KR101897368B1 - 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 리사바이러스 검사 키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 리얼타임 PCR로 검출가능하게 하는 특유한 4종의 프라이머들의 조합(3종의 정방향 프라이머들과 1종의 역방향 프라이머의 조합)과, 특유한 2종의 프로브들의 조합을 제공한다. 본 발명에 따르면, 최소한의 프라이머들을 사용하여 한번의 검사로 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 신속하면서도 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 검사 비용이 저렴할 뿐만아니라 지금까지 국내에서 발견되지 않은 리사바이러스의 감염자를 신속하고 정확하게 확인하여 리사바이러스의 국내 전파의 조기 차단에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용한 리사바이러스 검사 키트 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 최소한의 프라이머들을 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 지금까지 알려진 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 검사로 검출할 수 있는 판-리사바이러스(pan-lyssavirus) 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 특유한 4종의 프라이머들의 조합을 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 의심 환자의 검체로부터 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 검사로 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있는 판-리사바이러스 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 최소한의 프라이머들을 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 검사 비용이 저렴할 뿐만아니라 증폭 오류 없이 신속하게 판-리사바이러스 검사를 수행할 수 있는 기술을 제공함으로써, 지금까지 국내에서 발견되지 않은 리사바이러스의 감염자를 신속하고 정확하게 확인하여 리사바이러스의 국내 전파의 조기 차단에 기여할 수 있는 판-리사바이러스 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
리사바이러스(lyssavirus)는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae)에 속한 RNA 바이러스(ssRNA 바이러스)로 광견병(공수병) 바이러스(Rabies virus)를 포함하여 현재까지 총 14종이 확인되었다. 리사바이러스는 인간 뿐만 아니라 포유동물을 포함하여 척추동물에 감염되며, 일반적으로 리사바이러스의 숙주는 박쥐로 알려져 있다. 리사바이러스의 감염은 주로 이환된 동물로부터의 교상에 의해 상처부위에서 체내로 침입하여 일어나며, 인간에게 감염되면 두통, 발열, 정신착란, 혼수 증상 등이 나타나고 수일 내에 사망할 수 있다.
이와 같은 치명적인 리사바이러스의 숙주인 박쥐는 리사바이러스 뿐만 아니라 코로나바이러스(coronavirus), 한타바이러스(hantavirus) 등 다양한 바이러스를 보유하고 있으며, 사스(SARS)와 메르스(MERS)와 같은 신종 바이러스의 전파 매개체로 여겨지고 있다. 박쥐는 포유동물 중 비행을 할 수 있어 광범위한 지역에 바이러스를 전파할 수 있으며, 동굴 등 협소한 공간에서 다수의 개체가 생활하고 다양한 바이러스에 대한 대응할 수 있는 면역체계를 가지고 있어 다양한 바이러스의 전파 매개체로 작용할 수 있다.
지금까지의 연구에 따르면, 리사바이러스(lyssavirus)는 아라반 바이러스(Aravan virus), 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스(Australian bat lyssavirus), 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus), 두벤하게 바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 리사바이러스-1(European bat lyssavirus 1), 유럽 박쥐 리사바이러스-2(European bat lyssavirus 2), 이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus), 이르쿠트 바이러스(Irkut virus), 후잔트 바이러스(Khujand virus), 라고스 박쥐 바이러스(Lagos bat virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 광견병(공수병) 바이러스(rabies virus), 시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus) 및 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스(West Caucasian bat virus)의 14 종이 알려져 있으며, 광견병(공수병) 바이러스(rabies virus)를 제외하고는 아직 국내에서 보고된 적은 없다.
그러나, 일부 리사바이러스는 유라시아(Eurasia) 지역에서도 발견되어 지리학적으로 국내에서도 존재할 수 있는 가능성을 배제할 수 없게 되었고, 광견병(공수병) 바이러스 이외의 리사바이러스가 국내에 전파될 경우 국민 건강의 위협과 그 사회적 파장 및 혼란은 매우 크다고 할 수 있다. 이러한 관점에서 리사바이러스 감염 의심 증상이 나타난 경우, 검체 내의 리사바이러스 존재 유무를 신속하면서도 정확하게 확인하는 기술의 개발이 요구되는데, 특히 광견병(공수병) 바이러스 뿐만 아니라 앞서 언급한 바와 같이 현재까지 알려진 모든 리사바이러스를 확인할 수 있는 판-리사바이러스(pan lyssavirus) 검출방법이 개발되어야 한다.
광견병(공수병) 바이러스 감염의 진단을 위해, 일반적으로는 감염 의심 환자의 혈액과 뇌척수액에서 광견병(공수병) 바이러스에 특이적인 항체를 검사하거나, 머리털 부분의 피부조직을 검사하거나, 침과 같은 분비물에서 광견병(공수병) 바이러스의 핵산검출검사를 수행하고 있다. 그러나, 항체 검사는 환자에게 항체가 생성되지 않은 경우 진단이 불가능한 한계가 있을 뿐만아니라 뇌척수액을 뽑는 과정에서 환자에게 심한 고통을 주고 부작용도 발생할 위험성이 있으며, 피부조직 검사는 검사의 정확성이 떨어지는 문제가 있다.
