CN103068985A

CN103068985A - 抗狂犬病的广谱狂犬病病毒属病毒疫苗

Info

Publication number: CN103068985A
Application number: CN2011800407737A
Authority: CN
Inventors: 吴贤福; C·E·鲁普雷希特; I·V·库兹明
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services; US Government
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2011-06-23
Publication date: 2013-04-24
Also published as: RU2013102929A; KR20130098987A; US9248179B2; EP2585598A4; WO2011163446A2; WO2011163446A3; EP2585598B1; US20130095137A1; US20160114026A1; EP2585598A2

Abstract

本文描述了重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒编码狂犬病病毒糖蛋白和至少一种来自另一种狂犬病病毒属病毒例如莫克拉病毒、拉各斯蝙蝠病毒和/或西高加索蝙蝠病毒的异源糖蛋白。在具体的实施方案中，所述重组狂犬病病毒包括两种或三种异源的狂犬病病毒属病毒糖蛋白。所公开的重组狂犬病病毒可以用作广谱狂犬病病毒属病毒疫苗以提供抗引起狂犬病的狂犬病病毒属病毒的保护。

Description

抗狂犬病的广谱狂犬病病毒属病毒疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2010年6月24日提交的美国临时申请No.61/358,288的权益，所述临时申请以引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本公开涉及重组狂犬病病毒及其用作广谱狂犬病病毒属病毒疫苗来防止狂犬病病毒属病毒感染的用途。

背景技术

狂犬病病毒属（Lyssavirus）是单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales）（具有单链、反义基因组的病毒）中弹状病毒科（Rhabdoviridae）的成员。在恒温动物和人类中，狂犬病病毒属病毒是狂犬病脑炎的病原（Tordo et al.,“Lyssaviruses”In Fauquet et al.eds.Virus taxonomy:the classification and nomenclature of viruses.The8^thReport of the International Committee on Taxonomy of Viruses.SanDiego:Oxford Academic,2006,pages623-629;World HealthOrganization Expert Consultation on Rabies,5-8October2004,firstreport,World Health Organization Technical report series931,Geneva:World Health Organization,2005,pages15-19）。狂犬病病毒属的种包括狂犬病病毒（RABV，基因型1）、拉各斯蝙蝠病毒（Lagosbat virus）（LBV，基因型2）、莫可拉病毒（Mokola virus）（MOKV，基因型3）、杜文海格病毒（Duvenhage virus）（DUVV，基因型4）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-1（European bat lyssavirus-1）（EBLV-1，基因型5）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-2（European bat lyssavirus-2）（EBLV-2，基因型6）、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（Australian bat lyssavirus）（ABLV，基因型7）和从中亚和俄罗斯蝙蝠中分离出的4个其他种（Aravan病毒-ARAV、Khujand病毒–KHUV、Irkut病毒-IRKV和西高加索蝙蝠病毒（West Caucasian bat virus）-WCBV）（Kuzmin etal.,Emerg.Infect.Dis.14（12）:1887-1889,2008;Weyer et al.,Epidemiol.Infect.136:670-678,2007;Kuzmin and Rupprecht,“Batrabies”In Rabies,2^nd Edition,New York,Academic Press,2007,pages259-307,Jackson and Wunner,eds.）。

基于狂犬病病毒属病毒分离株的系统发生、免疫原性和毒力，已提出狂犬病病毒属病毒的两个遗传谱系（Badrane et al.,J.Virol.75:3268-3276,2001）。遗传谱系的划分一般与对狂犬病病毒属病毒观察到的疫苗交叉保护模式相关狂犬病病毒属病毒（Badrane et al.,J.Virol.75:3268-3276,2001;Hanlon et al.,Virus Res.111:44-54,2005;Nel et al.,Expert Rev.Vaccines4:553-540,2005）。遗传谱系1包括基因型1、4、5、6和7以及ARAV、KHUV和IRKV（Kuzmin et al.,VirusRes.97:65-79,2003;Kuzmin et al.,Virus Res.111:28-43,2005;Hanlonet al.,Virus Res.111:44-54,2005）。目前可用的商业疫苗和生物制品被认为可有效抗这个谱系中的病毒感染（Nel et al.,Expert Rev.Vaccines4:553-540,2005）。然而，这些用于狂犬病的疫苗和生物制品不能提供抗狂犬病病毒属病毒谱系1之外的病毒（即，基因型2和3）感染的完全保护。此外，WCBV是公认的最不同的狂犬病病毒属病毒并呈现有限的与基因型2和3病毒的关联性。先前的研究已表明，抗RABV的血清与WCBV没有或几乎没有交叉中和反应（Botvinkin et al.,Emerg.Infect.Dis.9:1623-1625,2003;Hanlon et al.,Virus Res.111:44-54,2005）。

因此，需要开发狂犬病疫苗，这种疫苗可以抗广谱的狂犬病病毒属病毒，尤其是WCBV和狂犬病病毒属基因型2和3，以提供保护。

发明内容

本文公开了具有来自至少两种不同狂犬病病毒属病毒的糖蛋白基因的重组狂犬病病毒。所公开的病毒可以用作广谱狂犬病病毒属病毒疫苗以提供抗多种基因型的狂犬病病毒属病毒感染的保护。

本文提供了重组狂犬病病毒。在一些实施方案中，所述重组狂犬病病毒的基因组包括狂犬病病毒核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、RNA依赖性RNA聚合酶（L）和糖蛋白（G）的基因和至少一个、至少两个或至少三个不同的异源狂犬病病毒属病毒糖蛋白基因。在一些实施方案中，所述狂犬病病毒属病毒选自：LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV和WCBV。在具体的实施方案中，所述狂犬病病毒属病毒选自：LBV、MOKV和WCBV。

还提供了一种包括全长的狂犬病病毒基因组反义DNA的载体。在一些实施方案中，所述基因组反义DNA包括狂犬病病毒N基因、P基因、M基因、L基因和G基因，并且所述载体还包括至少一个、至少两个或至少三个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。还提供了包含本文描述的狂犬病病毒载体的细胞。

还提供了包括一种或多种本文描述的重组狂犬病病毒和可药用载体的组合物。还提供了通过给予受试者一种或多种本文公开的重组狂犬病病毒在所述受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的方法。

从下面参照附图的具体实施方式，本发明的上述以及其他目的、特征和优点将变得更加明显。

附图说明

图1A：ERA转录质粒的示意图。图示了锤头状核酶和ERA反义基因组的位置。沿5’至3’方向示出了N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的相对位置。

图1B：构建全长ERA狂犬病病毒基因组cDNA质粒pTMF的示意图。示出了RT-PCR产物F1和F2片段，以及限制性内切酶识别位点（Nhe1，Kpn1，Blp1，Pst1和Not1）。标出了RdRz-锤头状核酶和HDVRz-丁型肝炎病毒核酶。菱形符号表示Kpn1或Pst1位点被删除，垂直箭头表示Nhe1或Not1被完整保留。

图2：示意性图示的提出的机制是pNLST7质粒的NLST7RNA聚合酶自身基因作用。DNA转染试剂复合物通过内吞作用被摄入细胞。从溶酶体和内涵体释放的大部分DNA保留在细胞质中。有限量的质粒被转运到细胞核：1）通过CMV极早期启动子，NLST7基因由细胞RNA聚合酶II转录；2）成熟的NLST7mRNA被从细胞核运送到细胞质，用于NLST7RNA聚合酶合成；3）新合成的NLST7RNA聚合酶被转运到细胞核中，而微量的NLST7被保留在细胞质中；4）NLST7RNA聚合酶通过PT7启动子起始转录。通过转录后修饰，产生用于蛋白合成的另外的NLST7mRNA，因而提高病毒恢复效率。

图3：10个衍生ERA病毒基因组的示意图。每个基因的大小不是按比例绘制的。符号“*”表示第333位氨基酸残基（本文中称为G333）处G的突变，“Ψ”标出Psi区域。

图4：构建ERA-3G的示意图。将G333突变引入至ERA的主链并加入两个转录（trans）单元。将这些转录单元引入至P基因和M基因之间以及G基因和L基因之间。将MOKV G基因和WCBV G基因克隆至这些转录单元内以形成具有三个糖蛋白基因的重组ERA狂犬病病毒（ERA-3G）。

图5：构建ERA-4G的示意图。将G333突变引入至ERA主链并加入三个转录（trans）单元。将这些转录单元引入至N基因和P基因之间、P基因和M基因之间以及G基因和L基因之间。将LBV G基因、MOKVG基因和WCBV G基因克隆至这些转录单元内以形成具有四个糖蛋白基因的重组ERA狂犬病病毒（ERA-4G）。

序列表

使用标准核苷酸碱基字母缩写和氨基酸的三字母代码（如在37C.F.R.1.822中所定义的）显示所附序列表中列出的核酸序列和氨基酸序列。只显示每个核酸序列的一条链，但应理解互补链通过提及所示链而被包括在内。在所附序列表中：

SEQ ID NO:1是通过反向遗传学复原的重组狂犬病病毒ERA的核苷酸序列。所述重组病毒的第4370-4372位核苷酸已从aga变为gag（相对于野生型病毒），这在G蛋白第333位残基上引入了从Arg到Glu的氨基酸改变。

SEQ ID NO:2是狂犬病病毒ERA N蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是狂犬病病毒ERA P蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是狂犬病病毒ERA M蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是第333位氨基酸突变（从Arg至Glu）的狂犬病病毒ERA G蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是狂犬病病毒ERA L蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是野生型狂犬病病毒ERA G蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8-11是用于扩增全长狂犬病病毒基因组cDNA的RT-PCR引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12-15是用于合成锤头状核酶和丁型肝炎病毒核酶的寡核苷酸序列。

SEQ ID NO:16-40是PCR引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:41和42是用于整合异源ORF的转录单元的核苷酸序列。

SEQ ID NO:43和44是用于扩增MOKV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:45和46是用于扩增WCBV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:47和48分别是MOKV G的核苷酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO:49和50分别是WCBV G的核苷酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO:51和52是用于扩增LBV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:53和54分别是LBV G的核苷酸和氨基酸序列。

具体实施方式

I.缩写

ABLV 澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒

ARAV Aravan病毒

CMV 巨细胞病毒

DFA 直接荧光抗体

DUVV 杜文海格病毒

EBLV-1 欧洲蝙蝠狂犬病病毒-1

EBLV-2 欧洲蝙蝠狂犬病病毒-2

ERA Evelyn-Rokitnicki-Abelseth

FFU 蚀斑形成单位

G 糖蛋白

i.m. 肌肉注射

IRES 内部核糖体进入位点

IRKV Irkut病毒

KHUV Khujand病毒

L RNA依赖性RNA聚合酶

LBV 拉各斯蝙蝠病毒

M 基质蛋白

MOKV 莫克拉病毒

N 核蛋白

NLS 核定位信号

ORF 开放阅读框

P 磷蛋白

PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳

RABV 狂犬病病毒

RNP 核糖核蛋白

RABV 狂犬病病毒

WCBV 西高加索蝙蝠病毒

II.术语和方法

除非另有说明，技术术语依其常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Gene V,由Oxford UniversityPress出版,1994（ISBN0-19-854287-9）；Kendrew等（eds.）,TheEncyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994（ISBN0-632-02182-9）和Robert A.Meyers（ed.）,MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.出版,1995（ISBN1-56081-569-8）。

为了有助于阅读本公开的各个实施方案，提供了对具体术语的如下解释：

佐剂：可非特异增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可包括吸附了抗原的矿物质（如明矾、氢氧化铝或磷酸盐）悬浮物；或油包水乳剂，其中抗原溶液乳化在矿物油（例如弗氏不完全佐剂）中，有时包含灭活的分支杆菌（弗氏完全佐剂）以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸（如包含CpG基序的那些）也可被用作佐剂（例如，参见美国专利No.6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116、6,339,068、6,406,705和6,429,199）。佐剂还包括生物分子，如共刺激分子。示例性的生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。

