CN108872572A

CN108872572A - 一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒

Info

Publication number: CN108872572A
Application number: CN201810546415.7A
Authority: CN
Inventors: 陈翠翠; 李来庆; 梁焕坤; 宁波; 郭晓晓; 刘细潘; 钟树海; 刘鹏娥
Original assignee: Guangzhou Youdi Biological Polytron Technologies Inc
Current assignee: Guangzhou Youdi Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108872572B

Abstract

本发明公开了一种用于狂犬病毒抗体检测的试剂盒，属于生物诊断技术领域。试剂盒包括偶联狂犬病毒抗原的磁珠、和狂犬病毒抗体结合并带有标记物的二抗、狂犬病毒抗体标准品、狂犬病毒抗体质控品、样本稀释液、洗涤液，狂犬病毒抗原的DNA序列如Seq No.1所示，狂犬病毒抗原的氨基酸序列如Seq No.2所示。本发明试剂盒采用管式磁珠首先把待测物分离出来，再采用化学发光法进行检测，避免了杂质的干扰，降低了假阳性的出现，提高检测灵敏度。

Description

一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒

技术领域

本发明属于生物诊断技术领域，尤其涉及一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒。

背景技术

狂犬病是一种人畜共患病，由被感染动物唾液中发现的一种病毒引起，其是通过咬伤或开放性创伤传染给宠物和人。狂犬病毒(Rabies virus，RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)，外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA；狂犬病毒是引起狂犬病的病原体。

狂犬病毒感染中枢神经系统，引起被感染个体脑部病变并最终死亡。从接触病毒到临床症状的出现可能间隔两周乃至数月，在出现明显临床症状的前几天，便可在动物的唾液中检测到狂犬病毒。但是，被感染的动物都会随着病症的发展最终走向死亡；被感染的蝙蝠、浣熊、狐狸、臭鼬、狗和猫会给人类带来极大的危险。全球每年有超过50000人死于狂犬病。作为人畜共患的急性传染病，狂犬病几乎没有有效的治疗手段；一旦发病，致死率接近100％。有必要对犬、猫等宠物进行严加管理，定期进行疫苗注射。若人被狂犬咬伤，应立即清洗伤口，可用20％肥皂水、去垢剂、含胺化合物或清水充分冲洗；冲洗后，尽快注射狂犬病毒免疫血清。

疫苗接种后，动态检测狂犬病毒抗体产生是极为重要的，起到监控狂犬病的作用。市场上现有的检测狂犬病毒抗体的试剂盒有胶体金法和ELISA法，现有的检测试剂盒存在一些不足：1)传统的胶体金法，无法定量，且检测灵敏度低；2)ELISA法可以实现定量检测，但灵敏度仍无法满足疫苗接种后抗体产生的动态检测。

因此，有必要设计出一种试剂盒，该试剂盒能动态检测狂犬病毒抗体。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，该试剂盒能动态检测狂犬病毒抗体。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种狂犬病毒抗原，所述狂犬病毒抗原为融合蛋白，所述狂犬病毒抗原的DNA序列如Seq No.1所示，所述狂犬病毒抗原的氨基酸序列如Seq No.2所示。

另外，本发明还提供所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其包括以下步骤：

S21)融合蛋白构建：选取狂犬病毒的糖蛋白膜外区第1位至第440位氨基酸为氮端，狂犬病毒的核蛋白第300位至第450位氨基酸为碳端，两个肽链之间以柔性连接肽GGSGG相连，融合蛋白C末端带有6个His；其中，G表示为甘氨酸，S表示为丝氨酸，His表示为组氨酸；

S22)真核表达载体构建，表达融合蛋白的细胞株构建；

S23)融合蛋白制备与纯化。

另外，本发明还提供一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，其包括偶联狂犬病毒抗原的磁珠、和狂犬病毒抗体结合并带有标记物的二抗、狂犬病毒抗体标准品、狂犬病毒抗体质控品、样本稀释液、洗涤液，所述狂犬病毒抗原的DNA序列如Seq No.1所示，所述狂犬病毒抗原的氨基酸序列如Seq No.2所示。

作为上述技术方案的改进，所述偶联狂犬病毒抗原的磁珠是通过以下方法进行制备：

S41)用包被缓冲液清洗羧基磁珠，向清洗后的羧基磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，置于室温下活化；所述包被缓冲液为0.05mol/l吗啉乙磺酸，包被缓冲液的pH值为6.0；

