CN107937606B - 一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽医病原微生物检测技术领域，公开了一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法。本发明所述试剂由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物、在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列上修饰有荧光基团1和淬灭基团的狂犬病毒疫苗株探针和在SEQ ID NO:4所示核苷酸序列上修饰有荧光基团2和淬灭基团的狂犬病毒野生型毒株探针组成。本发明提供了一组具备较高特异性和灵敏度的引物和探针试剂，通过所述试剂实现了准确鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的目的，弥补了现有一般病毒分离，血清学试验，RT‑PCR等方法较难区分野毒株与疫苗株的缺陷，可全面应用于狂犬病毒疫苗的安全性评价以及临床诊断中。

Description

一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法
技术领域
本发明涉及兽医病原微生物检测技术领域，具体涉及一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法。
背景技术
狂犬病毒(Rabies virus,RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA，是引起狂犬病的病原体。
狂犬病毒G蛋白是唯一可诱导机体产生中和抗体进行体液免疫的病毒结构蛋白，以前的研究已经确定G蛋白几个空间表位和线性表位。G基因编码524个氨基酸(AA)，在肽链的氨基端，前19个残基为信号肽，在成熟过程中，信号肽被切除，变为含505个AA的成熟G蛋白。它分为三个区域：膜外区，即抗原区(1～439AA)，位于病毒颗粒的表面；跨膜区(440～461AA)，由23个AA组成连续的疏水区域，与G蛋白在病毒的脂双层膜上的固定有关；膜内区(462～505AA)，由44个AA构成的羧基末端，位于病毒包膜的内表面，提供M和N相互作用的位点。
膜外区是G蛋白抗原性的主要区域，在该区域内，至少已确定有6个抗原表位，其中抗原位点Ⅱ和III最重要，抗原位点Ⅱ保守，由第34～42和第198～200位AA残基通过二硫键连接形成，它们受147和184位点AA残基的影响；抗原位点III也是由两个非连续区域构成，即330～338和357AA残基；表位I由23l位AA残基参与；表位Ⅳ由264位AA残基参与；表位V由254～275AA残基组成，是一个线性表位，在目前所测序的毒株中均保守，LHKFRSDE是其核心序列，L被P、Q或V及D被更小的氨基酸A、G取代后，可明显增强与单抗的结合效果，说明D有空间位阻效应。抗原位点a(minor site“a”)位于342～343位AA残基。在抗原位点III最关键和最易变化的AA在第333,336,338和357位，在抗原位点II是第198位AA上，它们不仅是病毒的中和抗原决定簇，是病毒中和抗体的主要结合部位，而且与病毒的感染和毒力直接相关，其中，第333位的精氨酸往往随着固定毒株致病性的失去而被异亮氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代。
在1990年，Dietzschold等人在ERA株上的G蛋白244～281位AA残基位点发现一个线性表位。然而，在1995年，Ni等人在几个实验室毒株发现，位于249和268位AA残基位点之间的序列构成一个线性表位，而且263位点的Phe是识别RG719单克隆抗体的必需AA残基。因此，狂犬病毒G蛋白第333位精氨酸往往随着野毒株致病性的失去而被异亮氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代。
目前检测狂犬病毒的实验室方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体方法(FAT)、快速荧光抑制灶技术(RFFIT)、反转录－聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等。但是这些方法不能区分野生型毒株和疫苗株，尤其缺乏对狂犬病毒疫苗株的鉴定方法，对于疫苗的安全性评价以及临床诊断等方面的应用存在不足，致使狂犬病毒疫苗使用存在一定的风险。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂，使得所述试剂能够准确鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株，并具备较高的特异性和灵敏度；
本发明的另外一个目的在于提供上述试剂在鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株以及在制备鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒中的应用；
