CN114262365A

CN114262365A - 一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的设计及其稳定表达细胞株hek-293

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Publication number: CN114262365A
Application number: CN202111469929.5A
Authority: CN
Inventors: 马兴元; 赵章婷; 郑文云; 邓昌平
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本发明先利用CVS株狂犬病病毒RABV的糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP自组装成的RVLPs为抗原，设计一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原；然后将RVGP、RVMP和EGFP共同构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，命名为pcDNA3.1(+)‑RVLPs‑EGFP。每个蛋白都具有独立的启动子(CMV)、核糖体结合位点(Kozak序列)和PloyA尾(PA)，以保证每个蛋白的表水平，同时利用EGFP实时监测目的蛋白的表达，构建真核重组表达质粒；而后将真核重组表达质粒转染HEK‑293细胞，细胞经扩增和传代后，进行筛选和鉴定，筛选得到稳定高效表达RVLPs的阳性单克隆细胞株HEK‑293/RVLPs。获得抗原具有哺乳动物细胞的翻译后修饰，克服了细菌、酵母、昆虫以及植物细胞来源的RVLPs由于糖基化修饰不正确而表现出低免疫原性，为RVLPs抗原的规模化生产奠定了基础。

Description

一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的设计及其稳定表达细胞株HEK-293

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种广谱性狂犬病病毒样颗粒(RVLPs)抗原的设计及其稳定表达细胞株HEK-293的筛选和鉴定。

背景技术

狂犬病(Rabies)是一种古老的且最容易被忽略的人畜共患病，主要由致死性病原体 ——狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引发(Zhao R Q,Shan Y,Li M H,et al.NovelStrategy for Expression and Characterization of Rabies Virus Glycoprotein[J].Protein Expression and Purification,2020,168:105567.Liu,Zhao W,He W T,etal.Generation of Monoclonal Antibodies against Variable Epitopes of the MProtein of Rabies Virus[J].Viruses,2019,11(4).)。犬类是RABV最主要的宿主，超过99％的人类狂犬病是由狗介导的(Navid M T,Li YY, Zhou M,et al.Comparison of theImmunogenicity of Two Inactivated Recombinant Rabies Viruses Overexpressingthe Glycoprotein[J].Archives of Virology,2016,161(10):2863-2870.)，其唾液中的RABV通过伤口处的皮肤或黏膜经突触扩散到周围神经，并逆行至中枢神经系统(Centralnervous system,CNS)，在大脑中快速复制并导致脑损伤，致亡率几乎 100％(Johnsona N,Cunningham A F,Fooks A R.The Immune Response to Rabies Virus Infection andVaccination[J].Vaccine,2010,28(23):3896-3901.)。

RABV是一种强烈的嗜神经性负链RNA病毒，属于弹状病毒科(Rhabdoviridaefamily) RABV属(Lyssavirus genus)。RABV的基因组(12kb左右)由不分节段的单股负链RNA组成，依次编码RVNP、RVPP、RVMP、RVGP和RVLP 5种结构蛋白(Navid M T,Li Y Y,ZhouM,et al.Comparison of the Immunogenicity of Two Inactivated RecombinantRabies Viruses Overexpressing the Glycoprotein[J].Archives of Virology,2016,161(10):2863-2870.)。RVGP 是唯一暴露在RABV表面具有诱导机体产生病毒中和抗体(Virus netralizing antibody,VNA) 的抗原。RVMP将核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein complexes,RNPs)定位于质膜，并将RVGP结合到出芽的RABV粒子中，参与RABV从出芽、复制以及形成子弹形态的整个过程(Liu,Zhao W,He W T,etal.Generation of Monoclonal Antibodies against Variable Epitopes of the MProtein of Rabies Virus[J].Viruses,2019,11(4).)。即使不存在RABV的其他成分，RVMP也能与RVGP自组装成病毒样颗粒(Virus like particle,VLP)结构。

虽然狂犬病是疫苗可预防性疾病，但仍造成每年全世界约6万人死亡，其中儿童占40-50％[5]。由于现有疫苗的免疫效果等方面存在不足，需要多次给药，成本效益有待提高。

VLP是通过病毒的一种或几种结构蛋白自组装形成的不含核酸，与原始病毒形貌和结构相似的纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)。VLP作为包含病毒关键抗原的多蛋白超分子结构，以重复的形式将高密度抗原表位展示在其表面，促进了B淋巴细胞受体(B cellreceptor, BCR)的交联，可以诱导强大的B细胞反应(Rybicki E P.Plant MolecularFarming of Virus-Like Nanoparticles as Vaccines and Reagents[J].WileyInterdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology,2020,12(2):e1587.)。此外，VLP的颗粒结构可以促进抗原递呈细胞(Antigen presenting cell,APC)的摄取，刺激先天性和适应性免疫反应(Ludwig C,Wagner R.Virus-Like Particles-Universal Molecular Toolboxes[J].Current Opinion in Biotechnology,2007,18(6):537-545.)。