给予：本文所用的向受试者给予组合物例如疫苗是指给予、施用或使组合物与所述受试者接触。给药可通过很多途径中的任一种来完成，例如，局部的、口服的、皮下的、肌肉的、腹膜内的、静脉内的、鞘内的和肌肉的。

动物：有生命的多细胞脊椎生物，种类包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。术语“动物”包括人受试者和兽受试者。例如，人、非人灵长类、狗、猫、马、浣熊、蝙蝠、大鼠、小鼠，狐狸、松鼠、负鼠、土狼、狼和牛。

抗体：包括一种或多种多肽的蛋白（或蛋白复合体），所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及大量的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，这些重链又反过来分别定义免疫球蛋白的种类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

基本免疫球蛋白（抗体）结构单元通常是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻链”（约25kDa）和一个“重链”（约50-70kDa）。每条链的N-端限定了约100至110或更多个氨基酸的可变区域，所述可变区域主要负责抗原识别。术语“可变轻链（V_L）”和“可变重链（V_H）”分别是指这些轻链和重链。

本文所用的术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白以及许多很好表征的片段。例如，结合目标蛋白（蛋白或融合蛋白内表位）的Fab、Fv和单链Fv（scFvs）也可以是所述目标蛋白（或表位）的特异性结合物质。这些抗体片段如下所示：（1）Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其是通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生完整轻链和一条重链的一部分而产生的；（2）Fab’，通过用胃蛋白酶处理完整抗体，之后还原以产生完整轻链和部分重链而得到的抗体分子片段；每个抗体分子得到两个Fab’片段；（3）（Fab’）₂，将完整的抗体用胃蛋白酶处理后未经之后的还原得到的抗体片段；（4）F（ab’）₂，是两个Fab'片段通过两个二硫键连接在一起的二聚体；（5）Fv，含有表达为2条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；（6）单链抗体，含有由合适的多肽接头连接在一起的轻链可变区、重链可变区的基因工程分子，其为基因融合的单链分子形式。制备这些抗体片段的方法是常规的方法（参见，例如，Harlow和Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,CSHL,New York,1999）。

抗体结合亲和力：是指单个抗体结合位点与配体（例如，抗原或表位）之间的结合强度。抗体结合位点X对配体Y的亲合力由解离常数（K_d）表示，解离常数是指占据溶液中存在的一半结合位点X所需要的Y的浓度。K_d越小表示X与Y之间的亲和相互作用越强或越高，也表示占据所述位点所需的配体浓度越低。通常，抗体互补位所识别的表位中，一个或多个氨基酸的改变、修饰和/或替代会影响抗体结合亲和力。结合亲和力可以使用本领域已知的任何技术来测量，例如Ag-ELISA测定中的终点滴定。

抗原：能够在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收进入动物体内的组合物。抗原与特异性体液免疫或细胞免疫的产物反应，所述产物包括由异源免疫原诱导的那些。

反义基因组：在具有负链RNA基因组（如狂犬病病毒属病毒的基因组）病毒的情形中，“反义基因组”是指负链基因组的互补链（正链）。

减毒的：在活病毒例如狂犬病病毒的情形中，如果它感染细胞或受试者的能力和/或产生疾病的能力降低（例如，被消除），则所述病毒是减毒的。通常，减毒病毒保留至少一些在给予有免疫能力的受试者后诱发免疫应答的能力。在一些情况下，减毒病毒能够诱发保护性免疫应答而不引起任何的感染迹象或症状。

表位：抗原决定簇。它们是分子上具有抗原性（即诱发特异性免疫应答）的特定化学基团，如连续或不连续的肽序列。基于抗体的三维结构和表位的匹配（或同源）三维结构，抗体可结合特定的抗原性表位。

Evelyn-Rokitnicki-Abelseth（ERA）:狂犬病病毒ERA株衍生自Street-Alabama-Dufferin（SAD）株，SAD株是1935年在阿拉巴马州（美国）从一只疯狗中首次分离出来的。ERA株衍生自在小鼠大脑、幼仓鼠肾（BHK）细胞和鸡胚胎中多次传代之后的SAD狂犬病病毒。

融合蛋白：通过表达由编码两个不同（异源）蛋白的至少一部分的核酸序列经基因工程得到的核酸序列而产生的蛋白。为形成融合蛋白，所述核酸序列必须在相同的阅读框内并且在所述阅读框内无终止密码子。

异源的：本文所用的“异源核酸序列”是来自不同来源、种或株的核酸序列。在本文所描述的一些实施方案中，所述异源核酸序列是编码狂犬病病毒ERA以外的狂犬病病毒属病毒的糖蛋白的核酸序列狂犬病病毒属病毒。在重组ERA狂犬病病毒的情形中，异源核酸序列是非来自ERA狂犬病病毒的任何核酸序列。

免疫应答：免疫系统的细胞例如B细胞、T细胞、巨噬细胞和多形核白细胞对刺激（如抗原）的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御反应的任何身体细胞，包括例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但并不限于先天免疫应答或炎症。本文所用的保护性免疫应答是指可保护受试者不受感染（防止感染或防止感染相关疾病的发生）的免疫应答。

免疫：保护受试者免受疾病（例如，感染性疾病），例如通过接种疫苗。

免疫原：在适合条件下能够刺激在动物体内免疫应答（如抗体产生或T细胞应答）的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收进入动物体内的组合物。本文所用的“免疫原性组合物”是包括免疫原的组合物。

免疫原性组合物：可用于刺激或诱发脊椎动物特异性免疫应答（或免疫原性应答）的组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包括重组狂犬病病毒，例如表达一种或多种异源糖蛋白（如来自MOKV、LBV或WCBV的糖蛋白）的重组狂犬病病毒。在一些实施方案中，免疫原性应答是保护性的，或者可提供保护性免疫，因为它使动物更好地抗所述免疫原性组合物所针对的病原体（例如，狂犬病病毒和其他狂犬病病毒属病毒）的感染和/或所述病原体所致疾病的发展。一种类型的免疫原性组合物的一个具体实例是疫苗。

在一些实施方案中，免疫原性组合物的“有效量”或“免疫刺激量”是当给予受试者时足以产生可检测的免疫应答的量。这样的应答可以包括例如产生对所述免疫原性组合物中提供的一个或多个表位特异的抗体。或者，所述应答可以包括对所述免疫原性组合物中提供的一个或多个表位的辅助性T细胞应答或基于CTL的应答。在其他实施方案中，免疫原性组合物的“保护性有效量”是当给予动物时足以赋予所述动物保护性免疫的量。

抑制或治疗疾病：抑制疾病或病症的充分发展，例如在处于疾病风险的受试者中。疾病的一个具体实例是狂犬病。“治疗”是指在疾病或病理状态开始出现之后改善其征兆或症状的治疗性介入。本文所用的术语“改善”当述及疾病、病理状态或症状时是指所述治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可例如被以下方面所证实：在易感受试者中所述疾病临床症状的推迟发生、所述疾病的一些或全部临床症状严重程度的减轻、所述疾病发展趋缓、所述疾病复发次数的减少、所述受试者整体健康状况改善或者所述具体疾病特异性的本领域熟知的其他参数。

分离的：“分离的”或“纯化的”生物组分（如核酸、肽、蛋白质、蛋白复合体或颗粒）已基本上从所述组分天然产生的生物体的细胞的其他生物组分中（即，其他的染色体DNA和RNA、染色体外DNA和RNA以及蛋白质）分离、分开而产生或纯化出来。已被“分离的”或“纯化的”核酸、肽和蛋白质因此包括通过常规的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。所述术语还包括通过在宿主细胞内重组表达而制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸或蛋白质。术语“分离的”或“纯化的”不要求绝对的纯度，而是意在作为一个相对术语。因此，举例来说，分离的生物组分是其生物组分比其细胞内天然环境或其他生产容器中的生物组分更富集。优选地，对制剂进行纯化，使得所述生物组分占所述制剂的总生物组分含量的至少50％，如至少70％、至少90％、至少95％或更高。

标签：可检测的化合物或组合物，所述化合物或组合物是直接或间接地与另一分子缀合以方便检测所述分子。标签的具体非限制性施例包括荧光标记、酶联物和放射性同位素。

狂犬病病毒属（Lyssavirus）：单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales）（具有单链、反义基因组的病毒）内弹状病毒科（Rhabdoviridae）中的病毒属。狂犬病病毒属病毒是温血动物和人的狂犬病脑炎的病原。狂犬病病毒属病毒的种包括狂犬病病毒（RABV，基因型1）、拉各斯蝙蝠病毒（LBV，基因型2）、莫可拉病毒（MOKV，基因型3）、杜文海格病毒（DUVV，基因型4）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-1（EBLV-1，基因型5）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-2（EBLV-2，基因型6）、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（ABLV，基因型7）和从中亚和俄罗斯蝙蝠中分离出的4个其他物种（Aravan病毒-ARAV、Khujand病毒-KHUV、Irkut病毒-IRKV和西高加索蝙蝠病毒-WCBV）（Kuzminet al.,Emerg.Infect.Dis.14（12）:1887-1889,2008;Weyer et al.,Epidemiol.Infect.136:670-678,2007;Kuzmin and Rupprecht,“Batrabies”In Rabies,2^nd Edition,New York,Academic Press,2007,pages259-307,Jackson and Wunner,eds.）。

ORF（开放阅读框）：编码氨基酸的没有任何终止密码子的一系列核苷酸三联体（密码子）。这些序列通常可被翻译成肽。

可操作连接：当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能关系放置时，第一核酸序列就与第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子可操作连接到编码序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并在必要时将两个蛋白编码区在相同的阅读框内连接。如果存在内含子，可操作连接的DNA序列可以是不连续的。

可药用载体：可用于本公开的可药用载体是常规的。Remington’sPharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版（1975年）描述了适用于药物递送一种或多种治疗性化合物或分子、蛋白或结合这些蛋白的抗体、病毒或载体和其他药剂的组合物和制剂。

通常，所述载体的性质将依赖于所采用的具体给药方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射的流体，所述流体包括药学上和生理上可用的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油或类似载体。对于固体组合物（例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式），常规的非毒性的固体载体可以包括例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，用于给药的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

质粒：能够在宿主细胞中自主复制的环形核酸分子。

多肽：其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，不论L-光学异构体还是D-光学异构体都可以使用，对于许多生物用途优选L-异构体。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”意在包括任何氨基酸分子并包括修饰的氨基酸分子。术语“多肽”特别地意在包括天然存在的蛋白质，以及重组或合成产生的蛋白质。

保守氨基酸置换是发生时对原始蛋白性质影响最小的氨基酸置换，也就是说，所述蛋白的结构，特别是功能，是保守的，不会被这样的置换显著改变。保守置换的实例显示如下。

保守置换一般可保持（a）所述置换区域中的多肽主链的结构，例如作为片层或螺旋构象，（b）分子在靶位点的电荷或疏水性或（c）侧链的大小。

根据它们的侧链，氨基酸通常被归类为一个或多个类别，包括极性氨基酸、疏水性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸和芳族氨基酸。极性氨基酸的实例包括具有如羟基、巯基和酰胺的侧链官能团的氨基酸以及酸性氨基酸和碱性氨基酸。极性氨基酸包括但不限于天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸。疏水性或非极性氨基酸的实例包括那些具有非极性脂肪族侧链的残基，例如但不限于亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸。碱性氨基酸残基的实例包括那些具有碱性侧链（如氨基或胍基）的残基。碱性氨基酸残基包括但不限于精氨酸、高赖氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸残基的实例包括那些具有酸性侧链官能团（如羧基）的残基。酸性氨基酸残基包括但不限于天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括那些具有芳族侧链基团的氨基酸。芳族氨基酸的实例包括但不限于联苯丙氨酸、组氨酸、2-napthylalananine、五氟苯丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。值得注意的是，某些氨基酸被分类到一个以上的类别，例如，组氨酸、色氨酸、酪氨酸被分类为极性和芳香族氨基酸。被分类至上述每个类别的其他氨基酸是本技术领域普通技术人员已知的。

