CN104736568A - 诱导针对所有登革热病毒血清型的免疫性的疫苗及制造疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于生产具有黄热病毒和登革热病毒的部分的嵌合蛋白的方法。黄热病毒17D疫苗株(或其它相关的黄病毒)的包膜蛋白的一小部分可以被来自于登革热病毒包膜蛋白的相应部分替换。在一些实施方式中，所述嵌合蛋白可用于制造用于DENV感染的治疗组合物。在其它实施方式中，所述嵌合蛋白可用于制造疫苗，所述疫苗会诱导针对登革热病毒的广谱保护性抗体并减少会引起增强效应的非中和性抗体的诱导。

Description

诱导针对所有登革热病毒血清型的免疫性的疫苗及制造疫苗的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年10月25日提交的美国临时专利申请No.61/550,982的优先权和权益，所述美国临时专利申请以其全文通过引用并入本文之中。
政府支持
本发明是根据国防威胁降低局(Defense Threat Reduction Agency)批准的合作协议第HDTRA1-10-1-0009号在政府支持下作出的。政府可能享有本发明的某些权利。
背景技术
登革热病毒(DENV)为黄病毒属的成员，是世界各地的热带和亚热带地区中蚊子传播的病毒性疾病的最常见原因。每年有约5000万-1亿人感染DENV。DENV感染可以是无症状的，但最常见的是表现为登革热(DF)，一种自限性疾病。登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)是登革热感染的更严重并且威胁生命的表现。DENV造成了任何蚊子传播的病毒性病原体的最大社会和经济负担之一。没有对感染的特异性治疗，而且已经证明通过接种疫苗来控制登革热病毒是难以实现的。DHF/DSS的发病机理没有被完全理解。登革热病毒有四种血清型(DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4)。一种血清型的感染能够赋予终生的同型免疫性，但是对于异型血清型只有短期(约三至六个月)的交叉保护。
在具有多于一种的循环血清型的对象中发生二次异型感染期间，严重疾病的风险是最大的。有证据表明，先前感染一种类型能够在后续感染不同的血清型期间产生可以加剧或增强疾病进程的抗体应答。疫苗组分能够引起增强性抗体应答(与保护性应答相反)的可能性已经成为设计和测试疫苗以保护不受登革热感染中的主要担忧。因此，对于可以有效针对不同的血清型并且不会增强DENV感染进程的疫苗，存在着需求。
发明内容
本文描述了形成嵌合蛋白的方法，其包括以下步骤：提供具有SEQID NO.1的黄热病毒17-D包膜蛋白；提供选自SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的登革热病毒包膜蛋白；以及使SEQ ID NO.1的第1-11、28-30、32、42、44、46、70-81、95-99、110-115、142-147、149-157、236-242、304-324、333、335、337、350-352、355、356、362-370、377、379、386、388-393位氨基酸中的一个或多个被所选择的登革热病毒包膜蛋白的相应氨基酸取代以制造嵌合包膜蛋白。
本文还描述了制造治疗组合物的方法，其包括以下步骤：提供来自于黄病毒的包膜蛋白的一部分；提供选自SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的登革热病毒包膜蛋白；使黄病毒的包膜蛋白氨基酸的一部分被所选择的登革热病毒的相应包膜蛋白氨基酸取代以制造嵌合包膜蛋白；提供药学上可接受的赋形剂；以及将嵌合包膜蛋白和赋形剂混合。
本文进一步描述了嵌合蛋白，其包含：由具有SEQ ID NO.1的黄热病毒17-D包膜蛋白组成的包膜蛋白，其中黄热病毒17-D包膜蛋白的所选择的氨基酸被选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的登革热病毒包膜蛋白的相应氨基酸取代。
本文还描述了用于治疗登革热病毒的组合物，其包含：由黄病毒包膜蛋白组成的嵌合包膜蛋白，其中黄病毒包膜蛋白的所选择的氨基酸被选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的登革热病毒包膜蛋白的相应氨基酸取代；以及药学上可接受的赋形剂。
