CN102924571A - 狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽及其筛选、鉴定方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及抗原表位多肽的筛选与鉴定。本发明公开了一系列狂犬病毒糖蛋白与核蛋白抗原表位多肽的筛选、鉴定以及应用。通过生物信息学手段对狂犬病毒糖蛋白与核蛋白进行预测获得候选表位多肽，利用淋巴细胞增殖实验、ELISPOT实验以及流式细胞法对后续表位多肽进行体外实验验证，获得四条狂犬病毒蛋白的抗原表位多肽，其特征在于包含Th表位和CTL表位，并能够在体外刺激经疫苗免疫小鼠的淋巴细胞增殖，且诱导细胞分泌相关细胞因子，具有杀伤感染病毒的细胞以及刺激抗体产生的作用。本发明可用于狂犬病毒表位疫苗的开发和对疫苗功效的检测，对研制生产狂犬病疫苗的免疫功能检测试剂盒具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种狂犬病毒糖蛋白与核蛋白抗原表位及其筛选、鉴定方法与应用。
背景技术
狂犬病是当前威胁人类健康的一种比较严重的急性传染病，人类患者一旦被病畜咬伤而发病，死亡率高达95%以上。狂犬病病毒属于弹状病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病病毒属(lyssa virus)，呈子弹状。狂犬病病毒可通过破损的皮肤或黏膜侵入人体，经神经末梢上行进入人及所有温血动物中枢神经系统(CNS)而引发狂犬病。狂犬病病毒基因组核酸为不分节段的单股负链RNA，由11928或11932个核苷酸组成，相对分子量约4.6×106，3’到5’端依次排列着N、 P、M、G、L基因，分别编码5种结构蛋白：核蛋白(nucleoprotein, NP)、磷酸化蛋白(phosphoprotein，PP)、基质蛋白(matrix protein, MP)、糖蛋白(glycoprotein，GP)和转录酶大蛋白(large protein, LP)。完整的狂犬病病毒颗粒由核衣壳和包膜两部分构成，核衣壳由核蛋白、磷蛋白和转录酶大蛋白构成，而包膜由糖蛋白和基质蛋白构成。
当前我国狂犬病形势相当严峻，发病率居世界第二位，仅次于印度。通过注射狂犬病毒疫苗预防狂犬病的感染是当前控制狂犬病发病的重要途径。但是目前狂犬病毒疫苗的免疫效果在人群中存在较大差异，且注射后体内狂犬病毒抗体的滴度上升到具有保护效力的滴度所需要的时间较长，不足以在病毒潜伏期内产生足够的抗体以抵抗狂犬病毒的感染和发病。
表位疫苗作为近年来新发展起来的一种新型疫苗技术，其含有能够被机体免疫细胞直接识别的MHC限制性多肽，能够激发机体产生广泛而强烈的细胞免疫与体液免疫反应，特别是针对T细胞表位设计的表位疫苗，能够产生具有细胞杀伤作用的CTL和促进中和抗体产生的Th免疫应答反应，对于清除病毒感染、提供免疫保护具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种狂犬病毒的抗原表位多肽，并提供筛选和鉴定这种表位多肽的方法以及抗原表位多肽的应用。
本发明涉及的一系列狂犬病毒抗原表位多肽，具体包含以下序列：
（1）狂犬病毒糖蛋白氨基酸序列第367~381的Th表位，记作G367-381，以及第333~341的CTL表位，记作G333-341，分别如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示；
（2）狂犬病毒核蛋白氨基酸序列第92~106的Th表位，记作N92-106，以及第409~423的CTL表位，记作N409-423，分别如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示。
本发明提供的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽，具有MHC限制性的特征，并且所述抗原为如下(a)或 (b)所示的蛋白质：
(a) 由SEQ.ID .NO.1、SEQ.ID .NO.2、SEQ.ID .NO.3或SEQ.ID .NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b) 在(a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加1~5个氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由(a)衍生的蛋白质。
本发明还提供编码所述蛋白质(a)或 (b)的基因，其具有：
(a) 由SEQ.ID .NO.1、SEQ.ID .NO.2、SEQ.ID .NO.3或SEQ.ID .NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b) 在 (a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加1~5个氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由 (a)衍生的蛋白质。
本发明还提供所述基因的原核表达载体。
本发明还提供所述的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽，其由上述4条多肽以任意顺序直接连接或者通过连接肽连接而成。
本发明提供的一系列狂犬病毒抗原表位多肽具有以下的功能特征：①在淋巴细胞增殖实验中，可刺激经疫苗免疫的BALB/c小鼠脾细胞增殖，刺激指数SI＞2；②在ELISPOT实验中，可刺激经疫苗免疫的BALB/c小鼠脾细胞分泌细胞因子IL-4和IFN-γ； 
在流式细胞实验中，可诱导CD3+ CD4+ T细胞和CD3+ CD8+ T细胞分化。
本发明公开的筛选和鉴定表位多肽的方法，具体步骤为：
（1）通过生物信息学软件BIMAS、SYFPEITHI以及RANKPEP对从NCBI获取的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白序列进行预测分析，选择一定参数，选取结果中排名考前的序列作为候选表位序列；
（2）合成候选表位序列，通过体外淋巴细胞增殖的实验对候选表位进行第一次筛选，选择刺激指数SI＞2的多肽进行下一步实验；
（3）经过第一次筛选获得的多肽序列用ELISPOT实验和流式细胞法检测，检测指标主要是多肽刺激细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌情况以及对CD3+CD4+/ CD3+CD8+T细胞亚群的影响情况；
（4）通过对实验结果的分析，确定最后的表位多肽。
本发明中的多肽可被抗原递呈细胞正确递呈，促进相关T细胞的激活，并且分泌细胞因子，具有激活细胞免疫应答的特性。由于细胞免疫反应对于清除机体感染的病毒发挥了关键的作用，因此，本发明可用于制备狂犬病毒的表位疫苗，及制备检测狂犬病毒的表位疫苗免疫效果的试剂盒。
附图说明
图1 狂犬病毒糖蛋白与核蛋白CTL表位预测结果。
