CN109627294B

CN109627294B - 一种正确折叠的重组狂犬病毒g蛋白胞外段及其潜在应用

Info

Publication number: CN109627294B
Application number: CN201811631304.2A
Authority: CN
Inventors: 逯光文; 杨凡力; 叶飞; 林升; 杨婧
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Chengdu weisk biomedical Co.,Ltd.
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109627294A

Abstract

本发明公开了一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用，属于蛋白质工程和生物制品技术领域。本发明将狂犬病毒G蛋白胞外段中的融合环替换为柔性的连接肽，实现了狂犬病毒G蛋白胞外段的可溶和分泌表达，并成功制备得到了溶液中性质均一的蛋白，该方法在疫苗制备、中和抗体筛选以及用作诊断试剂盒和疫苗抗原含量标定的标准品等方面均具有重要的潜在应用价值。

Description

一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用

技术领域

本发明涉及一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用，属于蛋白质工程和生物制品技术领域。

背景技术

狂犬病毒(rabies virus,RABV)，又称为传统狂犬病毒，是目前造成绝大多数人类狂犬病的致病原，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病毒属(Lyssavirus)。狂犬病毒呈子弹状结构，直径约75-80nm，长度约170-180nm，为有囊膜包被的RNA病毒。其基因组为单股、负链、不分节段的RNA，大小约12kb，编码N(核蛋白)、L(转录复制酶蛋白)、P(磷酸化蛋白)、G(糖蛋白)和M(基质蛋白)共计五个蛋白。其中，糖蛋白(glycoprotein,G)是病毒囊膜中的唯一蛋白组分，其属于I型跨膜蛋白，成熟蛋白以三聚体形式定位于病毒囊膜中，形成约8-10nm的病毒刺突或棘突；在成熟的狂犬病毒粒子表面，约分布有300-400个这样的G蛋白刺突分子，占病毒总蛋白含量的40％以上。

狂犬病毒G蛋白(rabies virus glycoprotein,RABV-G)作为病毒囊膜中的唯一蛋白组分，是介导病毒对宿主细胞表面受体识别的唯一分子，也是行使膜融合功能介导病毒侵入的唯一病毒组分，因此，在病毒致病中发挥决定性作用。同时作为唯一暴露于病毒表面的病毒蛋白，狂犬病毒G蛋白还是病毒中和抗体的唯一靶点，是狂犬病毒疫苗的最重要抗原组分。鉴于狂犬病毒G蛋白的重要作用，具有良好理化性质的狂犬病毒G蛋白即可被用于疫苗制备和中和抗体筛选，也可被用作疫苗抗原含量标定的标准品等，具有重要的潜在应用价值。

狂犬病毒G蛋白全长按其氨基酸序列组成，由N-端到C-端分别包括信号肽(signalpeptide)、胞外段(ecto-domain)、跨膜区(transmembrane domain)和胞内段(cytoplasmicdomain)共四个功能区段，其中，胞外段是真正暴露于病毒粒子表面的G蛋白区段，是行使受体识别和膜融合的真正功能区段，也是疫苗制备中真正有效的抗原区段以及中和抗体的真正靶点。因此，如何实现体外制备具有良好理化性质且具有正确折叠的狂犬病毒G蛋白胞外段具有重要意义。

目前对狂犬病毒G蛋白表达制备的研究报道按其重组表达宿主的不同可大致分为四类：

1.利用原核蛋白表达系统(通常为工程大肠杆菌)表达G蛋白。通常将G蛋白全长或G蛋白胞外段自身直接在工程大肠杆菌中表达，或者将其与融合标签(如GST、SUMO等)融合后在工程大肠杆菌中表达。前者往往为不可溶的蛋白包涵体形式，或者仅极少量的蛋白可溶表达；后者虽然可以增加G蛋白的可溶表达比例，但是其融合标签往往难以切除，且蛋白虽然可溶，但其溶液中的均一性很差，在分子排阻层析中为空体积洗脱，证明其以无规则的多聚体形式存在。代表性的此类狂犬病毒G蛋白表达纯化研究可参考文献(1)。

2.利用酵母细胞表达G蛋白。通常将狂犬病毒G蛋白在毕赤酵母中进行表达。针对此类G蛋白的表达制备方法，虽然通过表达条件优化等，能在一定程度上实现蛋白的可溶和分泌表达，但其分泌表达量低。而尤其需要注意的是，此类利用酵母细胞表达狂犬病毒G蛋白的研究中，所表达的蛋白均未进行有效的纯化，因此均是通过western blot的方法进行蛋白检测；同时均缺少利用分子排阻层析、离子交换层析等层析方法对蛋白性质进行研究的数据，所表达的G蛋白在溶液中的理化性质等均未知。代表性的此类狂犬病毒G蛋白表达纯化研究可参考文献(2)。

3.利用昆虫细胞蛋白表达系统表达G蛋白。此类狂犬病毒G蛋白的表达研究多为全长蛋白在Drosophila S2(一种昆虫细胞)细胞中开展。此类表达尝试虽然能够实现狂犬病毒G蛋白的有效表达，但由于全长蛋白中跨膜区的存在，所表达的蛋白绝大多数均定位于昆虫细胞的膜组分中，需要使用去污剂(如NP-40等)再次萃取蛋白；且利用此类方法所获得的狂犬病毒G蛋白均缺少利用分子排阻层析、离子交换层析等层析方法对蛋白性质进行研究的数据，没有相关蛋白在溶液中的理化性质的研究。很可能是由于跨膜区的高度疏水性，由此所获得的G蛋白极易在溶液中聚集而形成高度不均一的蛋白多聚体，因而难以有效纯化。代表性的此类狂犬病毒G蛋白表达纯化研究可参考文献(3)。

4.利用哺乳动物细胞表达G蛋白。利用哺乳动物细胞表达狂犬病毒G蛋白，目前研究较多的为全长蛋白在CHO细胞中进行表达。同样由于全长蛋白含有疏水性很强的跨膜区，虽然G蛋白能够在细胞中表达，但大多数蛋白位于胞内膜组分中，分泌表达比例低；且针对所表达的蛋白，均缺少利用分子排阻层析、离子交换层析等层析方法对蛋白性质进行研究的数据，以及相应的蛋白在溶液中的理化性质分析。代表性的此类狂犬病毒G蛋白表达纯化研究可参考文献(4)。

可见，目前针对狂犬病毒G蛋白的表达尝试，虽然能够实现蛋白在原核或真核细胞中的表达，但所表达的蛋白存在诸如不可溶、难于纯化、不均一、溶液中的理化性质未知等诸多问题(见参考文献1～4)，尤其针对体外重组表达制备的狂犬病毒G蛋白，从未有任何成功结晶并解析蛋白质晶体结构以证明蛋白具有正确空间折叠的报道。因此，如何通过基因工程以及蛋白质工程手段，实现狂犬病毒G蛋白胞外段的体外重组表达，并进一步获得可溶、性质均一、理化性质好且具有正确空间折叠和天然构象的蛋白，是亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明利用基因工程手段，针对狂犬病毒G蛋白胞外段(RABV-G-ecto)进行了重组改造，将蛋白胞外段第一融合环中的第73～79位氨基酸所在区域和第二融合环中的第117～125位氨基酸所在区域分别替换为由5个氨基酸(GGSGG)组成的连接肽，同时在该序列的N-端引入GP67信号肽序列(用于蛋白的胞外分泌表达)，在该序列的C-端引入6xHis标签(用于重组表达蛋白的纯化)，由此获得改造后的重组RABV-G-ecto蛋白表达构建，并进一步利用杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统分泌表达该蛋白，利用亲和层析、离子交换层析和分子排阻层析进行纯化，成功获得了可溶、溶液中性质均一且高纯度的重组RABV-G-ecto蛋白，利用抗体识别和受体结合实验以及蛋白质结晶和结构解析证明该蛋白具有正确的空间折叠。本发明成功制备了具有可溶、性质均一、理化性质好等特征，且具有正确的空间折叠和天然构象的重组RABV-G-ecto蛋白。进一步，针对这一基于“融合环取代”的蛋白制备策略在不同长度的狂犬病毒G蛋白胞外段(包括完整的胞外段以及C-端截短的胞外段)、以及不同的狂犬病毒毒株的G蛋白胞外段的制备中进行了验证，证明此方法是一种针对不同长度的胞外段、以及针对不同的狂犬病毒毒株均广泛适用的、制备具有正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段的方法。