이러한 문제점을 감안하여 바이러스가 가지는 특정 유전자 서열을 증폭하여 검사하는 유전자 검사, 예를 들어 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR)이 주목을 받고 있으나, 종래의 RT-PCR에 의한 리사바이러스 진단법들은 광견병(공수병) 바이러스의 검사만이 가능하였고, 앞서 언급한 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 PCR로 검사할 수 있는 판-리사바이러스의 진단방법은 전무한 상태이며, 현재까지는 10종의 리사바이러스의 검출이 가능한 것으로 알려져 있다.
이와 관련하여 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0060830호에서는 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)을 이용하여 광견병(공수병) 바이러스를 민감하고 신속하게 검출할 수 있는 기술을 개시하고 있으나, 이는 광견병(공수병) 바이러스 1종만의 검출이 가능한 기술이며 앞서 논의된 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 PCR로 검사할 수 있는 판-리사바이러스 검사법에 관한 것이 아니었다.
또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0060830호에서는 광견병(공수병) 바이러스 1종을 검출하기 위해 뉴클레오캡시드의 6곳의 표적 서열에 대한 6가지의 프라이머를 사용하고 있는데, 이를 응용하여 14종의 리사바이러스 검출법을 개발할 경우 이론적으로 84종의 프라이머들이 필요하게 된다. 즉, 종래의 뉴클레오캡시드의 CDS(coding DNA sequence)를 단순히 이용하여 프라이머를 설계하는 방식은 문제가 있다. 뿐만아니라, 14종 리사바이러스의 확인을 위해 1종 마다 PR-PCR을 수행하면 시간이 오래 걸리고 검사 비용이 증가하기 때문에, 신속한 검사 및 검사의 효율성을 높이기 위해서는 한번의 검사로 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 검출할 수 있는 멀티플렉스 RT-PCR 검사법이 구현되어야 한다.
따라서, 한번의 검사로 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 신속하고 정확하게 검사할 수 있는 판-리사바이러스 RT-PCR 검사방법이 개발된다면, 지금까지 국내에서 발견되지 않은 리사바이러스의 감염자를 신속하고 정확하게 확인하고, 이에 따라 신속한 방역 조치를 강구할 있어 리사바이러스의 국내 전파에 의한 국민 건강의 위협과 그 사회적 파장 및 혼란을 미연에 방지할 수 있을 것이다.
그러나, 종래기술에 따라 14종의 리사바이러스를 멀티플렉스 RT-PCR로 검사하기 위해서는 많은 종류의 프라이머(예를 들어 상기 종래기술에 따르면 84종의 프라이머)를 이용하여 검체 내의 리사바이러스 주형을 증폭해야 하는 문제가 있다. 프라이머의 종류 및 양이 증가함에 따라 검사 비용이 증가할 뿐만아니라 프라이머들의 이량체의 생성 확률이 높아진다. 프라이머들의 이량체가 생성되면 리사바이러스의 주형 만이 증폭되는 것이 아니라 프라이머들의 이량체들이 증폭되어 PCR 결과 판독에 악영향을 주게 되고, 리사바이러스가 없는 경우에도 오류 증폭에 의해 위양성으로 판정하게 될 가능성이 높은 문제가 있다.
따라서, 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 최소한의 프라이머들을 사용하여 한번의 검사로 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 신속하면서도 정확하게 검출할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 판-리사바이러스 검사 키트 및 방법을 안출하였다.
본 발명은 최소한의 프라이머들을 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 지금까지 알려진 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 검사로 검출할 수 있는 판-리사바이러스 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 특유한 4종의 프라이머들의 조합을 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 의심 환자의 검체로부터 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 검사로 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있는 판-리사바이러스 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 최소한의 프라이머들을 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 검사 비용이 저렴할 뿐만아니라 증폭 오류 없이 신속하게 판-리사바이러스 검사를 수행할 수 있는 기술을 제공함으로써, 지금까지 국내에서 발견되지 않은 리사바이러스의 감염자를 신속하고 정확하게 확인하여 리사바이러스의 국내 전파의 조기 차단에 기여할 수 있는 판-리사바이러스 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 리얼타임 PCR로 검출가능하게 하는 특유한 4종의 프라이머들의 조합(3종의 정방향 프라이머들과 1종의 역방향 프라이머의 조합)과, 특유한 2종의 프로브들의 조합을 안출하였고, 이를 바탕으로 특이도 및 민감도 높게 판-리사바이러스 검사가 가능한 리얼타임 PCR 기술을 고안하기에 이르렀다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "검체"란 감염 의심 환자의 뇌조직, 혈액, 뇌척수액, 타액, 콧물, 눈물 외에도 리사바이러스의 유전자 검출이 가능한 각종 시료, 예를 들어 숙주 동물 및 의심 환자에 교상을 입힌 동물의 타액, 뇌척수액, 혈액, 조직, 세포 등도 포함하는 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "유전자 샘플"이란 RNA, DNA, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 생성된 cDNA, pre-PCR (예비 PCR)을 통해 증폭된 DNA 또는 cDNA 등을 포함하는 광의의 개념으로 사용된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "합성 유전자 서열"은 지금까지 알려진 14종의 리사바이러스의 RNA 유전자 서열 뿐만아니라 RNA 유전자로부터 생성된 cDNA 서열로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 이러한 리얼타임(real-time) PCR은 SYBR 그린(SYBR Green)을 사용하는 방법과 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로 나누어진다.