图2 狂犬病毒糖蛋白与核蛋白Th表位预测结果。
具体实施方式
一、狂犬病毒糖蛋白与和蛋白氨基酸序列的获得与表位的预测
通过检索NCBI数据库，获得狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的氨基酸全长序列，编号分别为gi_32440976与gi_294999043，具体序列如SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6显示。对NCBI数据库中获得的狂犬病毒G蛋白与N蛋白的序列进行CTL表位以及Th表位的预测。小鼠的MHC-I类分子包括H-2kd、H-2Dd和H-2Ld三个亚类，MHC-II类分子包括I-Ad和I-Ed两个亚类。因此为了获得CTL和Th表位，需要分别对这几个亚类进行分析与预测。对于MHC-I类分子，使用SYFPEITHI和BIMAS软件进行预测，选择共同得分较高的6条序列，如表1所示。对于MHC-II类分子，使用RANKPEP软件进行预测，选择得分较高的6条序列，如表2所示。
二、表位多肽的合成与保存
多肽合成由上海强耀生物科技有限公司完成，共计12条。多肽合成后经HPLC纯化，纯度在90.55%~96.65%之间。经质谱分析，合成的多肽实际相对分子质量与理论相符，说明合成的多肽正确，可用于后续鉴定实验。合成的多肽分别溶解于DMSO中，浓度为5mg/ml，-80℃保存备用。
三、小鼠分组与免疫
将BALB/c小鼠随机分为两组，即实验组和对照组，每组12只。其中实验组腹腔注射0.5ml人用狂犬病疫苗（Vero细胞），对照组注射相同剂量的生理盐水。各组小鼠均在第0天和第七天各免疫一次，注射部位与剂量均相同。
四、表位多肽淋巴细胞增殖实验
小鼠末次免疫后10d断头处死，无菌取脾后研磨过滤，用淋巴细胞分离液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为106个/ml,加入96孔细胞培养板，100μl/孔，同时加入稀释好的多肽，终浓度为20μg/ml（每组5个平行孔，其中两孔用于流式细胞分析）。阴性对照孔加入无关多肽，阳性对照孔加入终稀释度为1:10的狂犬病疫苗原液，空白对照孔为普通1640培养基。将淋巴细胞置于37℃，5% CO2饱和湿度条件下进行培养。5d后每孔加入10μl CCK-8溶液，继续培养4h，于450nm处测定吸光度A值，结果以3复孔的平均A450值表示，以刺激指数SI（Stimulation index）值表示结果（SI=实验孔OD值/阴性孔OD值）。结果如图1所示，以SI＞2为判断阳性的标准，共筛选到6条候选多肽。
五、多肽刺激淋巴细胞分泌细胞因子的ELISOPOT实验
小鼠末次免疫后10d断头处死，无菌取脾，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为106个/ml，每只小鼠脾细胞样品设4个复孔。其余步骤按照试剂盒说明操作：每孔加入100μl细胞，阳性对照加入10μl PHA，实验孔加入10μl终浓度为20μg/ml的合成多肽，阴性对照孔加入无关多肽，空白对照孔位为普通1640培养基。将细胞置于37℃，5% CO2饱和湿度条件下培养20h，弃去细胞样品，洗涤后加入100μl生物素标记的抗体，孵育1h后再次洗涤，加入100μl酶标亲和素，孵育1h。最后一次洗涤后加入100μl 显色液于室温下显色25min，观察斑点形成。显色完毕后，用去离子水洗板3次终止反应，将板放置于室温阴凉处，干燥后用读板机进行读板，以分泌IL-4或IFN-γ的细胞数/106个脾细胞表示。结果如图2所示，G367-381、N92-106、N409-423及G333-341四条多肽可刺激细胞分泌IL-4与IFN-γ，可确认为表位多肽。
六、多肽刺激T细胞分化情况的流式细胞实验
淋巴细胞培养5d后，收集细胞，用细胞染色缓冲液洗涤两次，调整细胞浓度为107个/ml。每管加入100μl细胞悬液，并加入FITC anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD4以及PE/Cy5 anti-mouse CD8a荧光抗体各2ul，冰上避光孵育20min。加入1.5ml细胞染色缓冲液以1500r/min，5min离心洗涤细胞2次，去除残留的荧光抗体。最后以0.5ml细胞染色缓冲液重悬细胞，转移至流式管中，上机检测多肽刺激对CD3+CD4+/ CD3+CD8+T细胞亚群的影响情况。结果如表3显示，ELISPOT筛选获得的多肽均能诱导T细胞分化，进一步验证筛选到的多肽具有成为表位的可能性，其中，G367-381和N92-106主要诱导产生以CD3+ CD4+ T细胞增殖为主的Th型免疫应答，而N409-423及G333-341则主要诱导产生以CD3+ CD8+ T细胞增殖为主的CTL型免疫应答。
七、具体应用
现有的狂犬疫苗尽管能够提供一定的保护作用，但往往存在免疫原性较差、抗体产生缓慢、免疫程序繁琐等不足，在严重的情况下，患者还需要同时注射昂贵的免疫球蛋白进行辅助治疗。狂犬病毒侵入机体后，一般通过产生中和抗体以及细胞免疫反应两种途径清除感染，中和抗体只能清除游离于细胞外的病毒，而对于进入细胞内的病毒，只能依靠细胞免疫的杀伤作用进行清除，因此细胞免疫对于预防和清除狂犬病毒的感染具有非常重要的作用。
表位疫苗作为近年来新发展起来的一种新型疫苗技术，其含有能够被机体免疫细胞直接识别的MHC限制性多肽，能够激发机体产生广泛而强烈的细胞免疫与体液免疫反应，特别是针对T细胞表位设计的表位疫苗，能够产生具有细胞杀伤作用的CTL和促进中和抗体产生的Th免疫应答反应，对于清除病毒感染、提供免疫保护具有重要的作用。
本发明提供的一系列狂犬病毒抗原表位，经体外实验证明可明显提高淋巴细胞增殖能力，以及诱导细胞分泌抗病毒感染的相关细胞因子，主要可在以下两方面得到应用：
1、有助于狂犬病表位疫苗的开发。通过化学合成或基因工程表达狂犬病毒抗原表位多肽，将其与KLH、BSA等分子量较大的蛋白进行偶联，或加入疫苗佐剂，制成狂犬病表位疫苗，可直接提高机体对狂犬病毒的细胞免疫及体液免疫应答水平，克服现有狂犬病疫苗的种种不足；
2、用于开发检测疫苗免疫效果的试剂盒。狂犬疫苗注射后的免疫效果主要是通过检测中和抗体的水平来判断，但是细胞免疫的水平在抗病毒感染的过程中也发挥了非常重要的作用。通过本发明提供的狂犬病毒抗原表位多肽与注射疫苗患者的免疫细胞相互作用的实验（如具体实施四、五、六实验所述），可判断狂犬病疫苗在机体内诱导细胞免疫应答的水平，从而更有效地指导诊断和治疗。
表1
表2
表3
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽及其筛选、鉴定方法与应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213>
<400> 1
Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe
1 5 10 15
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213>