本发明中狂犬病毒G蛋白胞外段氨基酸的位点计算方式均以G蛋白去除信号肽后的第一个氨基酸计数为第1位。

本发明的第一个目的是提供一种制备可溶且均一性好的重组狂犬病毒G蛋白胞外段的方法，所述方法是用柔性连接肽替换狂犬病毒G蛋白胞外段融合环区域的至少3个氨基酸；所述融合环区域包括第一融合环(fusion loop 1，FL1)，即狂犬病毒G蛋白胞外段氨基酸序列第67～83位氨基酸所在区域，和第二融合环(fusion loop 2，FL2)，即狂犬病毒G蛋白胞外段氨基酸序列第110～128位氨基酸所在区域。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是用柔性连接肽替换狂犬病毒G蛋白融合环区域的至少5个氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是用柔性连接肽替换狂犬病毒G蛋白融合环区域的7～9个氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述融合环区域包括狂犬病毒G蛋白胞外段第一融合环中的第70～80位氨基酸所在区域，和狂犬病毒G蛋白胞外段第二融合环中的第114～126位氨基酸所在区域。

在本发明的一种实施方式中，所述融合环区域包括狂犬病毒G蛋白胞外段第一融合环中的第73～79位氨基酸所在区域，和狂犬病毒G蛋白胞外段第二融合环中的第117～125位氨基酸所在区域。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是用柔性连接肽替换狂犬病毒G蛋白胞外段第一融合环中的第73～79位氨基酸所在区域，和狂犬病毒G蛋白胞外段第二融合环中的第117～125位氨基酸所在区域。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白胞外段包括完整的胞外段，即狂犬病毒G蛋白氨基酸序列第1～439位氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白胞外段包括但不限于C-端截短的胞外段，即狂犬病毒G蛋白氨基酸序列第1～431位氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白胞外段包括但不限于C-端截短的胞外段，即狂犬病毒G蛋白氨基酸序列第1～425位氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白胞外段包括但不限于C-端截短的胞外段，即狂犬病毒G蛋白氨基酸序列第1～419位氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白胞外段包括但不限于C-端截短的胞外段，即狂犬病毒G蛋白氨基酸序列第1～414位氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白胞外段包括但不限于C-端截短的胞外段，即狂犬病毒G蛋白氨基酸序列第1～405位氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述柔性连接肽包括但不限于GS连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述GS连接肽包括但不限于GGS、GGGS、(GS)₂、GGSGG、GGGGS、GSGSG、(GGS)₂、(GS)₃、GGSGGSG、GSGSGSG、GGGSGGG、(GS)₄、GGSGGSGG、(GGGS)₂、GSGSGSGSG、(GGS)₃、GGSGGSGGSG、(GS)₅、(GGGGS)₂、(GGSGG)₂、(G)₃、(G)₄、(G)₅、(G)₆、(G)₇、(G)₈、(G)₉、(G)₁₀。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白为狂犬病毒CVS-11株的G蛋白(GenBank登录号为ADJ29911.1)，或与狂犬病毒CVS-11株G蛋白具有至少96％氨基酸同源性的狂犬病毒G蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白为狂犬病毒2472株的G蛋白(GenBank登录号为ADX60070.1)，或与狂犬病毒2472株G蛋白具有至少96％氨基酸同源性的狂犬病毒G蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病毒G蛋白为狂犬病毒HEP-Flury(GenBank登录号为BAC53868.1)、PV(GenBank登录号为AAA47218.1)、Pitman Moore(GenBank登录号为CAI43218.1)、MOR1-DG(GenBank登录号为AAK92057.1)、MOR3-HM(GenBank登录号为AAK92058.1)、NeiMeng1025C(GenBank登录号为ABY19509.2)、FRA1-FX(GenBank登录号为AAK92050.1)、CNX8601(GenBank登录号为AAG34722.1)、CHI1-BK(GenBank登录号为AAK92060.1)、MAU1-CL(GenBank登录号为AAK92072.1)、Yunnan_Zt07(GenBank登录号为ABX79939.1)、RVD(GenBank登录号为AAO72525.1)株的G蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将狂犬病毒CVS-11株的G蛋白胞外段第73～79位及第117～125位氨基酸分别替换为GS连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将狂犬病毒2472株的G蛋白胞外段第73～79位及第117～125位氨基酸分别替换为GS连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将狂犬病毒Pitman Moore株的G蛋白胞外段第73～79位及第117～125位氨基酸分别替换为GS连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将狂犬病毒HEP-Flury株的G蛋白胞外段第73～79位及第117～125位氨基酸分别替换为GS连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将狂犬病毒Yunnan_Zt07株的G蛋白胞外段第73～79位及第117～125位氨基酸分别替换为GS连接肽。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将经GS连接肽取代后的重组狂犬病毒G蛋白胞外段在细胞中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述表达是在昆虫细胞中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述昆虫细胞包括但不限于Sf9和Hi5细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述方法对分泌表达到细胞培养基上清中的蛋白进行亲和层析粗纯化。

在本发明的一种实施方式中，所述粗纯化的蛋白进行离子交换层析和/或分子筛层析精细纯化和分析，证明所述纯化的蛋白在溶液中性质均一。

在本发明的一种实施方式中，所述纯化的蛋白进行抗体结合实验和受体多肽结合实验，证明所述纯化的蛋白能够被抗体识别且具有受体结合的功能。

在本发明的一种实施方式中，所述纯化的蛋白在碱性和酸性pH条件下进行结晶并解析其晶体结构，证明所述纯化的蛋白具有正确的空间折叠和天然构象。

本发明的第二个目的是提供应用所述方法制备获得的重组狂犬病毒G蛋白胞外段。

本发明的第三个目的是提供含有所述重组狂犬病毒G蛋白胞外段的组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述重组狂犬病毒G蛋白胞外段或其组合物为疫苗候选组分。

在本发明的一种实施方式中，所述重组狂犬病毒G蛋白胞外段或其组合物为诊断试剂盒抗原组分。

在本发明的一种实施方式中，所述重组狂犬病毒G蛋白胞外段或其组合物为疫苗抗原含量标定的标准品。

本发明还要求保护所述重组狂犬病毒G蛋白胞外段在生物、医药领域制备包括疫苗候选组分、诊断试剂盒抗原组分、疫苗抗原含量标定的标准品在内的产品方面的应用。

有益效果：本发明提供了目前已知的唯一一种制备可溶、性质均一、理化性质好、且具有正确空间折叠和天然构象的重组狂犬病毒G蛋白胞外段的方法。本发明将狂犬病毒G蛋白胞外段中的融合环替换为柔性的连接肽，实现了狂犬病毒G蛋白胞外段的可溶和分泌表达，并成功制备得到了高纯度的重组狂犬病毒G蛋白胞外段；所制备的蛋白在离子交换层析中表现为窄且尖的蛋白洗脱峰，证明蛋白在溶液中具有均一的荷电性；所制备蛋白在分子筛层析中表现为对称的蛋白洗脱峰，证明蛋白在溶液中具有均一的分子大小；所制备蛋白能够与目前已报道的多种狂犬病毒G蛋白特异性抗体相互结合，能够与已报道的受体多肽相互作用，证明蛋白具有正确的表位特征和受体结合功能；所制备蛋白能够在碱性和酸性pH条件下结晶，且其晶体结构呈现出pH依赖的构象变化，证明蛋白具有正确的空间折叠和天然构象。该方法所制备的重组狂犬病毒G蛋白胞外段在疫苗制备、中和抗体筛选以及用作诊断试剂盒和疫苗抗原含量标定的标准品等方面均具有重要的潜在应用价值。

附图说明

图1为重组RABV-G-ecto蛋白(CVS-11株)在昆虫细胞培养基上清分泌表达的Western blot鉴定。

图2为重组RABV-G-ecto(CVS-11株)蛋白的离子交换层析、分子排阻层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。左图为重组RABV-G-ecto蛋白的离子交换纯化图，其中，第一个洗脱峰为亲和层析粗纯时未能去除的杂蛋白峰，第二个窄且尖的峰为重组RABV-G-ecto的目的蛋白峰。右图为重组RABV-G-ecto蛋白的分子排阻层析纯化图，右图中的内嵌图为重组RABV-G-ecto蛋白的SDS-PAGE鉴定图。

图3为狂犬病毒G蛋白特异性单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定。左图为非还原条件下的SDS-PAGE鉴定图，右图为还原条件下的SDS-PAGE鉴定图。

图4为间接ELISA鉴定重组RABV-G-ecto蛋白与不同单克隆抗体之间的相互作用。可见重组RABV-G-ecto蛋白与狂犬病毒G蛋白特异性单克隆抗体SOJB、SO57、EP5G3、SOJA、GD2D12、523-11和Fab094均能够互作结合，但不与同型对照(Isotype-control)抗体结合。

图5为重组RABV-G-ecto蛋白结合乙酰胆碱受体多肽(T32和C32)的Biacore动力学曲线。横坐标是结合解离时间，单位是秒；纵坐标是芯片表面的结合响应强度，单位是RUs(即Response units)。可见重组RABV-G-ecto蛋白与T32和C32受体多肽均表现出浓度依赖的结合特征，且对T32的结合显著强于对C32的结合。

