHIKV的E3區域末端之弗林位點RQRR經因子Xa辨識模體IDGR置換的CHIKV病毒結構蛋白質的CHIKV-Xa VLP表現質體，以及可表現其中於CHIKV的E3區域末端之弗林位點RQRR經腸激酶辨識模體DDDDK置換的CHIKV病毒結構蛋白質的CHIKV-En VLP表現質體。將所有三種質體10ug轉染至293F細胞且於轉染4日後，收集上清液。20ul之上清液以水(對照)、因子Xa或腸激酶處理隔夜。使用抗CHIKV的血清藉由西方墨漬法測定上清液中的VLP。結果示於第8圖。

未成熟的VLP係表現於以質體CHIKV-P2、CHIKV-Xa及CHIKV-En轉染的細胞的上清液中。由經CHIKV-Xa-轉染的細胞所產生的未成熟VLP係以因子Xa分解。未成熟VLP利用E3且其成為成熟VLP型(第5道)。由經CHIKV-En-轉染細胞所產生的未成熟VLP係以腸激酶分解。未成熟VLP利用E3且其成為成熟VLP型(第9道)。

實施例8製備成熟VEEV VLP

使用可表現其中於VEEV的E3區域末端之弗林位點RQRR經SGGGS置換的VEEV病毒結構蛋白質的VEEV-P2 VLP表現質體，可表現其中於VEEV的E3區域末端之弗林位點RQRR經因子Xa辨識模體IDGR置換的VEEV病毒結構蛋白質的VEEV-IDGR VLP表現質體，以及可表現其中於VEEV的E3區域末端之弗林位點RQRR經另一因子Xa辨識模體IEGR置換的VEEV病毒結構蛋白質的VEEV-IEGR質體。將所有三種質體10ug轉染至293F細胞且於轉染4日後，收集上清液。20ul之上清液以水(對照)、因子Xa處理隔夜。使用抗VEEV的血清藉由西方墨漬法測定上清液中的VLP。未成熟VLP係表現於經質體VEEV-P2、VEEV-IDGR及VEEV-IEGR轉染的細胞的上清液中。由經VEEV-IDGR及VEEV-IEGR-轉染的細胞所產生的未成熟VLP係以因子Xa分解。結果示於第9圖。由經VEEV-IDGR及VEEV-IEGR-轉染的細胞所產生的未成熟VLP利用E3且其成為成熟VLP型(第5道及第6道)。

實施例9：製備包含經插入至該病毒結構蛋白質之套膜蛋白質E3之DISC1_451、452或454的屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子

使用下述DISC1蛋白質的多肽製備包含DISC1抗原的CHIKV-VLP。

對於抗原，SGG係N終端連結子(TCCGGAGGA於核序列)以及GGS係C終端連結子(GGAGGATCC於核序列)。

個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之531-位置的Ser及532-位置的Asn的密碼子之間，以及插入至編碼序列編號：2之321位置的H及326-位置的S密碼子之間以構築質體，用以表現其中經DISC-1衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E2及E3的屈公病病毒結構蛋白質。個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體(後文分別指稱為pCHIKV-299.56及pCHIKV-274.56)，用以表現其中經DISC-1-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。

293F細胞以表現VLP之指定的DISC1轉染。轉染4日後，收取上清液。

包含接合至CHIKV結構蛋白多肽的 DISC1_451、_452或_454的VLP的表現係使用抗-CHIKV抗體藉由西方墨漬法確認(參照第10圖)。一級抗體(1：1000稀釋)為抗屈公病病毒的抗血清以及二級抗體(1：5000稀釋)為抗-小鼠IgG-HRP抗體。如第10圖所見，當抗原插入至E3及E2與E3二者(雙重)時，製造出DISC1_451、_452及_454-經插入VLP。

實施例10：製備包含經插入至該病毒結構蛋白質之套膜蛋白質E3之IL-2的屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子

人類IL-2突變體係根據揭示於Levin et.al,Nature 484(7395)：529-533,2012的方法製備。小鼠IL-2突變體為F54A(Mott HR et al.J.Mol.Biol.247,979-994,1995)及D34K(Berndt et al.Biochemistry 33,6571,1994)，該等文獻之全部內容以參考方式併入本文。