<400> 2
Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys Thr Leu
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213>
<400> 3
Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Leu Ile Ala Arg Lys Gly Asp Arg Ile
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213>
<400> 4
Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu Lys Arg Ser His
1 5 10 15
<210> 5
<211> 524
<212> PRT
<213>
<400> 5
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1 5 10 15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
20 25 30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
35 40 45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu
50 55 60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys
65 70 75 80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
85 90 95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
100 105 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu
115 120 125
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val
130 135 140
Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp
145 150 155 160
Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly
165 170 175
Lys Cys Pro Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His
180 185 190
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys
195 200 205
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu
210 215 220
Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
225 230 235 240
Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
245 250 255
Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro
260 265 270
Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu
275 280 285
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp
290 295 300
Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
305 310 315 320
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
325 330 335
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg
340 345 350
Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly
355 360 365
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu
370 375 380
Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
385 390 395 400
Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His
405 410 415
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu
420 425 430
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly
435 440 445
Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala
450 455 460
Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys
465 470 475 480
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
485 490 495
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
500 505 510
Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Gln Thr Arg Leu
515 520
<210> 6
<211> 450
<212> PRT
<213> 复旦大学
<400> 6
Met Asp Ala Asp Lys Ile Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser
1 5 10 15
Leu Lys Pro Glu Ile Ile Val Asp Gln Tyr Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala
20 25 30
Ile Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys Ile Thr Leu Gly Lys Ala Pro Asp
35 40 45
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50 55 60
