CN109022375A - 一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用 - Google Patents

一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用。本发明通过反向遗传技术将发热伴血小板减少综合征病毒编码Gn蛋白的基因序列插入到狂犬病病毒基因组中，获得免疫原性好、毒力弱、复制滴度高的重组狂犬病病毒，重组狂犬病病毒在NA细胞中的滴度达到3.3×108FFU/mL，与亲本狂犬病病毒SAD株的生长滴度相近，对重组狂犬病病毒的复制没有明显影响，且安全性高，重组狂犬病病毒还可诱导小鼠产生狂犬病病毒与SFTSV的特异性中和抗体，中和抗体效价分别可达2IU与1:100以上，为制备预防狂犬病和发热伴血小板减少综合征二联疫苗奠定了良好的基础。

Description

一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用，属于生物病毒疫苗研究领域。
背景技术
发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是由发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus,SFTSV)引起的一种自然疫源性人兽共患传染病。该病2009年在中国河南首次被发现，随后韩国、日本等一些东亚国家也陆续报道了此类病例。SFTS的病死率高达2.5％～30％，其传播机制尚不明确，目前认为，其传播与蜱虫叮咬有关，人类可通过蜱虫叮咬而患病。通过对SFTSV的流行地区家养动物调查研究显示，动物血清中SFTSV抗体阳性率高达45.19％，其中鼠、牛、羊、猪、狗的抗体阳性率分别为1.06％、100.00％、76.27％、3.75％、75.00％(杜燕华,黄学勇,王海峰,等.河南省信阳市动物中新布尼亚病毒感染情况调查[J].中国人兽共患病学报,2014,(07):766-8.)。这表明，SFTSV在疾病流行地区的家养动物中广泛存在，且这些动物可能是SFTSV的扩大宿主，在病毒的传播过程中起重要作用。
SFTSV是布尼亚病毒目白蛉病毒科的一个新成员。SFTSV具有布尼亚病毒的一般特征，基因组为分节段的负链RNA，有包膜，病毒颗粒呈球形，直径80-100nm。病毒基因组包括3个片段，分别是L、M、S，其中M片段共3378个核苷酸，含有1个开放读码框架(open readingframe,OFR)，编码含1073个氨基酸的膜蛋白前体，最终形成Gn和Gc 2个病毒糖蛋白，Gn被证明具有中和抗体表位。
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的全球流行、危害严重的人兽共患病，病死率达100％。RABV基因组有五种结构基因：编码RNA依赖的RNA聚合酶的L基因、编码核蛋白的N基因、编码磷酸蛋白的P基因、编码基质蛋白的M基因和编码外膜蛋白的G基因，且在G基因和L基因之间有一个约400bp的不编码蛋白的假基因区间，该区间是一个独立的转录单元，在转录的启动子和终止子之间存在着多个特异性酶切位点序列。几乎所有人的狂犬病都是由动物传播引起的，全球每年因病犬传播造成的狂犬病死亡人数约5.9万，导致的伤残调整寿命年达370万，造成86亿美元的损失(HAMPSON K,COUDEVILLE L,LEMBO T,et al.Estimating the global burden of endemic canine rabies[J].PLoSneglected tropical diseases,2015,9(4):e0003709.)。疫苗免疫接种已成为消除和预防狂犬病最重要的应对措施，狂犬疫苗接种显得尤为重要。RABV作为载体表达外源基因的研究已久，拥有许多独特优势，科研工作者借助于基因重组技术已成功地以此载体制备了包括人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV-1)、犬瘟热病毒(caninedistemper virus,CDV)、中东呼吸综合症冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome,MERS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)等重组疫苗在内的多种重组活疫苗。
SFTS是我国近年来新发的传染病，目前针对该病并没有特效治疗方案及药物可供使用，研制安全有效的预防疫苗对该疾病的防控具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用，本发明通过将发热伴血小板减少综合征病毒编码Gn蛋白的基因序列插入到狂犬病病毒基因组中，构建重组狂犬病病毒，获得免疫原性好、毒力弱、复制滴度高的重组病毒。该重组病毒免疫动物后，能诱导机体产生针对狂犬病病毒和发热伴血小板减少综合征病毒的高效价特异性中和抗体。
术语说明：
SFTSV：发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus)，是引发发热伴血小板减少综合征的一种病毒。
pSAD质粒：含有狂犬病病毒SAD株全长基因组的质粒。
本发明的技术方案如下：
一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒，其特征在于，所述重组狂犬病病毒为在狂犬病病毒基因组的假基因区插入SFTSV Gn基因，该重组狂犬病病毒的基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种上述表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒的构建方法，步骤如下：
(1)提取SFTSV mRNA，反转录，得cDNA；
(2)以步骤(1)cDNA为模板，PCR扩增得Gn基因，所述Gn基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；
(3)用Pfl23Ⅱ和NheI双酶切pSAD质粒和步骤(2)Gn基因，切胶回收质粒载体和目的片段，连接后转化感受态细胞，经鉴定得阳性重组质粒pSAD-Gn；
(4)将步骤(3)阳性重组质粒pSAD-Gn转染BHK-21细胞，经培养收获上清，即得表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病毒的基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
根据本发明优选的，上述步骤(1)中所述反转录的反应体系为：SFTSV mRNA 2μL，5×反转录缓冲液4μL，2.5mmol/L的dNTP 4μL，10U/μL的RNase Inhibitor 1μL，2.5U/μL的AMV反转录酶1μL，Random引物1μL，OligodT引物1μL，补加ddH2O至20μL；
反转录反应条件为：42℃反应1h。
根据本发明优选的，上述步骤(2)中所述PCR扩增的引物序列如下，上游引物中下划线部分为Pfl23Ⅱ酶切位点，下游引物中下划线部分为NheI酶切位点：
上游引物GnF：5′-TATACGTACGGCCACCATGATGAAAGTCATCTGG-3′，
下游引物GnR：5′-AAATGCTAGCTTAGCTCTCAGCAAGCCCTATT-3′；
PCR扩增的反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L的dNTP 4μL，25pmol/μL的上游引物1μL，25pmol/μL的下游引物1μL，cDNA 2μL，5U/μL的DNA聚合酶0.5μL，补加ddH2O至50μL；
PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；94℃变性20s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃保温10min。
根据本发明优选的，上述步骤(3)中所述pSAD质粒采用现有技术制备，制备方法参照Rabies Virus Expressing Dendritic Cell-Activating Molecules Enhances theInnate and Adaptive Immune Response to Vaccination，Yongjun Wen等,JOURNAL OFVIROLOGY,2011。
根据本发明优选的，上述步骤(3)中所述双酶切的反应体系为：10×缓冲液5μL，pSAD质粒/Gn基因2μg，Pfl23Ⅱ和NheI内切酶各2μL，补加ddH2O至50μL；
双酶切的反应条件为：37℃反应60min。
根据本发明优选的，上述步骤(3)中所述连接的反应体系为：10×缓冲液2μL，切胶回收的目的片段100μg，切胶回收的质粒载体40μg，T4连接酶2μL，补加ddH2O至20μL；
连接的反应条件为：16℃反应2h。
根据本发明优选的，上述步骤(3)中所述感受态细胞为以下中的一种：Top10感受态细胞，Trans5a感受态细胞，Trans109感受态细胞，Trans110感受态细胞，Trans1-Blue感受态细胞；进一步优选的，所述感受态细胞为Top10感受态细胞。
根据本发明优选的，上述步骤(4)中所述转染的步骤为：将BHK-21细胞铺板于6孔板，10％FBS的DMEM培养12-16h，转染时细胞密度为90％，阳性重组质粒pSAD-Gn的用量为2.0μg，辅助质粒用量为pSAD-N 0.5μg、pSAD-P 0.25μg、pSAD-L 0.1μg、pSAD-G 0.15μg，其中，辅助质粒pSAD-N、pSAD-P、pSAD-L、pSAD-G按照现有技术制备，制备方法参照RabiesVirus Expressing Dendritic Cell-Activating Molecules Enhances the Innate andAdaptive Immune Response to Vaccination，Yongjun Wen等,JOURNAL OF VIROLOGY,2011。
根据本发明优选的，上述步骤(4)中所述的培养为：将转染后的BHK-21细胞置于37℃5％CO2培养箱中培养4-5天。
根据本发明优选的，上述步骤(4)中所述上清即为狂犬病和发热伴血小板减少综合征二联疫苗。
上述表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒在制备预防狂犬病和发热伴血小板减少综合征的二联疫苗中的应用。
上述未详细说明的实验步骤及操作可按照现有技术进行。
有益效果：
1、本发明通过反向遗传技术成功构建表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒，重组狂犬病病毒在NA细胞中的滴度达到3.3×108FFU/mL，与亲本狂犬病病毒SAD株的生长滴度相近，这表明Gn蛋白基因的插入对重组狂犬病病毒的复制没有明显影响；重组狂犬病病毒免疫动物，小鼠无任何明显发病症状，与亲本病毒一致，表明该重组病毒安全性高。重组狂犬病病毒还可诱导小鼠产生特异性SFTSV中和抗体，中和抗体效价达1:100左右。
2、本发明成功构建了表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒，并进行了鉴定和动物免疫，这为该重组病毒应用于制备预防狂犬病和发热伴血小板减少综合征二联疫苗奠定了良好的基础。
附图说明
图1为阳性重组质粒pSAD-Gn双酶切琼脂糖凝胶电泳图，
图中，M泳道为DNA标志物DL15000，1泳道为阳性重组质粒pSAD-Gn条带，2泳道为peazy-blunt-Gn对照质粒条带；
图2为重组狂犬病病毒的PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，
图中，M泳道为DNA标志物DL2000，1泳道为重组狂犬病病毒条带，2泳道为狂犬病病毒SAD株条带；
图3为重组狂犬病病毒的免疫荧光(IFA)染色鉴定显微镜照片，
图中，SAD-Gn.重组狂犬病病毒，SAD.狂犬病病毒SAD株，SFTSV.发热伴血小板减少综合征病毒，Mock.阴性对照；
图4为重组狂犬病病毒的复制动力学曲线，
图中，A.NA细胞；B.BHK-21细胞；*P<0.05，**P<0.01；SAD-Gn.重组狂犬病病毒，SAD.狂犬病病毒SAD株；纵坐标为病毒滴度，横坐标为病毒感染后时间；
图5为动物免疫4周后血清中和抗体水平，
图中，A.RABV中和抗体；B.SFTSV中和抗体；纵坐标为病毒中和抗体滴度，横坐标中：SAD-Gn.重组狂犬病病毒，SAD.狂犬病病毒SAD株，MOCK.阴性对照。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域的常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为普通市售产品。
实施例1
一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒的构建方法，步骤如下：
(1)按照TIANamp Virus RNA试剂盒操作说明提取SFTSV mRNA，反转录，得cDNA；
(2)以步骤(1)cDNA为模板，根据GenBank SFTSV Gn基因核苷酸序列设计PCR引物，经PCR扩增得Gn基因，所述Gn基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
(3)用Pfl23Ⅱ和NheI双酶切步骤(2)扩增得到的Gn基因和pSAD质粒，经琼脂糖凝胶电泳纯化，切胶回收目的片段和质粒载体，按照T4连接酶说明书(NEB公司)进行连接，连接后转化Top10感受态细胞，提取质粒，鉴定得阳性重组质粒pSAD-Gn，-20℃冻存备用；其中，pSAD质粒按照现有技术制备得到；
(4)将步骤(3)阳性重组质粒pSAD-Gn按照Lipofectamine 2000说明书(Invitrogen公司)转染BHK-21细胞，将BHK-21细胞铺板于6孔板，10％FBS的DMEM培养12-16h，转染时细胞密度为90％，阳性重组质粒pSAD-Gn的用量为2.0μg，辅助质粒用量为pSAD-N0.5μg，pSAD-P 0.25μg、pSAD-L 0.1μg、pSAD-G 0.15μg；转染后将细胞放在37℃5％CO2培养箱中继续培养4-5天，收获上清，即得表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病毒的基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；其中，辅助质粒pSAD-N、pSAD-P、pSAD-L、pSAD-G按照现有技术制备得到。
其中，上述步骤(1)中所述反转录的反应体系为：抽提的SFTSV mRNA 2μL，5×反转录缓冲液4μL，2.5mmol/L的dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)4μL，RNase Inhibitor(10U/μL)1μL，2.5U/μL的AMV反转录酶1μL，Random引物1μL，OligodT引物1μL，补加ddH2O至20μL，瞬间离心后，按照AMV反转录酶操作说明进行，其中的Random引物，OligodT引物为AMV反转录酶试剂盒提供；
反转录程序为：42℃反应1h。
上述步骤(2)中所述PCR扩增的引物序列为，上游引物下划线部分为Pfl23Ⅱ酶切位点，下游引物下划线部分为NheI酶切位点：
上游引物GnF：5′-TATACGTACGGCCACCATGATGAAAGTCATCTGG-3′，
下游引物GnR：5′-AAATGCTAGCTTAGCTCTCAGCAAGCCCTATT-3′；