一般预计产生蛋白性质最大改变的置换应是非保守的，例如如下改变：（a）亲水残基，例如丝氨酰基或苏氨酰基，置换疏水残基，例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基，或被疏水残基，例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基，置换；（b）半胱氨酸或脯氨酸置换任何其他残基，或被任何其他残基置换；（c）具有带正电侧链的残基，例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基，置换具有带负电侧链的残基例如谷氨酰基或天冬氨酰基，或被具有带负电侧链的残基例如谷氨酰基或天冬氨酰基置换；或者（d）具有大侧链的残基，例如苯丙氨酸，置换不具有侧链的残基例如甘氨酸，或被不具有侧链的残基例如甘氨酸置换。

启动子：启动子是指导核酸转录的一系列核酸控制序列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列。启动子还任选包括远端增强子或抑制子元件。“组成型启动子”是持续活跃的，不受外部信号或分子的调控。相反，“诱导型启动子”的活性由外部信号或分子（例如，转录因子）调控。

纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯度；而是意在作为相对术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白、病毒或其他活性化合物完全或部分地与天然相关蛋白和其他污染物分离。在一些实施方案中，术语“基本纯化的”是指已经从细胞、细胞培养基或其他粗制品中分离并进行分级以除去初始制品中的多种组分例如蛋白、细胞碎片和其他组分的肽、蛋白、病毒或其他活性化合物。

狂犬病：一种在温血动物中引起急性脑炎（脑部炎症）的病毒性疾病。狂犬病是动物传染性的（由动物传播），最常见的是被已感染的动物咬伤，但偶尔也会是其他形式的接触。如果没有在严重症状发作之前给予暴露后预防，狂犬病经常是致命的。狂犬病是由狂犬病病毒属的病毒引起的。

狂犬病病毒（RABV或RABV）:弹状病毒科的一员，弹状病毒科具有反义极性的不分段RNA基因组。狂犬病病毒是狂犬病病毒属的原型。狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth（ERA）株衍生自Street-Alabama-Dufferin（SAD）株，SAD株于1935年在阿拉巴马州（美国）首次从一只疯狗中分离出来。ERA株衍生自在小鼠脑、幼仓鼠肾细胞（BHK）和鸡胚胎中多次传代之后的SAD RABV。ERA株的全基因组序列公开在PCT公开文本No.WO2007/047459中，通过反向遗传学复原的ERA株的序列如本文中SEQ ID NO:1所列出。

重组的：重组的核酸、蛋白或病毒具有非天然存在的序列或具有通过人工结合两个原本分离的序列片段而产生的序列。这种人工结合经常是通过化学合成完成或更常见地通过人工操作分离的核酸片段例如经基因工程技术完成。在一些实施方案中，使用反向遗传学（如PCT公开本文No.WO2007/047459中描述的反向遗传学系统）来生成重组狂犬病病毒。在一些实例中，重组狂犬病病毒在病毒毒力因子（如糖蛋白）中含有一个或多个突变。在其他实例中，重组狂犬病病毒包括异源基因，如编码来自另一狂犬病病毒属病毒（如莫克拉病毒、西高加索蝙蝠病毒或拉各斯蝙蝠病毒）的糖蛋白的序列。

反向遗传学：是指为了确定突变的表型效应向生物体或病毒基因组中引入突变（如缺失、插入或点突变）的过程。例如，在具体的病毒基因中引入突变来确定该基因的功能。

序列同一性：两条核酸序列或两条氨基酸序列之间的相似性以所述序列之间的相似性表示，或者称为序列同一性。序列同一性常以百分比同一性（或相似性或同源性）度量；所述百分比越大，则两条序列越相似。

将序列比对以进行比较的方法是本领域已知的。多种程序和比对算法记载于：Smith和Waterman（Adv.Appl.Math.,2:482,1981）;Needleman和Wunsch（J.Mol.Biol.,48:443,1970）;Pearson和Lipman（Proc.Natl.Acad.Sci.,85:2444,1988）;Higgins和Sharp（Gene,73:237-44,1988）;Higgins和Sharp（CABIOS,5:151-53,1989）;Corpet等人（Nuc.Acids Res.,16:10881-90,1988）;Huang等人（Comp.Appls.Biosci.,8:155-65,1992）;和Pearson等人（Meth.Mol.Biol.,24:307-31,1994）。Altschul等人（Nature Genet.,6:119-29,1994）提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

可使用比对工具ALIGN（Myers and Miller,CABIOS 4:11-17,1989）或LFASTA（Pearson and Lipman,Proc.,1988）进行序列比较（Internet Program

1996,W.R.Pearson and the University ofVirginia,“fasta20u63”version2.0u63,发布日1996年12月）。ALIGN相对于彼此比较整个序列，而LFASTA比较局部相似区域。这些比对工具和它们各自的教程可以在NCSA网站的互联网上得到。或者，为了比较超过约30个氨基酸的氨基酸序列，可使用设置为默认参数（空位出现罚分11、每残基空位罚分1）的默认BLOSUM62矩阵的“Blast2 sequences”函数。当比对短肽（少于约30个氨基酸）时，比对应使用设置为默认参数（开放空位罚分9，延伸空位罚分1）的PAM30矩阵，使用“Blast 2 sequences”函数进行。BLAST序列比较系统可从例如NCBI网站得到；还可参见Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403-10,1990;Gish and States,Nature Genet.,3:266-72,1993;Madden et al.,Meth.Enzymol.,266:131-41,1996;Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-402,1997;和Zhang and Madden,Genome Res.,7:649-56,1997。

蛋白的直系同源物（等价于其他物种的蛋白）在一些情况下的特征是具有超过75%的序列同一性，所述序列同一性使用设置为默认参数的ALIGN与具体蛋白的氨基酸序列进行全长比对计算。具有与参比序列甚至更大相似性的蛋白在通过这种方法评估时会呈现更高的百分比同一性，如至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%或至少98%的序列同一性。此外，可对公开的融合蛋白的一个或两个结合区域的全长上比较序列同一性。

当对显著少于全序列的序列进行序列同一性比较时，同源序列在10-20的短窗口上一般具有至少80%的序列同一性，并且根据它们与参比序列的相似性可具有至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的序列同一性。在这样的短窗口上的序列同一性可使用LFASTA确定；方法在NCSA网站上有描述。本领域技术人员应理解，提供这些序列同一性区间仅为指导的目的；完全可能得到落在提供的区间外的非常显著的同源物。如对蛋白的描述，类似的同源性概念适用于核酸。两个核酸分子密切相关的另一指示是两个分子在严格条件下相互杂交。

由于遗传密码子的简并性，未显示出高度同一性的核酸序列仍可以编码相似的氨基酸序列。应理解，可使用所述简并性制造核酸序列的改变以产生各自编码基本相同蛋白的多个核酸序列。

受试者：活的多细胞脊椎动物，所述类别包括人和非人哺乳动物。

治疗有效量：在以指定试剂治疗的受试者中足以达到所需效果的该试剂的量。例如，这可以是可用于在受试者中诱发免疫应答和/或预防狂犬病病毒或其他狂犬病病毒感染的重组狂犬病病毒的量。理想的情况是，在本公开的上下文中，重组狂犬病病毒的治疗有效量是足以在受试者中增强对由一种或多种狂犬病病毒属病毒引起的感染的抗性并且/或者预防、改善和/或治疗由一种或多种狂犬病病毒属病毒引起的感染而不在受试者中引起大量细胞毒性效应的量。可用于在受试者中增强对感染的抗性并且/或者预防、改善和/或治疗感染的重组狂犬病病毒的有效量取决于，例如，待治疗的受试者、所述治疗性组合物的给药方式和其他因素。在一些实施方案中，本文所述的重组狂犬病病毒包括编码狂犬病病毒ERA以外的狂犬病病毒属病毒的一种或多种糖蛋白的核酸序列。

疫苗：给予以预防、改善或治疗的传染性疾病或其他类型的疾病（如癌症）的能够刺激免疫应答的免疫原性物质的制剂。所述免疫原性物质可以包括减毒或灭活微生物（如减毒病毒），或者来源于这些微生物的抗原性蛋白、肽或DNA。疫苗可以诱发预防疾病的（预防性）反应和治疗性反应。给药方法根据疫苗而有所不同，但可包括接种、摄入、吸入或其他形式的给药。接种可通过许多途径中的任何一种来实现，包括肠胃外途径，例如静脉途径、皮下途径或肌肉途径。疫苗可以和佐剂一起给予以增强免疫应答。

载体：可以被引入到宿主细胞中并由此产生转化宿主细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点（参与启动DNA合成的DNA序列）。载体还可以包括一个或多个可选择的标记基因和本领域中已知的其他遗传元件。

病毒：在活细胞内繁殖的微小的感染性生物体。病毒通常基本上由被蛋白质外壳包围的核酸（单链或双链RNA或DNA）核心组成，在一些情况下有脂质包膜，并且具有仅在活细胞内复制的能力。“病毒复制”是通过发生至少一个病毒生命周期来产生另外的病毒。

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。除非上下文另有明确说明，单数术语“一种”、“一个”和“所述”包括复数的指代物。类似地，除非上下文另有明确说明，词“或（或者）”意欲包括“和（并且）”。因此，“包括（含）A或B”是指包括（含）A或B，或者包括（含）A和B。还应理解，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值都是为描述的目的给出的近似值。与本文描述的方法或材料类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本公开。下文描述了合适的方法和材料。在有冲突的情况下，以本说明书包括对术语的解释为准。此外，所述材料、方法和实例仅是示例性的，不是意欲进行限制。

III.对数个实施方案的综述

本文所公开了具有来自至少两种不同的狂犬病病毒属病毒的糖蛋白（G）基因的重组狂犬病病毒。所公开的病毒可以用作广谱狂犬病病毒属病毒疫苗来提供抗多种基因型狂犬病病毒属的感染的保护。本公开之前，预防西高加索蝙蝠病毒和/或狂犬病病毒属基因型2（拉各斯蝙蝠病毒）和3（莫克拉病毒）的疫苗没有被记载过。因此，本文所述的重组狂犬病病毒代表了用于预防狂犬病的疫苗发展的重要进展。

本文所示例的重组狂犬病病毒是通过使用之前描述过的基于狂犬病病毒ERA株的反向遗传学系统（PCT公开文本No.WO2007/047459）来产生的。然而，用于狂犬病病毒的其他反向遗传学系统（参见例如Ito et al.,J.Virol.75（19）:9121-9128）可以用来产生具有多个狂犬病病毒属病毒G基因的重组病毒。

本文提供了一种重组狂犬病病毒，其中所述重组狂犬病病毒基因组包括狂犬病病毒核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、RNA依赖性RNA聚合酶（L）和糖蛋白（G）的基因和至少一个、至少两个或至少三个不同的异源狂犬病病毒属病毒的糖蛋白基因，其中所述狂犬病病毒属病毒选自拉各斯蝙蝠病毒（LBV）、莫克拉病毒（MOKV）、杜文海格病毒（DUVV）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-1（EBLV-1）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-2（EBLV-2）、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（ABLV）、Aravan病毒（ARAV）、Khujand病毒（KHUV），Irkut病毒（IRKV）和西高加索蝙蝠病毒（WCBV）。在具体的实施方案中，所述狂犬病病毒属病毒选自：LBV、MOKV和WCBV。

在一些实施方案中，所述重组狂犬病病毒包括两个异源G基因。在具体实例中，所述两个异源G基因来自MOKV和WCBV。在其他实例中，所述两个异源G基因来自LBV和MOKV。而在其他实例中，所述两个异源G基因来自LBV和WCBV。