图6为RABV-G-ecto-T1(CVS-11株)蛋白的离子交换层析、分子排阻层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。左图为RABV-G-ecto-T1蛋白的离子交换纯化图，其中，第一个洗脱峰为亲和层析粗纯时未能去除的杂蛋白峰，第二个窄且尖的峰为RABV-G-ecto-T1的目的蛋白峰。右图为RABV-G-ecto-T1蛋白的分子排阻层析纯化图，右图中的内嵌图为RABV-G-ecto-T1蛋白的SDS-PAGE鉴定图。

图7为RABV-G-ecto-T2(CVS-11株)蛋白的离子交换层析、分子排阻层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。左图为RABV-G-ecto-T2蛋白的离子交换纯化图，其中，第一个洗脱峰为亲和层析粗纯时未能去除的杂蛋白峰，第二个窄且尖的峰为RABV-G-ecto-T2的目的蛋白峰。右图为RABV-G-ecto-T2蛋白的分子排阻层析纯化图，右图中的内嵌图为RABV-G-ecto-T2蛋白的SDS-PAGE鉴定图。

图8为RABV-G-ecto-T3(CVS-11株)蛋白的离子交换层析、分子排阻层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。左图为RABV-G-ecto-T3蛋白的离子交换纯化图，其中，前峰为粗纯时未能去除的杂蛋白，主峰为RABV-G-ecto-T3的目的蛋白峰，主峰峰型窄且对称。右图为RABV-G-ecto-T3蛋白的分子排阻层析纯化图，右图中的内嵌图为RABV-G-ecto-T3蛋白的SDS-PAGE鉴定图。

图9为RABV-G-ecto-T4(CVS-11株)蛋白的分子排阻层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。

图10为RABV-G-ecto-T5(CVS-11株)蛋白的分子排阻层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。

图11为重组RABV-G-ecto蛋白(CVS-11株)的晶体结构。左图为在pH 8.3条件下获得的蛋白结构。其中，蛋白的三个结构域CD，PHD和FD分别以浅灰、深灰和黑色显示。右图为在pH 6.5的条件下获得的蛋白晶体结构。其中，CD，PHD和FD分别以浅灰、深灰和黑色显示。图中可见蛋白发生了明显的pH依赖的构象变化，与狂犬病毒G蛋白构象变化的理论模型高度吻合，证明本发明所制备的重组RABV-G-ecto蛋白具有正确的空间折叠和天然构象。

图12为重组RABV-G-ecto蛋白(2472株)的离子交换层析、分子排阻层析纯化和SDS-PAGE鉴定图。左图为重组RABV-G-ecto蛋白的离子交换纯化图，右图为重组RABV-G-ecto蛋白的分子排阻层析纯化图，右图中的内嵌图为蛋白的SDS-PAGE鉴定图。

图13为2472株与CVS-11株的重组RABV-G-ecto的结构空间比对。其中，左上图为2472株的重组RABV-G-ecto蛋白的结构，左下图为CVS-11株的重组RABV-G-ecto蛋白的结构，右图为两者之间的空间重叠比对图。可见，2472株与CVS-11株的重组RABV-G-ecto蛋白结构高度一致。

具体实施方式

在不做特别说明的情况下，本申请中狂犬病毒G蛋白胞外段氨基酸的位点计算方式均以G蛋白去除信号肽后的第一个氨基酸计数为第1位。

在不做特别说明的情况下，对本申请出现的技术术语按如下方式理解：

信号肽(signal peptide,SP)：狂犬病毒G蛋白中位于蛋白质N-端的一小段序列，在蛋白翻译过程中，负责将新生蛋白多肽引导入内质网中，由此实现该蛋白的分泌表达。信号肽随后会被宿主的信号肽酶切除，因此，在成熟蛋白中，并不存在信号肽。

胞外段(ecto-domain)：狂犬病毒G蛋白中最主要的功能区，位于病毒囊膜外，约占成熟蛋白85％的分子质量。是病毒识别受体和介导膜融合的真正功能区段，也是疫苗制备中真正有效的抗原区段以及中和抗体的真正靶点。在狂犬病毒中，其G蛋白胞外段的氨基酸数目为：RABV-G-ecto，1-439位氨基酸。

跨膜区(transmembrane domain,TM)：狂犬病毒G蛋白中位于胞外段之后的一小段序列，是锚定G蛋白到病毒囊膜中的关键区域，在维持G蛋白在病毒粒子表面的三聚体形成中也发挥重要作用。在狂犬病毒中，其G蛋白跨膜区为440-462位氨基酸。

胞内段(cytoplasmic domain,cyto)：狂犬病毒G蛋白中位于蛋白质C-端的一段氨基酸序列，在子代病毒粒子的装配过程中发挥重要作用。在狂犬病毒中，其G蛋白胞内段为463-505位氨基酸。

融合环(fusion loop，FL)：狂犬病毒G蛋白胞外段中的两段具有一定疏水性质的区域，在病毒侵入过程中，融合环可插入到宿主细胞膜中，由此在病毒囊膜与宿主细胞膜的膜融合过程中发挥作用。因其具有较强的疏水性质，因此常常导致重组蛋白在溶液中发生聚集而影响蛋白在溶液中的均一性。在狂犬病毒G蛋白中，其两个融合环(fusion loop1and 2，FL1和FL2)均较小，约17-19个氨基酸，分别位于G蛋白胞外段的67-83以及110-128位氨基酸区域内；因其在整个G蛋白胞外段中所占比例很小(<5％)，因此其取代通常不会影响整个G蛋白胞外段的折叠及其抗原性等。在本发明中，为得到可溶且性质均一的重组G蛋白胞外段，同时针对两个融合环区域内的氨基酸进行取代，将其替换为柔性且具有一定亲水性的GS连接肽。

柔性连接肽：一段柔性且具有一定亲水性的氨基酸序列，依据其连接的两个氨基酸之间的距离长短，连接肽长度通常可以为3-30个氨基酸，通常为多G(甘氨酸)和/或多S(丝氨酸)的组合。

乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)：是目前已知的最重要的狂犬病毒G蛋白受体之一。且有多篇研究报道表明，该受体中一段由32个氨基酸组成的多肽能够高效结合狂犬病毒G蛋白，并且这种多肽对G蛋白的结合由于封闭了G蛋白上的nAChR受体结合位点，因此能够有效抑制狂犬病毒对细胞的侵入。见参考文献(5-7)。

T32：来源于电鯆(一种鱼类)nAChR受体的、可以结合狂犬病毒G蛋白并抑制狂犬病毒侵入的、一段由32个氨基酸组成的多肽。其氨基酸组成为SGEWVMKDYRGWKHWVYYTCCPDTPYLDITYH。有多项研究表明，该多肽能够高效抑制狂犬病毒侵入细胞。见参考文献(5-7)。在本发明中，该多肽由上海吉尔生化公司合成，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的受体多肽结合实验。

C32：来源于牛nAChR受体的、可以结合狂犬病毒G蛋白并抑制狂犬病毒侵入的、一段由32个氨基酸组成的多肽。其氨基酸组成为SGEWVIKESRGWKHWVFYACCPSTPYLDITYH。该多肽也能够抑制狂犬病毒侵入细胞，但其效率较T32低。见参考文献(5-7)。在本发明中，该多肽由上海吉尔生化公司合成，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的受体多肽结合实验。

SOJB：一种已报道的狂犬病毒G蛋白中和抗体。见参考文献(8)。在本发明中，该抗体通过重组表达的方式、在293T细胞中生产获得，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合实验。

SO57：一种已报道的狂犬病毒G蛋白中和抗体。见参考文献(8)。在本发明中，该抗体通过重组表达的方式、在293T细胞中生产获得，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合实验。

SOJA：一种已报道的狂犬病毒G蛋白中和抗体。见参考文献(8)。在本发明中，该抗体通过重组表达的方式、在293T细胞中生产获得，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合实验。

EP5G3：一种已报道的狂犬病毒G蛋白中和抗体。见参考文献(9)。在本发明中，该抗体通过重组表达的方式、在293T细胞中生产获得，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合实验。

GD2D12：一种已报道的狂犬病毒G蛋白中和抗体。见参考文献(9)。在本发明中，该抗体通过重组表达的方式、在293T细胞中生产获得，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合实验。

Fab094：一种已报道的狂犬病毒G蛋白中和抗体。见参考文献(10)。在本发明中，该抗体通过重组表达的方式、在293T细胞中生产获得，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合实验。

523-11：一种已报道的狂犬病毒G蛋白抗体。未有相关文献，但其序列和结构已经提交到Protein Data Bank数据库(PDB code：4M43)。在本发明中，该抗体通过重组表达的方式、在293T细胞中生产获得，被用作重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合实验。

Isotype-control：一种已报道的埃博拉病毒糖蛋白的抗体5E6。见参考文献(11)。在本发明中，该抗体通过昆虫细胞表达，在重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合实验中，用作阴性对照。