SYBR 그린(SYBR green) 기법은 리얼타임 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어들어가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 검출하여 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 또한, 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 리얼타임 PCR 기법은 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로서, 이중 표지된 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 표적 유전자의 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고, 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 본 발명에서는 상기 방법 이외에 TaqMan 프로브법 등 당업계에 알려진 리얼타임 PCR이 적용가능함은 물론이다.
본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법에서 사용되는 리얼타임 PCR용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 리얼타임 PCR용 프라이머 세트는 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하고, 지금까지 알려진 14종의 리사바이러스, 즉 아라반 바이러스(Aravan virus), 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스(Australian bat lyssavirus), 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus), 두벤하게 바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 리사바이러스-1(European bat lyssavirus 1), 유럽 박쥐 리사바이러스-2(European bat lyssavirus 2), 이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus), 이르쿠트 바이러스(Irkut virus), 후잔트 바이러스(Khujand virus), 라고스 박쥐 바이러스(Lagos bat virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 광견병(공수병) 바이러스(rabies virus), 시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus) 및 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스(West Caucasian bat virus) 전체를 검출가능하게 한다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트를 제공한다. 본 발명의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트는, 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합, 그리고 서열번호 5의 프로브와 서열번호 6의 프로브의 조합을 포함한다.
전술한 바와 같은 본 발명의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트는, 지금까지 알려진 14종의 리사바이러스, 즉 아라반 바이러스(Aravan virus), 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스(Australian bat lyssavirus), 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus), 두벤하게 바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 리사바이러스-1(European bat lyssavirus 1), 유럽 박쥐 리사바이러스-2(European bat lyssavirus 2), 이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus), 이르쿠트 바이러스(Irkut virus), 후잔트 바이러스(Khujand virus), 라고스 박쥐 바이러스(Lagos bat virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 광견병(공수병) 바이러스(rabies virus), 시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus) 및 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스(West Caucasian bat virus) 전체를 한번의 리얼타임 PCR로 검출할 수 있다.
본 발명의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트에 있어서, 서열번호 1의 정방향 프라이머는 이코마 리사바이러스 및 시모니 박쥐 바이러스를 제외한 리사바이러스를 검출하는데 사용되고, 서열번호 3의 정방향 프라이머는 이코마 리사바이러스를 검출하는데 사용되며, 서열번호 4의 정방향 프라이머는 시모니 박쥐 바이러스를 검출하는데 사용된다. 서열번호 2의 역방향 프라이머는 상기 14종의 리사바이러스 모두를 검출하는데 사용된다.
또한, 서열번호 5의 프로브는 아라반 바이러스, 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스, 두벤하게 바이러스, 유럽 박쥐 리사바이러스-1, 유럽 박쥐 리사바이러스-2, 이르쿠트 바이러스, 후잔트 바이러스, 광견병(공수병) 바이러스 및 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스를 검출하는데 사용되고, 서열번호 6의 프로브는 라고스 박쥐 바이러스(Lagos bat virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus), 이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus) 및 시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus)를 검출하는데 사용된다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트는, 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트에 있어서, 상기 표지물질은 서열번호 5의 프로브의 한쪽 말단과, 서열번호 6의 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 리사바이러스 RNA 유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법은, 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와, 전술한 바와 같은 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와, 리얼타임 PCR 결과에 기초하여 상기 검체 내의 리사바이러스를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법은,
증폭 전, 리사바이러스 RNA 유전자의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 전술한 바와 같은 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트와 리사바이러스 RNA 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 리사바이러스 RNA 유전자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 리사바이러스 RNA 유전자를 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 리사바이러스 감염 여부를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법에 있어서, 상기 표지물질은 서열번호 5의 프로브의 한쪽 말단과, 서열번호 6의 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 리사바이러스 RNA 유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX, TET 및 TAMRA 등과 같은 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3'말단은 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2 등), EBQ, ZEN-IBFQ 등과 같은 소광물질로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따르면, 최소한의 프라이머들을 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 지금까지 알려진 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 검사로 검출할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 특유한 4종의 프라이머들의 조합, 즉 3종의 정방향 프라이머들 및 1종의 역방향 프라이머의 조합을 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 의심 환자의 검체로부터 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 검사로 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 최소한의 프라이머를 사용한 리얼타임 PCR을 이용하여 검사 비용이 저렴할 뿐만아니라 증폭 오류 없이 신속하게 판-리사바이러스 검사를 수행할 수 있는 기술을 제공함으로써, 지금까지 국내에서 발견되지 않은 리사바이러스의 감염자를 신속하고 정확하게 확인하여 리사바이러스의 국내 전파의 조기 차단에 기여할 수 있다.