在一些实施方案中，所述重组狂犬病病毒包括三个异源G基因。在具体实例中，所述三个异源G基因来自LBV、MOKV和WCBV。

在重组狂犬病病毒包括MOKV G基因的一些实施方案中，所述MOKV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的。在重组狂犬病病毒包括WCBV G基因的一些实施方案中，所述WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的。在重组狂犬病病毒包括LBV G基因的一些实施方案中，所述LBVG基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:53的核苷酸序列是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的。

在一些实例中，MOKV G基因包括SEQ ID NO:47的核苷酸序列；WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列；并且/或者LBV G基因包括SEQ ID NO:53的核苷酸序列。在具体实例中，MOKV G基因由SEQ ID NO:47的核苷酸序列组成；WCBV G基因由SEQ ID NO:49的核苷酸序列组成；并且/或者LBV G基因由SEQ ID NO:53的核苷酸序列组成。

异源G基因可以在任何合适的位置并以任何顺序被克隆到狂犬病病毒基因组中，以使异源蛋白质的表达，而不改变内源狂犬病病毒基因的表达。在一些实施方案中，异源G基因被插入到狂犬病病毒P基因和M基因之间、狂犬病病毒G基因和L基因和/或狂犬病病毒N基因和P基因之间。在具体实例中，重组狂犬病病毒包括两个异源G基因，所述异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间以及G基因和L基因之间。在其他实例中，重组狂犬病病毒包括三个异源G基因，所述异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间、狂犬病病毒P基因和M基因之间以及G基因和L基因之间。

可通过合成转录单元来帮助将异源基因插入到狂犬病病毒基因组中。所述转录单元被插入到所需基因连接区并且所述异源G基因被克隆到所述转录单元内。在一些实施方案中，所述转录单元的核苷酸序列与SEQ ID NO:42的核苷酸序列是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的。在一些实例中，所述转录单元包括SEQ ID NO:42的核苷酸序列。

在一些实施方案中，重组狂犬病病毒基因组来自狂犬病病毒ERA株。在一些实施方案中，所述ERA株基因组的核苷酸序列包括与SEQID NO:1至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。在具体实例中，所述ERA株基因组的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，重组狂犬病病毒包括一个或多个减毒突变。在示例性实施方案中，狂犬病病毒糖蛋白在氨基酸第333位上包括谷氨酸（SEQ ID NO:5）。

还提供了一种包括全长的狂犬病病毒反义基因组DNA的载体，其中所述反义基因组DNA包括狂犬病病毒N基因、P基因、M基因、L基因和G基因，并且其中所述载体还包括至少一个、至少两个或至少三个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因，其中所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV和WCBV。在具体的实施方案中，所述狂犬病病毒属病毒选自：LBV、MOKV和WCBV。

在一些实施方案中，所述载体包括两个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。在具体实例中，所述两个异源G基因是MOKV G基因和WCBV G基因。在其他实例中，所述两个异源G基因是MOKV G基因和LBV G基因。在其他实例中，所述两个异源G基因是LBV G基因和WCBV G基因。

在一些实施方案中，所述载体包括三个异源G基因。在具体实例中，所述三个异源G基因来自LBV、MOKV和WCBV。

在载体包括MOKV G基因的一些实施方案中，所述MOKV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的。在载体包括WCBV G基因的一些实施方案中，所述WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的。在载体包括LBV G基因的一些实施方案中，所述LBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:53的核苷酸序列是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的。

在一些实例中，MOKV G基因包括SEQ ID NO:47的核苷酸序列；WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列；并且/或者LBV G基因包括SEQ ID NO:53的核苷酸序列。在具体实例中，所述MOKVG基因由SEQ ID NO:47的核苷酸序列组成；WCBV G基因由SEQ IDNO:49的核苷酸序列组成；并且/或者LBV G基因由SEQ ID NO:53的核苷酸序列组成。

异源G基因可以在任何合适的位置并以任何顺序被克隆到编码狂犬病病毒基因组的载体中，以使异源蛋白表达，而不改变狂犬病病毒内源性基因的表达。在一些实施方案中，异源G基因被插入到狂犬病病毒P基因和M基因之间、狂犬病病毒G基因和L基因和/或狂犬病病毒N基因和P基因之间。在具体实例中，重组狂犬病病毒包括两个异源G基因，所述两个异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间以及G基因和L基因之间。在其他实例中，重组狂犬病病毒包括三个异源G基因，所述三个异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间、狂犬病病毒P基因和M基因之间以及G基因和L基因之间。

在一些实施方案中，插入到所述载体中的狂犬病病毒反义基因组DNA来自狂犬病病毒ERA株。在一些实施方案中，所述ERA株反义基因组DNA的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:1至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的序列。在具体实例中，所述ERA株反义基因组DNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1。

本文还提供了一种包含一个或多个本文所公开的狂犬病病毒载体的细胞。

还提供了包括本文所述的重组狂犬病病毒与可药用载体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包括佐剂。

还考虑包括多种重组狂犬病病毒的组合物，每种重组狂犬病病毒编码至少一个异源G基因。在一些实施方案中，所述组合物包括（i）第一重组狂犬病病毒，其中所述第一重组狂犬病病毒的基因组包括狂犬病病毒G基因和至少一个异源狂犬病病毒属病毒G基因，和（ii）第二重组狂犬病病毒，其中所述第二重组狂犬病病毒的基因组包括来自不同狂犬病病毒属病毒的至少一个G基因（即，不是第一重组狂犬病病毒的狂犬病病毒属病毒G基因）；其中所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV和WCBV。在具体的实施方案中，所述狂犬病病毒选自：LBV、MOKV和WCBV。在一些实例中，所述第二重组狂犬病病毒还包括狂犬病病毒G基因。在一些实例中，所述第一和/第二重组狂犬病病毒包括至少两个异源G基因。

在一些实例中，所述组合物包括（i）第一重组狂犬病病毒，其中所述第一重组狂犬病病毒的基因组包括狂犬病病毒G基因和来自MOKV和WCBV的G基因；和（ii）第二重组狂犬病病毒，其中所述第二重组狂犬病病毒的基因组包括来自LBV的G基因。

还提供了一种通过给予受试者一种或多种本文公开的重组狂犬病病毒或组合物在所述受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的方法。在一些实施方案中，在受试者中抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答可保护受试者免受至少三种不同基因型的狂犬病病毒属病毒的感染。在一些实施方案中，在受试者中抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答可保护受试者免受至少4种不同基因型的狂犬病病毒属病毒的感染。在一些实施方案中，所述受试者是人。在其他实施方案中，所述受试者是非人动物。

IV.狂犬病病毒致病性的决定因素

狂犬病病毒（RABV）是弹状病毒科病毒——一种具有反义极性的不分段RNA病毒。在弹状病毒科中，狂犬病病毒是狂犬病病毒属的原型。狂犬病病毒属病毒由两个主要结构部件组成：核衣壳或核糖核蛋白（RNP），以及包围RNP核心的双层膜形式的被膜。所有弹状病毒的感染性组件均是RNP核心，所述RNP核心由被核蛋白（N）包裹的负链RNA基因组以及RNA依赖性RNA聚合酶（L）和磷蛋白（P）组成。包围RNP的膜包含两种蛋白，跨膜糖蛋白（G）和位于膜内部位点的基质蛋白（M）。因此，病毒基因组编码这五种蛋白：RNP中的三种蛋白（N、L和P）、基质蛋白（M）和糖蛋白（G）。

各种狂犬病病毒株的致病性的分子决定因素尚未被完全阐明。RABV的致病性归因于多基因事件（Yamada et al.,Microbiol.Immunol.50:25-32,2006）。例如，RABV基因组中的某些位点如果突变则会影响病毒转录和复制，从而降低毒力。N基因中磷酸化位点第389位丝氨酸残基突变（Wu et al.,J.Virol.76:4153-4161,2002）或L基因中高度保守的C基序的GDN核心序列突变（Schnell and Conzelmann,Virol.214:522-530,1995）大大降低了RABV的转录和复制。

G蛋白——也称为刺突蛋白——参与RABV的细胞附着和膜融合。第330至第340位的氨基酸区域（称为抗原位点III）已被确定对某些株的RABV的毒力是重要的。数项研究支持固定的RABV株的致病性由糖蛋白第333位氨基酸残基处存在精氨酸或赖氨酸决定的观点（Dietzschold et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:70-74,1983;Tuffereau et al.,Virology172:206-212,1989）。

这种现象似乎至少适用于固定的狂犬病病毒例如CVS、ERA、PV、SAD-B19和HEP-Flury株（Anilionis et al.,Nature294:275-278,1981;Morimoto et al.,Virology173:465-477,1989）。例如，在糖蛋白第333位上具有不同于Arg的氨基酸的狂犬病疫苗病毒已被记载于，例如，WO00/32755（描述了RABV突变体，其中与亲本病毒相比，G蛋白Arg₃₃₃密码子的全部三个核苷酸都被改变，使得第333位的Arg被其他氨基酸置换）；欧洲专利350398（描述了一种衍生自RABV的BernSAD株的无毒RABV突变体SAD1，其中糖蛋白第333位的Arg被置换为Ser）；以及欧洲专利申请583998（描述了一种减毒RABV突变株——SAG2，其中G蛋白第333位的Arg被置换为Glu）中。

其他病毒株，例如RC-HL株，在G蛋白第333位上具有精氨酸残基，但是在成年小鼠中却不引起致死性感染（Ito et al.,Microl.Immunol.38:479-482,1994;Ito et al.,J.Virol.75:9121-9128,2001）。因此，可能整个G对RABV的毒力有贡献，尽管它的决定因子或区域还未被完全阐明。

G基因编码可诱导病毒中和抗体的唯一一种蛋白。已知RABV糖蛋白的至少三种状态：负责受体结合的天然状态（N）、膜融合过程的起始步骤所必需的活性疏水状态（A）（Gaudin,J.Cell Biol.150:601-612,2000）和融合非活性构象（I）。G蛋白的正确折叠和成熟对免疫识别起到重要的作用。ERA G胞外结构域中三个潜在糖基化位点出现在Asn³⁷、Asn2⁴⁷和Asn³¹⁹残基处（Wojczyk et al.,Glycobiology.8:121-130,1998）。G的非糖基化不仅影响构象，而且还抑制蛋白在细胞表面的呈递。

之前已经表明G的表达可增强抗RABV的免疫应答（参见PCT公开文本No.WO2007/047459,此公开文本以引用的方式纳入本文）。此外，在RABV ERA糖蛋白第333位氨基酸处引入精氨酸至谷氨酸突变产生了减毒的病毒（被称为ERAg3）。该减毒病毒能在动物中诱发高滴度的中和抗体，并赋予抗野生型病毒激发的保护。此外，如PCT公开文本No.WO2007/047459中所述，包括两个拷贝的G333突变糖蛋白的重组RABV由于其诱发高滴度的中和抗体而无发病和死亡的能力而特别可用作疫苗。在本文的一些实例中，糖蛋白中包括G333突变的重组狂犬病病毒可以被用作平台来引入来自一个或多个不同基因型的狂犬病病毒属病毒的一个或多个（例如一个、两个或三个）其他G基因。然而，本领域普通技术人员应了解，使用如下文总结的PCT公开文本No.WO2007/047459中公开的反向遗传学系统（或其他狂犬病病毒反向遗传学系统），大量重组狂犬病病毒中的任一个可以被用于整合异源序列。

V.狂犬病病毒反向遗传学系统

RNA不容易通过分子生物学方法直接操作。传统RNA病毒疫苗是来自自然减毒分离株，这些分离株难于控制并且提供难以预测的结果。反向遗传学技术使得像操作DNA一样操作RNA成为可能，DNA可以根据精心设计被突变、缺失或重构。每种基因功能都可以被仔细地、独立地、协同地研究，这有利于疫苗开发。反向遗传学涉及反转录RNA病毒基因组成cDNA和将cDNA克隆到载体（例如质粒）中。转染宿主细胞后，载体被转录成将被病毒结构蛋白包裹的RNA，这些结构蛋白也可由质粒提供。壳体化的RNA可形成核糖核蛋白复合体，其形成可被恢复的病毒粒子。