個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體(後文分別指稱為pCHIKV-299.56及pCHIKV-274.56)，用以表現其中經IL-2-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。根據揭示於實施例6的相同方式，製備及純化包含IL-2的類屈公病病毒粒子。

包含接合至CHIKV結構多肽的IL-2之VLP係使用小鼠抗CHIKV抗體藉由西方墨漬法確認(參照第11圖及第12圖)。如第11圖及第12圖所見，當該等抗原插入至E3時，製造出人類IL-2野生型、人類IL-2突變體、小鼠IL-2野生型及小鼠IL-2突變體-經插入VLP。

所提供於其等之套膜蛋白質E3包含IL-2衍生肽之CHIKV病毒結構蛋白質以及表現該病毒結構蛋白質的表現載體為序列編號：83至92。該等序列含有6K蛋白質但該6K蛋白質係作為信號序列用以傳輸E1蛋白質至內質網，其於該處藉由宿主信號肽酶處理且其不組裝至病毒粒子。

實施例11：藉由肌內注射包含經插入至該病毒結構蛋白質的E2及E3二者之小鼠瘧疾(約氏瘧疾原蟲(Plasmodium yoelii))的CHIKV VLP之小鼠對抗瘧疾(約氏瘧疾原蟲(Plasmodium yoelii))的保護

包含經約氏瘧疾原蟲CSP 4X重複插入至套膜蛋白質E2及E3(261.261 CHIKV VLP)之屈公病病毒VLP以及包含經約氏瘧疾原蟲CSP 14X重複插入至套膜蛋白質E2及E3(264.264 CHIKV VLP)之屈公病病毒VLP係以前述實施例類似方式製備與純化。使用於此實施例之具有連結子的重複抗原的胺基酸序列及核苷酸序列為序列編號：93至96。於E2及E3二者含有抗原之CHIKV病毒結構蛋白質以及該等病毒結構蛋白質的表現載體為序列編號：97至100。該等序列含有6K蛋白質但該6K蛋白質係作為信號序列用以傳輸E1蛋白質至內質網，其於該處藉由宿主信號肽酶處理且其不組裝至病毒粒子。

於第0週及第3週藉由2次肌內注射以 261.261 CHIKV VLP或264.264 CHIKV VLP使小鼠(n=10)免疫。VLP與鋁膠複合佐劑於注射前混合。於第5週，以261.261 CHIKV VLP、264.264 CHIKV VLP及無插入抗原之CHIKV VLP(對照)免疫的小鼠以1000劑量的約氏瘧疾原蟲子胞子進行靜脈內挑戰。

瘧疾感染藉由PCR確認。自挑戰後14日之小鼠血液純化基因體DNA。藉由PCR放大18S瘧疾DNA。第13圖顯示PCR的結果，表示以對照VLP免疫的10隻小鼠中，9隻小鼠感染瘧疾；以包含經瘧疾CSP 4X重複插入至套膜蛋白質E2及E3二者的屈公病病毒VLP(261.261 VLP)免疫的10隻小鼠中，9隻小鼠未受到瘧疾感染；以及以包含經瘧疾CSP 14X重複插入至套膜蛋白質E2及E3二者的屈公病病毒VLP免疫的10隻小鼠中，9隻小鼠未受到瘧疾感染。

實施例12：包含病毒結構蛋白質以及人類瘧疾CSP重複抗原決定基：74.74(E2及E3(雙重)插入)、74(E2插入)及74(E3插入)之屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子之免疫原性

包含瘧疾CSP 6X重複抗原(6XNPNA)於其E2或E3，以及E2及E3二者之屈公病病毒結構蛋白質係以前述實施例類似方式製備。包含CSP 6X重複抗原於E2及E3二者之CHIKV病毒結構蛋白質為序列編號：101，以及該病毒結構蛋白質之表現載體為序列編號：102(74.74.58)。包含CSP 6X重複抗原之CHIKV VLP係以實施例6相同方氏製備及純化。

以10ug的指定VLP免疫小鼠(每群n=4)。免疫後10日藉由以重組CSP被覆的ELISA測定經免疫小鼠的血清中之抗-CSP抗體。

第14圖顯示E3-經插入以及E2-與E3-經插入(雙重)的VLP具有高於E2-經插入的VLP之效價。

實施例13：製備包含病毒結構蛋白質及hHer2抗原之屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子