单链抗体形式(scFv)：是由抗体轻链可变区和重链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。由于scFv仅保留了抗体可变区，其分子量较小，常被用于与抗原的复合物晶体结构研究。

实施例1狂犬病毒CVS-11株的重组RABV-G-ecto蛋白的制备

(1)狂犬病毒CVS-11株全长G蛋白编码基因的获得

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的狂犬病毒CVS-11株(GenBank序列号为ADJ29911.1)G蛋白的氨基酸序列，通过全基因合成的方式获得了对昆虫细胞进行了密码子优化的全长G蛋白编码序列(如SEQ ID No.1所示)。

(2)pFastBac1-RABV-G-ecto-CVS11重组质粒的构建

设计并合成了下述引物用于扩增和改造狂犬病毒G蛋白：

RV-K20FP：5’-AGGAATTCAAATTCCCCATCTACAC-3'；

RVGT91GGSGGRP：5’-ACCACCAGAACCACCGGTGTAGGTCTCAGC-3’；

RVGT99-Y135FP：5’-GGTGGTTCTGGTGGTACCACTTTCAAGCGT-3’；

RVGT99-Y135RP：5’-ACCACCAGAACCACCGTAGGGGTTGTGCAG-3’；

RVGR145FP：5’-GGTGGTTCTGGTGGTCGCACCACTAAGGAG-3’；

RV-K458RP：5’-CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTGCCCCAATTAGGCA-3'。

分别用合成的引物RV-K20FP和RVGT91GGSGGRP作为上下游引物，RVGT99-P135FP和RVGT99-P135RP作为上下游引物，以及RVGR145FP和RV-K458RP作为上下游引物，以SEQ IDNo.1所示的G蛋白基因作为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：预变性96℃2min，(变性96℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min)30个循环，终延伸72℃10min。获得的3个PCR产物各取1μl作为模板，进行搭桥PCR。PCR反应条件为预变性96℃2min，(变性96℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min)30个循环，终延伸72℃10min。由此获得了改造后的重组RABV-G-ecto蛋白编码序列(如SEQ ID NO.2所示)。此改造后的蛋白构建序列编码SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，包括G蛋白的胞外段的1-439位氨基酸，同时将胞外段中的两个融合环区域内的氨基酸(氨基酸73-79位和氨基酸117-125位)分别替换为两段GGSGG的柔性连接肽，并在蛋白的C-端加入了6xHis标签用于后续蛋白的纯化。

含GP67信号肽的pFastBac1载体(pFastBac1-GP67)为本实验室构建，即在商品化pFastBac1载体(Invitrogen公司)上，在限制性酶切位点BamH I和EcoR I中间插入了一段GP67信号肽的编码序列(编码GP67信号肽的核酸序列见SEQ ID NO.4)。

将所得重组RABV-G-ecto蛋白编码核酸序列(SEQ ID NO.2)通过EcoR I和HindIII限制性酶切位点克隆至pFastBac1-GP67载体，由此获得pFastBac1-RABV-G-ecto-CVS11重组质粒。该质粒经测序证实插入的外源片段完全正确。

(3)重组RABV-G-ecto蛋白的表达和纯化

将pFastBac1-RABV-G-ecto-CVS11转化感受态细胞DH10Bac，然后在含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素以及100μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG的LB平板上涂布，37℃培养48h后，挑取白色菌落，培养后使用质粒提取试剂盒提取对应的重组Bacmid。

将上述提取的重组Bacmid转染sf9昆虫细胞，培养72h收获P1代重组杆状病毒。通过将重组杆状病毒在sf9细胞中传代培养，扩增至P3代，而后通过Western blot鉴定培养基上清中分泌表达的重组RABV-G-ecto蛋白(见图1)。结果表明该重组蛋白能够在昆虫细胞培养基上清中分泌表达。

将上述P3代重组杆状病毒接种Hi5昆虫细胞进行表达。在接种病毒48h后，收获细胞上清。用HisTrap亲和层析柱(GE Healthcare)进行亲和层析初步纯化，然后再通过离子交换层析和分子排阻层析进一步精细纯化。亲和层析纯化中，首先将收获的含重组RABV-G-ecto蛋白的培养基上清通过HisTrap亲和层析柱，而后以10倍柱体积的buffer A(20mMTris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)清洗层析柱，然后以含200mM咪唑的buffer A(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，200mM imidazole)将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，由此得到粗纯的重组RABV-G-ecto蛋白。离子交换层析中，首先将上述粗纯的重组RABV-G-ecto蛋白换液至buffer B(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH 8.0)中，然后上样到source 15Q(GEHealthcare)离子交换层析柱中，以buffer C(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 8.0)将目的蛋白从离子交换层析柱上洗脱下来，其洗脱方法为40min，0％-50％的buffer C梯度洗脱，直至目的蛋白被完全洗脱，再用100％的buffer C处理离子交换柱。该蛋白进一步以Superdex200 Increase 10/300(GE Healthcare)层析柱进行精细纯化，并最终将纯化后的重组RABV-G-ecto蛋白换液至buffer A中。

将亲和层析后粗纯的蛋白在离子交换层析中进一步精细纯化，同时基于蛋白在离子交换层析柱中的洗脱情形对蛋白的荷电均一性进行分析。可见离子交换层析能够有效达成对粗纯的蛋白进行精细纯化的目的，目的蛋白在电导为20.1mS/cm(峰尖处的电导)时洗脱下来，目的蛋白洗脱峰窄且尖，表明蛋白在溶液中具有均一的荷电性(图2)。

将通过离子交换层析纯化后的蛋白进一步通过分子筛层析进行精细纯化，并基于蛋白在分子筛层析柱Superdex 200 Increase 10/300(GE Healthcare)中的洗脱情形对蛋白的分子大小均一性进行分析。可见目的蛋白在14.6ml(峰尖处的洗脱体积)洗脱下来，目的蛋白洗脱峰对称度好，表明蛋白在溶液中具有均一的分子大小(图2)。

最后，对通过分子筛层析精细纯化后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，显示蛋白纯度达到99％以上(图2)。

由此，成功获得了可溶、且溶液中性质均一的重组RABV-G-ecto蛋白。

实施例2重组RABV-G-ecto蛋白的抗体结合能力验证

为了进一步验证实施例1所制备的蛋白是否具有正确的抗原表位特征，选取共计7株已报道的狂犬病毒G蛋白单克隆抗体(包括SOJB(重链序列见GenBank序列号AAO17822.1，轻链序列见GenBank序列号AAO17826.1)、SO57(重链序列见GenBank序列号AAO17821.1，轻链序列见GenBank序列号AAO17824.1)、EP5G3(重链序列见GenBank序列号BAD90939.1，轻链序列见GenBank序列号BAD90940.1)、SOJA(重链序列见GenBank序列号AAO17823.1，轻链序列见GenBank序列号AAO17825.1)、GD2D12(重链序列见GenBank序列号BAD90941.1，轻链序列见GenBank序列号BAD90942.1)、Fab094(重链序列见GenBank序列号HQ706884.1，轻链序列见GenBank序列号HQ706885.1)和523-11(重链和轻链序列见Protein Data Bank数据库中的PDB code 4M43))，以及1株埃博拉病毒糖蛋白的单克隆抗体(抗体名字为5E6，用作Isotype-control对照，其重链和轻链序列见公开号为US8513391(B2)的美国专利)，与实施例1所制备的重组RABV-G-ecto蛋白进行ELISA结合实验验证。

(1)重组狂犬病毒G蛋白单克隆抗体的构建、表达与纯化

将人免疫球蛋白IgG1亚型重链的恒定区(GenBank序列号CAA75030.1的144-473位氨基酸)和轻链恒定区(GenBank序列号CAA75031.1的131-236位氨基酸)用Kpn I和Bgl II克隆至pCAGGS载体，得到pCAGGS-HC和pCAGGS-LC作为骨架质粒。选取文献报道以及PDB数据库报道的共计7株狂犬病毒G蛋白中和单抗，包括SOJB、SO57、EP5G3、SOJA、GD2D12、523-11和Fab094，分别合成其重链和轻链的可变区编码序列，在这些可变区序列的N-端融合一段IL-2的信号肽编码序列(见序列表SEQ ID No.5)用于分泌表达，然后用同源重组法分别克隆至对应的骨架质粒pCAGGS-HC和pCAGGS-LC，由此获得IgG1亚型的抗体重链全长和抗体轻链全长的表达质粒。