基于狂犬病病毒ERA株的有效反向遗传学系统被描述在PCT公开文本No.WO2007/047459中，该专利以引用的方式纳入本文。所述狂犬病反向遗传学系统可用于多种目的，包括以限定的方式减毒ERA病毒用于疫苗开发，产生ERA病毒载体用于表达异源蛋白，例如来自另一狂犬病病毒属病毒的蛋白用于产生广谱狂犬病病毒属病毒疫苗。

在PCT公开文本No.WO2007/047459中公开的反向遗传学系统具有一些或全部的如下特性，在图1A中使用示例性ERA株反义基因组cDNA示意显示的。

所述狂犬病病毒反向遗传学系统基于全长转录质粒和多个辅助质粒（例如5个辅助质粒）。所述辅助质粒编码N蛋白、P蛋白、L蛋白和任选的G蛋白，以及T7聚合酶。虽然G蛋白对于病毒拯救不是必需的，但是当被包括在转染中时，其改善病毒恢复效率或病毒出芽。

转录涉及哺乳动物细胞中存在的细胞RNA依赖性RNA聚合酶II和pNLST7质粒提供的T7RNA聚合酶。双重聚合酶的效果是兼具高和稳定的病毒恢复效率。

在转录质粒中，锤头状核酶和丁型肝炎病毒核酶在狂犬病病毒（例如ERA株）反义基因组cDNA的侧翼，使得可通过转录产生病毒反义基因组RNA可靠的5'和3'末端。锤头状核酶序列最开始的10个核苷酸被设计成与反义基因组序列最开始的10个核苷酸互补。

两种修饰的T7RNA聚合酶构建体比先前应用的野生型T7RNA聚合酶更有效地支持病毒恢复。一种T7RNA聚合酶第一个ATG已被突变为AT。第二种T7RNA聚合酶具有八氨基酸的细胞核定位信号（NLS），所述细胞核定位信号来自SV40病毒大T抗原并融合在亲本T7第一个ATG之后。加入NLS导致T7RNA聚合酶主要存在于细胞核内。根据NLS修饰质粒的转染机制，DNA/转染剂复合体可结合到细胞表面上。通过内吞作用，所述复合体被带入内体/溶酶体内，并且DNA被释放到细胞质中。在没有NLS的情况下，大部分转染质粒保留在细胞质中，只有小比例的释放DNA到达细胞核，在那里它被转录成RNA。在蛋白合成后，NLST7RNA聚合酶被转运回细胞核，并且细胞核中的辅助质粒（具有T7/CMV启动子）将被NLST7和细胞聚合酶II转录。因此，可合成更多辅助质粒的mRNA和全长pTMF或其衍生物的cRNA，导致高效率的病毒恢复。

在CMV启动子起始表达NLST7后，NLST7聚合酶结合到PT7来转录NLST7基因。通过在细胞核内对转录本进行修饰，合成更多的NLST7，导致NLST7聚合酶的更多表达。NLST7聚合酶的PT7以及全长反义基因组转录单元的PT7是处于NLST7聚合酶的控制下的，所述NLS7聚合酶作为“自身基因”起作用。NLS7RNA聚合酶的自身基因机制在图2中说明。在T7RNA聚合酶在细胞核中表达后，转染的T7构建体继续转录全长RNA模板用于N蛋白壳体化和/或L蛋白的结合，从而提高病毒恢复效率。

所述T7聚合酶和除编码N蛋白的质粒pTN以外的所有其他质粒被置于CMV和T7两个转录调控元件的控制之下。编码N蛋白的核酸序列在T7启动子的控制之下，基于IRES（内部核糖体进入位点）以不依赖帽子的方式被翻译。如果所有质粒被克隆为处于CMV启动子控制之下，细胞RNA聚合酶II单独可帮助RABV的恢复。在PCT公开文本No.WO2007/047459公开的ERA反向遗传学系统中，只有PTN在T7启动子的控制之下，以不依赖帽子的方式被翻译。所有其他构建体都处在CMV和T7两个转录调控元件的控制之下。通常，在RABV中，N的合成是高丰度的，并且N、P和L之间的比例约为50：20：1。为了在RABV反向遗传学系统中模拟野生型病毒转录和组装，N表达应最高。在NLST7聚合酶和IRES翻译模式的帮助下，N蛋白在质粒转染后被有效表达。这减少了与宿主细胞管家基因转录的竞争，因为在哺乳动物细胞中不存在T7转录起始信号，并导致T7转录效率提高。

此外，如PCT公开文本No.WO2007/047459中所描述的，为提高病毒蛋白的生产，可以构建辅助质粒来整合已对于每个蛋白编码序列优化翻译效率的Kozak序列。在ERA反向遗传学系统中转染五天后，拯救的病毒可靠并可重复地生长至10⁷FFU/ml，而不用进一步扩增。

可以使用例如在PCT公开文本No.WO2007/047459中公开的反向遗传学系统来设计具有有利于疫苗接种特性的重组狂犬病病毒。具有突变糖蛋白的改良株特别适合用作免疫原性组合物。所述RABV反向遗传学系统还可实现用于外源（异源）基因表达的狂犬病病毒载体系统。之前已证明额外的转录单元在整合至RABV ERA基因组后在两个不同位置是有功能的。因此，所述RABV反向遗传学系统提供了一种引入异源蛋白的方法。在一些实例中，所述异源蛋白是来自除RABVERA株以外的狂犬病病毒属病毒的糖蛋白。

VI.重组狂犬病病毒组合物的给药和用途

本文提供的重组狂犬病病毒包括至少一个编码非RABV ERA的狂犬病病毒属病毒的糖蛋白的异源核酸序列。本文提供的免疫原性组合物被设计成提供抗多种狂犬病病毒属基因型的保护，并且在一些情况下，提供抗所有11种已知狂犬病病毒属基因型的保护。本文提供的免疫原性组合组考虑用于人和非人动物两者。

所述免疫原性制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并使用常规的药物技术制备。这种技术包括使活性成分与一种或多种药用载体或一种或多种赋形剂缔合的步骤。通常，所述制剂通过使活性成分与液体载体均匀和紧密地缔合来制备。适合肠胃外给药的制剂包括水性和非水性的无菌注射液，所述注射液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑细菌剂和使所述制剂与目的接受者血液等渗的溶质；包含悬浮剂与增稠剂的水性和非水性无菌悬液。所述制剂可存在于单位剂量或多剂量的容器内，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以存储在冷冻干燥（冻干）条件下，仅需在临用前加入无菌液体载体例如注射用水。临时注射溶液和悬液可以从本领域普通技术人员常用的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。

在某些实施方案中，单位剂量制剂是那些含有一个剂量或单位，或其合适级分的要给药成分的制剂。应理解，除了上面具体提到的成分，本文包含的制剂还可以包括本技术领域普通技术人员常用的其他试剂。

本文提供的组合物，包括那些用作免疫原性组合组的组合物，可以通过不同的途径给药，例如口服（包括口腔和舌下）、直肠、肠胃外、喷雾、鼻、肌肉、皮下、皮内和局部。它们可以以不同的形式给药，包括但不限于溶液、乳液、悬液、微球、颗粒、微粒、纳米颗粒和脂质体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物被口服给药。

给药的体积根据给药途径而有所不同。本领域普通技术人员会知道不同途径给药的合适体积。

给药可以通过单剂量或多剂量来完成。在本发明上下文中，给予受试者的剂量应该足够诱发有益的治疗反应一段时间，例如预防狂犬病病毒属病毒感染或狂犬病的发生。所需剂量根据例如受试者的年龄、体重和健康状况而有所不同。

每剂量中免疫原性组合物的量被选择为可诱发免疫刺激应答、而无明显不良副作用的量。这样的量根据使用哪个具体组合物和怎样将其给药而有所不同。初始剂量的范围可以从约1μg到约1mg，在一些实施方案中，范围为约10μg至约800μg，而在其他的实施方案中，范围为约25μg至约500μg。在初次给予免疫原性组合物后，受试者可接受一次或几次适当间隔的加强给药。加强给药的范围可以从约1μg到约1mg，在其他实施方案中，范围为约10μg至约750μg，在其他的实施方案中，范围为从约50μg至约500μg。每隔1-5年如3年定期加强是保持所需水平的保护性免疫所需要的。在优选的实施方案中，受试者接受单剂量的免疫原性组合物。

本文提供了药用组合物（也被称为免疫原性组合物或免疫刺激性组合物），所述药用组合物仅包括治疗有效量的重组RABV或包括治疗有效量的重组RABV和可药用载体。在一些实施方案中，所述重组RABV包括异源蛋白，如来自引起狂犬病的另一狂犬病病毒属病毒的糖蛋白。

可药用载体包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它们的组合。所述载体和组合物可以是无菌的，并且所述制剂适合给药方式。所述组合物也可包含少量的润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末。所述组合物可以与传统的粘合剂和载体（例如甘油三酯）配制成栓剂。口服制剂可以包括常规载体例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。可以使用任何常用药用载体，例如无菌盐水溶液或麻油。所述介质还可以包含常规的药物辅助材料，例如，调节渗透压的可药用的盐、缓冲剂、防腐剂等。可以用于本文所提供的组合物和方法的其他介质是生理盐水和麻油。

本文所描述的重组RABV可以单独或与增强抗原性的其他可药用试剂联合使用。例如，所述重组病毒可以与佐剂一起给药，例如弗式不完全佐剂或弗氏完全佐剂。

任选地，一种或多种细胞因子，例如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ、一种或多种生长因子，例如GM-CSF或G-CSF；一种或多种分子，例如OX-40L或41BBL；或这些分子的组合可以被用作生物佐剂（参见，例如Salgaller et al.,1998,J.Surg.Oncol.68（2）:122-38;Lotze et al.,2000,Cancer J.Sci.Am.6（Suppl1）:S61-6;Cao et al.,1998,Stem Cells16（Suppl1）:251-60;Kuiper et al.,2000,Adv.Exp.Med.Biol.465:381-90）。这些分子可以全身性地（或局部地）给予寄主。

用于在体外和体内都诱导细胞应答的许多方法是已知的。脂质已被鉴定为能够在体内协助引发针对多种抗原的CTL的试剂。例如，如美国专利No.5,662,907中所描述的，棕榈酸残基可以被连接到赖氨酸残基的α-氨基和ε-氨基，然后被连接到免疫原性肽上（例如，经一个或多个连接残基，如甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等）。所述脂化肽可直接以胶束形式注射、整合在脂质体中或乳化在佐剂中。作为另一实例，当共价连接到合适的肽上时，可以使用大肠杆菌（E.coli）脂蛋白如三棕榈酰-S-甘油基半胱胺酰丝氨酰-丝氨酸来引发肿瘤特异性CTL（参见，Deres et al.,Nature342:561,1989）。另外，因为对中和抗体进行诱导也可以以缀合到呈现合适表位的肽上的相同分子所引发，所以在认为需要时，也可以将两种组合物结合来诱发体液介导的应答和细胞介导的应答。

提供了如下实施例以示例性说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所描述的具体特征或实施方案。

实施例

实施例1：用于狂犬病病毒反向遗传学系统的质粒的构建

本实施例描述了狂犬病病毒反向遗传学系统的设计和开发。狂犬病病毒株ERA获自ATCC并如所述制备（Wu et al.,J.Virol.76,4153-4161,2002）。为获得病毒基因组全长病毒cDNA，用ERA株病毒感染BSR细胞（幼仓鼠肾BHK细胞的克隆）并且将所述细胞在补充有10％胎牛血清的Dulbecco基本必需培养基中培养。回收上清液并以22000g离心1小时。用购自Qiagen（巴伦西亚，加利福尼亚州）的RNA病毒提取试剂盒根据制造商的说明书收集病毒片状沉淀物用于病毒基因组RNA纯化。病毒基因组RNA的完整性通过凝胶电泳证实。用Life Technologies（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）的第一链cDNA合成试剂盒（first-strand cDNA synthesis kit）转录病毒基因组cDNA。使用反转录（RT）反应混合物通过聚合酶链反应（PCR）进行扩增，用于分别合成全长病毒基组cDNA、N基因、P基因、G基因和L基因。为组装全长病毒基因组cDNA，以图1B所示意的四个连续步骤构建pTMF质粒。使用Superscript III反转录酶和校读platinum pfx聚合酶（proof reading platinum pfx polymerase）（Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）进行cDNA转录本合成与随后的PCR扩增。对于逆转录反应，将1μg纯化的基因组RNA用于RT反应混合物中，并在50℃下孵育80分钟，然后在85℃下加热5分钟来灭活Superscript III。在所述RT反应后，加入1单位的RNaseH来消化cDNA-RNA杂合体中的模板RNA。