使用下述衍生自hHer2之多肽製備包含hHer2抗原之CHIKV-VLP。對於抗原，SGG係N終端連結子(TCCGGAGGA於核序列)以及GGS係C終端連結子(GGAGGATCC於核序列)。

個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之531-位置的Ser及532-位置的Asn的密碼子之間以構築質體，用以表現其中經hHer2-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E2的屈公病病毒結構蛋白質。類似地，個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體，用以表現其中經hHer2-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。

根據實施例6所揭示的相同方式，製備及純化該包含hHER2的類屈公病病毒粒子。

包含接合至CHIKV結構多肽的hHER2的VLP的表現係使用小鼠抗CHIKV抗體藉由西方墨漬法確認(參照第15圖)。其等之中，因其等編碼不同的抗原決定基，401、404、406及409有相對高的表現程度。

實施例14：免疫原性

小鼠(每群n=4)以10ug包含經hHER2抗原#401插入至E2或插入至E2與E3二者(雙重)的CHIKV VLP免疫。於第0週及第3週藉由肌內注射包含hHER2抗原的VLP或未包含抗原的CHIKV VLP免疫小鼠(n=10)2次(每隻小鼠20ug VLP)。於注射前將VLP與鋁膠佐劑混合。

第二次免疫後2週(第一次免疫後5週)，藉由經以重組hHER2被覆的ELISA盤測定經免疫小鼠血清中的抗-hHER2抗體效價。

第16圖顯示包含hHER2抗原#401於E2或於E2與E3二者(雙重)的CHIKV VLP產生對抗hHER2蛋白質的抗體，以及經雙重插入之VLP，亦即經抗原插入至E2-與E3-二者，相較於經抗原插入至E2的VLP，可提供較高效價。

實施例15：製備包含病毒結構蛋白質及hHER2抗原之屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子

使用下述衍生自hHER2蛋白質(GENBANK序號： NM_001005862)的多肽以及衍生物製備包含hHER2抗原的CHIKV-VLP。

該等胺基酸序列對應於序列編號128、129、130及131。

對於抗原，SGG係N終端連結子以及GGS係C終端連結子。

個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體，用以表現其中經hHER2-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。

個別的多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之531-位置的Ser及532-位置的Asn的密碼子之間以構築質體，用以表現其中經hHER2-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E2的屈公病病毒結構蛋白質。

類似地，個別的多核苷酸係插入至屈公病病毒結構蛋白質的E2與E3二者。

根據實施例6所揭示的相同方式，製備及純化包含hHER2的類屈公病病毒粒子。包含經hHER2插入至 CHIKVE病毒結構蛋白質的E2、E3或E2與E-3雙重(E2與E3二者)的VLP2表現係使用抗CHIKV抗體藉由西方墨漬法確認。

實施例16：製備包含病毒結構蛋白質及BTLA抗原的屈公病病毒(CHIKV)-類病毒粒子

使用hBTLA的多肽(383：SGGCKLNGTTCGGS(序列編號：132)，衍生自GENBANK序號：NM_001085357)製備包含hBTLA抗原的CHIKV-VLP。對於抗原，SGG係N終端連結子以及GGS係C終端連結子。

編碼該胜肽之多核苷酸係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體，用以表現其中經hBTLA-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。

根據實施例6所揭示相同方式，製備及純化包含hBTLA抗原的類屈公病病毒粒子。

藉由傳統步驟自經以由此所獲得之VLP免疫的小鼠製備單株抗體。單株抗體結合至抗原的性質係藉由以BTLA蛋白質被覆的ELISA測定。第17圖顯示包含BTLA抗原的CHIKV VLP可產生結合至小鼠BTLA(mBTLA)蛋白質及人類BTLA(hBTLA)蛋白質二者之單株抗體。

實施例17：製備包含病毒結構蛋白質以及HVEM抗原的屈公病(CHIKV)-類病毒粒子

使用下述人類HVEM肽(hHVEM，衍生自GENBANK序號：NM_001297605)製備包含hHVEM抗原的CHIKV-VLP。

354：SGGCVKEASGELTGTVCGGS(序列編號：133)

356：SGGCYRVKEASGELTGTVSEPCGGS(序列編號：134)