将配对的抗体重链全长与轻链全长表达质粒用PEI共转293T细胞。转染后48h收集含有分泌表达的重组抗体的细胞上清，用HiTrap rProtein A FF层析柱(GE Healthcare公司)进行亲和层析纯化。首先将细胞上清以1ml/min的流速通过层析柱，然后用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱并收集抗体，然后迅速将抗体换液至1×PBS(136mM NaCl,2.6mM KCl,8mMNa₂HPO₄,2mM KH₂PO₄,pH 7.4)中。纯化后的抗体用还原条件下的SDS-PAGE(重链和轻链间的二硫键会被打开，因而可以观察到重链和轻链两条蛋白条带)和非还原条件下的SDS-PAGE(重链和轻链间的二硫键不会被打开，因而只会观察到一条重链+轻链的蛋白条带)鉴定(见图3)。以IgG1亚型的埃博拉病毒糖蛋白抗体5E6作为同型抗体的阴性对照(Isotype-control)，该抗体为本实验室用昆虫细胞表达后保存。从SDS-PAGE鉴定图可见(图3)，所有制备的抗体纯度均达到95％以上。

(2)ELISA方法鉴定重组RABV-G-ecto蛋白与狂犬病毒G蛋白特异性单克隆抗体的相互作用。

采用间接ELISA方法鉴定重组RABV-G-ecto蛋白与所制备的狂犬病毒G蛋白特异性单克隆抗体的相互作用，具体如下：

(A)酶标板包被抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将实施例1中所制备的重组RABV-G-ecto蛋白按200ng/孔在酶标板(Corning公司)上4℃包被过夜；

(B)封闭：封闭液为PBS稀释的5％脱脂奶粉，每孔100μl，37℃封闭1h。封闭后PBST(136mM NaCl,2.6mM KCl,8mM Na₂HPO₄,2mM KH₂PO₄,pH 7.4,0.05％Tween-20)洗3次；

(C)一抗孵育：将本实施例步骤(1)中表达制备的抗体用PBS做5倍梯度稀释至1μg/100μl、200ng/100μl、40ng/100μl、8ng/100μl、1.6ng/100μl、0.32ng/100μl、0.064ng/100μl，每孔加入100μl稀释后的抗体，每个稀释度做3个重复，室温孵育1.5h。PBST洗3次；

(D)二抗孵育：HRP标记的兔抗人二抗，体积比1:3000(V/V)用PBST稀释，然后每孔加入100μl，37℃1h。PBST洗5次；

(E)显色：显色液A和显色液B按体积比1:50混合，50μl/孔，室温孵育5min。加入50μl 2M HCl终止反应；

(F)读数：用酶标仪读取OD450，结果见图4。

结果表明实施例1中所制备的重组RABV-G-ecto蛋白与所有7株狂犬病毒G蛋白单抗SOJB、SO57、EP5G3、SOJA、GD2D12、523-11和Fab094均有很好的结合，但不与用作阴性对照的埃博拉抗体5E6结合。由此证明实施例1中所制备的RABV-G-ecto蛋白具有正确的抗原表位特征。

实施例3重组RABV-G-ecto蛋白与乙酰胆碱受体多肽的相互作用验证

基于文献报道的乙酰胆碱受体多肽T32和C32，利用Biacore研究实施例1中的重组RABV-G-ecto蛋白与受体多肽的相互作用。

将实施例1制备的重组RABV-G-ecto蛋白利用氨基偶联法固定在CM5芯片(GEHealthcare)上，然后将浓度梯度为94nM-6000nM的T32多肽，以及浓度梯度为125nM-8000nM的C32多肽注入芯片，分析在恒温25℃进行，使用pH为7.4的PBS-Tween缓冲液(136mM NaCl,2.6mM KCl,8mM Na₂HPO₄,2mM KH₂PO₄,0.005％Tween-20)，流速为30μl/min。芯片表面的再生使用的是10mM NaOH，结合曲线如图5所示。图T32的8条曲线由上到下分别代表T32多肽的浓度为6000，3000，1500，750，375，188，94，0nM；图C32的8条曲线由上到下分别代表C32多肽的浓度为8000，4000，2000，1000，500，250，125，0nM。结果显示，乙酰胆碱受体多肽T32和C32通过固定于芯片表面的重组RABV-G-ecto蛋白时，均表现出浓度依赖的结合响应值(单位为response units，RUs)的增加，证明实施例1中制备的重组RABV-G-ecto蛋白能够与T32和C32乙酰胆碱受体多肽相互作用；而浓度为6000nM的T32多肽通过固定于芯片表面的蛋白时，其响应值达到1538RU，显著强于浓度为8000nM的C32多肽通过固定于芯片表面的蛋白时的响应值(301RU)，证明实施例1中所制备的重组RABV-G-ecto蛋白与T32的结合显著强于与C32的结合。由此，可证明实施例1中所制备的重组RABV-G-ecto蛋白具备受体结合活性。鉴于具有正确的空间折叠是狂犬病毒G蛋白能够保留正确的抗原表位特征以及能够保留受体结合活性的前提条件，实施例2的抗体结合实验以及本实施例的受体多肽互作实验的结果表明，实施例1中制备的重组RABV-G-ecto蛋白具有正确的空间折叠。

实施例4重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白的表达纯化与制备

(1)重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白编码核苷酸的扩增

利用下述引物，

RV-K20FP：5’-AGGAATTCAAATTCCCCATCTACAC-3'；

RVG-T1RP：5’-CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATG GTCCACACCGGAGAT-3’。

以SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板，参照实施例1的PCR反应条件，扩增获得重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T1(T为truncation的缩写)的编码序列，该序列编码狂犬病毒CVS-11株(GenBank序列号为ADJ29911.1)G蛋白胞外段的1-431位氨基酸，同时将胞外段中的两个融合环区域内的氨基酸(氨基酸73-79位和氨基酸117-125位)分别替换为两段GGSGG的柔性连接肽，并在蛋白的C-端加入了6xHis标签用于后续蛋白的纯化。

利用下述引物，

RV-K20FP：5’-AGGAATTCAAATTCCCCATCTACAC-3'；

RCG-T2RP:5’CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATG CTTGTACACGTCGGG 3’。

以SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板，参照实施例1的PCR反应条件，扩增获得重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T2(T为truncation的缩写)的编码序列，该序列编码狂犬病毒CVS-11株(GenBank序列号为ADJ29911.1)G蛋白胞外段的1-425位氨基酸，同时将胞外段中的两个融合环区域内的氨基酸(氨基酸73-79位和氨基酸117-125位)分别替换为两段GGSGG的柔性连接肽，并在蛋白的C-端加入了6xHis标签用于后续蛋白的纯化。

利用下述引物，

RV-K20FP：5’-AGGAATTCAAATTCCCCATCTACAC-3'；

RVG-T3RP:5’CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATG GTGGACTTCCACGAA 3’。

以SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板，参照实施例1的PCR反应条件，扩增获得重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T3(T为truncation的缩写)的编码序列，该序列编码狂犬病毒CVS-11株(GenBank序列号为ADJ29911.1)G蛋白胞外段的1-419位氨基酸，同时将胞外段中的两个融合环区域内的氨基酸(氨基酸73-79位和氨基酸117-125位)分别替换为两段GGSGG的柔性连接肽，并在蛋白的C-端加入了6xHis标签用于后续蛋白的纯化。

利用下述引物，

RV-K20FP：5’-AGGAATTCAAATTCCCCATCTACAC-3'；

RVG-T4RP:5’CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATG GTCTTCAGCTTCGTC 3’。

以SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板，参照实施例1的PCR反应条件，扩增获得重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T4(T为truncation的缩写)的编码序列，该序列编码狂犬病毒CVS-11株(GenBank序列号为ADJ29911.1)G蛋白胞外段的1-414位氨基酸，同时将胞外段中的两个融合环区域内的氨基酸(氨基酸73-79位和氨基酸117-125位)分别替换为两段GGSGG的柔性连接肽，并在蛋白的C-端加入了6xHis标签用于后续蛋白的纯化。

利用下述引物，

RV-K20FP：5’-AGGAATTCAAATTCCCCATCTACAC-3'；

RVG-T5RP:5’-CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATG CACGGTGGAGGGATC-3’。

以SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板，参照实施例1的PCR反应条件，扩增获得重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T5(T为truncation的缩写)的编码序列，该序列编码狂犬病毒CVS-11株(GenBank序列号为ADJ29911.1)G蛋白胞外段的1-405位氨基酸，同时将胞外段中的两个融合环区域内的氨基酸(氨基酸73-79位和氨基酸117-125位)分别替换为两段GGSGG的柔性连接肽，并在蛋白的C-端加入了6xHis标签用于后续蛋白的纯化。

(2)重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白pFast-bac1重组质粒的构建

参照实施例1中pFast-bac1-RABV-G-ecto-CVS11重组质粒的构建方法，将上述扩增获得的RABV-G-ecto-T1、RABV-G-ecto-T2、RABV-G-ecto-T3、RABV-G-ecto-T4、RABV-G-ecto-T5蛋白编码核苷酸片段分别通过EcoR I和Hind III限制性酶切位点克隆至pFastBac1-GP67载体中，由此获得pFastBac1-RABV-G-ecto-T1、pFastBac1-RABV-G-ecto-T2、pFastBac1-RABV-G-ecto-T3、pFastBac1-RABV-G-ecto-T4、pFastBac1-RABV-G-ecto-T5重组质粒。质粒经测序证实插入的外源片段完全正确。