PCR扩增的反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，上游引物(25pmol/μL)1μL，下游引物(25pmol/μL)1μL，cDNA 2μL，DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，补加ddH2O至50μL；
PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；94℃变性20s、54℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环；72℃保温10min。
上述步骤(3)中所述双酶切的反应体系为：10×缓冲液5μL，pSAD质粒/Gn基因2μg，Pfl23Ⅱ和NheI内切酶各2μL，补加ddH2O至50μL；
双酶切的反应条件为：37℃反应60min。
上述步骤(3)中所述连接的反应体系为：10×缓冲液2μL，切胶回收的目的片段100μg，切胶回收的载体片段40μg，T4连接酶2μL，补加ddH2O至20μL；
连接的反应条件为：16℃反应2h。
上述步骤(3)中所述鉴定的方法为：对提取到的质粒进行Pfl23Ⅱ和NheI双酶切，以peazy-blunt-Gn作为对照，其中，peazy-blunt-Gn为按照说明书操作步骤在peasy-blunt克隆载体(北京全式金生物技术有限公司)上连接SFTSV Gn基因，双酶切的反应体系和反应条件与步骤(3)中所述双酶切的反应体系和反应条件相同，琼脂糖凝胶电泳验证目的条带，结果如图1所示，提取质粒中含有长度约为1689bp的条带，与peazy-blunt-Gn对照组中SFTSV Gn基因的长度相同，说明该质粒中成功插入SFTSV Gn基因，即为阳性重组质粒pSAD-Gn。
实施例2重组狂犬病病毒的PCR验证与IFA鉴定：
取狂犬病病毒SAD株和实施例1制备的重组狂犬病病毒分别感染Vero细胞，按照RNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取上述感染不同病毒的Vero细胞的总RNA，反转录得cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增，得到狂犬病病毒G基因和L基因之间的Gn基因，琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图2所示，重组狂犬病病毒组得到目的条带，与SFTSV Gn基因大小相符，约为1689bp，狂犬病病毒SAD株组无目的条带，说明重组狂犬病病毒成功插入SFTSV Gn基因。
将96孔板铺单层Vero细胞，并分为四个区域，第一区域接种狂犬病病毒SAD株病毒液，第二区域接种SFTSV病毒液，第三区域接种实施例1制备的重组狂犬病病毒液，第四区域接种含10％FBS的DMEM作为阴性对照，37℃、5％CO2孵箱培养48h后，弃上清，加丙酮固定。将96孔板四个区域分别加入FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体(1:200稀释，Fujirebio公司)，和抗SFTSV Gn蛋白抗体(1：200稀释)，每种情况设8个复孔，37℃孵箱培养1h后，PBS洗3次；Gn蛋白抗体孔再加入埃文思蓝染色液和Alexa Fluor 488荧光染料标记的山羊抗鼠二抗(1:500稀释，Proteintech Group公司)，37℃孵育1小时，PBS洗3次。
将上述96孔板置于荧光显微镜下观察，结果如图3所示，以狂犬病病毒N蛋白荧光抗体进行IFA检测，重组狂犬病病毒组和狂犬病病毒SAD株组均观察有大量荧光灶，SFTSV组和空白对照组无荧光灶；以SFTSV Gn蛋白抗体进行IFA检测，重组狂犬病病毒组和SFTSV组观察有大量荧光灶，狂犬病病毒SAD株组与空白对照组则无荧光灶，上述结果表明重组狂犬病病毒拯救成功，能表达狂犬病病毒的同时，还可以表达外源SFTSV Gn蛋白。
实施例3复制动力学测定
按照0.01MOI将实施例1制备的重组狂犬病病毒和狂犬病病毒SAD株分别感染单层NA细胞和BHK-21细胞，分别于感染后24h、48h、72h、96h取500μL细胞上清液，-20℃冰箱冻存。取样完成后，统一用NA细胞测其病毒滴度。将不同时间段的样品，分别用10％FBS DMEM做10倍系列稀释，取50μL加入96孔板单层NA细胞，每个稀释度做4个重复，37℃5％CO2孵箱培养24小时后，加入80％丙酮固定，加入FITC标记的N蛋白抗体染色。荧光显微镜下观察荧光结果，绘制病毒复制动力曲线，结果如图4所示。
结果表明，重组狂犬病病毒与狂犬病病毒SAD株在两种细胞上生长特性相似，24h时已开始复制，96h达到滴度最大值，约为3.3×108FFU/mL，与亲本狂犬病病毒SAD株的生长滴度相近。在神经细胞NA中，重组狂犬病病毒体现出良好的适应性和复制繁殖能力。在BHK-21细胞中，重组狂犬病病毒滴度略低于亲本狂犬病病毒SAD株，说明Gn基因的插入，没有明显影响病毒的复制特性。
实施例4动物免疫和血清中和抗体
取30只SPF级C57/BL6小鼠(6-8周龄，雌性)，随机分为3组，分别免疫无血清的DMEM，狂犬病病毒SAD株及实施例1制备的重组狂犬病病毒，免疫量体积均为100μL，病毒含量为1×107FFU。4周后将小鼠摘眼取血，分离血清，分别检测狂犬病病毒中和抗体以及SFTSV中和抗体。
FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体滴度：在96孔板将待测灭活血清和标准阳性血清(0.5IU/ml)50μL分别加到100μL 10％FBS DMEM中做3倍系列稀释，每个稀释度做4个重复，加50μL含有100TCID50的狂犬病病毒CVS-11病毒液，混合均匀，37℃5％CO2孵箱孵育中和1h，每孔加50μL浓度为4×105/mL BHK-21细胞悬液，37℃5％CO2孵箱培养48h，加入80％丙酮固定，加入FITC标记的N蛋白抗体染色。在荧光显微镜下观察结果，应用Spearman-Karber公式，以标准阳性血清滴度为参照系数，计算待测血清RABV中和效价(IU/mL)。
终点法中和试验检测SFTSV中和抗体滴度：在96孔板中，将待测血清用100μL 10％FBS DMEM 2倍系列稀释，每个稀释度做4个重复，每孔加入50μL含100TCID50SFTSV病毒液，混合均匀，37℃5％CO2孵箱孵育中和1.5h，将血清和病毒混合物加入弃去上清的单层Vero细胞中，37℃5％CO2孵箱培养48h，加入80％丙酮固定，依次加入Gn单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠二抗染色，置于荧光显微镜下观察结果，按照Reed-Muench法进行计算50％血清中和终点。
狂犬病病毒中和抗体以及SFTSV中和抗体的检测结果如图5所示，重组狂犬病病毒和亲本狂犬病病毒SAD株接种的小鼠血清内均能检测到抗狂犬病病毒中和抗体，狂犬病病毒SAD株组小鼠血清狂犬病病毒中和抗体滴度略高于重组狂犬病病毒组小鼠，两组小鼠狂犬病病毒中和抗体滴度均高于0.5IU/ml，高于WHO对狂犬病疫苗的标准。重组狂犬病病毒组的小鼠血清检测到SFTSV中和抗体，病毒中和抗体(virus neutralizing antibody,VNA)效价在1：100左右，狂犬病病毒SAD株组检测不到SFTSV中和抗体，空白组没有检测到狂犬病病毒和SFTSV的中和抗体。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒及其构建方法与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1689
<212> DNA
<213> severe fever with thrombocytopenia syndrome virus