为产生全长病毒基因组cDNA，通过如下RT-PCR扩增两个重叠片段：用如下引物RT-PCR扩增片段1（F1）：Le5-Kpn(CCGGGTACCAGGCTTAACAACCAGATCAAAGA;SEQ ID NO:8,Kpn1识别位点用粗体显示）和Le3-Blp（TAGGTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTAGGAC;SEQ ID NO:9,Blp1识别位点用粗体显示）。用如下引物RT-PCR扩增片段2（F2）：Tr5-Blp（GTCCTACCAGGAGTGCTTAGCAAGCGACCTA;SEQ ID NO:10,Blp1识别位点用粗体显示）和Tr3-Pst（AAAACTGCAGACGCTTAACAAATAAACAACAAAA;SEQ ID NO:11,Pst1识别位点用粗体显示）。成功合成上述两个片段后，将用Kpn1和Blp1限制性内切酶消化的F1进行凝胶纯化并克隆到pBluescriptIISK(+)的噬菌粒上（Stratagene，拉荷亚，加利福尼亚州）以形成pSKF1质粒。随后将Blp1和Pst1切割的凝胶纯化的F2片段克隆至pSKF1质粒上以形成全长病毒反义基因组cDNA。合成在5’末端具有Nhe1识别位点并在3’末端具有Kpn1位点的锤头状核酶（寡核苷酸1，CAAGGCTAGCTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCGGTACCACGCT;SEQ ID NO:12，Nhe1和Kpnl识别位点用粗体显示;寡核苷酸2，AGCGTGGTACCGACTATAGGAATTCCTTTCCTATAGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACGCTTAACAGCTAGCCTTG;SEQ ID NO:13，Kpn1和Nhe1酶切位点用粗体显示）。并将其融合到F1片段5’末端之前。合成在其5’端具有Pst1位点并在其3’末端具有Not1位点的丁型肝炎病毒核酶（寡核苷酸3,GACCTGCAGGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCGGCCGCACTC;SEQ ID NO:14,Pst1和Notl识别位点用粗体显示，寡核苷酸4，GAGTGCGGCCGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCCTGCAGGTC;SEQ ID NO:15,NOtl和Pst1识别位点用粗体显示）（Symons,Annu.Rev.Biochem.61:641-671,1992），并将其融合到F2片段的3’末端。锤头状核酶和F1片段之间的连接性Kpn1识别位点以级F2片段和丁型肝炎病毒核酶之间的Pst1位点通过定点突变来删除。全长病毒反义基因组cDNA被锤头型核酶和丁型肝炎病毒核酶夹在中间。这个片段被酶切下来并克隆到pBluescriptIISK(+)噬菌粒上以制备pSKF构建体。

将具有两个核酶的所述全长病毒反义基因组cDNA融合到T7转录起始位点的下游，所述T7转录起始位点处于质粒pcDNA3.1/Neo(+)（Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）的CMV极早期启动子的控制下。该最后一步完成了pTMF质粒的构建。

野生型ERA病毒基因组在G和Psi区域之间的基因间区域包括8个残基的polyA尾（polyA₈）。为了从亲本株中区分出拯救ERA（rERA）病毒，通过删除一个A而将具有7个A的链（polyA₇）引入到pTMF构建体中以代替原来的polyA₈。在rERA病毒被恢复后，进行RT-PCR，随后的序列数据证实了引入的polyA₇序列标记物的存在。

pTN质粒：通过RT-PCR用如下引物扩增N基因（5N:ACCACCATGGATGCCGACAAGATTG;SEQ ID NO:16，NCol识别位点和起始密码子用粗体显示;3N：GGCCCATGGTTATGAGTCACTCGAATATGTCTT;SEQ ID NO:17，NcOl识别位点和终止密码子用粗体显示）并克隆到质粒pCITE-2a(+)（Cap-Independent Translation Enhancer）（Novagen，麦迪逊，威斯康辛州）。

pMP质粒：通过RT-PCR用如下引物扩增P基因（5P：TTGGTACCACCATGAGCAAGATCTTTGTCAATC;SEQ ID NO:18，Kpnl识别位点和起始密码子用粗休显示;和3P:GGAGAGGAATTCTTAGCAAGATGTATAGCGATTC;SEQ ID NO:19,EcoRl识别位点和终止密码子用粗体显示），并将其克隆到pcDNA3.1/Neo(+)质粒上。

pMG质粒：通过RT-PCR用如下引物扩增G基因（5G:TTGGTACCACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG;SEQ ID NO:20,Kpnl识别位点和起始密码子用粗体显示;和3G:AAAACTGCAGTCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC;SEQ ID NO:21,PSt1识别位点和终止密码子用粗体显示），并将其克隆到pcDNA3.1/Neo(+)质粒上。

pML质粒：通过RT-PCR用如下引物扩增L基因（5L:ACCGCTAGCACCACCATGCTCGATCCTGGAGAGGTC;SEQ ID NO:22,Nhel识别位点和起始密码子用粗体显示;和3LAAAACTGCAGTCACAGGCAACTGTAGTCTAGTAG;SEQ ID NO:23，PSt1识别位点和终止密码子用粗体显示），并将其克隆到pcDNA3.1/Neo(+)质粒上。

PT7质粒：根据制造商的说明书，用DNeasy组织试剂盒（DneasyTissue Kit）（Qiagen，巴伦西亚，加利福尼亚州）从细菌BL-21（Novagene，麦迪逊，威斯康星州）提取基因组DNA。从所述纯化的基因组DNA通过PCR用如下引物扩增T7RNA聚合酶基因（5T7：TCGCTAGCACCACCATGAACACGATTAACATCGCTAAG;SEQ ID NO:24，Nhe1识别位点和起始密码子用粗体显示;和3T7:GATGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCGACTC;SEQ ID NO:25，EcORl识别位点和终止密码子用粗体显示），并将其克隆到pcDNA3.1/Neo(+)质粒上。

pNLST7质粒：使用PT7质粒作为模板用如下引物通过PCR扩增将来自SV40大T抗原的八氨基酸的细胞核定位信号（NLS）加至T7RNA聚合酶的N端（5T7NLS：TCGCTAGCCACCATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAAACACGATTAACATCGCTAAGAAC;SEQ ID NO:26，NLS用粗体显示和3T7引物)。扩增的片段被命名为NLST7，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)上以形成pNLST7构建体。

pGFP质粒：Monster绿色荧光蛋白（GFP）质粒phMGFP购自Promega（麦迪逊，威斯康辛州）。通过RT-PCR用如下引物扩增GFP基因（GFP5：AAAACTGCAGGCCACCATGGGCGTGATCAAG;SEQ ID NO:27，PSt1识别位点和起始密码子用粗体显示;和GFP3:CCGCTCGGTACCTATTAGCCGGCCTGGCGGG;SEQ ID NO:28，Kpn1识别位点和终止密码子用粗体显示），并将其克隆到pcDNA3.1/Neo(+)质粒上。

对所有的质粒构建体进行至少三次测序以确认在克隆、定点突变或基因缺失后没有意外的突变或缺失。此外，确认了糖蛋白和Psi区域之间存在由7个腺苷残基组成的标记物序列，而不是野生型ERA基因组中观察到的8个残基组成的标记物序列。

实施例2：狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth（ERA）株的限定修饰

除上述的亲本ERA病毒株外，还使用本文所公开的反向遗传学系统开发了衍生病毒株。产生了数种示例性的修饰病毒，即ERA-（缺失整个psi-区域）、ERAgreen1（绿色荧光蛋白基因插入ERA病毒基因组psi-区域）、ERAgreen2（绿色荧光蛋白基因插入磷蛋白和基质蛋白基因间区域）、ERA2g（在psi-区域包含额外的糖蛋白拷贝）、ERAg3（糖蛋白第333位氨基酸处具有突变）、ERA2g3（在psi-区域具有额外拷贝的Aa333突变糖蛋白）、ERA-G（糖蛋白缺失）、ERAgm（在基因组中M和G基因互换）和ERAgmg（在重排的ERAgm构建体中有两个拷贝的G），这些衍生物如图3中示例性所示。通过优化如所述的生长条件，在组织培养瓶和生物反应器两者中都可以得到滴度在10⁹至10¹⁰ffu/ml之间的所有这些拯救病毒。

反向遗传学系统中基因缺失和定点诱变

狂犬病病毒ERA基因组Psi区域的缺失

按照如下将狂犬病病毒ERA基因组完整Psi-区域缺失：使用pTMF作为模板通过PCR用如下引物扩增3’Δψ片段（5Δψ：CCCTCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACATTAGATCAGAAG;SEQ ID NO:29,Pst1和Kpn1识别位点用粗体显示；和Le3-Blp引物），并将其克隆到pCR-BluntII-TOPO载体（Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）用于构建pPΔ5ψ质粒。使用相同的模板通过PCR用如下引物扩增5’Δψ片段（SnaB5：ATGAACTTTCTACGTAAGATAGTG;SEQ ID NO:30，SnaBl识别位点用粗体显示;和3Δψ:CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCAAAAAGAACCCCCCAAG;SEQ ID NO:31,Pst1识别位点用粗体显示），并随后将其克隆到上述pPΔ5ψ质粒以完成pPΔψ质粒的构建。用从被SnaB1和Pst1限制性内切酶消化的pPΔψ质粒回收的片段取代pSKF构建体中的对应部分以制备pSKFΔψ质粒。将被Nhe1和Not1从pSKFΔψ质粒上消化的包含ERA基因组cDNA的整个DNA片段再克隆至pcDNA3.1/Neo(+)质粒以完成pTMFΔψ的构建。为了验证缺失Psi的拯救株（被称为Era-），将覆盖Psi-区域的引物应用于来自ERA感染的BSR细胞的总RNA的RT-PCR。对应于Psi区域的400bp片段只能从rERA病毒扩增，而不能从ERA扩增。序列数据确认了Psi区域的完全缺失。

狂犬病病毒ERA基因组中糖蛋白基因的缺失

使用pSKF为模板通过PCR用如下引物扩增5’gΔψ片段（SnaB5引物和3Δg：CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCACATCCAAGAGGATC;SEQID NO:32）。用SnaB1和Pst1限制性内切酶消化后，将回收片段克隆到pSKFΔψ载体上以替代其对应部分。使用相同的模板通过PCR用如下引物扩增3’gΔψ片段（5Δg：CCTCTGCAGTTTGGTACCTTCAAAAAAACCTGGGTTCAATAG;SEQ IDNO:33和Le3-Blp引物），并随后将其克隆至修饰的pSKFΔψ上来替代其对应部分。将用SnaB1和Blp1限制性内切酶从这个没有G基因的pSKFΔψ切割回收的最终片段再次克隆到pcDNA3.1/Neo(+)质粒上以形成pTMFΔg构建体用于病毒拯救。