(3)重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白的表达纯化与鉴定

参照实施例1的表达纯化方法，在sf9昆虫细胞中扩增获得重组杆状病毒，在Hi5细胞中分泌表达重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白，通过亲和层析对蛋白进行粗纯，通过分子筛层析和/或离子交换层析对蛋白进行精细纯化。

由此制备的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T1，在离子交换层析中在电导21.1mS/cm(峰尖处的电导)时洗脱下来，蛋白洗脱峰窄且尖，表明蛋白在溶液中具有均一的荷电性；在分子筛层析中在14.7ml(峰尖处的洗脱体积)洗脱下来，目的蛋白洗脱峰对称度好，表明蛋白在溶液中具有均一的分子大小；对精细纯化后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，显示蛋白纯度达到99％以上(图6)。

由此制备的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T2，在离子交换层析中在电导21.1mS/cm(峰尖处的电导)时洗脱下来，蛋白洗脱峰窄且尖，表明蛋白在溶液中具有均一的荷电性；在分子筛层析中在14.7ml(峰尖处的洗脱体积)洗脱下来，目的蛋白洗脱峰对称度好，表明蛋白在溶液中具有均一的分子大小；对精细纯化后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，显示蛋白纯度达到99％以上(图7)。

由此制备的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T3，在离子交换层析中在电导18.6mS/cm(峰尖处的电导)时洗脱下来，蛋白洗脱峰窄且尖，表明蛋白在溶液中具有均一的荷电性；在分子筛层析中在14.8ml(峰尖处的洗脱体积)洗脱下来，目的蛋白洗脱峰对称度好，表明蛋白在溶液中具有均一的分子大小；对精细纯化后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，显示蛋白纯度达到99％以上(图8)。

由此制备的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T4，在分子筛层析中在14.8ml(峰尖处的洗脱体积)洗脱下来，目的蛋白洗脱峰对称度好，表明蛋白在溶液中具有均一的分子大小；对精细纯化后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，显示蛋白纯度达到99％以上(图9)。

由此制备的C-端截短体蛋白RABV-G-ecto-T5，在分子筛层析中在15.1ml(峰尖处的洗脱体积)洗脱下来，目的蛋白洗脱峰对称度好，表明蛋白在溶液中具有均一的分子大小；对精细纯化后的蛋白进行SDS-PAGE鉴定，显示蛋白纯度达到99％以上(图10)。

由此，我们成功制备了5种可溶、且溶液中性质均一的重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白，这5种截短体蛋白分别以狂犬病毒G蛋白胞外段中的405、414、419、425和431位氨基酸截止。此结果表明，这一基于“融合环取代”的蛋白表达纯化策略在不同长度的狂犬病毒G蛋白胞外段(包括完整的胞外段以及C-端截短的胞外段)的制备中均适用。

实施例5重组RABV-G-ecto蛋白的结晶与结构解析

(1)重组RABV-G-ecto蛋白在碱性pH条件下的结晶

使用实施例1中制备的重组RABV-G-ecto蛋白和实施例4中制备的重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白，采用气相扩散座滴法(Vapor-diffusion sitting drop)，利用商品化的晶体筛选试剂盒(Hampton和Molecular Dimensions)，在18℃条件下进行蛋白晶体初筛；并在此基础上，以能够获得蛋白晶体的碱性结晶条件为基础，通过调整缓冲液pH及沉淀剂浓度的方法进行结晶条件的优化，最终使用重组RABV-G-ecto蛋白，在0.1M BICINE(pH8.0)，14％PEG300的条件下获得了质量较好，可用于衍射的蛋白晶体。重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白在晶体初筛中亦能在碱性条件下结晶，由于已经得到了衍射质量好的重组RABV-G-ecto的蛋白晶体，因此未在针对重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白进行结晶条件的优化。

(2)重组RABV-G-ecto蛋白在酸性pH条件下的结晶

使用实施例1中制备的重组RABV-G-ecto蛋白和实施例4中制备的重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白，采用气相扩散座滴法(Vapor-diffusion sitting drop)，利用商品化的晶体筛选试剂盒(Hampton和Molecular Dimensions)，在18℃条件下进行蛋白晶体初筛；并在此基础上，以能够获得蛋白晶体的酸性结晶条件为基础，通过调整缓冲液pH及沉淀剂浓度的方法进行结晶条件的优化。虽然重组RABV-G-ecto蛋白以及RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白能够在酸性条件下生长晶体，但晶体衍射质量差，分辨率低，无法达到解析结构的要求，对结晶条件优化后晶体质量无明显改善。

鉴于抗体分子与蛋白结合后，有一定几率能够通过稳定蛋白质的局部构象而提高晶体衍射分辨率，因此，首先制备了抗体523-11的单链抗体形式(scFv)蛋白。将抗体523-11的轻链可变区和重链可变区用由20个氨基酸组成的(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)多肽连接起来,将其编码序列克隆入pET-21a载体中，构建pET21a-scFv重组表达质粒，将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行重组表达。

抗体523-11的scFv在大肠杆菌中的表达通过500μM IPTG在37℃诱导6h实现。诱导表达的scFv为包涵体，将之以6M盐酸胍溶解后，利用稀释复性的方法将包涵体缓慢滴入复性液中(100mM Tris-HCl,500mM L-Arg,5mM GSH,1mM GSSG,pH 8.0)，4℃复性12h，然后用超滤浓缩杯将复性液浓缩至约十分之一体积后，换液至buffer A(20mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH 8.0)中，并经再次浓缩后，用分子排阻层析(Superdex 200Increase 10/300)进行精细纯化。抗体523-11scFv的氨基酸序列见序列表SEQ ID No.6。

获得抗体523-11scFv蛋白后，将实施例1中制备的重组RABV-G-ecto蛋白和实施例4中制备的重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白分别与523-11scFv进行共结晶筛选，最终使用RABV-G-ecto-T5蛋白，在Molecular Dimensions的试剂盒Morpheus MD 1-46kit#No.2-2：0.12M Ethylene 14glycols,0.1M Buffer system 1,pH 6.5,and 50％v/vPrecipitant Mix 2条件下获得了质量较好，可用于衍射的复合物蛋白晶体。

(3)晶体数据收集及结构解析

将步骤(1)、(2)获得的蛋白晶体分别进行衍射数据收集和结构解析。衍射数据均在上海同步辐射光源BL19U1线站完成。收集到的衍射数据通过HKL2000进行积分和平均；结构解析首先以523-11可变区的结构为模型(PDB号：4M43)进行分子置换，然后通过PHENIX的Autobuild程序搭建RABV-G-ecto-T5蛋白的结构模型，并通过Coot，REFMAC5及PHASER进行多轮的精修和优化，最终解析得到RABV-G-ecto-T5+523-11复合物在pH 6.5，即酸性pH条件下的晶体结构。重组RABV-G-ecto蛋白在pH 8.0，即碱性pH条件下的晶体结构，通过分子置换法，以复合物结构中的RABV-G-ecto-T5结构为模型，并通过Coot，REFMAC5及PHASER进行多轮的精修和优化后获得。

通过结构分析可见，狂犬病毒G蛋白胞外段的结构可分为3个结构域，将其命名为中心结构域(central domain,CD)、pleckstrin同源结构域(pleckstrin homologydomain,PHD)和融合结构域(fusion domain,FD)。在pH 8.0，即碱性条件下，该蛋白的3个结构域排布成弯曲的发夹状，呈现出典型的融合前构象状态；其分子大小约80埃米(见图11左)，与先前针对狂犬病毒粒子的电镜负染结果中在高pH条件下测量的分子大小高度一致(参见参考文献12)。而在pH 6.5，即酸性条件下，该蛋白的3个结构域几乎成线性排列，呈现出融合后构象状态；其分子大小约121埃米(见图11右)，也与先前病毒粒子在低pH条件下的电镜负染结果高度一致(参见参考文献12)。由此，可以证明，本发明制备的重组RABV-G-ecto以及重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白，不仅具有正确的空间折叠，而且其蛋白构象能够依据pH的改变而发生相应的构象变化，这与狂犬病毒G蛋白构象变化的理论模型高度吻合(参见参考文献13)。

上述结构生物学数据提供了切实证据，表明实施例1中制备的重组RABV-G-ecto蛋白和实施例4中制备的重组RABV-G-ecto的C-端截短体蛋白均具有正确的空间折叠和天然构象。