许多研究表明，由酵母，昆虫和植物细胞表达的RVGP作为抗原不能提供足够的保护(Ong H K,Tan W S,Ho K L.Virus Like Particles as a Platform for CancerVaccine Development[J].PeerJ,2017,5:e4053.Zhang Y C,Zhou M,Li Y Y,etal.Recombinant Rabies Virus with the Glycoprotein Fused with a Dc-BindingPeptide Is an Efficacious Rabies Vaccine[J].Oncotarget,2018,9(1):831-841.WangS J,Liu H Q,Zhang X Y,et al.Intranasal and Oral Vaccination with Protein-Based Antigens:Advantages,Challenges and Formulation Strategies[J].ProteinCell,2015,6(7):480-503.Brune K D,Howarth M.New Routes and Opportunities forModular Construction of Particulate Vaccines:Stick,Click,and Glue[J].Frontiers in Immunology,2018,9:1432.Kato T,Deo V K,Park E Y.Functional Virus-Like Particles Production Using Silkworm and Their Application in LifeScience[J].Journal of Biotechnology & Biomaterials,2012,S9(1):1-7.Scotti N,Rybicki E P.Virus-Like Particles Produced in Plants as Potential Vaccines[J].Expert Review of Vaccines,2013,12(2):211-224.)，这显然是由于与真核细胞不同的糖基化结构所致。目前，许多研究致力于通过用病毒载体感染HEK-293细胞来生产含有RVGP的VLP疫苗，这可以保护小鼠免受病毒攻击并实现大规模生产。但是这类疫苗可能存在具有感染性的载体病毒污染。

发明内容

本发明针对上述问题进行，致力于开发一种有足够安全性和广谱性的RVLPs，通过筛选获得稳定细胞株HEK-293以期实现RVLPs的大规模生产。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明先利用CVS株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的糖蛋白(Rabies virusglycoprotein,RVGP)和基质蛋白(Rabies virus matrix protein,RVMP)自组装成的RVLPs为抗原，设计一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原；然后将RVGP、RVMP和EGFP共同构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，命名为pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP。每个蛋白都具有独立的启动子(CMV)、核糖体结合位点(Kozak序列)和PloyA尾(PA)，以保证每个蛋白的表水平，同时利用EGFP实时监测目的蛋白的表达，构建真核重组表达质粒；而后将真核重组表达质粒转染HEK-293细胞，细胞经扩增和传代后，进行筛选和鉴定，筛选得到稳定高效表达RVLPs的阳性单克隆细胞株HEK-293/RVLPs。获得抗原具有哺乳动物细胞的翻译后修饰，克服了细菌、酵母、昆虫以及植物细胞来源的RVLPs由于糖基化修饰不正确而表现出低免疫原性，为RVLPs抗原的规模化生产奠定了基础。

本发明的第一方面，提供了一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原，包括CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP。CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP经密码子优化的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基质蛋白RVMP经密码子优化的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP具有4个可能的N-糖基化位点Asn56、Asn266、Asn338和Asn484，前3个位于RVGP的胞外域，第4个位于RVGP的胞质尾区；CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP的胞外域含有B细胞表位、CLT细胞表位和Th细胞表位，并且Asn56和Asn266包含于B细胞表位中，Asn338包含于CTL细胞表位中。

该广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的设计方法，包括如下步骤：

(1)利用在线网站NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取CSV株RVGP和RVMP的蛋白序列。

(2)通过在线软件ABCpred prediction server(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)预测 RVGP抗原序列中B细胞表位，帮助定位抗原表位区域，这些区域可用于确定候选疫苗。

(3)通过在线软件BioXGEM.PAComplex(http://pacomplex.life.nctu.edu.tw./)和 SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/FindYourMotif.htm)预测RVGP中潜在的CTL表位。

(4)通过在线软件RANKPEP(https://omictools.com/rankpep-tool)预测RVGP中潜在的 Th表位。

(5)通过在线软件NetNGlyc 1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测 RVGP中的N-糖基化位点。

(6)通过(2)-(4)中的生物信息学软件以及PyMOL软件分析糖基化位点突变后RVGP的抗原表位和三级结构的改变。

(7)从NCBI获取34株从中国不同地区分离的RVGP氨基酸序列，利用DNAMAN 软件对获取的RVGP与CSV株RVGP进行序列比对，确定候选RVGP与中国来源的RVGP 的序列一致性，进而判定其是否可以作为中国动物用ORV的候选抗原。

本发明的第二方面，提供了含有上述的广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的真核重组表达质粒。

该真核重组表达质粒的构建方法，包括如下步骤：

1)以真核质粒pcDNA3.1(+)为模板，分别扩增启动子(CMV)、SV40 PA和绿色荧光蛋白EGFP；

2)以启动子、SV40 PA为模板，重叠延伸PCR扩增目的片段SV40 PA-CMV和SV40 PA-CMV；

3)以SV40 PA-CMV和荧光蛋白为模板，重叠延伸PCR扩增目的片段SV40 PA-CMV-EGFP。

优选的，真核重组表达质粒中，RVGP、RVMP以及荧光蛋白都具有独立的启动子(CMV) 、核糖体结合位点(Kozak序列)和PloyA尾(PA)。

本发明的第三方面，提供了一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的真核表达系统，该真核表达系统是HEK-293细胞或其他能实现哺乳动物糖翻译后修饰的哺乳动物细胞。