<400> 1
atgatgaaag tcatctggtt ctcctctctg atctgctttg tcattcaatg cagtggggac 60
tcgggcccaa tcatctgtgc aggacccatc cactcaaaca agagtgctga catacctcac 120
ctgctgggtt actctgagaa gatatgtcag atagatcgac tgatacatgt ttcgtcatgg 180
ctcagaaacc actcacaatt tcagggttac gtagggcagc gaggtggacg ctctcaggtg 240
agctactacc cagctgaaaa ttcttactca aggtggagtg ggcttctaag cccctgtgat 300
gctgattggc ttgggatgct tgttgtgaag aaagccaagg ggtctgatat gatagttcct 360
gggccttcat acaaggggaa agtctttttt gagcggccaa cttttgatgg atatgtaggc 420
tggggctgtg gtagtgggaa gtctaggaca gagtcaggag agctctgcag ttcagactca 480
gggactagct ctggtcttct gccctcagat agggttctct ggataggtga tgttgcttgt 540
cagcctatga cacccatccc tgaagagaca tttctggagc tgaagagttt tagccaaagt 600
gaattcccag acatatgcaa aattgatggc attgtgttca accagtgtga gggtgagagt 660
ctacctcagc cttttgatgt tgcatggatg gatgttggcc actctcataa aatcatcatg 720
agggagcaca agaccaaatg ggtgcaagag agctcatcca aggattttgt gtgctataag 780
gaagggactg ggccttgttc tgaatcagaa gaaaagactt gcaagaccag tggatcatgc 840
aggggggaca tgcagttctg caaggtagca ggttgtgaac atggagaaga ggcatctgaa 900
gccaagtgta gatgctcact tgtacacaag cccggagaag tcgttgtgtc atatggaggg 960
atgcgtatca gaccaaagtg ctatggtttc tccagaatga tggcaacact ggaggtgaac 1020
caaccagagc aaaggcttgg tcaatgcact ggctgccatc tggaatgcat aaatgggggt 1080
gtgaggctaa taactctaac cagtgagctc aagtcagcta ctgtctgtgc ttcccacttt 1140
tgtagttctg ccacgagtgg caagaaaagc acggagattc aattccactc aggatcattg 1200
gttgggaaaa cagcaataca cgtcaaaggg gcattggtag atggaactga attcacattt 1260
gagggtagtt gcatgttccc agatggttgt gatgcggtgg actgcacttt ctgtcgtgag 1320
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ctccttggat atgcaggcct catgctactc accaatgtcc tcaaggcaat tgggatttgg 1440
ggatcatggg tcatagctcc agtgaagcta atgtttgcca tcataaagaa actaatgaga 1500
actgtgagct gcttgatgag gaaattgatg gataggggaa ggcaagtgat ccatgaggag 1560
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agggtaaggc attggatgta ctcacctgtc atcctgacta ttttagcaat agggcttgct 1680
gagagctga 1689
<210> 2
<211> 13259
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa 60
cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120
gaagcctgag attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa 180
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acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420
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tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540
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gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 720
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aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840
actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900
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atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020
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tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320
gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380
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tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500
aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560
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ggctcatctc caaggggaac ccatagaggt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680
tcacctggat gatggaaaat cgcccaacca tggtgagata gccaaggtgg gagaaggcaa 1740
gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800
cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860
gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920
tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980
gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040
aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggctacc aatgaagagg atgatctatc 2100
agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160
ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220
tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280
actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340
gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400
ttgctaaccg aacctctccc ctcagtccct ctagacaata aaatccgaga tgtcccaaag 2460
tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa cctcctacgt aagatagtga 2520
aaaaccgcag ggacgaggac actcaaaaat cctctcccgc gtcagcccct ctggatgacg 2580
atgacttgtg gcttccaccc cctgaatacg tcccgctgaa agaacttaca ggcaagaaga 2640
acatgaggaa cttttgtatc aacggaaggg ttaaagtgtg tagcccgaat ggttactcgt 2700
tcaggatcct gcggcacatt ctgaaatcat tcgacgagat atattctggg aatcatagga 2760
tgatcgggtt agtcaaagtg gttattggac tggctttgtc aggatctcca gtccctgagg 2820
gcctgaactg ggtatacaaa ttgaggagaa cctttatctt ccagtgggct gattccaggg 2880
gccctcttga aggggaggag ttggaatact ctcaggagat cacttgggat gatgatactg 2940
agttcgtcgg attgcaaata agagtgattg caaaacagtg tcatatccag ggcagagtct 3000
ggtgtatcaa catgaacccg agagcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060
aaaggtccga agaggacaaa gattcctctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120
aaatttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180
gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240
agttgattac ctttacattt tgatcctctt ggatgtgaaa aaaactatta acatccctca 3300
aaagactcaa ggaaagatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc 3360
attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagtcc 3420
gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac 3480
caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaagt 3540
gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg 3600
ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc 3660
cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta 3720
ccctgactac cgctggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc 3780
tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag 3840
cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac 3900
catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta ccaatagtag 3960
agggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata 4020
taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat 4080
ggatggaaca tgggtctcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgataa 4140
gttggtgaac ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt 4200
ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt 4260
gagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac 4320
catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtca gaacttggaa 4380
tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa 4440
cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat 4500
gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt 4560
gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt 4620
tgaagttcac cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa 4680
ctgggggaag tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt 4740
cctgatgaca tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg 4800
gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc 4860
acacaagagt gggggtgaga ccagactgta aggactggcc gtcctttcaa cgatccaagt 4920