附图说明
图1显示了用固定化的病毒包膜糖蛋白、患者血清和来自于DENV感染患者的单克隆抗体所进行的ELISA测定的结果。
图2显示了将DENV-1至4感染的LLC-MK-2细胞暴露在来自于DENV感染患者的单克隆抗体下所进行的免疫荧光测定的结果。
图3显示了用DENV-1至4感染的LLC-MK-2细胞、患者血清、来自于DENV感染患者的单克隆抗体所进行的中和测定的结果。
图4显示了在存在来自于DENV感染患者的单克隆抗体的情况下所进行的增强测定的病毒摄取结果。
图5显示了在存在来自于DENV感染患者的单克隆抗体的情况下所进行的病毒-细胞结合抑制测定的结果。
图6显示了在存在来自于DENV感染患者的单克隆抗体的情况下所进行的病毒-脂质体结合抑制测定的结果。
图7显示了使用纯化的DENV-2进行的并使用来自于DENV感染患者的单克隆抗体进行探测的蛋白质免疫印迹测定的结果。
图8显示了使用可溶性蛋白E进行的并使用来自于DENV感染患者的单克隆抗体进行探测的蛋白质免疫印迹测定的结果。
图9显示了表位作图的结果，并给出了来自于DENV感染患者的单克隆抗体对于可溶性蛋白E的解离常数。
图10显示了用来自于DENV感染患者的单克隆抗体和4G2所进行的竞争性结合ELISA测定的结果。
图11显示了使用DI/II和DIII进行的并使用来自于DENV感染患者的单克隆抗体进行探测的蛋白质免疫印迹测定的结果。
图12显示了来自于DENV感染患者的单克隆抗体作图到E蛋白晶体结构上的残基。
图13显示了DENV-1至4与黄热17-D包膜蛋白的氨基酸序列比对。
图14显示了DENV包膜蛋白的蛋白质晶体结构并显示了融合环(黑色)及(绿色)和(鸭绿色)周围的氨基酸的位置。
具体实施方式
对于公共卫生官员而言，由登革热病毒感染所产生的严重并发症的出现已经成为日益严重的问题。登革出血热(DHF)和休克综合症(DSS)两者都是与预先存在的针对异源登革热病毒血清型的免疫性的存在有关的临床结果。登革出血热最初的特征在于持续3-5天的轻微发热病症。患者在退热期可能会恶化至带有凝血障碍和血管通透性增加并常常伴有内部出血和休克的综合症的下个阶段。自从其首次在泰国被确认以来，据报道多达150万的儿童因该综合征住院，其中有33,000例死亡(世界卫生组织，1989)。DHF/DSS此后继续存在，并且其爆发会给许多国家的公共卫生造成重大问题。
登革热病毒(DENV)是蚊子传播的病毒，并在地理范围以及疾病严重程度上不断扩大。存在四种不同的引起相似疾病症状的登革热血清型，血清型1-4。单一血清型的感染导致针对相同血清型的保护性免疫应答，但会引起针对其他血清型(以及其他黄病毒)的交叉反应性抗体应答。流行病学研究显示，在后续感染不同的血清型期间，交叉反应性抗体的存在与更加严重的疾病结果有关。该效应的机制似乎是表达Fc受体的巨噬细胞和巨噬细胞样细胞的感染的抗体依赖性增强。正常情况下，这些细胞不会被登革热病毒有效感染，但是在存在登革热病毒结合性抗体的情况下变得高度易受感染，所述抗体随后通过抗体重链和细胞Fc受体的相互作用使病毒粒子直接靶向至巨噬细胞。
一些研究试图通过表征人抗登革热单克隆抗体来确定针对登革热病毒的人抗体应答。在本研究之前，关于登革热感染的大部分免疫学研究都是在小鼠中进行的，而小鼠并不是登革热的天然宿主并且会产生非常不同的抗体应答。人类研究中得出的结论之一是，针对登革热病毒的表面蛋白、膜蛋白(prM和M)和包膜蛋白(E，可溶性包膜蛋白，sE)的主要人抗体应答是非中和性的，并对登革热的四种血清型具有交叉反应性。这些非中和性、交叉反应性的抗体是疾病的抗体依赖性增强的主要原因。这为利用整个prM和E蛋白的登革热疫苗的开发带来了问题。即使利用全长prM和E的疫苗制剂能够诱导针对所有四种血清型的广谱中和性应答，当中和性抗体应答随着时间推移减少时，占据优势的非中和性应答将继续保留并使疫苗接受者面临严重的疾病，如果他们再次受到感染的话。尚不清楚中和性疫苗应答会持续多长时间或者疫苗接受者可能在何时会有疾病增强的风险，但是几乎没有能够诱导终生保护的疫苗的实例。