稳定表达上述广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的HEK-293细胞的筛选和鉴定方法，包括如下步骤：

1)将真核质粒SV40 PA-CMV-EGFP转染到HEK-293细胞中，并培养该细胞用于稳定表达RVLPs的细胞株筛选；

2)转染48h后，通过WB和qPCR检测RVLPs的蛋白和mRNA水平；

3)采用2mg/mL的G418筛选稳定表达广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的HEK-293细胞株，培养和富集后，实现阳性克隆株的扩增和传代；

4)将阳性单克隆细胞株消化，用流式检测EGFP阳性细胞的比例和平均荧光强度，并利用WB检测RVLPs的表达情况，选择EGFP阳性细胞比例大于99％的细胞株作为候选的稳定细胞株，最优的选择平均荧光强度和RVLPs表达量最高的细胞株作为稳定细胞株，命名为HEK-293/RVLPs；

5)将HEK-293/RVLPs进行传代培养，消化第10代细胞，一部分接种到共聚焦培养皿中培养，12h后，用4％多聚甲醛室温固定，随后用Hoechest 33342染核10min，PBS 洗净后，利用激光共聚焦显微镜观察EGFP阳性细胞比例；一部分细胞用于流式检测EGFP 阳性细胞比例；一部分细胞以不同密度接种到24孔板，WB鉴定目的蛋白表达水平；同时收集HEK-293/RVLPs细胞，用于细胞超薄切片；收集培养基，提取HEK-293/RVLPs 细胞总蛋白，进行蔗糖密度梯度离心，实现RVLPs的鉴定和纯化。

优选的，转染48h后，采用流式细胞仪检测转染效率，然后进行步骤(2)，利用WB 和qPCR检测RVLPs的蛋白和mRNA水平。

优选的，转染48h后，可先暂时不进行步骤2)，根据根据MTT的结果，选择2mg/mL 的G418进行稳定细胞株的筛选，最优的G418浓度为2.235±0.206mg/mL，之后进行步骤(3)。

步骤3)中，进行阳性单克隆细胞株的培养时，每隔2天更换一次含有2mg/mL G418的新鲜DMEM培养基，共14天；进行阳性单克隆细胞株的富集时，胰酶消化细胞，并稀释至1个/200μL，混匀取200μL加入96孔板中，每隔3天更换一次含1mg/mL的新鲜 DMEM培养基，进行阳性单克隆细胞株的富集，共7天。

优选的，步骤5)中，进行细胞超博切片检测时，方法如下：

①消化收集得到绿豆大小的细胞沉淀；PBS洗涤3次后用2.5％多聚甲醛4℃过夜固定；

②固定好的细胞用浓度递增的乙醇溶液脱水处理后，包埋在环氧树脂中。送电镜室进行超薄细胞切片并固定到铜网上；

③1％磷钨酸负染20-30s后，透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)(电压 200kV)下观察RVLPs在细胞内的定位。

进行RVLPs的鉴定和纯化时的方法如下：

①收获培养HEK-293/RVLPs细胞培养基，0.45μm滤膜过滤后30KDa超滤管浓缩，浓缩上清液于-80℃保存；

②提取HEK-293/RVLPs细胞总蛋白；

③将①和②中的上清在4℃，30000rpm下离心3h，沉淀用PBS在4℃过夜溶解；

④配制浓度为20％、40％和60％的蔗糖溶液，0.45μm滤膜过滤；

⑤将蔗糖溶液按照由低到高的顺序加入超速离心管中，形成20％-40％-60％的密度梯度，加入溶解后的离心产物，4℃，35000rpm离心2h；

⑥收集位于40％-60％蔗糖层间的白色条带，于PBS中4℃，30000rpm离心3h进行脱糖处理，沉淀用PBS在4℃过夜溶解；

⑦用BCA试剂盒测定RVLPs的浓度，-80℃保存备用；

⑧利用WB鉴定不同蔗糖层间的RVLPs蛋白；

⑨取10μL纯化后的RVLPs样品滴加到铜网上静置15-20min，滤纸吸干残留液体，1％的磷钨酸负染20-30s，吸掉多余液体，静置至铜网干燥，然后用TEM(电压120kV) 观察样品。

本发明的有益效果如下：

抗原方面：本发明将由CSV毒株RVGP和RVMP组装成RVLPs作为预防中国犬类狂犬病的广谱性抗原。生物信息学软件分析结果表明RVGP的胞外域含有全部抗原表位和3 个主要的N-糖基化位点；胞外域的N-糖基化位点的突变会导致RVGP空间表位的丢失和结构的改变；候选RVGP与34株中国其他地区来源的RVGP序列的一致性达到了97.25％，主要的抗原结合位点和所有的糖基化位点都是高度保守的，表明所选的RVGP可以作为针对中国犬类狂犬病的候选抗原。