ccatgaaaaa aactaacacc cctcccgtac gatgatgaaa gtcatctggt tctcctctct 4980
gatctgcttt gtcattcaat gcagtgggga ctcgggccca atcatctgtg caggacccat 5040
ccactcaaac aagagtgctg acatacctca cctgctgggt tactctgaga agatatgtca 5100
gatagatcga ctgatacatg tttcgtcatg gctcagaaac cactcacaat ttcagggtta 5160
cgtagggcag cgaggtggac gctctcaggt gagctactac ccagctgaaa attcttactc 5220
aaggtggagt gggcttctaa gcccctgtga tgctgattgg cttgggatgc ttgttgtgaa 5280
gaaagccaag gggtctgata tgatagttcc tgggccttca tacaagggga aagtcttttt 5340
tgagcggcca acttttgatg gatatgtagg ctggggctgt ggtagtggga agtctaggac 5400
agagtcagga gagctctgca gttcagactc agggactagc tctggtcttc tgccctcaga 5460
tagggttctc tggataggtg atgttgcttg tcagcctatg acacccatcc ctgaagagac 5520
atttctggag ctgaagagtt ttagccaaag tgaattccca gacatatgca aaattgatgg 5580
cattgtgttc aaccagtgtg agggtgagag tctacctcag ccttttgatg ttgcatggat 5640
ggatgttggc cactctcata aaatcatcat gagggagcac aagaccaaat gggtgcaaga 5700
gagctcatcc aaggattttg tgtgctataa ggaagggact gggccttgtt ctgaatcaga 5760
agaaaagact tgcaagacca gtggatcatg caggggggac atgcagttct gcaaggtagc 5820
aggttgtgaa catggagaag aggcatctga agccaagtgt agatgctcac ttgtacacaa 5880
gcccggagaa gtcgttgtgt catatggagg gatgcgtatc agaccaaagt gctatggttt 5940
ctccagaatg atggcaacac tggaggtgaa ccaaccagag caaaggcttg gtcaatgcac 6000
tggctgccat ctggaatgca taaatggggg tgtgaggcta ataactctaa ccagtgagct 6060
caagtcagct actgtctgtg cttcccactt ttgtagttct gccacgagtg gcaagaaaag 6120
cacggagatt caattccact caggatcatt ggttgggaaa acagcaatac acgtcaaagg 6180
ggcattggta gatggaactg aattcacatt tgagggtagt tgcatgttcc cagatggttg 6240
tgatgcggtg gactgcactt tctgtcgtga gtttctaaaa aatccccagt gctaccctgc 6300
aaagaagtgg ctgttcatca ttattgtcat cctccttgga tatgcaggcc tcatgctact 6360
caccaatgtc ctcaaggcaa ttgggatttg gggatcatgg gtcatagctc cagtgaagct 6420
aatgtttgcc atcataaaga aactaatgag aactgtgagc tgcttgatga ggaaattgat 6480
ggatagggga aggcaagtga tccatgagga gataggggag aatagagagg gcaaccaaga 6540
tgatgttagg attgagatgg caagacccag aagggtaagg cattggatgt actcacctgt 6600
catcctgact attttagcaa tagggcttgc tgagagctaa gctagcttat aaagtgctgg 6660
gtcatctaag cttttcagtc gagaaaaaaa cattagatca gaagaacaac tggcaacact 6720
tctcaacctg agacttactt caagatgctc gatcctggag aggtctatga tgaccctatt 6780
gacccaatcg agttagaggc tgaacccaga ggaaccccca ttgtccccaa catcttgagg 6840
aactctgact acaatctcaa ctctcctttg atagaagatc ctgctagact aatgttagaa 6900
tggttaaaaa cagggaatag accttatcgg atgactctaa cagacaattg ctccaggtct 6960
ttcagagttt tgaaagatta tttcaagaag gtagatttgg gttctctcaa ggtgggcgga 7020
atggctgcac agtcaatgat ttctctctgg ttatatggtg cccactctga atccaacagg 7080
agccggagat gtataacaga cttggcccat ttctattcca agtcgtcccc catagagaag 7140
ctgttgaatc tcacgctagg aaatagaggg ctgagaatcc ccccagaggg agtgttaagt 7200
tgccttgaga gggttgatta tgataatgca tttggaaggt atcttgccaa cacgtattcc 7260
tcttacttgt tcttccatgt aatcacctta tacatgaacg ccctagactg ggatgaagaa 7320
aagaccatcc tagcattatg gaaagattta acctcagtgg acatcgggaa ggacttggta 7380
aagttcaaag accaaatatg gggactgctg atcgtgacaa aggactttgt ttactcccaa 7440
agttccaatt gtctttttga cagaaactac acacttatgc taaaagatct tttcttgtct 7500
cgcttcaact ccttaatggt cttgctctct cccccagagc cccgatactc agatgacttg 7560
atatctcaac tatgccagct gtacattgct ggggatcaag tcttgtctat gtgtggaaac 7620
tccggctatg aagtcatcaa aatattggag ccatatgtcg tgaatagttt agtccagaga 7680
gcagaaaagt ttaggcctct cattcattcc ttgggagact ttcctgtatt tataaaagac 7740
aaggtaagtc aacttgaaga gacgttcggt ccctgtgcaa gaaggttctt tagggctctg 7800
