CN109439803A - 狂犬病毒荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
发明涉及一种采用荧光PCR技术特异性检测样品中狂犬病毒核酸存在的试剂盒。利用本发明的试剂盒，可快速检测样品中是否存在狂犬病毒核酸，该试剂盒能够灵敏地检测并鉴别样品中存在的狂犬病毒，其检测下限为10拷贝每反应体系，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用荧光PCR技术特异性检测样品中狂犬病毒核酸存在的试剂盒，属于狂犬病毒的体外诊断领域。
背景技术
狂犬病毒（Rabies Virus）属于弹状病毒科狂犬病毒属。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。是引起狂犬病的病原体。狂犬病毒具有两种主要抗原：一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体，中和抗体具有保护作用；另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。
狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的传染病。多数动物实验证明，在潜伏期和发病期间并不出现病毒血症，狂犬病的发病过程可分为3个阶段：局部组织内繁殖期、侵入中枢神经期、向各器官扩散期。 狂犬病毒进入人体，沿周围传入神经而到达中枢神经系统，因此头、颈部、上肢等处咬伤和创口面积大而深者发病机会多。狂犬病毒主要存在于患病动物的延脑、大脑皮层、小脑和脊髓中。唾液腺和唾液中也常含有大量病毒，人被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂犬病，在特定条件下也可以通过呼吸道气溶胶传染。潜伏期长短不一，多数在3个月以内，国内报告平均66.9天。4~10%病人的潜伏期超过半年，1%超过1年，文献中最长的一例为6年。狂犬病一旦发病，死亡率几乎是100%。
在实验室检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以病毒培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。
本发明针对狂犬病毒特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-time RT-PCR的方法，用来鉴别检测样品中狂犬病毒核酸，可以快速获得特异性检测结果。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在狂犬病毒，提供一种特异性检测狂犬病毒的荧光PCR试剂盒。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种特异性检测样品中狂犬病毒的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有相关的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有逆转录酶和热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含有狂犬病毒检测靶序列的RNA。
PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对狂犬病毒基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1，Probe1为针对狂犬病毒基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团X1为FAM，荧光淬灭基团Y1为Eclipse（见表1）。
表1 检测狂犬病毒的引物和探针序列
本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测狂犬病毒的应用方法，包括：
试剂盒选用的PCR反应体系为20 µl，包括2×PCR缓冲液10 µl、10mmol/L dNTP 1.0 µl、25µmol/L引物各0.5 µl、10µmol/L 探针0.2 µl、逆转录酶和热启动Taq酶混合液0.8 µl、样品RNA 2 µl，加灭菌水至终体系20 µl。
试剂盒的PCR反应循环参数为逆转录阶段：42℃，10min；预变性阶段：94℃，10sec；预扩增阶段：变性 94℃，5sec；退火 50℃，20sec；延伸 72℃，20sec；共5个循环。注意本阶段不采集荧光信号。检测阶段：变性 94℃，5sec；退火 56℃，50sec；延伸 72℃，15sec；共40个循环。在退火步骤检测荧光信号。
质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。
结果判读：
阳性：出现“S”型扩增曲线，Ct值≤35；可疑：出现“S”型扩增曲线，但Ct值＞35；阴性：没有出现“S”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“S”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“S”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
样本要求：临床样本类型包括唾液、脑脊液和病毒培养物；临床样本采集后应带冰运输，-20℃保存，不能反复冻融；从临床样本提取RNA，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的RNA应立即检测，否则，应将RNA分装后-80℃～-20℃保存。
本发明提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出狂犬病毒的核酸，但不能检出非狂犬病毒病原体的核酸；对狂犬病毒核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需要2小时即可完成检测，可为狂犬病毒的疾病监测和临床诊断提供实验依据。
附图说明
图1为单重实时荧光PCR检测狂犬病毒核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右的5条曲线分别为狂犬病毒体外转录RNA梯度稀释后（2×106-2×102 copies/µl）扩增结果。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的△Rn值。
图2为单重实时荧光PCR检测体系对狂犬病毒核酸检测特异性扩增曲线图。狂犬病毒出现S型扩增曲线，而其他病原微生物质控毒株均未出现S型扩增曲线。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的△Rn值。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
1、引物和Taqman探针的设计与合成