도 1은 실시예 2에 따라 합성된 모콜라 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 2는 실시예 2에 따라 합성된 유럽 박쥐 리사바이러스-1 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 3은 실시예 2에 따라 합성된 라고스 박쥐 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4는 실시예 2에 따라 합성된 이르쿠트 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 5는 실시예 2에 따라 합성된 유럽 박쥐 리사바이러스-2 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 6은 실시예 2에 따라 합성된 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 7은 실시예 2에 따라 합성된 두벤하게 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 8은 실시예 2에 따라 합성된 시모니 박쥐 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 9는 실시예 2에 따라 합성된 광견병(공수병) 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 10은 실시예 2에 따라 합성된 아라반 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 11은 실시예 2에 따라 합성된 후잔트 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 12는 실시예 2에 따라 합성된 이코마 리사바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 13은 실시예 2에 따라 합성된 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 14는 실시예 2에 따라 합성된 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus) RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 2는 실시예 2에 따라 합성된 유럽 박쥐 리사바이러스-1 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 3은 실시예 2에 따라 합성된 라고스 박쥐 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4는 실시예 2에 따라 합성된 이르쿠트 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 5는 실시예 2에 따라 합성된 유럽 박쥐 리사바이러스-2 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 6은 실시예 2에 따라 합성된 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 7은 실시예 2에 따라 합성된 두벤하게 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 8은 실시예 2에 따라 합성된 시모니 박쥐 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 9는 실시예 2에 따라 합성된 광견병(공수병) 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 10은 실시예 2에 따라 합성된 아라반 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 11은 실시예 2에 따라 합성된 후잔트 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 12는 실시예 2에 따라 합성된 이코마 리사바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 13은 실시예 2에 따라 합성된 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 14는 실시예 2에 따라 합성된 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus) RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합을 사용하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 14종의 리사바이러스 표적유전자의 상동성 분석과 유전자 합성
알려진 14종의 리사바이러스의 표준서열 상동성 분석을 시행하였으며, 보존적인 서열범위를 포함하여 14종의 리사바이러스를 검출할 수 있도록 각각의 유전자 서열 일부를 합성하였다(하기 표 1 내지 표 14 참조).
유전자 합성은 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)의 아큐젠블록 서비스(AccuGeneBlock Service)를 이용하여 진행하였으며, 인비트로 전사(in vitro transcription)를 위해 5' 서열 상단에 SP6 프로모터(promotor) 서열을 첨가하였다(5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3'). 합성된 각 유전자의 상세한 서열정보는 다음과 같다.
| Rabies (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. AY956319) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAACAAAACCAAAGAAGAAGCAGACAGCGTCAATTGCAAAGCAAAAATGTAACACCCCTACAATGGATGCCGACAAGATTGTATTCAAAGTCAATAATCAGGTGGTCTCTTTGAAGCCTGAGATTATCGTGGATCAATATGAGTACAAGTACCC |
| Lagos (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. EU259198) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAGCAAAATCAGAGAAGATATAGACAGCGACAATGCGCTAAACAAAATGTAACACCCCTACAATGGATTCTGACAAGATTGTTTTCAAGGTTCATAATCAGATCGTATCTTTAAAGCCTGAGATTATATCAGACCAATATGAATATAAGTATCC |
| Mokola (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. KF155006) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAACAAAATCAAAGAAGACACAGATAGTATCAGTGACCTAAACAAAATGTAACACTCCTACAATGGAGTCTGACAAGATTGTGTTCAAGGTGAATAACCAAGTTGTTTCTTTGAAGCCTGAGGTCATATCAGATCAATATGAGTATAAATATCC |
| Duvenhage (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. EU293120) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAACAAAATCATAAAAGGGGCAAACATGTTCATTTGTATAACACAAATGTAACACCCCTACAATGGATGCTGAAAGAATTGTCTTTAAGGTCCGTAATCAGCTAGTCTCTGTAAAACCAGAGGTCATCTCTGATCAGTATGAGTACAAATATCC |
| EBL1 (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. EU293112) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAACAAAATCAAAAAAGGGGTAGACACGTTCATCGATAGAACAGAAATGTAACACCCCTACAATGGATGTTAACAGGGTTGTTTTTAAGGTCCATAATCAGTTGGTCTCGGTAAAACCTGAGGTGATTTCTGATCAGTATGAGTACAAATACCC |
| EBL2 (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. EU293114) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACGACAAAACCAGAAAAGGAATAGACACAATCGTCTGTAGAGCAGAAATGCAACACCCCTACAATGGATGCTGACAGAATTGTCTTCAAAGTCCATAATCAGTTGGTGTCTGTAAAGCCAGAAGTAATTGTAGATCAATATGAGTACAAATACCC |