糖蛋白基因定点诱变：

如之前所述（Wu et al.,J.Virol.76:4153-4161,2002）进行定点诱变，以在糖蛋白氨基酸位置第333位引入从AGA到GAG的三核苷酸改变。诱变反应中的引物是M5G引物：CTCACTACAAGTCAGTCGAGACTTGGAATGAGATC(SEQ ID NO:34，3个突变的核苷酸用粗体表示)和M3G引物:GACTGACTTTGAGTGAGCATCGGCTTCCATCAAGG(SEQ ID NO:35)。对于恢复株（ERAg3），以引物5G和3G进行RT-PCR后，通过测序来确认氨基酸位置第333位（aa333）处从AGA到GAG的三核苷酸改变。在DNA测序确认后，将突变的G克隆回pTMF质粒以制备pTMFg3构建体用于病毒恢复。由该突变的G基因编码的糖蛋白由SEQ ID NO:7表示。

将外源ORF整合至ERA狂犬病病毒基因组

为了在RABV中表达外源ORF，形成了具有Pst1和Kpn1识别位点的额外转录单元，并将其分别整合至Psi或P-M基因的基因间区域。简言之，为了在Psi区域形成额外的转录单元，除5’Δψ片段扩增步骤之外进行了相同的步骤，3Δψ引物变成3Δψcis：CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTAGTTTTTTTTCATGATGAACCCCCCAAGGGGAGG(SEQIDNO:36).无Psi-区域、但具有额外转录单元的最终构建体被命名为pMTFΔψcis。将GFP、ERA G或第333位氨基酸残基处突变的G分别克隆到这个转录单元以形成pMTFgfp1、pMTF2g、pMTFg3、pMTF2g3构建体，用于病毒拯救。

为了将额外的转录单元整合至P-M基因间区域，使用pMTF作为模板用如下引物扩增cisp5片段：cis55：GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCTGTTAAG(SEQ ID NO:37),cis53:CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTACTTTTTTTCATGTTGACTTTAGGACATCTCGG(SEQ ID NO:38),并将其克隆至pMTF质粒替代其对应部分。以如下引物以相似方式扩增和克隆cisp3片段：cis35：CCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACAGGCAACACCACTGATAAAATGAAC(SEQ ID NO:39)和Cis33:CCTCCCCTTCAAGAGGGCCCCTGGAATCAG(SEQ ID NO:40).cisp5和 cisp3片段组装在一起后，最终构建体被命名为pMTFcisp，用于接收ORF。包括GFP基因的重组构建体被命名为pTMFgfp2，用于病毒恢复。

为产生其中糖蛋白编码序列与基质蛋白编码序列反向的ERA衍生物（命名为ERAgm），如上文所述将糖蛋白基因缺失。然后将所述G基因（如上文所公开扩增的）插入到P基因和M基因之间，得到顺序为N-P-G-M-L的狂犬病病毒基因组。类似地，应用相同的策略来产生ERAg3m衍生物，其中所述糖蛋白通过替换经上文所述定点诱变产生的G基因而在第333位氨基酸残基处具有三核苷酸突变（从AGA到GAG）。为了产生ERAgmg构建体，将额外拷贝的糖蛋白基因插入到P基因和M基因之间，并制备基因组顺序为N-P-G-M-G-L的狂犬病病毒。

将额外的转录单元进行修饰并整合至ERA基因组的两个不同区域，即psi-区域和P-M基因间区域。当异源的ORF被整合至这些转录单元（分别命名为trans1和trans2）时，导致编码产物的高效产生。转录单元的序列是：CTAACACCCCTCCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAA(SEQID NO:41,Pst1和Kpn1用下划线显示）。

实施例3：亲本病毒和衍生病毒的恢复

本实施例描述了使用本文所公开的反向遗传学系统恢复亲本ERA病毒和示例性衍生物。根据制造商建议的方法，在六孔板中以3μg/孔的病毒全长转录质粒pTMF（分别为pTMFΔψ、pTMFg3、pTMF2g、pTMF2g3、pTMFgfp1、pTMFgfp2、pTMFΔg、pTMFgm或pTMFgmg）与5个辅助质粒：PTN（1μg/孔）、PMP（0.5μg/孔）、PML（0.5μg/孔）、PMG（0.5μg/孔）和pNLST7（1μg/孔）一起通过TransIT-LT1p试剂（Mirus，麦迪逊，威斯康辛州）在约80%汇合时转染BSR细胞。转染后四天，向每孔内加入1ml新鲜BSR细胞悬液（约5×10⁵个细胞），细胞在37℃、5%CO₂下孵育3天。收集细胞上清用于病毒滴定。

为了滴定恢复的病毒，以系列10倍稀释的病毒上清物在LAB-TEK八孔板（Naperville，IL）中感染单层BSR细胞，并将所述细胞在37℃、0.5%CO₂下孵育48小时。将细胞在80％的冷丙酮中在室温下固定1小时，并用FITC标记的狂犬病病毒N单克隆抗体（FITC-labeled anti-rabies virus N monoclonal antibody）在37℃下染色30分钟。在用PBS漂洗所述板三遍之后，使用直接荧光显微镜计数染色蚀斑。直接RABV荧光测定（DFA）的详情可在环球网cdc.gov/ncidod/dvrd/rabies/professional/publications/DFA-diagnosis/DFA_protocol.htm找到。

如表1中所示，来自培养的BSR细胞的除ERA-G之外的所有病毒都以高滴度被恢复。出人意料地，G基因与M基因重排和交换并不妨碍重组衍生ERA病毒的恢复。由于G蛋白的过度表达所导致的细胞死亡，RABV基因组中G基因的重排先前并不认为是可行的（Faberet al.,J.Virol.76:3374-3381,2002）。然而，这些结果表明，在ERA株内重排是可能的。因此，很可能RABV基因移动不仅对G基因来说是可能的，同时对其他基因也是可能的。

按照用于其他病毒构建体恢复的相同步骤，在质粒转染后拯救ERA-G（无G），但是病毒蚀斑非常有限，在第一轮转染后局限于局部区域。即使在37℃、5%CO₂下孵育一个星期后，拯救的病毒仍不能向附近的健康BSR细胞进一步扩散。用上述转染上清液感染正常BSR细胞在DFA检测中呈现单细胞染色，这表明恢复的病毒不能扩散。使用组成型表达ERA G的BHK细胞系扩增ERA-G病毒（PCT公开文本No.WO2007/047459）。通过间接免疫荧光测定筛选，表达G的BHK细胞池被选择出来并维持用于扩增ERA-G病毒。在BHK-G细胞系的帮助下，ERA-G病毒生长到10⁷ffu/ml。从ERA-G病毒感染的BHK-G细胞中提取总RNA用于以G基因探针进行的RNA印记分析。病毒基因组RNA中没有G基因，然而检测到了G mRNA，其来自感染的支持性BHK-G细胞。在纯化的ERA-G病毒基因组RNA中，用G探针没有检测到杂交信号，这表明在ERA基因组中G基因的缺失。

实施例4：拯救的ERA病毒及其衍生物在生物反应器中生长至高滴度

在口服疫苗开发中，通常需要高病毒滴度以在给药后诱发可靠的免疫。本实施例表明，ERA病毒和衍生物可以在生物反应器中以适用于商业规模的体积培养至高滴度。将所有10种拯救的ERA病毒在生物反应器CELLine AD1000（IBS Integra Bioscience，库尔，瑞士）中扩增到10⁷至10¹⁰FFU/ml的滴度。简言之，如上所述，以示例性反义基因组转录载体和辅助载体转染BSR细胞。在十分之一的生物反应器容器体积中10⁶个细胞/ml的浓度下，将细胞以每细胞1病毒粒子的感染复数接种。在37℃、5％CO₂下，将转染细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM中培养。上清液每3到5天收集一次，收集两到三次。与其他病毒相比，缺陷的ERA-G的生长较差，ERA-G只有10⁸ffu/ml（表1）。

表1常常质粒构建体和相应的拯救的病毒

实施例5：狂犬病病毒中来自额外转录单元的外源蛋白的表达

本实施例表明了来自插入到狂犬病病毒载体中的异源ORF的重组蛋白的表达。在这个实施例中，ERA病毒载体被用作狂犬病病毒载体的原型。为了构建ERA病毒作为接受ORF的载体，对N基因和P基因之间保守RABV转录单元进行修饰并引入到ERA基因组的两个不同位置：1）在psi区域（trans1），和2）位于P-M基因间区域（trans2）。所述转录单元被设计为具有两个独特的限制性内切酶识别位点以便于如下的异源多核苷酸序列的引入：(TTTTTTTGATTGTGGGGAGGAAAGCGACGTCAAACCATGGCAGCTCTTTTTTT;SEQ ID NO:42，Pst1和Kpn1位点用粗体显示)。

在第一实例中，GFP基因被克隆到这个单元中用于病毒恢复，因为当转染的BSR细胞还在孵育时，GFP的表达可以在UV显微镜下直接被观察到。通过带有470±20nm激发滤光片的荧光显微镜，GFP的表达是直接可见的。被ERAgreen2（GFP基因插入到RABV基因组P基因之后-trans2）感染的细胞在质粒转染三天后表现出明显的绿色蚀斑，而被ERAgreen1（GFP基因插入到“传统”ψ区域中G基因之后-trans1）的细胞直到转染后5天仍不能呈现明显的绿色蚀斑。在RABV基因组这两个位置引入的转录单元都是有功能的，但当GFP从trans2表达时，表达和积累明显更迅速。因此，这些结果还表明，来自异源ORF的表达水平可以通过选择将ORF克隆到其中的转录单元来调控。

在其他实例中，1）额外拷贝的ERA G;或2）在第333位具有氨基酸替换的额外拷贝的ERA G，被整合至ERA病毒基因组。成功拯救的病毒分别被命名为ERA2g和ERA2g3。因为对病毒G基因表达定量不切合实际，因此用G探针通过RNA印记确认了ERA2g和ERA2g3感染细胞中G表达水平的相对增加。简言之，将ERA G基因探针用地高辛DNA标记试剂盒（Dig DNA Labeling Kit）（罗氏，印第安纳波利斯，印第安纳州）标记，用地高辛核酸检测试剂盒（Dig Nucleic AcidDetection Kit）（罗氏，印第安纳波利斯，印第安纳州）成像并用密度分光光度法测量。恢复的病毒中串联的G基因也通过使用5G和3G引物的RT-PCR得到了证实。在1.5kb观察到了指示单G拷贝指示的主带。此外，在约3.0kb观察到了第二个较弱的条带，这表明串联排列的两个G。

这些结果表明，将转录单元引入到ERA基因组可以用来从引入的ORF表达不同异源蛋白。进一步地，异源ORF编码的蛋白的表达是通过ORF的插入位置来调节的。因此，ERA病毒是广泛适用的用于表达重组蛋白的载体。

实施例6：有三个糖蛋白基因的重组狂犬病病毒的构建与表征

本实施例描述了编码三个不同糖蛋白基因的重组ERA株狂犬病病毒的产生和特征。所述重组病毒——被称为ERA-3G——包括狂犬病病毒糖蛋白、莫克拉病毒（MOKV）糖蛋白和西高加索蝙蝠病毒（WCBV）糖蛋白。ERA-3G的克隆策略如图4所示。用于产生这种病毒的狂犬病病毒反向遗传学系统在上文的实施例中描述。ERA-3G包括糖蛋白基因内的减毒突变，所述突变可导致蛋白（SEQ ID NO:5）第433位氨基酸残基处从精氨酸到谷氨酸的改变。

将来自MOKV和WCBV的G基因通过使用来自病毒感染细胞的病毒基因组RNA作为模板的RT-PCR克隆到ERA主链上。下列引物用于扩增所述糖蛋白基因：MokolaG5-CGACTGCAGATGAATATACCTTGCTTTGTTGTGATTC(SEQ IDNO:43)MokolaG3-CGTGGTACCTCATGTACCTGGAAGCCCTTTATAGGACTC(SEQID NO:44)WCBVG5-GATCTGCTAGCAATGGCTTCCTACTTTGCGTTG(SEQ ID NO:45)WCBVG3-TTCAATGGTACCTTATTGGGCAGTTTGTCCCTT(SEQ ID NO:46)