本发明的另外一个目的在于提供基于上述试剂鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂，由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物、在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列上修饰有荧光基团1和淬灭基团的狂犬病毒疫苗株探针和在SEQ ID NO:4所示核苷酸序列上修饰有荧光基团2和淬灭基团的狂犬病毒野生型毒株探针组成。
作为优选，所述荧光基团1和荧光基团2选自HEX和FAM，且互不相同；所述淬灭基团选自MGB。
在本发明具体实施方式中，所述试剂中引物和探针序列如下：
上游引物TGACCACMAAGTCCGTGAGTTT；
下游引物AGCATCAGCCTCCATCAAGGT；
疫苗株探针5’HEX-GGAAAAGCATATACCATATTC–MGB 3’；
野生型毒株探针5’FAM-GGAAAGGCGTATACCATATT-MGB 3’；
用本发明所述试剂中的引物和探针进行快速检测，以国内分离的狂犬病毒CVS-11疫苗株、JX-08-45疫苗株和BD06野毒株核酸RNA为模板均可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如犬瘟热病毒核酸、犬冠状病毒核酸、犬轮状病毒核酸和犬细小病毒核酸和健康犬咽拭子总核酸为模板进行RPA反应均没有扩增曲线。同时，检测结果表明FAM通道仅对狂犬病毒野毒株进行扩增，Hex通道仅对狂犬病毒疫苗株进行扩增。表明本发明检测试剂能特异性扩增狂犬病毒并且能区分疫苗株与野毒株，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。
此外，在灵敏度试验中，检测结果表明本发明所述试剂具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度。试验结果表明，本发明所述试剂对于狂犬病毒野毒株和疫苗株的检测具有高度的灵敏性。而在实际临床样本检测中，本发明能够有效区分Rabigen狂犬病灭活疫苗株、宠必威犬猫狂犬病灭活疫苗株、Nobivac犬猫狂犬病灭活疫苗株和病犬组织以及健康犬组织中的狂犬病毒类型，而标准《SN/T 4087-2014狂犬病检疫技术规范》虽能检测出狂犬病毒，但不能分型，这些结果表明本发明能够区分临床上的未知野毒株和疫苗株，并非仅限于BD06野毒株与所列举的疫苗株。
基于上述优异的技术效果，本发明提出了所述试剂在鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株和/或在制备鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒中的应用。其中，在本发明具体实施方式中，所述狂犬病毒疫苗株为狂犬病毒CVS-11疫苗株、狂犬病毒JX-08-45疫苗株、Rabigen狂犬病灭活疫苗株、宠必威犬猫狂犬病灭活疫苗株或Nobivac犬猫狂犬病灭活疫苗株；所述狂犬病毒疫苗株野生型毒株为狂犬病毒BD06野毒株。
根据上述应用，本发明提供了一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒，包括本发明所述试剂。为了进一步完善所述试剂盒，其还可以包括狂犬病毒RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂和实时荧光定量PCR反应试剂。
所述狂犬病毒RNA提取试剂可包括本领域常规用于提取狂犬病毒株RNA的试剂的一种或多种，在本发明具体实施方式中，本发明狂犬病毒RNA提取试剂采用QIAGEN公司的供应Mini Kit中的各种试剂。
所述RT-PCR反应试剂和实时荧光定量PCR反应试剂可包括本领域常规RT-PCR以及实时荧光定量PCR反应体系中的试剂的一种或多种；在本发明具体实施方式中，采用OneStep PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)试剂盒中的2×One StepRT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ和DEPC H2O等，一步完成逆转录反应和实时荧光定量PCR。
本发明还根据应用提供了一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的方法，包括：
步骤1、提取待测狂犬病毒疫苗株或野生型毒株的RNA；
步骤2、将所述RNA采用本发明所述试剂进行进行RT和实时荧光定量PCR扩增；
步骤3、扩增完成后，在荧光基团1通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断狂犬病毒野毒株为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为狂犬病毒野毒株为阴性；