细胞株选择方面：本发明通过将含有RVGP和RVMP的真核质粒转染到HEK-293细胞，筛选得到了稳定高效表达RVLPs的阳性单克隆细胞株HEK-293/RVLPs。WB和TEM 结果表明RVLPs可以在细胞内和培养基中检测到，经20％-40％-60％蔗糖密度梯度离心，分离得到的RVLPs主要位于40％-60％的蔗糖层，为非典型的子弹状形态，而是成圆形或椭圆形结构，分析可能是由于天然的RVLPs除了含有RVMP和RVGP外，内部还含有RNPs 复合体，它们紧密相连，在RVLPs内部起着一定的支撑作用。

因此，本发明构建的RVLPs缺乏内部的其他元件，没有支撑作用，故形态上与天然的 RVLPs有一定的区别。HEK-293细胞作为表达系统，具有完善的PTM机制，能保证RVGP 获得正确的糖基化结构，使得其免疫原性得到了保证。构建的HEK-293/RVLPs稳定细胞株，为生产高免疫原性RVLPs奠定了基础。

附图说明

图1为候选RVGP的序列分析及比对。

图2为CSV株RVGP的N-糖基化位点的预测；

图3为RVGP抗原表位和N-糖基化位点分析结果；

图4为N-糖基化位点对RVGP抗原性和三级结构的影响；

图5为34株中国狂犬病毒株与CVS株RVGP蛋白序列比对结果；

图6为pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP构建电泳图；

图7显示了pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP的构建及稳定表达RVLPs的HEK-293细胞株的获得流程。

图8为pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP质粒转染HEK-293细胞：其中，(A)荧光图；(B) 转染效率。

图9为HEK-293细胞中RVLPs(A)mRNA和(B)蛋白水平；

图10为HEK-293/RVLPs阳性细胞株的筛选和富集，其中：(A)HEK-293细胞的转染效率；(B)HEK-293细胞经不同浓度G418作用48h后的细胞存活率和IC50值；(C)经 2mg/mLG418处理的HEK-293细胞的形态变化及荧光分布。

图11为HEK-293/RVLPs的阳性单克隆细胞株的鉴定，其中：(A)不同阳性克隆细胞的比例；(B)平均荧光强度和(C)RVLPs的蛋白水平。

图12为HEK-293/RVLPs细胞株的传代稳定性，其中：(A)HEK-293/RVLPs细胞株的CLSM呈像；(B)HEK293/RVLPs细胞中的EGFP水平；(C)不同汇合度HEK-293/RVLPs 细胞中RVLPs的表达水平。

图13为RVLPs的表征，其中：(A)TEM观察RVLPs在细胞和培养基中分布；(B) 蔗糖密度梯度离心纯化RVLPs；(C)WB分析蔗糖密度梯度离心样品。

具体实施方式

下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

实施例1 广谱性狂犬病病毒样颗粒(RVLPs)抗原设计

1.RVGP的序列分析

从NCBI数据库获取CSV株RVGP和RVMP的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.1 和SEQID NO.2所示。候选RVGP的序列分析及比对结果如图1所示。

利用生物信息学软件测得到的RVGP的B细胞表位(表1)、CLT细胞表位和Th细胞表位(表2)，全部位于成熟RVGP的胞外域。

表1 CSV株RVGP的B细胞表位分析

表2 CSV株RVGP的T细胞表位分析

2.RVGP糖基化位点的预测

成熟的RVGP膜外域具有3个潜在的N-糖基化位点(Asn37、Asn247和Asn319)，即未成熟RVGP的Asn56、Asn266和Asn338位点。N-糖基化影响RVGP的抗原性及正确折叠，借助真核表达系统可以生产具有正确N-糖基化结构的RVGP。

通过分析确定候选RVGP具有4个可能的N-糖基化位点(Asn56、Asn266、Asn338和Asn484)(图2)。将预测的抗原表位与糖基化位点共同整合到RVGP的蛋白序列中，可以发现RVGP的胞外域含有所有抗原表位，且预测到的4个N-糖基化位点中前3个位于RVGP 的胞外域(Asn56、Asn266和Asn338)，第4个位于RVGP的胞质尾区(Asn484)。其中， Asn56和Asn266包含于B细胞表位中，Asn338包含于CTL细胞表位中，说明胞外域是 RVGP发挥抗原作用的关键区域(图3)。

3.糖基化位点对RVGP的抗原性和空间结构的影响

正确的糖基化结构对于RVGP发挥免疫作用至关重要。当Asn56发生突变时，该位置的空间B细胞表位丢失(图4A)，同时该位置的二级结构由β-折叠突变为线圈(图4B)；而糖基化位点的突变对线性表位的影响很小(图4A)，当位于线性B细胞和CTL细胞表位的Asn266和Asn338发生突变时，RVGP的空间结构变化不明显(图4B)。以上结果表明 N-糖基化位点影响RVGP的空间结构和抗原性，选择能够表达出具有正确N-糖基化结构的RVGP的表达系统在狂犬病疫苗的开发中起关键性作用。