本发明涉及嵌合蛋白，以及生产用于对个体进行免疫以针对登革热和登革热临床结果的嵌合蛋白的方法，以及用于治疗易受登革热病毒感染或被登革热病毒感染的个体的方法。在一些实施方式中，嵌合蛋白可用于制造用于感染个体的治疗组合物，而在其他实施方式中，嵌合蛋白可用于生产活的减毒疫苗或者不具备复制性的亚单位疫苗。
嵌合蛋白通过用任意的登革热病毒(DENV)(黄病毒属登革热病毒(Flavivirus denguebirus))株的包膜蛋白的一部分取代黄热病毒(YFV)(黄病毒属黄热病毒(Flavivirus yellow fever virus))包膜蛋白的一部分来制造。在一个实施方式中，使用YFV17D株的包膜蛋白来制造本发明的嵌合蛋白。虽然该实例被限定为YFV包膜蛋白，但在其他实施方式中可以设想的是，可以使用任何黄病毒例如西尼罗河病毒(West Nile Virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis)、登革热病毒、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis)和昆津病毒(Kunjinvirus)的包膜蛋白并且取代四种DENV株中任意一种的包膜蛋白来制造嵌合蛋白。
YFV17D株的包膜蛋白具有被鉴定为SEQ ID NO.1的如下序列：
AHCIGITDRDFIEGVHGGTWVSATLEQDKCVTVMAPDKPSLDISLETVAIDRPAEVRKVCYNAVLTHVKINDKCPSTGEAHLAEENEGDNACKRTYSDRGWGNGCGLFGKGSIVACAKFTCAKSMSLFEVDQTKIQYVIRAQLHVGAKQENWNTDIKTLKFDALSGSQEVEFIGYGKATLECQVQTAVDFGNSYIAEMETESWIVDRQWAQDLTLPWQSGSGGVWREMHHLVEFEPPHAATIRVLALGNQEGSLKTALTGAMRVTKDTNDNNLYKLHGGHVSCRVKLSALTLKGTSYKICTDKMFFVKNPTDTGHGTVVMQVKVSKGAPCRIPVIVADDLTAAINKGILVTVNPIASTNDDEVLIEVNPPFGDSYIIVGRGDSRLTYQWHKEGSSIGKLFTQTMKGVERLAVMGDTAWDFSSAGGFFTSVGKGIHTVFGSAFQGLFGGLNWITKVIMGAVLIWVGINTRNMTMSMSMILVGVIMMFLSLGVGA
DENV株1的包膜蛋白具有被鉴定为SEQ ID NO.2的如下序列：
MRCVGIGSRDFVEGLSGATWVDVVLEHGSCVTTMAKDKPTLDIELLKTEVTNPAVLRKLCIEAKISNTTTDSRCPTQGEATLVEEQDANFVCRRTFVDRGWGNGCGLFGKGSLITCAKFKCVTKLEGKIVQYENLKYSVIVTVHTGDQHQVGNESTEHGTTATITPQAPTXEIQLTDYGALTLDCSPRTGLDFNEMVLLTMKEKSWLVHKQWFLDLPLPWTSGASTSQETWNRQDLLVTFKTAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQTSGTTTIFAGHLKCRLKMDKLTLKGMSYVMCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQIKYEGTDAPCKIPFSTQDEKGVTQNGRLITANPIVTDKEKPVNIEAEPPFGESYIVIGAGEKALKLSWFKKGSSIGKMFEATARGARRMAILGDTAWDFGSIGGVFTSVGKLVHQIFGTAYGVLFSGVSWTMKIGIGVLLTWLGLNSRSTSLSMTCIAVGLVTLYLGVMVQA
DENV株2的包膜蛋白具有被鉴定为SEQ ID NO.3的如下序列：
MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTESRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMEGKXVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMEXKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKXVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMFETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQA
DENV株3的包膜蛋白具有被鉴定为SEQ ID NO.4的如下序列：
MRCVGVGNRDFVEGLSGATWVDVVLEHGGCVTTMAKNKPTLDIELQKTEATQLATLRKLCIEGKITNITTDSRCPTQGEAXLPEEQDQNYVCKHTYVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFQCLEPIEGKVVQYENLKYTVIITVHTGDQHQVGNETQGVTAEITPQASTTEAILPEYGTLGLECSPRTGLDFNEMILLTMKNKAWMVHRQWFFDLPLPWTSGATTETPTWNRKELLVTFKNAHAKKQEVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQNSGGTSIFAGHLKCRLKMDKLELKGMSYAMCTNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDXPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPVVTKKEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGDNALKINWYKKGSSIGKMFEATARGARRMAILGDTAWDFGSVGGVLNSLGKMVHQIFGSAYTALFSGVSWVMKIGIGVLLTWIGLNSKNTSMSFSCIAIGIITLYLGAVVQA
DENV株4的包膜蛋白具有被鉴定为SEQ ID NO.5的如下序列：
MRCVGVGNRDFVEGVSGGAWVDLVLEHGGCVTTMAQGKPTLDFELTKTTAKEVALLRTYCIEASISNITTATRCPTQGEPYLKEEQDQQYICRRDVVDRGWGNGCGLFGKGGVVTCAKFSCSGKITGNLVQIENLEYTVVVTVHNGDTHAVGNDTSNHGVTATITPRSPSVEVKLPDYGELTLDCEPRSGIDFNEMILMKMKKKTWLVHKQWFLDLPLPWTAGADTSEVHWNYKERMVTFKVPHAKRQDVTVLGSQEGAMHSALAGATEVDSGDGNHMFAGHLKCKVRMEKLRIKGMSYTMCSGKFSIDKEMAETQHGTTVVKVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNKEKVVGRVISSTPLAENTNSVTNIELEPPFGDSYIVIGVGNSALTLHWFRKGSSIGKMFESTYRGAKRMAILGETAWDFGSVGGLFTSLGKAVHQVFGSVYTTMFGGVSWMIRILIGFLVLWIGTNSRNTSMAMTCIAVGGITLFLGFTVQA
图13显示了YFV17D株的包膜蛋白与所有四种DENV株的包膜蛋白的比对。当在本发明中使用时，“相应氨基酸”如下所定义。图13可用于计算DENV包膜蛋白的哪些氨基酸与YFV包膜蛋白的氨基酸相对应。例如，图13显示，YFV包膜蛋白的第一个氨基酸丙氨酸与所有四种DENV株的包膜蛋白的第一个氨基酸甲硫氨酸相对应。作为另一实例，图13也可用于计算YFV包膜蛋白的第160个氨基酸赖氨酸与四种DENV株的包膜蛋白的下列氨基酸相对应：
DENV株 氨基酸位置 氨基酸
DENV1 第163个 苏氨酸
DENV2 第163个 赖氨酸
DENV3 第161个 谷氨酸
DENV4 第163个 苏氨酸
本领域技术人员可以利用其它黄病毒包膜蛋白例如利用尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒和昆津病毒的包膜蛋白来创建类似的氨基酸比对。这些氨基酸比对可以用于确定黄病毒包膜蛋白的哪个氨基酸与四种DENV株中任意一种的包膜蛋白相对应。