362：SGGCSRNSSRTENAVCGGS(序列編號：135)

372：SGGCQMSDPAMGLRSRNCGGS(序列編號：136)

對於抗原，SGG係N終端連結子以及GGS係C終端連結子。編碼該胜肽的多核甘酸係插入至編碼序列編號：2之321-位置的H及326-位置的S的密碼子之間以構築質體，用以表現其中經hHVEM-衍生肽插入至屈公病病毒結構蛋白質的E3的屈公病病毒結構蛋白質。

根據實施例6所揭示相同方式，製備及純化包含hHVEM的類屈公病病毒粒子。包含接合至CHIKV結構多肽的hHVEM的VLP表現係經確認(參照第18圖)。

實施例18：來自安定細胞株的未成熟CHIKV表現

製備表現實施例8所獲得未成熟的經轉染細胞株。

1. 293F細胞以使用於實施例8之含有如潮黴素B之選擇標記的表現載體轉染。

2. 培養經轉染的細胞一日。

3. 將經轉染的細胞於含有潮黴素150 200ug/ml的選擇培養基中培養1至2週。

4. 選擇可於選擇培養基中生長且分裂至少一次的細胞。

5. 單離及選殖單一細胞。然後藉由西方墨漬法確認該等細胞分泌VLP。

將經選殖之細胞於包含丁酸鈉的培養基中培養3個月，獲得培養物的上清液且確認上清液中的未成熟VLP。結果示於第19圖。數據顯示所獲得細胞株為安定的且能長時期持續地產生未成熟VLP。

實施例19：藉由PD-L1 VLP之對抗腫瘤的保護

使用實施例4所獲得之PD-L1 VLP。小鼠(每群n=10)於第0、3、6及9週注射PBS(對照)或PD-L1 VLP。

小鼠於第8週以CT26細胞株挑戰(1×10⁶細胞)。測量腫瘤尺寸。

第20週顯示PD-L1 VLP保護小鼠對抗腫瘤。

實施例20：製備包含病毒結構蛋白質及經插入至該病毒結構蛋白質的套膜蛋白質E2與E3二者的瘧疾抗原之類屈公病病毒(CHIKV)粒子的醫藥組成物

包含瘧疾CSP 14X重複抗原76(14XNPNA)僅於E3或於E2與E3二者的屈公病病毒結構蛋白質係根據前述實施例類似方式表現(含有CSP 14X重複抗原76於E2與E3之CHIKV病毒結構蛋白質為序列編號：103以及該病毒結構蛋白質的表現載體為序列編號：104)。以前述實施例類似方式製備及純化該類屈公病病毒粒子。包含接合至CHIKV結構多肽的CSP重複抗原76的VLP表現係藉由抗 CHIKV-VLP免疫猴血清之西方墨漬法確認。參照第21圖。

為了製備疫苗組成物之醫藥組成物，混合80μg所製備之粒子與1ml蔗糖磷酸鹽溶液，pH 7.2，無內毒素(Teknova，SP緩衝液)。

BALB/c小鼠群(n=4)以15μg由此所獲得之VLP，具有或不具有鋁膠2%佐劑，3週間隔肌內免疫3次。第3次用藥後2週收集血清。藉由使用(NANP)₆胜肽被覆之ELISA測定血清抗-CSP NANPO效價。此試驗結果係呈現於第22圖。含有CSP抗原決定基NANP的VLP刺激抗-CSP NANP抗體的製造且該反應因鋁膠的使用而增強。

<110> VLP醫療股份有限公司

<120> 包含改質套膜蛋白質E3之類病毒粒子

<150> US 62/035,037

<151> 2014-08-08

<150> US 62/079,128

<151> 2014-11-13

<150> US 62/101,514

<151> 2015-01-09

<150> US 62/120,569

<151> 2015-02-25

<150> US 62/198,949

<151> 2015-07-30

<160> 139

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1248

<212> PRT

<213> 屈公病毒結構蛋白質

<220>

<221> misc_feature

<222> (749)..(809)

<223> 6K

<400> 1

<210> 2

<211> 1248

<212> PRT

<213> 屈公病病毒結構蛋白質

<220>

<221> misc_feature

<222> (749)..(809)