4.RVGP氨基酸序列一致性分析

从NCBI数据库获取34株来自在中国不同地区的RVGP序列，利用DNAMAN软件对这些RVGP序列与CVS株RVGP的序列一致性进行分析，分析结果表明序列的一致性达到了97.25％，且关键的抗原位点及糖基化位点均高度保守，说明CVS株RVGP可以作为中国犬类狂犬病疫苗的候选抗原(图5)。

实施例2 重组质粒pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP的构建

将全基因合成的RVGP和RVMP构建到pcDNA3.1(+)中。以pcDNA3.1(+)为模板，分别扩增CMV、SV40 PA和EGFP；然后以CMV、SV40 PA为模板，重叠延伸PCR扩增目的片段(G)SV40PA-CMV和(M)SV40 PA-CMV；最后以(G)SV40 PA-CMV和EGFP为模板，重叠延伸PCR扩增目的片段(G)SV40 PA-CMV-EGFP。

所获得的目的片段的电泳结果如图6所示，与实际大小(CMV:618bp；SV40 PA:122bp； (G)/(M)SV40 PA-CMV:760bp；EGFP:759bp；(G)SV40 PA-CMV-EGFP:1484bp)一致，说明构建成功。

实施例3 HEK-293真核表达系统构建

1、真核表达系统构建流程

图7显示了pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP的构建及稳定表达RVLPs的HEK-293细胞株的获得流程，具体如下：

2)转染48h后，通过WB和qPCR检测RVLPs的蛋白和mRNA水平；

2、HEK-293细胞转染效率的检测

将pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP分别用PEI和脂质体两种试剂转染HEK-293细胞，确认最佳的转染方式。转染48h后，先通过倒置荧光显微镜定性观察转染情况(图8A)，再通过FCM对转染效率进行定量分析(图8B)。结果表明两种试剂的转染效率都达到60％以上，当DNA：PEI＝1：4时，转染效率最高(65.7％)，其次是脂质体(65.1％)，且脂质体的细胞毒性小于PEI，故采用脂质体作为转染试剂来筛选过表达RVLPs的HEK-293稳定细胞株(图8)。

3、RVLPs的检测

收集pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP转染48h后的HEK-293细胞和培养基，利用qPCR 检测细胞中的RVLPs的mRNA水平，利用WB检测细胞和培养基中RVLPs的蛋白水平，具体方法如下：

(1)WB检测RVLPs的蛋白水平

①细胞培养基用30KDa超滤管浓缩；

②胰酶消化细胞后，1000rpm离心5min收集细胞。

③PBS洗涤3次后，添加含有1％PMSF的RIPA细胞裂解液在4℃裂解30min。

④4℃，12000rpm离心10min，吸取上清液于-80℃保存。

⑤用BCA法测定培养基和细胞裂解上清中的蛋白浓度，以30μg上样量进行 SDS-PAGE。

⑥切取目的蛋白所在位置的凝胶，裁剪对应的大小的PVDF膜置于无水甲醇中活化5min；

⑦向阴极板上按顺序叠放经转膜缓冲液浸泡过的海绵-3层滤纸-凝胶-PVDF膜-3层滤纸-海绵，扣好阳极板，放入转膜装置中，4℃，200mA电转1.5h。

⑧1.5h后，取出PVDF膜，用3％脱脂奶粉室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次， 5min/次；

⑨用封闭液分别以1：200和1：500的比例稀释鼠抗RVGP单抗和兔抗RVMP多抗，与PVDF膜在4℃摇晃过夜，再以TBST洗膜3次，5min/次；

⑩用封闭液以1：6000倍稀释HRP标记的羊抗兔/鼠IgG，室温与PVDF膜摇晃孵育1h；用TBST洗3次，10min/次，然后进行ECL化学发光成像。

(2)qPCR检测RVLPs的mRNA水平

①qPCR引物序列见表3。

②引物稀释为10μM，按照表4在冰上配制qPCR反应液，震荡至充分混匀，离心进行qPCR反应。

③用Bio-Rad CFX96 qPCR仪进行反应，反应程序简述为：预变性：95℃，5s；PCR 反应：[95℃,5s；55℃,10s；72℃,20s]×40个循环，获得溶解曲线。

④qPCR结果采用2-ΔΔCt分析目的基因表达水平。公式如下：表达水平＝2-ΔΔCt，其中△△Ct＝[(Ctgene in test cell line-Ctgene in control cell line)-(Ctβ-actin in test cell lines-Ctβ-actin in control cell line)]。

表3 qPCR引物列表

表4 qPCR反应体系

由图9可知，RVGP和RVMP的转录水平基本一致，且HEK-293细胞内和培养基中均可检测到RVGP和RVMP蛋白。由于培养基浓缩后培养基的体积是细胞裂解上清的100 倍，表明由RVGP和RVMP组装成的RVLPs大部分被分泌到培养基中。