在荧光基团2通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为狂犬病毒疫苗株为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为狂犬病毒疫苗株为阴性。
在本发明具体实施方式中，所述步骤1可使用试剂公司出售的RNA提取试剂盒直接进行提取，如QIAGEN公司的试剂盒；也可以按照常规提取RNA的方法自行选择各试剂进行提取。
在本发明具体实施方式中，本发明采用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)试剂盒与本发明引物、探针以及模板RNA组成RT和实时荧光定量PCR反应体系(共20μl)，一步完成RT和实时荧光定量PCR，体系组成如下：
2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μl，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.4μl，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μl，20μM的引物各0.4μl，15μM的探针各0.4μl，模板RNA2μl和DEPC H2O 5.6μl。
在本发明具体实施方式中，所述RT和实时定量荧光PCR程序如下：
42℃5min，95℃10s反应；然后进行95℃5s，60℃35s，40个循环反应。
由以上技术方案可知，本发明提供了一组具备较高特异性和灵敏度的引物和探针试剂，通过所述试剂实现了准确鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的目的，弥补了现有的实验室检测方法如血清学试验、RT-PCR等方法较难区分野毒株与疫苗株的缺陷，可全面应用于狂犬病毒疫苗的安全性评价以及临床诊断中。
附图说明
图1所示为利用本发明所述引物和探针扩增不同核酸样本的实时荧光定量结果；其中，曲线A表示狂犬病毒CVS-11疫苗株核酸RNA，曲线B表示JX-08-45疫苗株核酸RNA，曲线C表示BD06野毒株核酸RNA；基线以下为其他病原核酸：犬瘟热病毒核酸、犬冠状病毒核酸、犬轮状病毒核酸和犬细小病毒核酸和健康犬咽拭子RNA；
图2所示为利用本发明所述引物和探针扩增狂犬病毒疫苗株和野毒株的实时荧光定量结果；其中，曲线A和B表示HEX通道下利用疫苗株探针扩增的曲线，曲线C表示FAM通道下利用野生型毒株探针扩增的曲线；
图3所示不同拷贝数的野生型毒株核酸RNA的实时荧光定量结果；其中，曲线从左至右所代表的拷贝数依次为106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl；
图4所示不同拷贝数的疫苗株核酸RNA的实时荧光定量结果；其中，曲线从左至右所代表的拷贝数依次为106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl。
具体实施方式
本发明公开了一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述试剂、应用和鉴定方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的试剂、应用和鉴定方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法做进一步说明。
实施例1：本发明所述试剂
RVGF(上游引物)：TGACCACMAAGTCCGTGAGTTT
RVGF(下游引物)：AGCATCAGCCTCCATCAAGGT
RVGVaP(疫苗株探针)：HEX-GGAAAAGCATATACCATATTC–MGB
RVGViP(野生型毒株探针)：FAM-GGAAAGGCGTATACCATATT-MGB
实施例2：本发明所述试剂特异性试验
材料：狂犬病毒CVS-11疫苗株、JX-08-45疫苗株和BD06野毒株、犬瘟热病毒核酸、犬冠状病毒核酸、犬轮状病毒核酸和犬细小病毒核酸、健康犬咽拭子，设置一个空白水对照。引物和探针采用实施例1中的试剂，均由上海生工生物技术有限公司合成，其他试剂均为生物纯试剂。
核酸提取：取200μl培养物或经2000g离心后的组织匀浆液，使用QIAGEN公司的RNeasy mini kit按照产品说明书提取各种材料中的RNA。
反应体系与反应条件：扩增使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(PerfectReal Time)(TaKaRa)试剂盒在20μl反应体系进行荧光扩增试验，首先在0.2ml离心管中加入2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ10μl，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.4μl，PrimeScriptRT Enzyme MixⅡ0.4μl，20μM的引物各0.4μl，15μM的探针各0.4μl，模板RNA 2μl和DEPCH2O 5.6μl，混匀.