通过测序确认了扩增的MOKV（SEQ ID NO:47）和WCBV（SEQID NO:49）的G基因。两个额外转录单元（各自具有SEQ ID NO：42的序列）被合成并被引入磷蛋白（P）和基质蛋白（M）之间的基因连接区，以及G和RNA依赖性RNA聚合酶（L）之间的基因连接区（图4）。MOKV G基因被克隆至ERA基因组主链上P和M之间的基因连接区，WCBV G被克隆至主链上G和L之间的基因连接区。

使用实施例3中所述的方法，通过将上述构建体转染至BSR细胞来恢复重组病毒。转染后约5-7天，将BSR细胞固定用于使用FITC缀合的抗狂犬病的抗体（FITC-conjugated anti-rabies antibodie）的DFA染色。

所恢复的ERA-3G病毒以在BSR细胞中的一步生长曲线表征。在感染24、48、72、96和120小时后评估病毒滴度。在72、96和120小时时间点，生物反应器中的病毒滴度范围为从10⁸至10⁹蚀斑形成单位（ffu）/ml。

然后，将ERA-3G病毒在仓鼠模型中测试，以确定接种ERA-3G疫苗是否提供抗RABV、LBV、MOKV和/或WCBV激发的保护。用ERA-3G、RabAvert^TM（Chiron公司，埃默里维尔，加利福尼亚州）或IMRAB^TM（Merial，德卢斯，乔治亚州）接种9只仓鼠（肌肉注射）。RabAvert^TM在0、7和14天给药，而ERA-3G和IMRAB^TM在0天给药。在第22天，用RABV、LBV、MOK或WCBV激发动物。对照动物不接受疫苗。激发实验的结果如表2所示：

表2.暴露前接种并以数种狂犬病病毒属病毒肌肉注射激发后，仓鼠的存活率

组	RABV(I-151)	LBV(SA)	MOK(SA)	WCBV
					RabAvert^TM	9/9	0/9	0/9	5/9
IMRAB^TM	9/9	1/9	0/9	3/9
					ERA-3G	9/9	1/9	9/9	9/9
对照	0/9	0/9	0/9	1/9

这些结果表明，ERA-3G提供了抗RABV、MOK和WCBV的完整保护。相反，现在可用的疫苗RabAvert^TM和IMRAB^TM仅提供抗RABV的保护。

对于动物疫苗的开发，ERA-3G将适用于在鸡胚成纤维细胞（CEF）和Vero细胞中生长。据认为，ERA-3G在用于动物疫苗开发的BSR细胞中将生长到范围为10⁸至10⁹ffu/ml的高滴度。对于人疫苗开发，ERA-3G将适应于CEF细胞和Vero细胞。据认为，在适应后，ERA-3G在CEF细胞和BSR细胞中的滴度将与在BSR细胞中病毒生长滴度相当。ERA-3G的纯度将被验证，并且将制备种子病毒用于工业生产。将使用标准的PCR方法检测潜在的支原体污染。

实施例7：有四个糖蛋白基因的重组狂犬病病毒的构建与表征

本实施例描述了编码三个不同糖蛋白基因的重组ERA株狂犬病病毒的产生和表征。所述重组病毒——被称为ERA-4——包括狂犬病病毒糖蛋白、拉各斯蝙蝠病毒（LBV）糖蛋白、MOKV糖蛋白和WCBV糖蛋白。ERA-4的克隆策略如图5所示。用于产生这种病毒的狂犬病病毒反向遗传学系统在上文的实施例中描述。ERA-4包括G基因内的减毒突变，所述突变可导致蛋白（SEQ ID NO:5）第433位氨基酸残基处从精氨酸到谷氨酸的改变。

将来自LBV、MOKV和WCBV的G基因通过使用来自病毒感染细胞的病毒基因组RNA作为模板的RT-PCR克隆到ERA主链上。下列引物用于扩增所述糖蛋白基因：LagosG5-CGACTGCAGATGAGTCAACTAAATTTGATACCCTTTTTC(SEQID NO:51)LagosG3-CCGTACGTATCAGACATTAGAGGTACCCTTATAAGATTCCCA(SEQ ID NO:52)MokolaG5-CGACTGCAGATCAATATACCTTGCTTTGTTGTGATTC(SEQ IDNO:43)MokolaG3-CGTGGTACCTCATGTACCTGGAAGCCCTTTATAGGACTC(SEQID NO:44)WCBVG5-CATCTGCTAGCAATGGCTTCCTACTTTGCGTTG(SEQ ID NO:45)WCBVG3-TTCAATGGTACCTTATTGGGCAGTTTGTCCCTT(SEQ ID NO:46)

通过测序确认了扩增的LBV（SEQ ID NO:53）、MOKV（SEQ IDNO:47）和WCBV（SEQ ID NO:49）的G基因。三个额外转录单元（各自具有SEQ ID NO：42的序列）被合成并被引入N基因和P基因、P基因和M基因以及G基因和L基因之间的基因连接区（图5）。LBV G被克隆至ERA基因组主链上N和P之间的基因连接区，MOKVG被克隆至ERA基因组主链上P和M之间的基因连接区，WCBV G被克隆至ERA基因组主链上G和L之间的基因连接区。

所恢复的ERA-4G病毒以在BSR细胞中的一步生长曲线表征。在感染24、48、72、96和120小时后确定病毒滴度。结果如下表3所示。

表3.ERA-4G在BSR细胞中的生长

时间点（h)	24	48	72	96	120
						滴度(ffu/ml)	1×10³	5×10³	1.2×10³	1.3×10⁷	3.2×10⁵

ERA-4G病毒将在仓鼠模型中测试，以确定以ERA-4G疫苗接种是否提供抗狂犬病病毒属病毒RABV、LBV、MOKV和WCBV激发的保护。如实施例6中对于ERA-3G所述将进行疫苗接种和激发实验。

对于动物疫苗开发，ERA-4G将适用于在鸡胚成纤维细胞（CEF）和Vero细胞中生长。据认为，ERA-4G在用于动物疫苗开发的BSR细胞中将生长到范围为10⁸至10⁹ffu/ml的高滴度。对于人疫苗开发，ERA-4G将适应于CEF细胞和Vero细胞。据认为，在适应后，ERA-4G在CEF细胞和BSR细胞中的滴度将与在BSR细胞中病毒生长滴度相当。ERA-4G的纯度将被验证，并且将制备种子病毒用于工业生产。将使用标准的PCR方法检测潜在的支原体污染。

考虑到本发明所公开的的原理可以适用的许多可能的实施方案，应所述认识到，示出的实施方案仅仅是本发明的优选实施例，而不应被视为对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由以下权利要求限定。因此，我们以落入这些权利要求的范围和精神之内的全部来要求本发明。

Claims

1.一种重组狂犬病病毒，其中，所述狂犬病病毒的基因组包括狂犬病病毒核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、RNA依赖性RNA聚合酶（L）和糖蛋白（G）的基因以及至少两个不同的异源狂犬病病毒属病毒糖蛋白基因，其中所述狂犬病病毒属病毒选自拉各斯蝙蝠病毒（LBV）、莫克拉病毒（MOKV）、杜文海格病毒（DUVV）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-1（EBLV-1）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒-2（EBLV-2）、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（ABLV）、Aravan病毒（ARAV）、Khujand病毒（KHUV），Irkut病毒（IRKV）和西高加索蝙蝠病毒（WCBV）。

2.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV和WCBV。

3.权利要求1的重组狂犬病病毒，所述狂犬病病毒包括两个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。

4.权利要求3的重组狂犬病病毒，其中所述两个异源G基因是MOKV G基因和WCBV G基因。

5.权利要求4的重组狂犬病病毒，其中所述MOKV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同，所述WCBVG基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同。

6.权利要求4的重组狂犬病病毒，其中所述MOKV G基因包括SEQ ID NO:47的核苷酸序列，所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列。

7.权利要求1的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒包括三个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。

8.权利要求7的重组狂犬病病毒，其中所述三个异源G基因是LBV G基因、MOKV G基因和WCBV G基因。

9.权利要求8的重组狂犬病病毒，其中所述MOKV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同；WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同；LBVG基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:53的核苷酸序列至少95%相同。

10.权利要求8的重组狂犬病病毒，其中所述MOKV G基因包括SEQ ID NO:47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列；所述LBV G基因包括SEQ ID NO:53的核苷酸序列。

11.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间。

12.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒G基因和L基因之间。

13.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间。

14.权利要求3的重组狂犬病病毒，其中所述异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间以及狂犬病病毒G基因和L基因之间。

15.权利要求7的重组狂犬病病毒，其中所述异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间、狂犬病病毒P基因和M基因之间以及狂犬病病毒G基因和L基因之间。

16.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中所述基因组来自狂犬病病毒ERA株。

17.权利要求16的重组狂犬病病毒，其中所述ERA株基因组的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:1至少95%相同的序列。

18.权利要求16的重组狂犬病病毒，其中所述ERA株基因组的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1。

19.权利要求1的重组狂犬病病毒，其中所述狂犬病病毒糖蛋白在第333位氨基酸包括Glu（SEQ ID NO:5）。

20.一种载体，所述载体包括全长狂犬病病毒反义基因组DNA，其中所述反义基因组DNA包括狂犬病病毒N基因、P基因、M基因、L基因和G基因，和至少两个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因，其中所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV和WCBV。

21.权利要求20的载体，其中所述狂犬病病毒属病毒选自LBV、MOKV和WCBV。

22.权利要求20的载体，所述载体包括两个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。

23.权利要求22的载体，其中所述两个异源G基因是MOKV G基因和WCBV G基因。

24.权利要求23的载体，其中所述MOKV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同，所述WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同。

25.权利要求23的载体，其中所述MOKV G基因包括SEQ ID NO:47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列。

26.权利要求20的载体，所述载体括三个不同的异源狂犬病病毒属病毒G基因。

27.权利要求26的载体，其中所述三个异源G基因是LBV G基因、MOKV G基因和WCBV G基因。

28.权利要求27的载体，其中所述MOKV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同；所述WCBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同；所述LBV G基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:53的核苷酸序列至少95%相同。

29.权利要求27的载体，其中所述MOKV G基因包括SEQ ID NO:47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列；并且所述LBV G基因包括SEQ ID NO:53的核苷酸序列。

30.权利要求20的载体，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间。

31.权利要求20的载体，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒G基因和L基因之间。

32.权利要求20的载体，其中一个异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间。

33.权利要求22的载体，其中所述异源G基因位于狂犬病病毒P基因和M基因之间以及狂犬病病毒G基因和L基因之间。

34.权利要求26的载体，其中所述异源G基因位于狂犬病病毒N基因和P基因之间、狂犬病病毒P基因和M基因之间以及狂犬病病毒G基因和L基因之间。

35.权利要求20的载体，其中所述反义基因组DNA来自狂犬病病毒ERA株。

36.权利要求35的载体，其中所述ERA株反义基因组DNA的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:1至少95%相同的序列。

37.权利要求35的载体，其中所述ERA株反义基因组DNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1。

38.一种细胞，所述细胞包含权利要求20-37任一项中的载体。

39.一种组合物，所述组合物包括权利要求1-19任一项的重组狂犬病病毒和可药用载体。

40.权利要求39的组合物，所述组合物还包括佐剂。

41.权利要求1-19任一项的重组狂犬病病毒在制备用于在受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的药剂中的用途。

42.权利要求39或40中的组合物在制备用于在受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的药剂中的用途。

43.权利要求41或42的用途，其中在所述受试者中抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答保护所述受试者免受至少三种不同基因型的狂犬病病毒属病毒的感染。

44.权利要求41或42的用途，其中在所述受试者中抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答保护所述受试者免受至少四种不同基因型的狂犬病病毒属病毒的感染。

45.权利要求1-19任一项的重组狂犬病病毒，用于在受试者中诱发抗狂犬病病毒属病毒的免疫应答的方法中。