YFV包膜蛋白SEQ ID NO.1的第1-11、28-30、32、42、44、46、70-81、95-99、110-115、142-147、149-157、236-242、304-324、333、335、337、350-352、355、356、362-370、377、379、386、388-393位氨基酸中的任意一个或全部氨基酸都可被所期望的DENV株的包膜(E)蛋白的相应氨基酸取代，以制造本发明的嵌合蛋白。可以根据本领域技术人员已知的方法进行取代。例如，可以对包膜蛋白进行定点诱变以制造嵌合蛋白。简而言之，该方法利用了短的突变体DNA引物，所述引物特异性结合于待改变的区域，但是包含一个或少数几个特定的碱基变化，所述碱基变化将会导致编码改变从而取代新的特定期望的氨基酸。利用PCR扩增来复制带有E基因的细菌质粒，以产生新的全长突变体DNA链。然后使原始DNA链降解，只留下剩余的特异性突变的DNA链。
通过取代结构域II融合环近端的YFV包膜蛋白的氨基酸来制造嵌合蛋白。当在本发明中使用时，结构域II融合环“近端”的氨基酸是在YFV包膜蛋白的结构域II融合环附近的那些氨基酸，如图13所示。在一个实施方式中，在融合环的内的氨基酸是融合环近端的氨基酸。在另一个实施方式中，在融合环的内的那些氨基酸是融合环近端的氨基酸。图13中也显示了在融合环的和内的氨基酸。
融合环是黄病毒包膜蛋白的结构特征，其存在于结构域II的末端并负责包膜(E)蛋白与靶细胞脂质膜的直接相互作用。在感染过程中，融合环由于E蛋白的结构重排而向外突出，导致融合环“如鱼叉”刺入靶细胞膜中。这种相互作用对于随后的膜融合步骤来说是关键的，所述膜融合步骤由将细胞和病毒膜拉在一起的E蛋白的进一步移动所介导。如图13中所示，融合环在登革热和黄热病毒中是高度保守的。融合环中第105位的半胱氨酸(C)与第74位的保守半胱氨酸(C)形成二硫键。这个二硫键对于融合环的正确折叠来说是重要的。在融合环的和内的氨基酸在YFV和DENV感染中也是重要的。
可以设想的是，嵌合蛋白可用作用于DENV感染个体的治疗组合物。还可以设想的是，嵌合蛋白可用于制造用于预防感染的治疗组合物，或有效针对一种或所有四种DENV株的疫苗。
在一个实施方式中，嵌合蛋白例如用于疫苗的嵌合蛋白，可以利用黄热病毒(YFV)17D疫苗株的包膜蛋白的一小部分被来自于登革热病毒包膜蛋白的相应部分所替换。对于减毒疫苗来说，疫苗可以使用带有DENV/YFV杂交E蛋白的具有复制能力的YFV。通过降低病原体例如YFV的毒力但却仍然保持其活力(或“活的”)来制造减毒疫苗。减毒需要感染原并对它进行改变，使其变得无害或毒力降低。这些疫苗与通过“杀死”病毒而生产出来的那些疫苗(灭活疫苗)不同。或者，本发明可用于开发不具备复制性的亚单位疫苗。不是将灭活或减毒的微生物引入至免疫系统(其会构成“全剂”疫苗)，而是其片段能产生免疫应答并参与生产亚单位疫苗。
本发明还提出用于控制黄病毒进入细胞的方法，治疗和预防黄病毒感染的方法以及疫苗和药物组合物。除登革热病毒之外，黄病毒科还包括至少70种由节肢动物传播的病毒，其中有许多是感染人和其他脊椎动物的。黄病毒科的亚群包括西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、森林脑炎病毒(tick borne encephalitis)等。日本脑炎病毒血清复合物(serocomplex)包括西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis)、昆津病毒以及其他病毒。作为使黄热病毒(YFV)17D疫苗株的包膜蛋白的一小部分被来自于登革热病毒包膜蛋白的相应部分所替换的替代性方法，本发明可以将登革热中和性表位交换到任何其他相关的黄病毒中。
所有的黄病毒，包括西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒和昆津病毒，都具有相似的大小、对称性和外观。尽管事实是黄病毒可以使用不同的方式进入宿主细胞中，例如内吞(描述的是西尼罗河病毒和昆津病毒)和直接的细胞融合(描述的是登革热病毒和脑炎病毒)，但是所有黄病毒进入宿主细胞都涉及病毒与细胞受体之间的相互作用。
由于黄病毒的病毒包膜蛋白在介导病毒-宿主细胞受体的相互作用中发挥作用，本发明考虑将登革热中和性表位应用到任何其他相关的黄病毒中。