实施例5“融合环取代”的重组RABV-G-ecto蛋白制备方法在不同狂犬病毒毒株中的应用验证

(1)狂犬病毒2472株的重组RABV-G-ecto蛋白的制备

选取狂犬病毒2472株的G蛋白(GenBank序列号为ADX60070.1)，参照实施例1所述的“融合环取代”策略，构建了2472株的重组RABV-G-ecto蛋白表达构建。该表达构建的序列包括2472株G蛋白胞外段的1-439位氨基酸，同时将胞外段中的两段融合环区域内的氨基酸(氨基酸73-79位和氨基酸117-125位)分别替换为两段GGSGG的柔性连接肽，并在蛋白的C-端加入了6xHis标签用于后续蛋白的纯化。我们直接通过全基因合成的方式获得了对昆虫细胞进行了密码子优化的该表达构建序列(核苷酸序列参见SEQ ID No.7，其表达的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示)，并将其克隆到pFastBac1-GP67载体中以引入GP67信号肽，辅助该蛋白的可溶和分泌表达。

同样参照实施例1的表达纯化方法，包括在sf9细胞中进行重组杆状病毒的扩增，在Hi5细胞中进行蛋白表达，利用亲和层析、离子交换层析和分子排阻层析进行蛋白纯化，最终，得到了可溶且溶液中性质均一的2472株的重组RABV-G-ecto蛋白(见图12)。

(2)狂犬病毒2472株的重组RABV-G-ecto蛋白的结晶及结构分析

利用本实施例中(1)所制备的蛋白，成功在碱性pH条件下(0.1M Tris-HCl,pH8.1,8％PEG8000)得到了该蛋白的晶体，并通过分子置换法解析了该蛋白的结构。结构分析可见，该2472株的蛋白与上述CVS-11株的蛋白具有完全相同的空间结构(见图13)。由此，可证明，利用该“融合环取代”策略所制备的2472株的重组狂犬病毒G蛋白胞外段同样具有正确的空间折叠和结构。

(3)常见狂犬病毒毒株的G蛋白序列比对分析

选取目前已知的常见狂犬病毒毒株，包括CVS-11(GenBank序列号为ADJ29911.1)、2472(GenBank序列号为ADX60070.1)、HEP-Flury(GenBank登录号为BAC53868.1)、PV(GenBank登录号为AAA47218.1)、Pitman Moore(GenBank登录号为CAI43218.1)、MOR1-DG(GenBank登录号为AAK92057.1)、MOR3-HM(GenBank登录号为AAK92058.1)、NeiMeng1025C(GenBank登录号为ABY19509.2)、FRA1-FX(GenBank登录号为AAK92050.1)、CNX8601(GenBank登录号为AAG34722.1)、CHI1-BK(GenBank登录号为AAK92060.1)、MAU1-CL(GenBank登录号为AAK92072.1)、Yunnan_Zt07(GenBank登录号为ABX79939.1)、RVD(GenBank登录号为AAO72525.1)，针对其病毒G蛋白进行序列同源性比对分析，可见这些狂犬病毒毒株的G蛋白胞外段高度保守，其中本实施例中的2472株与实施例1中的CVS-11株的G蛋白胞外段同源性最低，但其同源性亦在95％以上(同源性95.9％)，而其他毒株与2472株的G蛋白胞外段同源性分别为HEP-Flury株(同源性96.4％)、PV株(同源性96.4％)、PitmanMoore株(同源性96.4％)、MOR1-DG株(同源性99.5％)、MOR3-HM株(同源性99.5％)、NeiMeng1025C株(同源性99.3％)、FRA1-FX株(同源性98.4％)、CNX8601株(同源性98.9％)、CHI1-BK株(同源性98.4％)、MAU1-CL株(同源性97.7％)、Yunnan_Zt07株(同源性96.6％)、RVD株(同源性96.8％)，均高于CVS-11株(同源性95.9％)。

利用该“融合环取代”策略，本实施例和实施例1分别针对两种最远源的狂犬病毒G蛋白胞外段(2472株和CVS-11株)，成功制备得到了可溶蛋白，并通过离子交换层析、分子筛层析和晶体结构证明所制备的蛋白在溶液中性质均一且具有正确的空间折叠，因此，该“融合环取代”策略推断也可用于HEP-Flury、PV、Pitman Moore、MOR1-DG、MOR3-HM、NeiMeng1025C、FRA1-FX、CNX8601、CHI1-BK、MAU1-CL、Yunnan_Zt07、RVD株的G蛋白胞外段的制备。而2472株和CVS-11株狂犬病毒G蛋白胞外段的同源性为95.9％，因此该“融合环取代”策略推断也能够用于与CVS-11、2472、HEP-Flury、PV、Pitman Moore、MOR1-DG、MOR3-HM、NeiMeng1025C、FRA1-FX、CNX8601、CHI1-BK、MAU1-CL、Yunnan_Zt07、RVD株G蛋白有96％以上氨基酸同源性的G蛋白胞外段的制备。

实施例6

采用实施例1相同的策略，对狂犬病毒Pitman Moore株G蛋白胞外段第73～79位及第117～125位氨基酸进行替换，结果显示，制备获得的重组G蛋白胞外段可溶且溶液中性质均一。鉴于该毒株与2472株的G蛋白同源性(96.4％)高于CVS-11株(95.9％)，而实施例4和实施例5中已经针对两种最远源的重组G蛋白胞外段分别进行了结晶并解析了结构，因此本实施例中未再对Pitman Moore株的重组G蛋白胞外段进行结晶。

实施例7

采用实施例1相同的策略，对狂犬病毒HEP-Flury株G蛋白胞外段第73～79位及第117～125位氨基酸进行替换，结果显示，制备获得的重组G蛋白胞外段可溶且溶液中性质均一。鉴于该毒株与2472株的G蛋白同源性(96.4％)高于CVS-11株(95.9％)，而实施例4和实施例5中已经针对两种最远源的重组G蛋白胞外段分别进行了结晶并解析了结构，因此本实施例中未再对HEP-Flury株的重组G蛋白胞外段进行结晶。

实施例8

采用实施例1相同的策略，对狂犬病毒Yunnan_Zt07株G蛋白胞外段第73～79位及第117～125位氨基酸进行替换，结果显示，制备获得的重组G蛋白胞外段可溶且溶液中性质均一。鉴于该毒株与2472株的G蛋白同源性(96.6％)高于CVS-11株(95.9％)，而实施例4和实施例5中已经针对两种最远源的重组G蛋白胞外段分别进行了结晶并解析了结构，因此本实施例中未再对Yunnan_Zt07株的重组G蛋白胞外段进行结晶。

参考文献：

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虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1572

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggttcctc aggtgctgct cttcgtgctc ctgctgggct tcagcctgtg cttcggcaaa 60

ttccccatct acaccatccc cgatgagctc ggtccttggt cccccatcga catccaccat 120

ctgtcctgcc ccaacaacct ggtggtcgag gacgagggct gcactaacct gtccgagttt 180

tcctacatgg aactgaaggt gggttacatc tccgctatca aggtcaacgg cttcacttgc 240

accggtgtgg tgaccgaggc tgagacctac accaatttcg tcggttacgt caccaccact 300

ttcaagcgta agcacttccg tcccactcct gatgcctgcc gcgccgctta caactggaag 360

atggctggcg accctcgcta cgaggagtcc ctgcacaacc cctaccctga ctaccactgg 420

ctgcgcaccg tccgcaccac taaggagtcc ctcatcatta tctcccccag cgtgaccgac 480

ctcgatcctt acgacaagtc cctgcattcc cgcgtgttcc ccggtggcaa gtgctccggc 540

atcaccgtga gctccaccta ttgttctacc aaccatgatt acaccatctg gatgcccgag 600

aaccctcgcc cccgcacccc ctgcgatatc ttcaccaaca gccgtggtaa gcgcgccagc 660

aacggcaaca agacctgcgg tttcgtcgac gagcgtggtc tgtacaagag cctgaagggt 720

gcttgccgtc tcaagctgtg tggtgtgctg ggcctgcgcc tgatggatgg cacctgggtg 780

gccatgcaga cctccgacga gaccaagtgg tgcccccccg accagctggt gaacctgcac 840

gatttccgca gcgacgagat cgaacacctg gtggtggagg agctggtcaa gaagcgcgaa 900

gagtgcctgg acgctttaga aagcatcatg accactaaga gcgtgtcctt ccgtcgtctg 960

tcccatctgc gcaagctggt ccccggtttt ggcaaggcct acaccatctt caacaagacc 1020

ctcatggagg ccgacgctca ttataagtcc gtgcgcacct ggaacgagat tatcccctcc 1080

aagggttgcc tcaaggtcgg tggccgctgc catccccacg tcaacggcgt gttcttcaac 1140

ggtatcatcc tcggccctga cgaccacgtg ctcatccccg agatgcagag ctccctgctg 1200

caacagcaca tggagctgct caagagcagc gtcatccccc tcatgcatcc tctggctgat 1260

ccctccaccg tgttcaagga aggcgacgaa gctgaagact tcgtggaagt ccacctcccc 1320

gacgtgtaca agcaaatctc cggtgtggac ctcggcctgc ctaattgggg caagtacgtg 1380

ctgatgaccg ctggcgctat gatcggcctc gtcctgatct tctccctgat gacctggtgc 1440

cgccgtgcca accgccctga atccaagcag cgctccttcg gtggtactgg cggcaacgtg 1500

tccgtgacca gccagagcgg caaggtgatc cccagctggg agagctaccg ctccggtggt 1560

gagattcgcc tc 1572

<210> 2

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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catctgtcct gccccaacaa cctggtggtc gaggacgagg gctgcactaa cctgtccgag 120