S42)用包被缓冲液洗去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入狂犬病毒抗原进行室温反应；

S43)用封闭缓冲液置换反应液，再加入封闭缓冲液对偶联狂犬病毒抗原的磁珠进行浓度调节，置于冰箱保存；所述封闭缓冲液由0.05mol/l Tris(三羟甲基氨基甲烷)、质量体积比为2％牛血清白蛋白、体积比为0.05％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和质量体积比为0.09％叠氮化钠组成，且封闭缓冲液的pH值为7.5。

作为上述技术方案的改进，所述二抗与吖啶酯偶联，所述试剂盒还包括底物激发液A和底物激发液B，所述底物激发液A由0.1mol/l浓硝酸、体积比为0.15％过氧化氢和体积比为0.1％TrionX-100组成，所述底物激发液B由0.35mol/l氢氧化钠和体积比为2.5％TrionX-100组成。

作为上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括用于保存偶联吖啶酯的二抗的发光试剂保存液，所述发光试剂保存液由pH值为6.3的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)、质量体积比为1％海藻糖和体积比为0.5％TrionX-100组成。

作为上述技术方案的改进，所述样本稀释液由pH值为7.4的PBS缓冲液和体积比为0.05％Proclin300(诊断试剂防腐剂)组成。

作为上述技术方案的改进，所述洗涤液为体积比为0.05％PBST缓冲液(PBS溶液中加入Twee-20)。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，管式磁珠首先把待测物分离出来，再采用化学发光法进行检测，避免了杂质的干扰，降低了假阳性的出现，提高检测灵敏度；本发明选用狂犬病病毒糖蛋白RgP的膜外区(1～440氨基酸)与核蛋白NP的B细胞优势抗原肽段(300～450氨基酸)重组为融合蛋白，以融合蛋白作为抗原，提高狂犬病毒抗体检测的特异性和敏感性。

附图说明

图1为本发明试剂盒中标准品得到的标准曲线图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实验和附图对本发明作进一步说明。

狂犬病毒抗原的制备

S21)融合蛋白构建

选取狂犬病毒的糖蛋白膜外区第1位至第440位氨基酸为氮端，狂犬病毒的核蛋白第300位至第450位氨基酸为碳端，两个肽链之间以柔性连接肽GGSGG相连，融合蛋白C末端带有6个His；狂犬病毒抗原的结构式为：RgP(1～440aa)-GGSGG-NP(300～450aa)-6×His，狂犬病毒抗原的DNA序列如Seq No.1所示，狂犬病毒抗原的氨基酸序列如Seq No.2所示；其中，G表示为甘氨酸，S表示为丝氨酸，His表示为组氨酸；糖蛋白RgP膜外区氨基酸序列和核蛋白NP氨基酸序列均选用我国现用疫苗株CTN-1，RgP的GeneBank号为AIA08921，NP的GeneBank号为AIA08918，NP肽段的C末端带6个His标签；

S22)真核表达载体构建，表达融合蛋白的细胞株构建

融合蛋白的基因序列委托无锡青兰生物技术有限公司合成并克隆构建真核表达载体pCDNA3-RgP-GGSGG-NP-6×His；取重组质粒pCDNA3-RgP-GGSGG-NP-6×His用脂质体介导的方法转染COS-7细胞，按照Lipofectamine 2000(Invitrogen，Inc.)说明书进行操作；转染48h后加入G418进行筛选；约14d后，可见有单克隆细胞集落形成，挑选10个以上的单克隆细胞集落扩增培养；以RT-PCR检测融合蛋白的mRNA转录，并对高转录融合蛋白mRNA的单克隆细胞进行扩增培养；分别对阳性克隆细胞用Western blot、间接免疫荧光检测融合蛋白表达情况；

S23)融合蛋白制备与纯化

大量培养稳定高表达融合蛋白的COS-7细胞，收集表达融合蛋白细胞悬液，超声破碎、12 000r/min离心15min；弃细胞碎片，取上清液透析，Ni²⁺-NTA柱纯化。

本发明选用狂犬病病毒糖蛋白RgP的膜外区(1～440氨基酸)与核蛋白NP的B细胞优势抗原肽段(300～450氨基酸)重组为融合蛋白，以融合蛋白作为抗原，提高狂犬病毒抗体检测的特异性和敏感性。

