CN104611420A

CN104611420A - 一种结核菌检测试剂盒

Info

Publication number: CN104611420A
Application number: CN201510000645.XA
Authority: CN
Inventors: 李沛祥; 王倩; 高源远; 刘德斌; 印思源; 李军
Original assignee: NANJING AIBIMENG BIOLOGICAL MATERIAL Co Ltd
Current assignee: NANJING AIBIMENG BIOLOGICAL MATERIAL Co Ltd
Priority date: 2015-01-04
Filing date: 2015-01-04
Publication date: 2015-05-13

Abstract

本发明公布了一种检测结核菌的qPCR引物，包括(1)扩增结核分枝杆菌Insertional Sequence 6110基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；(2)扩增阳性对照β-actin基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示，属于生物工程技术领域。本发明还公布了上述引物在制备结核菌检测试剂中的应用，以及结核菌检测试剂盒在制备检测结核病试剂中的应用。本发明对结核菌DNA检测特异性强，解决了DNA结合荧光染料qPCR用于分子诊断时存在的非特异信号扩增和二聚体形成等问题，具有检测成本低、应用范围广等优点。

Description

一种结核菌检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种结核菌的检测试剂盒。

背景技术

全球目前约有20亿人感染结核菌，每年新出现的结核病患者约800～1000万，年死亡人数高达三百万。虽然结核病已经不是过去那种能够让人“十痨九死”的瘟神了，但近20年来结核病在世界范围内出现暴发流行而呈现“复燃”，其主要原因就是耐药结核菌株的产生和缺乏快速准确的诊断方法。作为结核病“大国”，中国有近一半人口感染了结核菌，现有结核病患者500万，每年新增患者150万。与病毒性传染病如艾滋和肝炎病不同，目前已有多种有效抗结核药物。因此，控制结核病复燃的关键在于研发出快速、可靠的结核菌检测技术。因为只有病人得到快速、准确地检测，才能得到及时而且合理的治疗，从而有效地控制住结核病传播，而现如今，基因检测技术的迅速发展为结核病及耐药结核的快速诊断提供了技术可能性。

长期以来，传统的结核病实验方法主要包括以下四种：1)痰涂片检查：操作简便，价格低廉，可以迅速得到初步结果，但敏感性极低；2)免疫诊断方法：操作相对简单可行，敏感性高，但特异性较差；3)菌培养：特异性及敏感性都较强，最大缺点就是结核菌生长缓慢，耗时太长，病人往往不能得到及时诊治。虽然近些年来新型培养基能够快速提高结核菌的生长速度，但仍需2-3周的时间，同时新型培养基还需要价格昂贵的先进设备，因而不能被各级卫生机构广泛应用；4)分子诊断方法：包括探针杂交及基因芯片技术，虽然这种诊断方法已经大大提高了对结核病及其耐药性的检测速度，但仍需2-3天。同时，其操作过程繁琐，在高通量检测方面有相当的局限性。

近年来发展起来的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR,)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子诊断研究中的重要工具。

目前real-time PCR(也称qPCR)所使用的荧光化学方法主要包括探针法(TaqMan探针)和双链DNA结合荧光染料发光法。探针法具有特异性高，敏感性强等特点，正在被广泛地应用于各类疾病的分子检测，同时也可应用于单个核苷酸突变检测。然而探针法由于其价格昂贵，在大多数传染病高发的发展中国家，无法广泛应用于HIV、HPV和结核病这类潜性感染性的，需要在人群中进行广泛普查的传染性疾病。双链DNA结合荧光染料发光法，主要包括SYBR I染料法和近年兴起的更为敏感的Eva Green染料法，与探针法相比，这种方法的成本更为低廉。但是，双链DNA结合荧光染料发光法具有一个显著的缺点，即其特异性非常容易受到非特异性基因扩增和引物二聚体形成的影响。虽然目前该技术已广泛应用于国内外的科学研究实验，但其成功应用于临床检测尚为罕见，更没有用于结核病分子诊断。因而，改进和完善成本相对较低的荧光染料结合定量PCR方法对于许多传染性疾病的防治具有重大意义，对于分子诊断能尽早地应用于广大基层医院也有重要的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测结核菌的qPCR引物。

本发明还要解决的技术问题是，提供包含上述引物的结核菌检测试剂盒。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述结核菌检测试剂盒的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

检测结核菌的qPCR引物对，包括如下引物序列：

(1)扩增结核分枝杆菌Insertional Sequence 6110基因的引物，其核苷酸序列如SEQID NO：1～2所示；

(2)扩增阳性对照β-actin基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。

上述的检测结核菌的qPCR引物在制备结核菌检测试剂中的应用在本发明的保护范围之内。

一种结核菌检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物对，即SEQ ID NO：1～2和SEQ IDNO：3～4。

更优选的是，上述结核菌检测试剂盒包括如下试剂：qPCR缓冲液、dNTP混合液，单链DNA结合蛋白、尿嘧啶-DNA糖基化酶、DNA聚合酶、与DNA聚合酶特异性结合的单克隆抗体和Eva Green荧光染料，其中，所述的dNTP混合液为将dATP、dGTP、dCTP和dUTP按照等摩尔数混合的水溶液。

其中，所述的qPCR缓冲液的组成如下：KCl 50mM，Triton X-100 0.5％v/v，BSA0.5mg/ml，MgSO₄7.5mM，Glycerol 17.0％v/v，(NH₄)₂SO₄50mM，Tris-H₂SO₄150mM，pH为9.75。