| ABL (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. AF418014) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACGACAAAACCAGAGAAGGAGTAGACATGATCATTTGCGAAGCAAAAATGTAACACCCCTACAATGGATTCTGATAAGATTGTCTTTAAGGTCAACAATCAGTTGGTGTCTGTTAAGCCGGAGGTGATAGTAGATCAATATGAGTACAAATATCC |
| WCBV (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. EF614258) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAACAAAATCTTATAAGGACGAGAAAACCTCAGAGGGCAAAAACCAATGTAACACCCCTACAATGGATTCTGAACACATTGTGTTTAGGGTCAGAAATGAAATAGTGACTCTCAAACCCGAAGTGATATCCGACCAGTATGAATATAAATATCC |
| Aravan (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. EF614259) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACGACAAAAACAGAAAAGGAATAGACATAATCGCCTGCAGAATAGAAATGTAACACCCCTACAATGGATTCTGACAAGATTGTCTTCAAGGTCCATAACCAGTTGGTTTCAGTGAAGCCTGAGGTGATTACTGATCAGTATGAGTATAAGTATCC |
| Irkut (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. JX442979) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAACCAAATCACAAAAGGGGTAGACATGTTCATCTGTAGAACAGAAATGTAACACCCCTAAAATGGATTCTGACCGAATTGTCTTCAAAGTTCATAATCAGCTGGTTTCTCTAAGGCCAGAGGTTATTTCTGATCAGTATGAATACAAATACCC |
| Khujand lyssavirus (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. EF614261) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACGACAAAACCAGAAAAGGAATAGACATCATCGCCTGTAGAATAGGAATGTAACACCCCTACAATGGATGCCGACAGAATTGTCTTTAAAGTTAAGAATCAGTTGGTGTCTGTTAAGCCGGAGGTGATTGTTGATCAGTACGAGTACAAATACCC |
| Bokeloh bat lyssavirus (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. JF311903) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACGACAAAATCAGAAAAGGAGTAGACACACTCATCTACAGAGCAAAAAGGTAACACCCCTACAATGGACTCTGACAAGATTGTCTTCAAAGTCCATAATCAGTTGGTGTCTGTAAAGCCAGAGGTGATTGTTGATCAATATGAGTACAAATATCC |
| Ikoma (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. NC_018629) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAGCTAAAAACCAGAAGACAGAGAAGGAATCGAAGGGGAAAAGAAAAAGTAACACTTCTACAATGGATCCTGAACAAGTAGTTTTCAAGTCTCGGAAGGAAATTGTCGTGTTGAGACCAGAGGTGATATCGGATCAGTATGAATACAAATACCC |
| Shimoni (GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. GU170201) |
| ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG ACGCTTAACAGCAAAGTCAGAGAAGAGATAAGCCTCTACAATGAGCGAATCAAAATGTAACACCCCTACAATGGACTCTGAAAAGATTGTTTTCAAAGTTCGTAACCAGGTGGTGTCTTTGAAGCCAGAAATAATCTCTGATCAGTATGAGTACAAATATCC |
실시예 2: 인비트로 전사(In vitro transcription)를 이용한 RNA 양성대조물질(positive control RNA)의 합성
실시예 1에 따라 합성된 유전자를 이용하여 RNA 양성대조물질을 합성하였다. 각 리사바이러스 합성 유전자에 대한 각 RNA 양성대조물질은 써모피셔 사이언티픽社(Thermo fisher scientific)(미합중국 매사추세츠주 소재)의 메가스크립트 SP6 인비트로 전사 키트(MEGAscript SP6 in vitro transcription kit)를 이용하여 합성였으며 합성과정은 상기 제조사에 의해 제공되는 프로토콜에 따라 진행하였다.
각각의 합성된 RNA는 상기 제조사의 젠제트 RNA 정제 키트(GeneJET RNA Purification kit)를 이용하여 정제하였고, 정제된 RNA는 동사의 큐비트 2.0 플루오로미터(Qubit 2.0 fluorometer)를 이용하여 정량하였다. 또한, 동사의 써모사이언티픽 웹 툴(Thermo Scientific Web Tools)을 이용하여 카피수를 계산하였다. 그리고, 총 14종의 리사바이러스의 RNA 양성대조물질을 105 copies/μL가 되도록 준비하여 후속의 리얼타임 PCR 실험의 주형으로 사용하였다.
실시예 3: 판-리사바이러스(Pan-lyssavirus) 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 준비
본 발명자들은 상기 실시예 1의 표 1 내지 표 14에 기술된 바와 같은 14종의 리사바이러스의 유전자 서열 정보를 바탕으로 예의 연구를 거듭한 결과, 한번의 리얼타임 PCR로 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 검출가능하게 하는 특유한 4종의 프라이머들(3종의 정방향 프라이머들 및 1종의 역방향 프라이머의 조합)과, 특유한 2종의 프로브들(증폭반응 결과물을 특이적으로 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브들)의 조합을 디자인하였다. 전체 리사바이러스 증폭을 위한 프라이머 및 프로브 서열은 아래의 표 15와 같다.
프라이머와 프로브 서열의 GC%와 Tm 값 분석은 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES)사에서 제공하는 웹 기반 프로그램인 oligoanalyzer 3.1을 이용하여 수행하였다.
| 서열번호 | 올리고머 종류 | 염기서열 (5'→3') | 길이 | GC% | Tm(℃) | 증폭산물 |
| 1 | 정방향 프라이머 | ACGCTTAACRRCMAAAHC | 18 | 43.5 | 50.5 | 162 bp |
| 2 | 역방향 프라이머 | GGRTAYTTRTAYTCRTAYTGRTC | 23 | 37 | 49.4 | |
| 3 | 정방형 프라이머 | ACGCTTAACAGCTAAAAA | 18 | 33.3 | 46.7 | |
| 4 | 정방향 프라이머 | ACGCTTAACAGCAAAGTC | 18 | 44.4 | 50.5 | |
| 5 | 프로브 | AATGYAACACCCCTAMAATGGA | 22 | 40.9 | 54.4 | |
| 6 | 프로브 | AADGTAACACYHCTACAATGGA | 22 | 37.1 | 51.7 |
상기 표 15의 각 올리고머의 위치를 살펴보면, 서열번호 1의 올리고머는 정방향 프라이머로서 참고서열 AY956319 (서열번호 7)를 기준으로 할 때 1-18에 위치하고 이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus) 및 시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus)를 제외한 모든 리사바이러스를 검출할 수 있다. 서열번호 2의 올리고머는 역방향의 프라이머로서 참고서열 AY956319를 기준으로 할 때 162-140에 위치하며 14종의 모든 리사바이러스를 검출할 수 있다.