用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒

本发明所述试剂盒包括以下组分：

1、偶联狂犬病毒抗原的磁珠，2、和狂犬病毒抗体结合并偶联吖啶酯的二抗，3、狂犬病毒抗体标准品，4、狂犬病毒抗体质控品，5、样本稀释液，6、洗涤液，7、底物激发液A、底物激发液B，8、保存偶联吖啶酯的二抗的发光试剂保存液；

底物激发液A由0.1mol/l浓硝酸、0.15％过氧化氢(v/v)和0.1％TrionX-100(v/v)组成，底物激发液B由0.35mol/l氢氧化钠和2.5％TrionX-100(v/v)组成，发光试剂保存液由pH值为6.3的PBS缓冲液、1％海藻糖(w/v)和0.5％TrionX-100(v/v)组成，样本稀释液由pH值为7.4的PBS缓冲液和0.05％Proclin300(v/v)组成，洗涤液为0.05％PBST缓冲液(v/v)。

上述偶联狂犬病毒抗原的磁珠是通过以下方法进行制备：

S41)用包被缓冲液清洗羧基磁珠3次，向清洗后的羧基磁珠中加入等质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，1mg磁珠对应1.2mg EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，置于室温下活化30min；所述包被缓冲液为0.05mol/l吗啉乙磺酸，包被缓冲液的pH值为6.0；

S42)用包被缓冲液洗去未反应的EDC和NHS，再加入狂犬病毒抗原进行室温反应2h；

S43)用封闭缓冲液置换反应液3次，再加入封闭缓冲液将偶联狂犬病毒抗原的磁珠)的浓度调节为3mg/ml，置于4℃冰箱保存；所述封闭缓冲液由0.05mol/l Tris、2％牛血清白蛋白(w/v)、0.05％Triton X-100(v/v)和0.09％叠氮化钠(w/v)组成，封闭缓冲液的pH值为7.5。

上述偶联吖啶酯的二抗是通过以下方法进行制备：

使用超管，离心浓缩除去杂质；按照3：1质量比将抗犬IgG抗体(二抗)与吖啶酯充分混匀进行标记偶联；在室温且pH为6.3条件下，轻轻震荡标记3h；用0.1mol/l PBS透析，以除去未结合的吖啶酯；再过Sephadex G50凝胶层析柱纯化，化学发光仪上收集发光强度高的产物，合并纯化后的二抗与吖啶酯的偶联物，保存在发光试剂保存液，制成发光试剂，分装，保存备用。

狂犬病毒抗体检测

标准品制备

将从广州艺佳生物科技有限公司购买的抗狂犬病毒抗体，用样本稀释液准确稀释成0，1，5，10，50，100ng/ml 6个浓度；质控品采用狂犬病毒抗体血清(液体)国家标准物质。

本试剂盒采用管式磁珠化学发光法进行狂犬病毒抗体的定量检测，具体步骤如下：取血清样本，用样本稀释液进行适当稀释；在透明的反应管中，依次加入50μl待测血清标本(标准品或质控品)、50μl发光试剂、100μl抗原磁珠，震荡混匀，于室温下孵育反应20min，随后在磁场作用下用洗涤液清洗3次；当反应管进入检测暗室后，全自动发光仪先后泵入底物激发液A和底物激发液B；化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)，发光值与标本中的抗体浓度成正相关；狂犬病毒抗体浓度根据标准品和对应的RLU值建立的标准曲线进行定量计算。

如图1所示，标准曲线的相关系数分别为R²＝0.9945，表明线性相关性良好，检测灵敏度为0.45ng/ml。

方法的特异性

选取几个常见的病毒抗体进行特异性分析，犬细小病毒抗体、犬流感病毒抗体、犬冠状病毒抗体、犬瘟热病毒抗体。用此试剂盒测定，结果见表1，本试剂盒测定高浓度的犬细小病毒抗体、犬流感病毒抗体、犬冠状病毒抗体、犬瘟热病毒抗体时，测定浓度均远低于理论浓度，说明该方法的特异性较好。