<223> 6K

<400> 2

<210> 3

<211> 1255

<212> PRT

<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質

<220>

<221> misc_feature

<222> (758)..(813)

<223> 6K

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CSP抗原

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CSP抗原

<400> 5

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 8

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 9

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 11

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 12

<210> 13

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 13

<210> 14

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1抗原

<400> 14

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 15

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 16

<210> 17

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 17

<210> 18

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 18

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 19

<210> 20

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 20

<210> 21

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 21

<210> 22

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 22

<210> 23

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 23

<210> 24

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 24

<210> 25

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 25

<210> 26

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗原

<400> 26

<210> 27

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA-4抗原

<400> 27

<210> 28

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA-4抗原

<400> 28

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA-4抗原

<400> 29

<210> 30

<211> 8401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> _CHI 0抗原(E3)載體

<400> 30

<210> 31

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV殼體37997株

<400> 31

<210> 32

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV E1(37997株)

<400> 32

<210> 33

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV E3-插入-E2(37997株)

<220>

<221> NON_CONS

<222> (60)..(61)

<223> 抗原將被插入

<400> 33

<210> 34

<211> 8422

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> _VEEV 0.66載體

<400> 34

<210> 35

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV殼體

<400> 35

<210> 36

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV E1

<400> 36

<210> 37

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV E3-插入-E2

<220>

<221> NON_CONS

<222> (61)..(62)

<223> 抗原將被插入

<400> 37

<210> 38

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有CSP重複74的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 38

<210> 39

<211> 3843

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有CSP重複74(74.66)的VEEV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 39

<210> 40

<211> 3789

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠PD-1抗原"274"的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 40

<210> 41

<211> 3810

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠PD-1抗原"274"(274.66)的VEEV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 41

<210> 42

<211> 3783

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠PDL1抗原"299"的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 42

<210> 43

<211> 3804

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠PDL1抗原(299.66)的VEEV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 43

<210> 44

<211> 3804

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠CTLA4_Ver2抗原的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 44

<210> 45

<211> 3825

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠CTLA4ver2抗原的VEEV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 45

<210> 46

<211> 351

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV E3-瘧疾-E2

<400> 46

<210> 47

<211> 502

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV E3-PD-1-E2

<400> 47

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<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV E3-PD-L1-E2

<400> 48

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<211> 507

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV E3-CTLA-4-E2

<400> 49

<210> 50

<211> 508

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV E3瘧疾-E2(74.66)

<400> 50

<210> 51

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV E3-PD-1-E2

<400> 51

<210> 52

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV E3-PD-L1-E2

<400> 52

<210> 53

<211> 502

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV E3-CTLA-4-E2

<400> 53

<210> 54

<211> 3747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV

<400> 54

<210> 55

<211> 3768

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV

<400> 55

<210> 56

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的瘧疾抗原

<400> 56

<210> 57

<211> 8476

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有CSP重複抗原"74"(74.16)的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 57

<210> 58

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的瘧疾抗原

<400> 58

<210> 59

<211> 8497

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有抗原"261"(261.66)的VEEV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 59

<210> 60

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的CSP重複抗原"74"(NPNA的6重複)

<400> 60

<210> 61

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的CSP重複抗原"76"(NPNA的14重複)

<400> 61

<210> 62

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的CSP重複抗原"76"(NPNA的14重複)

<400> 62

<210> 63

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的CSP重複抗原"78"(NPNA的25重複)

<400> 63

<210> 64

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的CSP重複抗原"78"(NPNA的25重複)

<400> 64

<210> 65

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CSP重複抗原"261"(qgpgap的重複)

<400> 65

<210> 66

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 302R(具有連接子的之衍生自pfs25的抗原)

<400> 66

<210> 67

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 302R(具有連接子的之衍生自pfs25的抗原)

<400> 67

<210> 68

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 303R(具有連接子的之衍生自pfs25的抗原)

<400> 68

<210> 69

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 303R(具有連接子的之衍生自pfs25的抗原)

<400> 69

<210> 70

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 299(具有連接子的小鼠PD-L1抗原)

<400> 70

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 299(具有連接子的小鼠PD-L1抗原)

<400> 71

<210> 72

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 274(具有連接子的小鼠PD-1抗原)

<400> 72

<210> 73

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 274(具有連接子的小鼠PD-1抗原)