또한, 서열번호 3의 올리고머는 정방향 프라이머로서 이코마 리사바이러스를 검출할 수 있고, 서열번호 4의 올리고머는 정방향 프라이머로서 시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus)를 검출할 수 있다. 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머는 서열번호 1의 프라이머와 동일하게 참고서열 AY956319를 기준으로 할 때 1-18에 위치한다.
한편, 서열번호 5의 프로브는 라고스 박쥐 바이러스(Lagos bat virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus), 이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus) 및 시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus)의 5종을 제외한 모든 리사바이러스, 즉 아라반 바이러스(Aravan virus), 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스(Australian bat lyssavirus), 두벤하게 바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 리사바이러스-1(European bat lyssavirus 1), 유럽 박쥐 리사바이러스-2(European bat lyssavirus 2), 이르쿠트 바이러스(Irkut virus), 후잔트 바이러스(Khujand virus), 광견병(공수병) 바이러스(rabies virus) 및 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스(West Caucasian bat virus)를 검출할 수 있도록 설계하였다.
그리고, 서열번호 6의 프로브는 라고스 박쥐 바이러스(Lagos bat virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus), 이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus) 및 시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus)를 검출할 수 있도록 설계하였다. 서열번호 5의 프로브와 서열번호 6의 프로브는 모두 전술한 참고서열을 기준으로 54-75에 위치하며 이들의 5' 말단에는 FAM 형광물질을 표지하였고, 3' 말단에는 소광물질 BHQ-1을 표지하였다.
한편, 상기 표 15의 프라이머 쌍과 프로브는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)의 올리고 합성 서비스를 이용하여 합성하였고, 최종 농도가 10 μM이 되도록 멸균증류수를 첨가하여 준비하였으며, 증폭 실험 전까지 냉장 보관하였다.
실시예 4: RNA 양성대조물질(Positive control RNA)을 이용한 판-리사바이러스(pan-lyssavirus) 검출 실험
실시예 2에서 준비된 RNA 양성대조물질(14종의 리사바이러스 RNA 양성대조물질)과 실시예 3에서 준비된 특유의 프라이머들의 조합 및 프로브들의 조합을 이용하여, 14종의 리사바이러스가 빠짐없이 리얼타임 PCR 검사법으로 검출이 되는지를 확인하였다.
증폭실험은 ABI 7500 패스트 리얼타임(fast real-time) PCR 장비를 이용하여 수행하되, 하기 표 16에 기술된 바와 같은 리얼타임 PCR 반응 조성액을 조제하여 사용하였다. 반응 당 105 copies/μL의 농도가 되도록 1μL의 준비된 RNA 양성대조물질(주형)을 상기 반응 조성액에 첨가하였다. 2X 리얼타임 PCR 마스터 믹스(Real-time PCR Master Mix)는 제이에스 바이오테크(대한민국 경기도 소재)의 제품을 사용하였다.
| 구 성 물 | 첨 가 량 |
| 2X 리얼타임 PCR 마스터 믹스 | 10 μL |
| 정방향 프라이머(10 μM) (서열번호 1, 3, 4) |
각 1 μL |
| 역방향 프라이머(10 μM) (서열번호 2) |
각 1 μL |
| 프로브 (10 μM) (서열번호 5, 6) |
각 0.5 μL |
| 주형 | 1 μL |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 4 μL |
| 전체 부피 | 20 μL |
또한, 실시예 3에서 기술한 바와 같이, 리얼 타임 PCR 증폭 반응결과물을 확인하고 이를 정량적으로 분석하기 위해 각 프로브는 형광물질 및 소광물질로 이중 표지되는데, 서열번호 5의 프로브와 서열번호 6의 프로브는 모두 5'말단에 FAM(최대 흡수파장: 495nm, 최대 방출 파장: 520nm)으로 표지하였고, 이들 프로브의 3'말단에는 소광물질인 BHQ-1을 표지하였다. 그리고, 한편, 프로브를 표지하는 형광물질 및 소광물질로는 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
리얼타임(real-time) PCR 방법은 이러한 형광물질과 소광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있다. 리얼타임 PCR의 기본 원리는 중합효소와 형광공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광의 검출과 정량에 있다.
리얼타임 PCR에서의 정량은 PCR시 매 주기의 진행 상황을 감시하여 지수 증가기(exponential phase) 범위 내에서 실시간으로 증폭산물을 측정하는 방법으로서, 이때 중요한 개념이 Ct(threshold cycle) 또는 Cp(crossing point)라는 수치이다. 이 값은 전술한 이중 표지된 프로브에 의해 생기는 형광의 세기가 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가하는 시점의 주기수이며, 이는 표적 유전자의 초기 주형량(본 발명의 경우 14종의 리사바이러스의 RNA 유전자 카피수)을 정확하게 반영한다. 따라서, 14종의 리사바이러스의 RNA 유전자를 포함하는 시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 형광물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, 14종의 리사바이러스의 RNA 유전자가 존재하는지 여부와 시료 내에 포함된 리사바이러스 RNA 유전자의 초기 주형량을 정량적으로 분석할 수 있다.