4、阳性单克隆细胞株HEK-293/RVLPs的筛选和鉴定

MTT实验结果表明G418对HEK-293细胞的IC50为2.235±0.206mg/mL(图10B)。因此，选择2mg/mL G418进行HEK-293/RVLPs细胞株的筛选。pcDNA3.1(+)-RVLPs-EGFP 转染HEK-293细胞48h后，一组细胞用FCM检测，转染效率为65.66％(图10A)。另一组细胞用含2mg/mL G418的DMEM培养基连续筛选14天，使阳性细胞富集(图10C)。然后，利用有限稀释法让阳性单克隆细胞在96孔板中扩增，通过FCM筛选出EGFP阳性细胞比例大于99％的细胞株，命名为HEK-293/RVLPs clone 1/2/4/5/8/10/11/12(图11A)。 FCM和WB结果表明，clone11的平均荧光强度和蛋白表达水平显著高于其它阳性单克隆细胞株(P<0.05)(图11B和C)。因此，clone 11将被用于后续的研究，命名为 HEK-293/RVLPs。

5、HEK-293/RVLPs细胞株的传代稳定性

将得到的RVLPs高效表达细胞株HEK-293/RVLPs传至第10代，消化并接种到共聚焦培养皿中，4％多聚甲醛固定后，利用Hoecst 33342染料进行核染，CLSM观察并拍照。CLSM结果显示每个细胞都表达EGFP，并且主要定位于细胞质(图12A)。FCM结果显示 EGFP阳性细胞比例为100％(图12B)。剩余的细胞继续培养，倒置荧光显微镜观察结果显示细胞中并没有出现绿色荧光的丢失，WB检测不同汇合度下HEK-293/RVLPs细胞蛋白表达水平，结果表明RVLPs胞内表达水平并没有降低(图12C)。

6、RVLPs的表征

胰酶消化收获T25培养瓶中的HEK-293/RVLPs细胞进行超薄细胞切片，方法如下：

同时，利用TEM观察经蔗糖密度梯度离心纯化的RVLPs，方法如下：

②提取HEK-293/RVLPs细胞总蛋白；

④配制浓度为20％、40％和60％的蔗糖溶液，0.45μm滤膜过滤；

⑦用BCA试剂盒测定RVLPs的浓度，-80℃保存备用；

⑧利用WB鉴定不同蔗糖层间的RVLPs蛋白；

如13A左图所示，在HEK-293/RVLPs细胞囊泡中和细胞外均观察到大小在180-200nm 之间的RVLPs，表明RVLPs表达后可以分泌至培养基中；有大小在180-200nm之间的圆形或椭圆形粒子(图13A右)。RVLPs经密度梯度离心后主要位于40％-60％的蔗糖层(图13B)，结合WB的结果，可以充分说明观察到的NPs是由RVGP和RVMP自组装成 RVLPs(图13C)。虽然自组装的RVLPs具有不同的沉降系数，但是大部分RVLPs位于 40-60％的蔗糖层，说明大部分RVLPs是按照病毒本身的组装比例去自组装的。

综上，本专利将由CSV毒株RVGP和RVMP组装成RVLPs作为预防中国犬类狂犬病的广谱性抗原。生物信息学软件分析结果表明RVGP的胞外域含有全部抗原表位和3 个主要的N-糖基化位点；其次，胞外域的N-糖基化位点的突变会导致RVGP空间表位的丢失和结构的改变；最后，候选RVGP与34株中国其他地区来源的RVGP序列的一致性达到了97.25％，主要的抗原结合位点和所有的糖基化位点都是高度保守的，表明所选的 RVGP可以作为针对中国犬类狂犬病的候选抗原。

本发明通过将含有RVGP和RVMP的真核质粒转染到HEK-293细胞，筛选得到稳定高效表达RVLPs的阳性单克隆细胞株HEK-293/RVLPs。WB和TEM结果表明RVLPs可以在细胞内和培养基中检测到，经20％-40％-60％蔗糖密度梯度离心，分离得到的RVLPs 主要位于40％-60％的蔗糖层，为非典型的子弹状形态，而是成圆形或椭圆形结构，分析可能是由于天然的RVLPs除了含有RVMP和RVGP外，内部还含有RNPs复合体，它们紧密相连，在RVLPs内部起着一定的支撑作用。本研究构建的RVLPs缺乏内部的其他元件，没有支撑作用，故形态上与天然的RVLPs有一定的区别。

HEK-293细胞作为表达系统，具有完善的PTM机制，能保证RVGP获得正确的糖基化结构，使得其免疫原性得到了保证。为了加强RVLPs的免疫效果，本章还构建并表达黏膜免疫佐剂LTB，其能够与大多数细胞表面的GMI受体结合，增强口服RVLPs的体液、细胞和黏膜免疫应答。总之，我们建立的HEK-293/RVLPs稳定细胞株，为生产高免疫原性RVLPs奠定了基础，黏膜佐剂的使用，进一步加强RVLPs的免疫原性。