Leu Asp Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe
65 70 75 80
Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Leu Ile
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Asp Arg Ile Thr Pro Asn Ser Leu Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu
115 120 125
Thr Arg Asp Pro Thr Val Ser Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu
130 135 140
Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Asn Thr Gly Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala
165 170 175
Pro Phe Val Lys Ile Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys
180 185 190
Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly
195 200 205
Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile
210 215 220
Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Leu Val
225 230 235 240
Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala
245 250 255
Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met
260 265 270
Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His
275 280 285
Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala
290 295 300
Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly
305 310 315 320
Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His
325 330 335
Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys
340 345 350
Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu
355 360 365
Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Ser Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp
370 375 380
Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg
385 390 395 400
Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu
405 410 415
Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln
420 425 430
Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Asn
435 440 445
Asp Ser
450
Claims (7)
1.一种狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽，其特征在于具有MHC限制性的特征，并且所述抗原为如下(a)或 (b)所示的蛋白质：，
(a) 由SEQ.ID .NO.1、SEQ.ID .NO.2、SEQ.ID .NO.3或SEQ.ID .NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b) 在(a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加1~5个氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码如权利要求1所述蛋白质(a)或 (b)的基因，其特征在于具有：
(a) 由序列表中SEQ.ID .NO.1、SEQ.ID .NO.2、SEQ.ID .NO.3或SEQ.ID .NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b) 在 (a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加1~5个氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由 (a)衍生的蛋白质。
3.含权利要求2所述基因的原核表达载体。
4.如权利要求1所述的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽，其特征在于所述的4条多肽以任意顺序直接连接或者通过连接肽连接而成。
5.一种如权利要求1所述的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白表位多肽的筛选鉴定方法，其特征在于具体步骤为：
（1）通过生物信息学软件BIMAS、SYFPEITHI以及RANKPEP对从NCBI获取的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白序列进行预测分析，选择一定参数，选取结果中排名考前的序列作为候选表位序列；
（2）合成候选表位序列，通过体外淋巴细胞增殖的实验对候选表位进行第一次筛选，选择刺激指数SI＞2的多肽进行下一步实验；
（3）经过第一次筛选获得的多肽序列用ELISPOT实验和流式细胞法检测，检测指标主要是多肽刺激细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌情况以及对CD3+CD4+/ CD3+CD8+T细胞亚群的影响情况；
（4）通过对实验结果的分析，确定最后的表位多肽。
6.如权利要求1或权利要求4所述的多肽在制备狂犬病毒疫苗中的应用。
7.如权利要求1或权利要求4所述的多肽在制备狂犬病免疫功能及狂犬病疫苗免疫功能检测试剂盒中的应用。
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