본 실시예에서는 실시예 2에서 합성된 14종의 리사바이러스의 RNA 양성대조물질, 즉 각각의 리사바이러스에 대응하는 합성 RNA 유전자에 대해 상기 표 16에 나타낸 바와 같은 리얼타임 PCR 증폭 반응액의 조성 하에서, 하기 표 17의 리얼타임 PCR 반응조건으로 40회 반복하여 실험을 진행하였으며, Ct 값을 기준으로 14종의 리사바이러스 전체의 음/양성(리사바이러스 RNA 유전자 존재 여부)을 판정하였다.
| 역전사 | 42℃, 15분 |
| 변성(Denaturation) | 95℃, 5분 |
| 40 사이클 | |
| 변성(Denaturation) | 95℃, 10초 |
| 어닐링 및 연장 (데이터 수집) | 50℃, 45초 |
실시예 2에 따라 합성된 14종의 리사바이러스 RNA 각각을 주형으로 하여 상기와 바와 같은 조성 및 반응조건으로 리얼타임 PCR을 수행하고, 리얼타임 PCR 증폭반응이 한번씩 반복될 때마다 FAM 파장에서 형광값을 측정하여 각 반응 사이클에 대한 형광세기를 분석하였다. 그 결과는 도 1 내지 도 14에 도시하였다.
도 1 내지 도 14에서 확인되는 바와 같이, 14종의 리사바이러스 각각의 RNA 유전자를 리얼 타임 PCR로 증폭하는데 사용하기 위해 디자인된 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합 그리고 서열번호 5 및 6의 프로브의 조합은 14종 리사바이러스 각각의 RNA 바이러스 유전자를 유효하게 증폭시키고 증폭 사이클에 대한 형광세기의 곡선 역시 각각의 리사바이러스 RNA 유전자의 존재 여부 판단과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 특유의 서열번호 1, 3 및 4의 정방향 프라이머들과 서열번호 2의 역방향 프라이머의 조합 그리고 서열번호 5 및 6의 프로브의 조합을 이용하여 리얼타임 PCR을 수행하면, 의심 환자의 검체로부터 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 한번의 검사로 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있는 것을 알 수 있다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명의 검사 키트 및 방법은 최소한의 프라이머들을 사용하여 한번의 검사로 14종의 리사바이러스를 빠짐없이 신속하면서도 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 검사 비용이 저렴할 뿐만아니라 지금까지 국내에서 발견되지 않은 리사바이러스의 감염자를 신속하고 정확하게 확인하여 리사바이러스의 국내 전파의 조기 차단에 기여할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> National Institute of Environmental Research
SNC Co., LTD.
YOON, Hyun Kyu
<120> Method and kit for detecting lyssavirus using real-time PCR
<130> N-P16-0001KR
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pan-lyssavirus forward primer 1
<400> 1
acgcttaacr rcmaaahc 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pan-lyssavirus reverse primer
<400> 2
ggrtayttrt aytcrtaytg rtc 23
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pan-lyssavirus forward primer 2
<400> 3
acgcttaaca gctaaaaa 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pan-lyssavirus forward primer 3
<400> 4
acgcttaaca gcaaagtc 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pan-lyssavirus probe 1
<400> 5
aatgyaacac ccctamaatg ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pan-lyssavirus probe 2
<400> 6
aadgtaacac yhctacaatg ga 22
<210> 7
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rabies virus synthetic gene
<400> 7
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acaacaaaac caaagaagaa gcagacagcg 60
tcaattgcaa agcaaaaatg taacacccct acaatggatg ccgacaagat tgtattcaaa 120
gtcaataatc aggtggtctc tttgaagcct gagattatcg tggatcaata tgagtacaag 180
taccc 185
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lagos Bat Lyssavirus synthetic gene
<400> 8
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acagcaaaat cagagaagat atagacagcg 60
acaatgcgct aaacaaaatg taacacccct acaatggatt ctgacaagat tgttttcaag 120
gttcataatc agatcgtatc tttaaagcct gagattatat cagaccaata tgaatataag 180
tatcc 185
<210> 9
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mokola Lyssavirus synthetic gene
<400> 9
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acaacaaaat caaagaagac acagatagta 60
tcagtgacct aaacaaaatg taacactcct acaatggagt ctgacaagat tgtgttcaag 120
gtgaataacc aagttgtttc tttgaagcct gaggtcatat cagatcaata tgagtataaa 180
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Duvenhage Lyssavirus synthetic gene
<400> 10
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acaacaaaat cataaaaggg gcaaacatgt 60
tcatttgtat aacacaaatg taacacccct acaatggatg ctgaaagaat tgtctttaag 120
gtccgtaatc agctagtctc tgtaaaacca gaggtcatct ctgatcagta tgagtacaaa 180
tatcc 185
<210> 11
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> European Bat 1 Lyssavirus synthetic gene
<400> 11
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tcatcgatag aacagaaatg taacacccct acaatggatg ttaacagggt tgtttttaag 120
gtccataatc agttggtctc ggtaaaacct gaggtgattt ctgatcagta tgagtacaaa 180
taccc 185
<210> 12
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> European Bat 2 Lyssavirus synthetic gene
<400> 12
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acgacaaaac cagaaaagga atagacacaa 60
tcgtctgtag agcagaaatg caacacccct acaatggatg ctgacagaat tgtcttcaaa 120
gtccataatc agttggtgtc tgtaaagcca gaagtaattg tagatcaata tgagtacaaa 180
taccc 185
<210> 13
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Australian Bat Lyssavirus synthetic gene
<400> 13
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tcatttgcga agcaaaaatg taacacccct acaatggatt ctgataagat tgtctttaag 120
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tatcc 185
<210> 14
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> West Caucasian Bat Lyssavirus synthetic gene
<400> 14
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acaacaaaat cttataagga cgagaaaacc 60