本发明中，经密码子优化的RVGP的编码序列(SEQ ID NO.1)

其中，AAGCTT为Hind III限制性酶切位点，

为Kpn I限制性酶切位点，GCGGCCGC为Not I限制性酶切位点，

为核糖体结合位点，GTCGAC为Sal I 限制性酶切位点，

为BamHI限制性酶切位点，GAATTC为EcoR I限制性酶切位点。

经密码子优化的RVMP的编码序列(SEQ ID NO.2)

其中，GCTAGC为Nhe I限制性酶切位点；

为核糖体结合位点，AAGCTT为Hind III限制性酶切位点。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的设计及其稳定表达细胞株HEK-293

<130> 权利要求书、说明书

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1619

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 1

aagcttggta ccgcggccgc gccaccatgg tgcctcaggc cctgctgttc gtgccactcc 60

tggtgttccc actgtgcttc ggcaagttcc caatttacac aattcctgac aagctgggcc 120

cttggtcacc tattgacatt caccacctct cttgccctaa caacctcgtg gtggaggacg 180

agggctgcac aaacctgtct ggcttctctt acatggagct gaaggtgggc tacattctcg 240

ccattaagat gaacggcttc acatgcacag gcgtggtgac agaggccgag acatacacaa 300

acttcgtggg ctacgtgacc accaccttca agcggaagca cttcagacct acccccgacg 360

cctgccgcgc cgcctacaac tggaagatgg ccggcgaccc tagatacgag gagtctctcc 420

acaaccctta ccccgactac cactggctca gaacagtcaa gacaacaaag gagtctctgg 480

tgattatcag cccatctgtg gccgacctcg acccttacga ccgcagcctc cactcgcgcg 540

tgttccctag cggcaagtgc ccaggcgtgg ccgtgtctag cacatactgc tctaccaacc 600

acgactacac catttggatg ccagagaacc ctagactcgg catgtcttgc gacattttca 660

ccaacagtag gggcaagcgc gcctctaagg gcagcgagac atgcggcttc gtggacgagc 720

ggggcctgta caagagcctg aagggcgcct gcaagctgaa gctgtgcggc gtgctcggcc 780

tgagactgat ggacggcaca tgggtggcca tgcagacatc taacgagaca aagtggtgcc 840

ctccagacca gctcgtgaac ctccacgact tccggtccga cgagattgag cacctcgtgg 900

tggaggagct ggtgagaaag cgcgaggagt gcctcgacgc cctagaaagc attatgacaa 960

caaagtctgt gtctttccgc agactgagcc acctgcggaa gctggtgcca ggcttcggca 1020

aggcctacac aattttcaac aagacactca tggaggccga cgcccactac aagtctgtga 1080

gaacatggaa cgagattctc ccatctaagg gctgcctcag ggtgggcggc agatgccacc 1140

cccacgtgaa cggcgtgttc ttcaacggca ttattctggg ccccgacggc aacgtgctca 1200

tcccagagat gcagtctagc ctgctccagc agcacatgga gctgctggaa tcctctgtga 1260

ttccactcgt gcacccactc gccgacccat ctacagtgtt caaggacggc gacgaggccg 1320

aggacttcgt ggaggtgcac ctccccgacg tgcacaacca ggtgtctggc gtggacctgg 1380

gcctcccaaa ctggggcaag tacgtgctcc tgtccgccgg cgccctcacc gccctgatgc 1440

tcattatttt cctgatgaca tgttgtagaa gagtgaatcg gtctgagcca acacagcaca 1500

acctgcgggg cacaggcagg gaggtgtccg tgacccctca gtccggcaag atcattagct 1560

cttgggagtc tcacaagtcc ggcggccaga ccagactgtg agtcgacgga tccgaattc 1619

<210> 2

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

gctagcgcca ccatgaactt tctacgtaag atagtgaaaa attgcaggga cgaggacact 60

caaaaaccct ctcccgtgtc agcccctctg gatgacgatg acttgtggct tccaccccct 120

gaatacgtcc cgctgaaaga acttacaagc aagaagaaca tgaggaactt ttgtatcgac 180

ggaggggtta aagtgtgtag cccgaatggt tactcgttca ggatcctgcg gcacattctg 240

aaatcattcg acgagatata ttctgggaat cataggatga tcgggttagt caaagtagtt 300

attggactgg ctttgtcagg atctccagtc cctgagggca tgaactgggt atacaaattg 360

aggagaacct ttatcttcca gtgggctgat tccaggggcc ctcttgaagg ggaggagttg 420

gaatactctc aggagatcac ttgggatgat gatactgagt tcgtcggatt gcaaataaga 480

gtgattgcaa aacagtgtca tatccagggc agaatctggt gtatcaacat gaacccgaga 540

gcatgtcaac tatggtctga catgtctctt cagacacaaa ggtccgaaga ggacaaagat 600

tcctctctgc ttctagaata aaagctt 627

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 3

Asp Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 4

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys

1 5 10 15

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 5

Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 6

Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly Lys Cys Pro

1 5 10 15

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 7

Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu

1 5 10 15

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 8

Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu His Asn Pro

1 5 10 15

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 9

Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Gln

1 5 10 15

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 10

Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu

1 5 10 15

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 11

Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu

1 5 10 15

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 12

Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 13

Leu Arg Thr Val Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro

1 5 10 15

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 14

Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala Ala

1 5 10 15

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 15

Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 16

Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys Thr Leu

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 17

Cys Pro Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu

1 5

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 18

Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Lys Thr Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 19

Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 20

Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe

1 5 10 15

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 21

ctgctctacc aaccacgact acac 24

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 22

gtccacgaag ccgcatgtct c 21

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 23

tggatgacga tgacttgtgg cttc 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 24

aacgagtaac cattcgggct acac 24

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 25

attggcaatg agcggttc 18

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 26

atactcctgc ttgctgatcc 20

Claims

1.一种广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原，其特征在于，包括CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP和基质蛋白RVMP，所述CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP经密码子优化的多核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述基质蛋白RVMP经密码子优化的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原，其特征在于：

其中，所述CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP具有4个可能的N-糖基化位点Asn56、Asn266、Asn338和Asn484，前3个位于RVGP的胞外域，第4个位于RVGP的胞质尾区；

CVS株狂犬病病毒糖蛋白RVGP的胞外域含有B细胞表位、CLT细胞表位和Th细胞表位，并且Asn56和Asn266包含于B细胞表位中，Asn338包含于CTL细胞表位中。

3.权利要求1或2所述的广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用在线网站NCBI获取CSV株RVGP和RVMP的蛋白序列；

2)通过在线软件ABCpredprediction server预测RVGP抗原序列中B细胞表位，帮助定位抗原表位区域，这些区域可用于确定候选疫苗；

3)通过在线软件BioXGEM.PAComplex和SYFPEITHI预测RVGP中潜在的CTL表位；

4)通过在线软件RANKPEP预测RVGP中潜在的Th表位；

5)通过在线软件NetNGlyc 1.0Server预测RVGP中的N-糖基化位点；

6)通过2)-4)中的生物信息学软件以及PyMOL软件分析糖基化位点突变后RVGP的抗原表位和三级结构的改变；

7)从NCBI获取34株从中国不同地区分离的RVGP氨基酸序列，利用DNAMAN软件对获取的RVGP与CSV株RVGP进行序列比对，确定候选RVGP与中国来源的RVGP的序列一致性，进而判定其是否可以作为中国动物用ORV的候选抗原。

4.含有权利要求1或2所述的广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的真核重组表达质粒。

5.权利要求3所述的真核重组表达质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以真核质粒为模板，分别扩增启动子、SV40 PA和荧光蛋白；

2)以启动子、SV40 PA为模板，重叠延伸PCR扩增目的片段SV40 PA-CMV和SV40PA-CMV；

3)以SV40 PA-CMV和荧光蛋白为模板，重叠延伸PCR扩增目的片段SV40PA-CMV-EGFP。

6.根据权利要求5所述的真核重组表达质粒的构建方法，其特征在于：

其中，所述真核重组表达质粒中，RVGP、RVMP以及荧光蛋白都具有独立的启动子、核糖体结合位点和PloyA尾。

7.表达权利要求1或2所述的广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的真核表达系统，其特征在于所述真核表达系统是HEK-293细胞或其他能实现哺乳动物糖翻译后修饰的哺乳动物细胞。

8.稳定表达权利要求1或2所述的广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的HEK-293细胞的筛选和鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将权利要求4所述的含有RVGP、RVMP和EGFP的真核质粒转染到HEK-293细胞中，并培养该细胞用于稳定表达RVLPs的细胞株筛选；

2)通过WB和qPCR检测RVLPs的蛋白和mRNA水平；

3)采用2mg/mL的G418筛选稳定表达广谱性狂犬病病毒样颗粒抗原的HEK-293细胞株，每隔2天更换一次含有2mg/mL G418的新鲜DMEM培养基，进行阳性细胞株的培养，14天后，进行阳性单克隆细胞株的富集，共7天，实现阳性克隆株的扩增和传代；

5)将HEK-293/RVLPs进行传代培养，消化第10代细胞，一部分接种到共聚焦培养皿中培养，12h后，用4％多聚甲醛室温固定，随后用Hoechest 33342染核10min，PBS洗净后，利用激光共聚焦显微镜观察EGFP阳性细胞比例；一部分细胞用于流式检测EGFP阳性细胞比例；一部分细胞以不同密度接种到24孔板，WB鉴定目的蛋白表达水平；同时收集HEK-293/RVLPs细胞，用于细胞超薄切片。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

步骤3)中，进行阳性单克隆细胞株的培养时，每隔2天更换一次含有2mg/mL G418的新鲜DMEM培养基，共14天；

进行阳性单克隆细胞株的富集时，胰酶消化细胞，并稀释至1个/200μL，混匀取200μL加入96孔板中，每隔3天更换一次含1mg/mL的新鲜DMEM培养基，进行阳性单克隆细胞株的富集，共7天。