<400> 73

<210> 74

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的mCTLA-4_ver2抗原

<400> 74

<210> 75

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV殼體(OPY-1株)

<400> 75

<210> 76

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV E1(OPY-1株)

<400> 76

<210> 77

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV E3-插入-E2(OPY-1株)

<220>

<221> NON_CONS

<222> (60)..(61)

<223> 抗原將被插入

<400> 77

<210> 78

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的mCTLA-4_ver2

<400> 78

<210> 79

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的mCTLA-4_ver4

<400> 79

<210> 80

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的mCTLA-4_ver4

<400> 80

<210> 81

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的mCTLA-4_ver5

<400> 81

<210> 82

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的mCTLA-4_ver5

<400> 82

<210> 83

<211> 9257

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠IL2(wt)抗原的CHIKV 表現載體

<400> 83

<210> 84

<211> 1398

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E3中含有小鼠IL2(wt)抗原的CHIKV

<400> 84

<210> 85

<211> 9212

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有人類IL-2(wt)抗原的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 85

<210> 86

<211> 1383

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E3中含有人類IL-2(wt)抗原的CHIKV病毒結構蛋白質

<400> 86

<210> 87

<211> 9257

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠IL-2(F54A)抗原的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 87

<210> 88

<211> 1398

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E3中含有小鼠IL-2(F54A)抗原的CHIKV病毒結構蛋白質

<400> 88

<210> 89

<211> 9257

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有小鼠IL-2(D34K)抗原的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 89

<210> 90

<211> 1398

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E3中含有小鼠IL-2(D34K)抗原的CHIKV病毒結構蛋白質

<400> 90

<210> 91

<211> 9212

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E3中含有人類IL-2(FDVVF突變體)抗原的CHIKV病毒結構蛋白質的表現載體

<400> 91

<210> 92

<211> 1383

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有人類IL-2(FDVVF突變體)抗原的CHIKV病毒結構蛋白質

<400> 92

<210> 93

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的小鼠瘧疾(約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii))CSP抗原決定基4X(261)

<400> 93

<210> 94

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 94

<210> 95

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的小鼠瘧疾(約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii))CSP抗原決定基14X(264)

<400> 95

<210> 96

<211> 270

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的小鼠瘧疾(約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii))CSP 抗原決定基14X(264)

<400> 96

<210> 97

<211> 1303

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2及E3(261雙重)中含有CSP抗原決定基4X(261)的CHIKV病毒結構蛋白質

<400> 97

<210> 98

<211> 8972

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E2及E3中(261.261.58)含有CSP抗原決定基4X(261)的CHIKV結構蛋白質表現載體

<400> 98

<210> 99

<211> 1423

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV 264.264.58(264雙重)

<400> 99

<210> 100

<211> 9332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E2及E3(264雙重)中含有CSP抗原決定基14X(264)的CHIKV病毒結構蛋白質表現載體

<400> 100

<210> 101

<211> 1303

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2及E3中(74雙重)含有CSP抗原74的CHIKV病毒結構蛋白質

<400> 101

<210> 102

<211> 8972

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E2及E3(74雙重)中含有CSP抗原74的CHIKV病毒結構蛋白質表現載體(CHIKV 74.74.58)

<400> 102

<210> 103

<211> 1367

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2及E3(76雙重)中含有CSP抗原76的CHIKV病毒結構蛋白質

<400> 103

<210> 104

<211> 9164

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對於E2及E3中含有CSP抗原76的CHIKV病毒結構蛋白質表現載體(76.76.58)