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tatcc 185
<210> 15
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Aravan Lyssavirus synthetic gene
<400> 15
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acgacaaaaa cagaaaagga atagacataa 60
tcgcctgcag aatagaaatg taacacccct acaatggatt ctgacaagat tgtcttcaag 120
gtccataacc agttggtttc agtgaagcct gaggtgatta ctgatcagta tgagtataag 180
tatcc 185
<210> 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Irkut Lyssavirus synthetic gene
<400> 16
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gttcataatc agctggtttc tctaaggcca gaggttattt ctgatcagta tgaatacaaa 180
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Khujand Lyssavirus synthetic gene
<400> 17
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acgacaaaac cagaaaagga atagacatca 60
tcgcctgtag aataggaatg taacacccct acaatggatg ccgacagaat tgtctttaaa 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bokeloh Bat Lyssavirus synthetic gene
<400> 18
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acgacaaaat cagaaaagga gtagacacac 60
tcatctacag agcaaaaagg taacacccct acaatggact ctgacaagat tgtcttcaaa 120
gtccataatc agttggtgtc tgtaaagcca gaggtgattg ttgatcaata tgagtacaaa 180
tatcc 185
<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ikoma lyssavirus synthetic gene
<400> 19
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acagctaaaa accagaagac agagaaggaa 60
tcgaagggga aaagaaaaag taacacttct acaatggatc ctgaacaagt agttttcaag 120
tctcggaagg aaattgtcgt gttgagacca gaggtgatat cggatcagta tgaatacaaa 180
taccc 185
<210> 20
<211> 185
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Shimoni bat lyssavirus synthetic gene
<400> 20
atttaggtga cactatagaa gagacgctta acagcaaagt cagagaagag ataagcctct 60
acaatgagcg aatcaaaatg taacacccct acaatggact ctgaaaagat tgttttcaaa 120
gttcgtaacc aggtggtgtc tttgaagcca gaaataatct ctgatcagta tgagtacaaa 180
tatcc 185
Claims (10)
- 아라반 바이러스, 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스, 두벤하게 바이러스, 유럽 박쥐 리사바이러스-1, 유럽 박쥐 리사바이러스-2, 이르쿠트 바이러스, 후잔트 바이러스, 광견병(공수병) 바이러스, 및 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍과, 서열번호 5의 프로브와의 제1조합과,
라고스 박쥐 바이러스(Lagos bat virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 및 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍과, 서열번호 6의 프로브와의 제2조합과,
이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍과, 서열번호 6의 프로브와의 제3조합과,
시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍과, 서열번호 6의 프로브와의 제4조합을 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트. - 제4항에 있어서,
상기 표지물질은,
서열번호 5의 프로브의 한쪽 말단과,
서열번호 6의 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는, 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트. - 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
청구항 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 기재된 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
리얼타임 PCR 결과에 기초하여 상기 검체 내의 리사바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법. - 제6항에 있어서,
증폭 전, 리사바이러스 RNA 유전자의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 상기 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 키트와 리사바이러스 RNA 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 리사바이러스 RNA 유전자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 리사바이러스 RNA 유전자를 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 리사바이러스 감염 여부를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법. - 제7항에 있어서,
상기 표지물질은,
서열번호 5의 프로브의 한쪽 말단과,
서열번호 6의 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는, 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법. - 리얼타임 PCR을 이용한 리사바이러스 검사 방법에서 사용되는 리얼타임 PCR용 프라이머 세트로서,
아라반 바이러스(Aravan virus), 오스트레일리아 박쥐 리사바이러스(Australian bat lyssavirus), 두벤하게 바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 리사바이러스-1(European bat lyssavirus 1), 유럽 박쥐 리사바이러스-2(European bat lyssavirus 2), 이르쿠트 바이러스(Irkut virus), 후잔트 바이러스(Khujand virus), 광견병(공수병) 바이러스(rabies virus), 웨스트 코카시안 박쥐 바이러스(West Caucasian bat virus), 라고스 박쥐 바이러스(Lagos bat virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 및 보켈로호 박쥐 리사바이러스(Bokeloh bat lyssavirus)를 검출하는데 사용되는, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍과,
이코마 리사바이러스(Ikoma lyssavirus)를 검출하는데 사용되는, 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍과,
시모니 박쥐 바이러스(Shimoni bat virus)를 검출하는데 사용되는, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍을 포함하는, 리얼타임 PCR용 프라이머 세트. - 삭제
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-
2016
- 2016-12-02 KR KR1020160163646A patent/KR101897368B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
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| Wakeley 등. J. CLIN. MICROBIOL. Vol. 43, No. 6, 페이지 2786-2792 (2005.06.)* |
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