利用Blast工具对Genbank和国内外文献中所有的狂犬病毒基因组序列进行分析，分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列，并针对检测靶序列设计和合成引物和探针（见表1）。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中狂犬病毒的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团。
2、检测菌种的准备
本实施例中所使用的狂犬病毒以及其他阴性对照毒株（脊髓灰质炎病毒，腮腺炎，腺病毒3型、7型，肠道病毒，麻疹病毒，风疹病毒，单纯疱疹病毒，流行性乙型脑炎病毒）均购买于中国药品生物制品检定所。
3、菌株RNA的抽提
选用德国QIAGEN公司生产的核酸提取或纯化试剂 QIAamp DSP Virus Spin Kit (国械备20140008 QIAGEN GmbH)提取毒株RNA。具体步骤参考试剂盒操作说明书。
4、引物和探针的筛选
采用设计的引物和探针分别检测提取的狂犬病毒和阴性对照毒株的基因组RNA，经反复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合（见序列表，狂犬病毒正向引物P1、反向引物P2和探针Probe1）。
5、标准品的构建与制备
分别利用P1、P2引物，RT-PCR扩增狂犬病毒特异性基因片段，并克隆至含有T7启动子序列的质粒（如pGEM-T easy vector），使用大连宝生物公司的RNA Polymerase，合成RNA，加入无RNA酶的胰DNA酶I以终止体外转录反应，通过用酚：氯仿抽提纯化RNA。利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处的吸光率，然后计算RNA浓度与纯度，然后10倍梯度稀释至200拷贝每微升。
6、反应条件优化
对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为：2×PCR缓冲液10 µl、10mmol/LdNTP 1.0 µl、25µmol/L引物各0.5 µl、10µmol/L 探针0.2 µl、逆转录酶和热启动Taq酶混合液0.8 µl、模板2ul，加灭菌水至终体系20 µl。
根据扩增片段长短、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应的退火温度和延伸时间进行了优化，最终确定循环参数为：逆转录阶段：42℃，10min；预变性阶段：94℃，10sec；预扩增阶段：变性 94℃，5sec；退火 50℃，20sec；延伸 72℃，20sec；共5个循环。注意本阶段不采集荧光信号。检测阶段：变性 94℃，5sec；退火 56℃，50sec；延伸 72℃，15sec；共40个循环。在退火步骤检测荧光信号。
在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。
7、检测限的评价
以上述5中的阳性标准品评价本发明提供的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度为：2×106copies/µl、2×105copies/µl、2×104copies/µl、2×103copies/µl、2×102copies/µl，本发明提供的试剂盒对狂犬病毒核酸的检测下限为10拷贝每反应体系。
8、检测特异性的评价
以上述2中的毒株RNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对狂犬病毒RNA进行检测时均可见明确的扩增曲线，对上述9种其他嗜神经常见病原微生物RNA检测时，未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他毒株之间不存在交叉反应。
尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光报告基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、HEX、TAMRA、ROX 、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LCGreen等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测狂犬病毒的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。
序列表
<110> 湖北金雀医学检验实验室有限公司
<120> 狂犬病毒荧光PCR检测试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> 狂犬病毒(Rabies virus)
<400> 1
ctggcagayg ayggaac 17
<210> 2
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 狂犬病毒(Rabies virus)
<400> 2
catcatgatt cgagtatara cagc 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 狂犬病毒(Rabies virus)
<400> 3
tctgaygacg aggaytactt ctcmgg 26
Claims (3)
1.一种用于特异性检测样品中狂犬病毒的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品，PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下：
P1：5`-CTGGCAGAYGAYGGAAC-3`，
P2：5`-CATCATGATTCGAGTATARACAGC-3`，
PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下：
Probe1：5`-X1-TCTGAYGACGAGGAYTACTTCTCMGG-Y1-3`，
Probe1荧光报告基团X1为FAM，荧光淬灭基团Y1为Eclipse。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系为20 µl，包括2×PCR缓冲液10 µl、10mmol/L dNTP 1.0 µl、25µmol/L引物各0.5 µl、10µmol/L 探针0.2 µl、逆转录酶和热启动Taq酶混合液0.8µl、样品RNA 2 µl，加灭菌水至终体系20 µl。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应循环参数为：
逆转录阶段：42℃，10min；预变性阶段：94℃，10sec；预扩增阶段：变性 94℃，5sec；退火 50℃，20sec；延伸 72℃，20sec；共5个循环；注意本阶段不采集荧光信号；
检测阶段：变性 94℃，5sec；退火 56℃，50sec；延伸 72℃，15sec；共40个循环；在退火步骤检测荧光信号。
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