<400> 104

<210> 105

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的DISC1_451抗原

<400> 105

<210> 106

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的DISC1_452抗原

<400> 106

<210> 107

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的DISC1_454抗原

<400> 107

<210> 108

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 108

<210> 109

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 109

<210> 110

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 110

<210> 111

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 111

<210> 112

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 112

<210> 113

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 113

<210> 114

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 114

<210> 115

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 115

<210> 116

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 116

<210> 117

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的DISC1_451

<400> 117

<210> 118

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的DISC1_452

<400> 118

<210> 119

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的DISC1_454

<400> 119

<210> 120

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的hHER2抗原

<400> 120

<210> 121

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的hHER2抗原

<400> 121

<210> 122

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 122

<210> 123

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 123

<210> 124

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HER2抗原

<400> 124

<210> 125

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 125

<210> 126

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 126

<210> 127

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 127

<210> 128

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 128

<210> 129

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 129

<210> 130

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 130

<210> 131

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的HER2抗原

<400> 131

<210> 132

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的hBTLA抗原

<400> 132

<210> 133

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hHVEM抗原

<400> 133

<210> 134

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的hHVEM抗原

<400> 134

<210> 135

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的hHVEM抗原

<400> 135

<210> 136

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有連接子的hHVEM抗原

<400> 136

<210> 137

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV OPY-1株6K序列

<400> 137

<210> 138

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CHIKV 37997株6K序列

<400> 138

<210> 139

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEEV TC-83株6K序列

<400> 139

Claims

一種類病毒粒子，其包含病毒結構蛋白質，該病毒結構蛋白質包含套膜蛋白質E3，並且，該病毒結構蛋白質係衍生自α病毒屬，其中，位於該套膜蛋白質E3之弗林裂解位點係經改變或突變以預防弗林位點產生裂解，該套膜蛋白質E3係藉由在其弗林裂解位點插入至少一種外源性抗原而經改變或突變，該至少一種外源性抗原係插入至對應於序列編號：1之321及326的殘基之間、序列編號：2之殘基321及326之間或序列編號：3之殘基330及335之間。
如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中，該病毒結構蛋白質係衍生自屈公病病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒。
如申請專利範圍第2項所述之類病毒粒子，其中，該類病毒粒子係衍生自屈公病病毒株37997或株OPY-1，或委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83。
如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中，該套膜蛋白質E3係藉由在其弗林裂解位點置換、加成及/或刪除一個或多個胺基酸殘基而經改變或突變。
如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中，該病毒結構蛋白質包含殼體、套膜蛋白質E1、套膜蛋白質E2及套膜蛋白質E3。
如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，係更含有套膜蛋白質E2，其中，該至少一種外源性抗原係再插入至套膜蛋白質E2。
如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中，該至少一種外源性抗原係衍生自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)環子孢子蛋白質、PD-1、PD-L1、CTLA-4、DISC1、IL-2、HER2、BTLA或HVEM。
如申請專利範圍第7項所述之類病毒粒子，其中，選自(NPNA)n(n=4至30)、序列編號：6至9及15至29所代表之胺基酸序列之胜肽係插入至套膜E3蛋白質。
一種經單離的核酸分子，其包含編碼如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之類病毒粒子之核苷酸序列。
一種載體，其包含如申請專利範圍第9項所述之核酸分子，其中，該載體視需要包含可操作性地連結至該核酸分子的表現調控序列。
一種醫藥組成物或疫苗組成物，其包含(a)如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之類病毒粒子，以及(b)醫藥可接受載劑。
如申請專利範圍第11項所述之組成物，其係用於治療或預防癌、神經疾患、感染疾患或瘧疾；製造抗體對抗於哺乳動物中之該至少一種外源性抗原；調節免疫反應；免疫刺激；抑制該至少一種外源性抗原之功能；或於巨噬細胞呈現抗原。
一種如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之類病毒粒子之用途，其係用於製造醫藥，該醫藥係用以治療或預防癌、神經疾患、感染疾患或瘧疾；製造抗體對抗於哺乳動物中之該至少一種外源性抗原；調節免疫反應；免疫刺激；抑制該至少一種外源性抗原之功能；或於巨噬細胞呈現抗原。
一種細胞株，其表現病毒結構蛋白質，該病毒結構蛋白質包含套膜蛋白質E3，並且，該病毒結構蛋白質係衍生自α病毒屬，其中，位於套膜蛋白質E3之弗林裂解位點係經改變或突變以預防弗林位點裂解，該套膜蛋白質E3係藉由在其弗林裂解位點插入至少一種外源性抗原而經改變或突變，該至少一種外源性抗原係插入至對應於序列編號：1之321及326的殘基之間、序列編號：2之殘基321及326之間或序列編號：3之殘基330及335之間。
如申請專利範圍第14項所述之細胞株，其中，該細胞株為安定細胞株。
如申請專利範圍第14或15項所述之細胞株，其中，該E3係藉由蛋白酶移除。