本发明制造了一种疫苗，所述疫苗会诱导针对登革热病毒的广谱保护性抗体并减少会引起增强效应的非中和性抗体的诱导。本发明涉及疫苗和生产疫苗的方法，其中利用了对负责诱导对登革热病毒的中和性抗体应答的E蛋白区域进行定义的信息。中和性抗体能够产生感染增强效应，但是它们只有在亚中和浓度下才会这么做，而非中和性抗体在所有浓度下都产生增强效应。本发明认识到，如果人抗体应答能够从非中和性应答转为中和性应答，这就能够大幅降低疫苗接种后疾病增强的风险。本发明提供了一种显著降低诱导增强性抗体应答的风险的疫苗。疫苗制剂可以通过仅包含诱导中和性应答的登革热E蛋白表位而不包含产生非中和性应答的表位来实现这一点。本发明描述了一类常见的人广谱中和性单克隆抗体并鉴定了它们的结合表位，使得可进行疫苗制剂的设计。本发明已经确认了在黄热病毒疫苗株中进行替换的来自于登革热病毒的包膜部分，并考虑利用常规技术使得所得到的嵌合病毒能够生长得足够好以提供合适的疫苗应答。
在感染后两周、两月和两年的时间点，从在牙买加、新加坡和缅甸感染了登革热的三个患者中的每个患者中均测定到了广谱中和性单克隆抗体。这些抗体(4.8A，D11Ckl和1.6D)针对所有四种登革热血清型都表现出中和活性并识别由E蛋白融合环及其附近区域组成的共同表位。它们靶向这个区域，因为它们干扰了已知靶向融合环的先前得到表征的小鼠单克隆抗体(4G2)的结合，并且它们干扰了彼此的结合。
从机制实验中证实了融合环是靶标。这些抗体不干扰病毒：细胞结合，但是确实抑制了病毒与脂质体融合的能力。通过与一大组E蛋白突变体进行结合实验进一步确定了它们的表位。E蛋白中防止这些抗体的结合的突变作图在融合环中和融合环附近的位置上。
这些抗体(4.8A，D11Ckl和1.6D)没有显示出针对黄热病毒的强烈的中和活性，表明黄热病毒E蛋白缺少被这些抗体所识别的重要氨基酸序列。由于登革热病毒和黄热病毒的融合环是相同的，因此重要氨基酸的位置位于融合环的外面。登革热和黄热病毒E蛋白的氨基酸序列比对显示了登革热和黄热病毒之间的差异，这些差异负责抗体识别。
将这些登革热病毒特异性氨基酸序列交换到黄热病毒E蛋白中将产生嵌合E蛋白，所述嵌合E蛋白会诱导针对登革热的中和性抗体并被所述中和性抗体识别。该嵌合E蛋白可用作对黄热病毒17-D疫苗的修饰，该黄热病毒17-D疫苗是曾经开发的最成功的疫苗之一。
图1确定了患者血清的DENV特异性和广谱反应性。
图2确定了细胞背景下DENV抗原的特异性。
图3确定了来自于DENV感染患者的单克隆抗体和患者血清的中和活性。
图4确定了增强性浓度与对DENV-1至4的结合亲和性有关，同时还显示了中和。
图5排除了结合抑制机制。
图6确定了单克隆抗体D11Ckl的融合抑制机制。
图7显示了来自于DENV感染患者的单克隆抗体结合于与E大小一致的蛋白质，并且该表位在构象上是敏感的。
图8证实了来自于DENV感染患者的单克隆抗体与E结合，具体来说是与胞外结构域结合。
图9确定了来自于DENV感染患者的单克隆抗体与E蛋白结合的紧密程度。
图10确定了来自于DENV感染患者的单克隆抗体与已知的融合环结合物4G2竞争相同的结构域。
图11确定了来自于DENV感染患者的单克隆抗体与DI/II结合，这与融合抑制和竞争测定相一致。
图12证实了单克隆抗体4.8A表位是融合环和/或附近区域。
图13高亮显示了黄热病毒17-D包膜蛋白中可被DENV-1至4包膜氨基酸取代以制造嵌合E蛋白的氨基酸。它高亮显示了期望的氨基酸取代位置以及所推荐的氨基酸取代。
图14显示了DENV包膜蛋白的蛋白质晶体结构并显示了融合环及和周围分别10个、12个和14个氨基酸的位置。
在另一个方面中，本发明包括用于针对登革出血热和/或登革休克综合征对个体进行免疫的疫苗。该疫苗包括在药学上可接受的佐剂中的一种或多种所述类型的肽。
应当认识到，本发明提供了使用了将黄热病毒17D疫苗株(或其他相关的黄病毒)的包膜蛋白的一小部分被来自于登革热病毒包膜蛋白的相应部分替换的登革热疫苗及方法。这制造出了例如用于疫苗中的嵌合蛋白，所述疫苗会诱导针对登革热病毒的广谱保护性抗体并减少会引起增强效应的非中和性抗体的诱导。虽然已参考某些实施方式对本发明进行了描述，但是本领域技术人员会理解，可以在不背离本发明范围的情况下进行多种改变并进行等同形式的替换。此外，在不背离本发明范围的情况下，可以进行多种修改以使特定的情形和材料适用于本发明的教导。因此，本发明并非意在仅限于所公开的任何具体实施方式，而是包括落入权利要求书范围内的所有实施方式。