表1

精密度实验

采用本发明检测试剂盒对精确定量的高、中、低三个标准品浓度进行测定，各设置10各复孔。如表2所示，本试剂盒的批内变异系数和批间变异系数均较小，符合试剂盒规定要求。

表2

精确度实验

采用本发明检测试剂盒，按照常规方法进行回收实验，如表3所示，高中低三个浓度的回收率在99.74％～102.4％之间，本发明检测试剂盒的精确度较高。

表3

稳定性实验

本方法试剂盒的各组成部分放于37℃加速破坏7d后，再对各组份进行检测，发光值均有所降低，但变化幅度均在10％以内，表示此本发明试剂盒检测方法比较稳定。

临床应用实验

取广州福懋宠物医院经过狂犬疫苗免疫过的犬血清样本40列，未经狂犬疫苗免疫的健康犬血清30列，采用本发明试剂盒进行检测。

具体检测步骤：在透明的反应管中，依次加入50μl待测血清标本(标准品或质控品)、50μl发光试剂、100μl抗原磁珠，震荡混匀，于室温下孵育反应20min，随后在磁场作用下用洗涤液清洗3次；当反应管进入检测暗室后，全自动发光仪先后泵入底物激发液A和底物激发液B；化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)，发光值与标本中的抗体浓度成正相关；狂犬病毒抗体浓度根据标准品和对应的RLU值建立的标准曲线进行定量计算。

结果免疫后的犬血清中狂犬抗体水平为48.4±20.6ng/ml；未经免疫的健康犬血清抗体水平为0.88±0.47ng/ml。经过狂犬疫苗接种后，犬产生了不同程度的免疫反应，产生了抗狂犬病毒的抗体。本发明试剂盒可用于狂犬疫苗接种后免疫效果的动态检测。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州优迪生物科技股份有限公司

<120> 一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒

<130> 2018.5.18

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1842

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgatccccc aggccctgct gttcgtgccc ctgctggtgt tccccctgtg cttcggcaag 60

ttccccatct acaccatccc cgacaagctg ggcccctgga gccccatcga catccaccac 120

ctgagctgcc ccaacaacct ggtggtggag gacgagggct gcaccaacct gagcggcttc 180

agctacatgg agctgaaggt gggctacatc agcgccatca aggtgaacgg cttcacctgc 240

accggcgtgg tgaccgaggc cgagacctac accaacttcg tgggctacgt gaccaccacc 300

ttcaagcgca agcacttccg ccccaccccc gacgcctgcc gcagcgccta caactggaag 360

atggccggcg acccccgcta cgaggagagc ctgcacaacc cctaccccga ctaccactgg 420

ctgcgcaccg tgaagaccac caaggagagc gtggtgatca tcagccccag cgtggccgac 480

ctggacccct acgacgagag cctgcacagc cgcgtgttcc cccgcggcaa gtgcagcggc 540

atcaccgtga gcagcgccta ctgcagcacc aaccacgact acaccatctg gatgcccgag 600

aacccccgcc tgggcaccag ctgcgacatc ttcaccaaca gccgcggcaa gcgcgccagc 660

aagggcagca agacctgcgg cttcgtggac gagcgcggcc tgtacaagag cctgaagggc 720

gcctgcaagc tgaagctgtg cggcgtgctg ggcctgcgcc tgatggacgg cacctgggtg 780

gccatccaga ccagcaacga gaccaagtgg tgcccccccg accagctggt gaacctgcac 840

gacttccaca gcgacgagat cgagcacctg gtggtggagg agctggtgaa gaagcgcgag 900

gagtgcctgg acgccctgga gagcatcatg accaccaaga gcgtgagctt ccgccgcctg 960

agccacctgc gcaagctggt gcccggcttc ggcaaggcct acaccatctt caacaagacc 1020

ctgatggagg ccgacgccca ctacaagagc gtgcagacct ggaacgagat catccccagc 1080

aagggctgcc tgcgcgtggg cggccgctgc cacccccacg tgaacggcgt gttcttcaac 1140

ggcatcatcc tgggccccga cggccacgtg ctgatccccg agatgcagag cagcctgctg 1200

cagcagcaca tggagctgct gaagagcagc gtgatccccc tgatgcaccc cctggccgac 1260

cccagcaccg tgttcaagga cggcgacgag gtggaggact tcgtggaggt gcacctgcag 1320

gacgtgcaca agcaggtgag cggcgtggac ggcggcagcg gcggcagcag caacgccgtg 1380

ggccacgtgt tcaacctgat ccacttcgtg ggctgctaca tgggccaggt gcgcagcctg 1440

aacgccaccg tgatcgccgc ctgcgccccc cacgagatga gcgtgctggg cggctacctg 1500

ggcgaggagt tcttcggcaa gggcaccttc gagcgccgct tcttccgcga cgagaaggag 1560

ctgcaggagt acgaggccgc cgagctgacc aagaccgacc tggccctggc cgacgacggc 1620

accgtgaaca gcgacgacga ggactacttc agcggcgaga cccgcagccc cgaggccgtg 1680

tacacccgca tcatgatgaa cggcggccgc ctgaagcgca gccacatccg ccgctacgtg 1740

agcgtgagca gcaaccacca ggcccgcccc aacagcttcg ccgagttcct gaacaagacc 1800

tacagcagcg acagcggcgg cagccaccac caccaccacc ac 1842

<210> 2

<211> 614

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ile Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro

20 25 30

Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

35 40 45

Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu

50 55 60

Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys

65 70 75 80

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr

85 90 95

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala

100 105 110

Cys Arg Ser Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu

115 120 125

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val

130 135 140

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Val Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp

145 150 155 160

Leu Asp Pro Tyr Asp Glu Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Arg Gly

165 170 175

Lys Cys Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Ala Tyr Cys Ser Thr Asn His

180 185 190

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Thr Ser Cys

195 200 205

Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Lys

210 215 220

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly

225 230 235 240

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp

245 250 255

Gly Thr Trp Val Ala Ile Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro

260 265 270

Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe His Ser Asp Glu Ile Glu

275 280 285

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp

290 295 300

Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu

305 310 315 320

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile

325 330 335

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Gln

340 345 350

Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly

355 360 365

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu

370 375 380

Gly Pro Asp Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Lys Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His

405 410 415

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Val Glu

420 425 430

Asp Phe Val Glu Val His Leu Gln Asp Val His Lys Gln Val Ser Gly

435 440 445

Val Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ala Val Gly His Val Phe

450 455 460

Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly Gln Val Arg Ser Leu

465 470 475 480

Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His Glu Met Ser Val Leu

485 490 495

Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys Gly Thr Phe Glu Arg

500 505 510

Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu Tyr Glu Ala Ala Glu

515 520 525

Leu Thr Lys Thr Asp Leu Ala Leu Ala Asp Asp Gly Thr Val Asn Ser

530 535 540

Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg Ser Pro Glu Ala Val

545 550 555 560

Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu Lys Arg Ser His Ile

565 570 575

Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln Ala Arg Pro Asn Ser

580 585 590

Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Ser Asp Ser Gly Gly Ser

595 600 605

His His His His His His

610

Claims

1.一种狂犬病毒抗原，其特征在于，所述狂犬病毒抗原为融合蛋白，所述狂犬病毒抗原的DNA序列如Seq No.1所示，所述狂犬病毒抗原的氨基酸序列如Seq No.2所示。

2.如权利要求1所述的狂犬病毒抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S21)融合蛋白构建：选取狂犬病毒的糖蛋白膜外区第1位至第440位氨基酸为氮端，狂犬病毒的核蛋白第300位至第450位氨基酸为碳端，两个肽链之间以柔性连接肽GGSGG相连，融合蛋白碳末端带有6个His；其中，G表示为甘氨酸，S表示为丝氨酸，His表示为组氨酸；

S22)真核表达载体构建，表达融合蛋白的细胞株构建；

S23)融合蛋白制备与纯化。

3.一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，其特征在于，包括偶联狂犬病毒抗原的磁珠、和狂犬病毒抗体结合并带有标记物的二抗、狂犬病毒抗体标准品、狂犬病毒抗体质控品、样本稀释液、洗涤液，所述狂犬病毒抗原的DNA序列如Seq No.1所示，所述狂犬病毒抗原的氨基酸序列如Seq No.2所示。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联狂犬病毒抗原的磁珠是通过以下方法进行制备：

S43)用封闭缓冲液置换反应液，再加入封闭缓冲液对偶联狂犬病毒抗原的磁珠进行浓度调节，置于冰箱保存；所述封闭缓冲液由0.05mol/l Tris、质量体积比为2％牛血清白蛋白、体积比为0.05％Triton X-100和质量体积比为0.09％叠氮化钠组成，且封闭缓冲液的pH值为7.5。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述二抗与吖啶酯偶联，所述试剂盒还包括底物激发液A和底物激发液B，所述底物激发液A由0.1mol/l浓硝酸、体积比为0.15％过氧化氢和体积比为0.1％TrionX-100组成，所述底物激发液B由0.35mol/l氢氧化钠和体积比为2.5％TrionX-100组成。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于保存偶联吖啶酯的二抗的发光试剂保存液，所述发光试剂保存液由pH值为6.3的PBS缓冲液、质量体积比为1％海藻糖和体积比为0.5％TrionX-100组成。

7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液由pH值为7.4的PBS缓冲液和体积比为0.05％Proclin300组成。

8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为体积比为0.05％PBST缓冲液。