将反应管置于荧光定量PCR仪中，42℃ 5min，95℃ 10s反应；然后进行95℃ 5s，60℃ 35s，40个循环反应。
扩增完成后，在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断狂犬病毒野毒株为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为狂犬病毒野毒株为阴性。在Hex通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为狂犬病毒疫苗株为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为狂犬病毒疫苗株为阴性。
用本发明所设计的引物和探针进行快速检测，以国内分离的狂犬病毒CVS-11疫苗株株、JX-08-45疫苗株株和BD06野毒株核酸RNA为模板均可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如犬瘟热病毒核酸、犬冠状病毒核酸、犬轮状病毒核酸和犬细小病毒核酸和健康犬咽拭子总核酸为模板进行反应均没有扩增曲线(图1)。
检测结果表明FAM通道仅对狂犬病毒野毒株进行扩增，Hex通道仅对狂犬病毒疫苗株进行扩增(图2)。表明本发明检测试剂能特异性扩增狂犬病毒并且能区分疫苗株与野毒株，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。
实施例3：本发明所述试剂灵敏度试验
体外转录制备狂犬病毒模板：
提取狂犬病毒病毒BD06野毒株RNA，以引物TGACCACMAAGTCCGTGAGTTT(SEQ ID NO:1)和AGCATCAGCCTCCATCAAGGT(SEQ ID NO:2)进行RT-PCR扩增，对PCR产物进行纯化后连接到pGEM-T载体上，重组质粒经鉴定方向后，提取质粒使用限制性酶酶切成线性，然后按照Invitro Transcription T7Kit(Takara)的说明书进行体外转录，产物经DNase I消化、3M的醋酸钠乙醇沉淀后，溶解于无RNase的水中，测定浓度后计算出对应拷贝数，依次从106拷贝/μl以10倍倍比稀释至10 0个拷贝/μl，按照实施例2中反应体系与反应条件进行试验，以测试引物探针的敏感性。
检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度(图3，图4)增加。试验结果表明，本发明试剂对于狂犬病毒野毒株和疫苗株的检测达到10 1个拷贝/μl，具有高度的灵敏性。
实施例4：本发明所述试剂的临床检测
按照实施例2方法对6份临床样品进行检测，同时与标准《SN/T 4087-2014狂犬病检疫技术规范》所述的荧光PCR方法进行比较，临床样品包括市售的疫苗以及采集的样品，结果显示(表1)，本发明方法与标准方法鉴定结果一致，并且能有效区分出疫苗株与野生型毒株，而标准方法虽能检测出狂犬病毒但不能区分出疫苗株和野生型。
表1临床样品检测结果
Figure BDA0001478524990000081
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure BDA0001478524990000091
Figure BDA0001478524990000101
序列表
<110> 深圳市福田区动物防疫监督所;深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
<120> 一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaccacmaa gtccgtgagt tt 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcatcagcc tccatcaagg t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaaaagcat ataccatatt c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaaaggcgt ataccatatt 20

Claims (7)

1.一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂，其特征在于，由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物、在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列上修饰有荧光基团1和淬灭基团的狂犬病毒疫苗株探针和在SEQ ID NO:4所示核苷酸序列上修饰有荧光基团2和淬灭基团的狂犬病毒野生型毒株探针组成；
所述荧光基团1和荧光基团2选自HEX和FAM，且互不相同。
2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，所述淬灭基团选自MGB。
3.权利要求1-2任意一项所述试剂在制备鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述狂犬病毒疫苗株为狂犬病毒CVS-11疫苗株、狂犬病毒JX-08-45疫苗株、Rabigen狂犬病灭活疫苗株、宠必威犬猫狂犬病灭活疫苗株或Nobivac犬猫狂犬病灭活疫苗株。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述狂犬病毒疫苗株野生型毒株为狂犬病毒BD06野毒株。
6.一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任意一项所述试剂。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括：狂犬病毒RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂和实时荧光定量PCR反应试剂。
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