gatcaattcg acaacataca tgacttggtt tttgtgtttg gctgttacag gcattggggg 7860
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aaaatgatag ataagtccta ccaggagtgc ttagcaagcg acctagccag gaggatcctt 7980
agatggggtt ttgataagta ctccaagtgg tatctggatt caagattcct agcccgagac 8040
caccccttga ctccttatat caaaacccaa acatggccac ccaaacatat tgtagacttg 8100
gtgggggata catggcacaa gctcccgatc acgcagatct ttgagattcc tgaatcaatg 8160
gatccgtcag aaatattgga tgacaaatca cattctttca ccagaacgag actagcttct 8220
tggctgtcag aaaaccgagg ggggcctgtt cctagcgaaa aagttattat cacggccctg 8280
tctaagccgc ctgtcaatcc ccgagagttt ctgaggtcta tagacctcgg aggattgcca 8340
gatgaagact tgataattgg cctcaagcca aaggaacggg aattgaagat tgaaggtcga 8400
ttctttgctc taatgtcatg gaatctaaga ttgtattttg tcatcactga aaaactcttg 8460
gccaactaca tcttgccact ttttgacgcg ctgactatga cagacaacct gaacaaggtg 8520
tttaaaaagc tgatcgacag ggtcaccggg caagggcttt tggactattc aagggtcaca 8580
tatgcatttc acctggacta tgaaaagtgg aacaaccatc aaagattaga gtcaacagag 8640
gatgtatttt ctgtcctaga tcaagtgttt ggattgaaga gagtgttttc tagaacacac 8700
gagttttttc aaaaggcctg gatctattat tcagacagat cagacctcat cgggttacgg 8760
gaggatcaaa tatactgctt agatgcgtcc aacggcccaa cctgttggaa tggccaggat 8820
ggcgggctag aaggcttacg gcagaagggc tggagtctag tcagcttatt gatgatagat 8880
agagaatctc aaatcaggaa cacaagaacc aaaatactag ctcaaggaga caaccaggtt 8940
ttatgtccga catacatgtt gtcgccaggg ctatctcaag aggggctcct ctatgaattg 9000
gagagaatat caaggaatgc actttcgata tacagagccg tcgaggaagg ggcatctaag 9060
ctagggctga tcatcaagaa agaagagacc atgtgtagtt atgacttcct catctatgga 9120
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ctcatgtcag tacaggcagt ctttcactac ctgctattta gcccaatctt aaagggaaga 9360
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gccagtccta ccattctact caaggatgca atcagaaagg ctttatatga cgaggtggac 9720
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ggtagagaaa agtctcacca tatcggatca gctcaggggc tcttatactc aatcttagtg 10920
gcaattcacg actcaggata caatgatgga accatcttcc ctgtcaacat atacggcaag 10980
gtttccccta gagactattt gagagggctc gcaaggggag tattgatagg atcctcgatt 11040
tgcttcttga caagaatgac aaatatcaat attaatagac ctcttgaatt ggtctcaggg 11100
gtaatctcat atattctcct gaggctagat aaccatccct ccttgtacat aatgctcaga 11160
gaaccgtctc ttagaggaga gatattttct atccctcaga aaatccccgc cgcttatcca 11220
accactatga aagaaggcaa cagatcaatc ttgtgttatc tccaacatgt gctacgctat 11280
gagcgagaga taatcacggc gtctccagag aatgactggc tatggatctt ttcagacttt 11340
agaagtgcca aaatgacgta cctatccctc attacttacc agtctcatct tctactccag 11400
agggttgaga gaaacctatc taagagtatg agagataacc tgcgacaatt gagttctttg 11460
atgaggcagg tgctgggcgg gcacggagaa gataccttag agtcagacga caacattcaa 11520
cgactgctaa aagactcttt acgaaggaca agatgggtgg atcaagaggt gcgccatgca 11580
gctagaacca tgactggaga ttacagcccc aacaagaagg tgtcccgtaa ggtaggatgt 11640
tcagaatggg tctgctctgc tcaacaggtt gcagtctcta cctcagcaaa cccggcccct 11700
gtctcggagc ttgacataag ggccctctct aagaggttcc agaacccttt gatctcgggc 11760
ttgagagtgg ttcagtgggc aaccggtgct cattataagc ttaagcctat tctagatgat 11820
ctcaatgttt tcccatctct ctgccttgta gttggggacg ggtcaggggg gatatcaagg 11880
gcagtcctca acatgtttcc agatgccaag cttgtgttca acagtctttt agaggtgaat 11940
gacctgatgg cttccggaac acatccactg cctccttcag caatcatgag gggaggaaat 12000
gatatcgtct ccagagtgat agatcttgac tcaatctggg aaaaaccgtc cgacttgaga 12060
aacttggcaa cctggaaata cttccagtca gtccaaaagc aggtcaacat gtcctatgac 12120
ctcattattt gcgatgcaga agttactgac attgcatcta tcaaccggat caccctgtta 12180