ttttcctaca tggaactgaa ggtgggttac atctccgcta tcaaggtcaa cggcttcact 180

tgcaccggtg tggtgaccga ggctgagacc tacaccggtg gttctggtgg taccactttc 240

aagcgtaagc acttccgtcc cactcctgat gcctgccgcg ccgcttacaa ctggaagatg 300

gctggcgacc ctcgctacga ggagtccctg cacaacccct acggtggttc tggtggtcgc 360

accactaagg agtccctcat cattatctcc cccagcgtga ccgacctcga tccttacgac 420

aagtccctgc attcccgcgt gttccccggt ggcaagtgct ccggcatcac cgtgagctcc 480

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accccctgcg atatcttcac caacagccgt ggtaagcgcg ccagcaacgg caacaagacc 600

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ctgtgtggtg tgctgggcct gcgcctgatg gatggcacct gggtggccat gcagacctcc 720

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atctccggtg tggacctcgg cctgcctaat tggggcaagc atcaccatca ccatcac 1317

<210> 3

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Glu Leu Gly Pro Trp Ser Pro

1 5 10 15

Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp

20 25 30

Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val

50 55 60

Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe

65 70 75 80

Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala Ala Tyr

85 90 95

Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu His Asn

100 105 110

Pro Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Arg Thr Thr Lys Glu Ser Leu Ile Ile

115 120 125

Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His

130 135 140

Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly Lys Cys Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser

145 150 155 160

Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn

165 170 175

Pro Arg Pro Arg Thr Pro Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys

180 185 190

Arg Ala Ser Asn Gly Asn Lys Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly

195 200 205

Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Arg Leu Lys Leu Cys Gly Val

210 215 220

Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser

225 230 235 240

Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp

245 250 255

Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys

260 265 270

Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys

275 280 285

Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly

290 295 300

Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp

305 310 315 320

Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys

325 330 335

Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val

340 345 350

Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp Asp His Val Leu Ile Pro

355 360 365

Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His Met Glu Leu Leu Lys Ser

370 375 380

Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe

385 390 395 400

Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp

405 410 415

Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly

420 425 430

Lys His His His His His His

435

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat 120

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

<210> 6

<211> 248

<212> PRT

<213> 523-11 scFv

<400> 6

Met Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro

1 5 10 15

Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Thr

20 25 30

Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu

65 70 75 80

Ser Asp Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro

85 90 95

Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly

130 135 140

Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp

145 150 155 160

Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Gln Trp

165 170 175

Ile Gly Asp Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Gly Tyr Ser Gln Lys

180 185 190

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Ala Arg Arg Asn Tyr Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 7

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagttcccta tctacacgat accagacaaa cttggtccct ggagcccgat tgacatacat 60

catctcagct gtccaaacaa cctggttgta gaagatgaag gatgtaccaa cttgtcgggt 120

ttctcctaca tggaacttaa ggtgggatac atttcagcca taaaagtaaa tgggttcacg 180

tgcacaggtg tggtgacaga ggcagagact tacactggtg gttctggtgg aaccacgttc 240

aaaagaaagc attttcgccc aacaccagat gcatgtcgag ctgcttacaa ctggaagatg 300

gccggtgacc ccagatatga agaatctctg cacaatccgt acggtggttc tggtggtaaa 360

accacaaagg agtccctcgt catcatatcc ccaagtgtag cggacctgga cccatacgac 420

aaatcccttc actcaagggt ctttcctagc gggaagtgct cggggataac aatatcatct 480

acctactgct ctactaacca tgattacaca atctggatgc ccgagaatcc gagactgggg 540

acatcttgtg acatctttac caacagtaga gggaagagag catccaaagg gagcaaaact 600

tgcggatttg ttgatgaaag aggcttgtat aagtctttga aaggggcatg caagctcaag 660

ttgtgtgggg ttcttggcct tagacttatg gatggaacat gggtcgcgat gcaaacatcg 720

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gagatcgaac atctcgttgt agaggagttg gtcaagaaaa gagaggagtg tctggatgca 840

ctagagtcta tcatgaccac caagtcggtg agtttcagac gtctcagcca cttgagaaaa 900

cttgtccctg ggttcggaaa agcatacacc atattcaaca aaaccctgat ggaagcagat 960

gctcactaca agtcagtcag aacctggaat gagatcatcc cctccaaggg gtgtttgaga 1020

gttggaggga ggtgtcatcc tcacgtgaac ggggtgtttt tcaacggtat aatactgggt 1080

cctgatggcc atgttctcat cccagagatg caatcatccc tccttcagca gcacatggag 1140

ttgttggaat cctcagttat ccctctgatg caccctttag cagacccgtc tacagttttc 1200

aaggacggcg atgaagcaga ggattttgtc gaggttcacc ttcccgatgt acacaaacaa 1260

atctcaggtg ttgacctggg tctccctaac tggggaaagc atcaccatca ccatcac 1317

<210> 8

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro

1 5 10 15

Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp

20 25 30

Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val

50 55 60

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65 70 75 80

Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala Ala Tyr

85 90 95

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115 120 125

Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His

130 135 140

Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly Lys Cys Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ser

145 150 155 160

Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn

165 170 175

Pro Arg Leu Gly Thr Ser Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys

180 185 190

Arg Ala Ser Lys Gly Ser Lys Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly

195 200 205

Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val

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Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser

225 230 235 240

Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly

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Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp Gly His Val Leu Ile Pro

355 360 365

Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser

370 375 380

Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe

385 390 395 400

Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp

405 410 415

Val His Lys Gln Ile Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly

420 425 430

Lys His His His His His His

435

Claims

1.一种制备可溶、均一性好且具有正确的空间折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段的方法，其特征在于，用柔性连接肽替换狂犬病毒G蛋白胞外段的第73～79位氨基酸所在区域，和狂犬病毒G蛋白胞外段的第117～125位氨基酸所在区域。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述狂犬病毒G蛋白胞外段为完整的胞外段或C-端截短的胞外段。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述完整的胞外段包括狂犬病毒G蛋白氨基酸序列第1～439位氨基酸；所述C-端截短的胞外段包括狂犬病毒G蛋白氨基酸序列第1～405位氨基酸，或第1～414位氨基酸，或第1～419位氨基酸，或第1～425位氨基酸，或第1～431位氨基酸。

4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，柔性连接肽为GS连接肽；所述GS连接肽为以下任一种：GGS、GGGS、(GS)₂、GGSGG、GGGGS、GSGSG、(GGS)₂、(GS)₃、GGSGGSG、GSGSGSG、GGGSGGG、(GS)₄、GGSGGSGG、(GGGS)₂、GSGSGSGSG、(GGS)₃、GGSGGSGGSG、(GS)₅、(GGGGS)₂、(GGSGG)₂、(G)₃、(G)₄、(G)₅、(G)₆、(G)₇、(G)₈、(G)₉、(G)₁₀。

5.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，狂犬病毒的株系为以下任一种：CVS-11、2472、HEP-Flury、PV、Pitman Moore、MOR1-DG、MOR3-HM、NeiMeng1025C、FRA1-FX、CNX8601、CHI1-BK、MAU1-CL、Yunnan_Zt07、RVD。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，狂犬病毒的株系为以下任一种：CVS-11、2472、HEP-Flury、PV、Pitman Moore、MOR1-DG、MOR3-HM、NeiMeng1025C、FRA1-FX、CNX8601、CHI1-BK、MAU1-CL、Yunnan_Zt07、RVD。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述G蛋白胞外段在昆虫细胞中表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述昆虫细胞选自Sf9或Hi5细胞。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，还对分泌表达到细胞培养基上清中的蛋白进行亲和层析粗纯化。

10.应用权利要求1～9任一所述方法制备获得的重组狂犬病毒G蛋白胞外段。

11.含有权利要求10所述的重组狂犬病毒G蛋白胞外段的组合物。

12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物为疫苗候选组分、诊断试剂盒抗原组分或疫苗抗原含量标定的标准品。

13.权利要求10所述的重组狂犬病毒G蛋白胞外段或权利要求11所述的重组狂犬病毒G蛋白胞外段的组合物在生物、医药领域制备产品方面的应用。