Claims (23)

1.形成嵌合蛋白的方法，其包括以下步骤：
提供具有SEQ ID NO.1的黄热病毒17-D包膜蛋白；
提供选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5的登革热病毒包膜蛋白；以及
使SEQ ID NO.1的第1-11、28-30、32、42、44、46、70-81、95-99、110-115、142-147、149-157、236-242、304-324、333、335、337、350-352、355、356、362-370、377、379、386、388-393位氨基酸中的一个或多个被所选择的登革热病毒包膜蛋白的相应氨基酸取代以制造嵌合包膜蛋白。
2.权利要求1的方法，其中被取代的氨基酸包括结构域II融合环近端的氨基酸。
3.权利要求2的方法，其中被取代的氨基酸包括在融合环的内的氨基酸。
4.权利要求2的方法，其中被取代的氨基酸包括在融合环的内的氨基酸。
5.治疗登革热病毒感染的方法，所述方法包括施用如权利要求1中所形成的嵌合蛋白的步骤。
6.制造治疗组合物的方法，其包括以下步骤：
提供来自于黄病毒的包膜蛋白的一部分；
提供选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5的登革热病毒包膜蛋白；
使黄病毒的包膜蛋白氨基酸的一部分被所选择的登革热病毒的相应包膜蛋白氨基酸取代以制造嵌合包膜蛋白；
提供药学上可接受的赋形剂；以及
将嵌合包膜蛋白和赋形剂混合。
7.权利要求6的方法，其中所述黄病毒选自西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒和昆津病毒。
8.权利要求6的方法，其中被取代的氨基酸包括融合环近端的氨基酸。
9.权利要求6的方法，其中被取代的氨基酸包括在融合环的内的氨基酸。
10.权利要求6的方法，其中被取代的氨基酸包括在融合环的内的氨基酸。
11.治疗登革热病毒感染的方法，所述方法包括施用如权利要求6中所形成的嵌合蛋白组合物的步骤。
11.嵌合蛋白，其包含：
由具有SEQ ID NO.1的黄热病毒17-D包膜蛋白组成的包膜蛋白，其中黄热病毒17-D包膜蛋白的所选择的氨基酸被选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的登革热病毒包膜蛋白的相应氨基酸取代。
12.权利要求11的嵌合蛋白，其中被取代的氨基酸包括结构域II融合环近端的氨基酸。
13.权利要求11的嵌合蛋白，其中被取代的氨基酸包括在融合环的内的氨基酸。
14.权利要求11的嵌合蛋白，其中被取代的氨基酸包括在融合环的内的氨基酸。
15.权利要求11的嵌合蛋白，其中SEQ ID No.1的第1-11、28-30、32、42、44、46、70-81、95-99、110-115、142-147、149-157、236-242、304-324、333、335、337、350-352、355、356、362-370、377、379、386、388-393位氨基酸中的一个或多个被所选择的登革热病毒包膜蛋白的相应氨基酸取代。
16.治疗登革热病毒感染的方法，所述方法包括施用权利要求11的嵌合蛋白的步骤。
17.用于治疗登革热病毒的组合物，其包含：
由黄病毒包膜蛋白组成的嵌合包膜蛋白，其中黄病毒包膜蛋白的所选择的氨基酸被选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的登革热病毒包膜蛋白的相应氨基酸取代；以及
药学上可接受的赋形剂。
18.权利要求17的组合物，其中黄病毒选自西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒和昆津病毒。
19.权利要求17的组合物，其中被取代的氨基酸包括融合环近端的氨基酸。
20.权利要求17的组合物，其中被取代的氨基酸包括在融合环的内的氨基酸。
21.权利要求17的组合物，其中被取代的氨基酸包括在融合环的内的氨基酸。
22.治疗登革热病毒感染的方法，所述方法包括施用权利要求11的嵌合蛋白的步骤。
23.治疗登革热病毒感染的方法，所述方法包括施用权利要求17的组合物的步骤。
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