atgtccgatt ttgcattgtc tatagatgga ccactctatt tggtcttcaa aacttatggg 12240
actatgctag taaatccaaa ctacaaggct attcaacacc tgtcaagagc gttcccctcg 12300
gtcacagggt ttatcaccca agtaacttcg tctttttcat ctgagctcta cctccgattc 12360
tccaaacgag ggaagttttt cagagatgct gagtacttga cctcttccac ccttcgagaa 12420
atgagccttg tgttattcaa ttgtagcagc cccaagagtg agatgcagag agctcgttcc 12480
ttgaactatc aggatcttgt gagaggattt cctgaagaaa tcatatcaaa tccttacaat 12540
gagatgatca taactctgat tgacagtgat gtagaatctt ttctagtcca caagatggtt 12600
gatgatcttg agttacagag gggaactctg tctaaagtgg ctatcattat agccatcatg 12660
atagttttct ccaacagagt cttcaacgtt tccaaacccc taactgaccc ctcgttctat 12720
ccaccgtctg atcccaaaat cctgaggcac ttcaacatat gttgcagtac tatgatgtat 12780
ctatctactg ctttaggtga cgtccctagc ttcgcaagac ttcacgacct gtataacaga 12840
cctataactt attacttcag aaagcaagtc attcgaggga acgtttatct atcttggagt 12900
tggtccaacg acacctcagt gttcaaaagg gtagcctgta attctagcct gagtctgtca 12960
tctcactgga tcaggttgat ttacaagata gtgaagacta ccagactcgt tggcagcatc 13020
aaggatctat ccagagaagt ggaaagacac cttcataggt acaacaggtg gatcacccta 13080
gaggatatca gatctagatc atccctacta gactacagtt gcctgtgaac cggatactcc 13140
tggaagcctg cccatgctaa gactcttgtg tgatgtatct tgaaaaaaac aagatcctaa 13200
atctgaacct ttggttgttt gattgttttt ctcatttttg ttgtttattt gttaagcgt 13259

Claims (10)

1.一种表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒，其特征在于，所述重组狂犬病病毒为在狂犬病病毒基因组的假基因区插入SFTSV Gn基因，该重组狂犬病病毒的基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种权利要求1所述的表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取SFTSV mRNA，反转录，得cDNA；
(2)以步骤(1)cDNA为模板，PCR扩增得Gn基因，所述Gn基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；
(3)用Pfl23Ⅱ和NheI双酶切pSAD质粒和步骤(2)Gn基因，切胶回收质粒载体和目的片段，连接后转化感受态细胞，经鉴定得阳性重组质粒pSAD-Gn；
(4)将步骤(3)阳性重组质粒pSAD-Gn转染BHK-21细胞，经培养收获上清，即得表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病毒的基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述反转录的反应体系为：SFTSV mRNA 2μL，5×反转录缓冲液4μL，2.5mmol/L的dNTP 4μL，10U/μL的RNase Inhibitor1μL，2.5U/μL的AMV反转录酶1μL，Random引物1μL，OligodT引物1μL，补加ddH2O至20μL；
反转录反应条件为：42℃反应1h。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的引物序列如下，上游引物中下划线部分为Pfl23Ⅱ酶切位点，下游引物中下划线部分为NheI酶切位点：
上游引物GnF：5′-TATACGTACGGCCACCATGATGAAAGTCATCTGG-3′，
下游引物GnR：5′-AAATGCTAGCTTAGCTCTCAGCAAGCCCTATT-3′；
PCR扩增的反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L的dNTP 4μL，25pmol/μL的上游引物1μL，25pmol/μL的下游引物1μL，cDNA 2μL，5U/μL的DNA聚合酶0.5μL，补加ddH2O至50μL；
PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；94℃变性20s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃保温10min。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述双酶切的反应体系为：10×缓冲液5μL，pSAD质粒/Gn基因2μg，Pfl23Ⅱ和NheI内切酶各2μL，补加ddH2O至50μL；
双酶切的反应条件为：37℃反应60min。
6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述连接的反应体系为：10×缓冲液2μL，切胶回收的目的片段100μg，切胶回收的质粒载体40μg，T4连接酶2μL，补加ddH2O至20μL；
连接的反应条件为：16℃反应2h。
7.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述感受态细胞为以下中的一种：Top10感受态细胞，Trans5a感受态细胞，Trans109感受态细胞，Trans110感受态细胞，Trans1-Blue感受态细胞；优选的，所述感受态细胞为Top10感受态细胞。
8.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述转染的步骤为：将BHK-21细胞铺板于6孔板，10％FBS的DMEM培养12-16h，转染时细胞密度为90％，阳性重组质粒pSAD-Gn的用量为2.0μg，辅助质粒用量为pSAD-N 0.5μg、pSAD-P 0.25μg、pSAD-L 0.1μg、pSAD-G 0.15μg；
所述的培养为：将转染后的BHK-21细胞置于37℃5％CO2培养箱中培养4-5天。
9.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述上清即为狂犬病和发热伴血小板减少综合征二联疫苗。
10.权利要求1所述的表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒在制备预防狂犬病和发热伴血小板减少综合征的二联疫苗中的应用。
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