其中，所述的qPCR缓冲液的pH为强碱性pH。现有技术中常用的PCR扩增缓冲液pH位于6.8-8.5之间，该pH范围是目前已有的各类DNA聚合酶最佳反应pH区间，也是引物之间相互配对结合的最佳pH条件，因此这个pH范围虽然能使各DNA聚合酶发挥最佳酶活，也更容易产生引物二聚体。将qPCR缓冲液调整至强碱性pH 9.75，减少引物之间错误配对，对抑制引物二聚体形成有非常积极的作用。

其中，所述的DNA聚合酶是一种能够耐受强碱性pH的酶，与现有技术中的各种DNA聚合酶不同，它仅在pH为9.6～10.1的条件范围内才具有酶活性，因此该DNA聚合酶能够在上述的强碱性的qPCR缓冲液发挥最佳酶活性。

其中，所述的与DNA聚合酶特异性结合的单克隆抗体，能够与DNA聚合酶结合，使DNA聚合酶具有热启动功能，消除qPCR反应前引物二聚体及其它非特异性扩增。PCR反应前和升温过程中，多数DNA聚合酶仍有一定活性，易发生引物错配和加速引物二聚体形成，继而导致非特异性产物的扩增。但是，若是在PCR反应体系中加入DNA聚合酶特异性单克隆抗体使之成为热启动DNA聚合酶，热启动DNA聚合酶PCR反应前和升温过程中结合了单克隆抗体而失去酶活性，PCR反应开始后升温至94℃使单克隆抗体发生变性，酶被释放到反应体系中发挥聚合酶的作用，这样就消除了反应起始时的非特异性扩增并且提高了整个反应的特异性。

其中，所述的单链DNA结合蛋白来源于嗜热菌，该蛋白高度耐热，半衰期为95℃，2小时，因此它在qPCR反应体系中能够有效地阻止单链DNA引物之间相互结合从而避免引物二聚体形成。单链DNA结合蛋白不能与PCR产物双链DNA结合，从而不会影响到qPCR正常反应。且该蛋白高度耐热，这样就保证了它能够在整个qPCR多次循环后保持其与单链DNA如引物相结合的活性。

其中，所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶(简称UDG酶)能够彻底消除qPCR反应中常见交叉污染，以保证实验结果的可靠性。qPCR反应常常出现假阳性结果的另一主要原因就是来自PCR产物的污染，控制这种情况的发生的有效方法之一就是在qPCR反应中用dUTP取代dTTP，同时使用在qPCR反应体系中加入UDG酶。这样扩增出来的PCR产物DNA片段中就会含有dUTP，若有来自包含有dUTP的PCR产物DNA交叉污染，加入qPCR反应中的UDG酶会选择性地将UTP降解下来而不会破坏含有正常胸腺嘧啶的DNA模板，从而消除来自前面PCR反应产物的污染。UDG酶不耐热，qPCR起始后的高温条件下可使其失活而不会影响到后续qPCR产物的继续扩增。

上述结核菌检测试剂盒在制备检测结合病试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

有益效果：

(1)本发明对结核菌DNA检测特异性强，解决了DNA结合荧光染料qPCR用于分子诊断时存在的非特异信号扩增和二聚体形成等问题。

(2)使用的Eva Green双链DNA荧光染料也较SYBR I染料更为敏感，本发明具备了特异性高，敏感性强的特点。

(3)本发明将双链DNA结合荧光染料qPCR检测方法应用于结核菌诊断，为结核病防治提供了快速准确的分子检测手段，同时大大降低了检验成本。

附图说明

图1引物二聚体形成示意图。

图2标准品结核菌DNA qPCR扩增。

图3CT值结核菌浓度换算标准曲线。

图4IS6110基因特异性引物扩增。

图5IS6110基因特异性引物扩增产物凝胶电泳分析。

图612例临床样本β-actin基因qPCR扩增结果。

图712例临床样本β-actin基因qPCR产物溶解曲线分析。

图812例临床样本IS6110基因qPCR扩增。

图912例临床样本IS6110基因qPCR扩增产物溶解曲线分析。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当，也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中所用的引物由Integrated DNA Technology(Coraville,Iowa,USA)公司合成。以下实施例中所用的Eva Green qPCR Mastermix试剂盒购自加拿大应用生物材料有限公司(温哥华，加拿大)。加拿大应用生物材料有限公司系该发明人在温哥华创建的公司，Eva Green qPCR Mastermix试剂盒中包含了2X Mastermix-R试剂。2XMastermix-R试剂中已经包含了pH 9.75的碱性qPCR缓冲液、单链DNA结合蛋白、尿嘧啶-DNA糖基化酶、DNA聚合酶、聚合酶单克隆抗体、Eva Green荧光染料、dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dUTP)所有的组分。

实施例1：引物设计。

双链DNA结合荧光染料qPCR方法，长期以来之所以不能广泛地应用到临床诊断上去的原因就是因为引物二聚体信号噪音干扰，这是这一技术长期以来未能被攻克而面临的技术难关。原因是基因顺序只有ACGT四个碱基，无论怎样设计qPCR反应引物，两个20bp左右长度的引物总会有至少一个或多个碱基在不同位点相匹配，包括连续性和非连续性碱基配对(图1)。这种碱基配对可以发生在两个不同引物(上游和下游)之间，或同一引物发生自行配对，一旦发生配对，双链DNA结合荧光染料如SYBR I和EvaGreen就会结合上去，从而在qPCR反应中产生微量荧光，导致qPCR反应CT值有35及其以下的非特异信号扩增。根据这些为数不多碱基匹配的位置不同，有时qPCR反应体系中的DNA聚合酶还能够对已形成的引物二聚体做进一步扩增延长，以致有时二聚体引物信号CT值可低至25左右，因而会严重干扰实验结果的判读，因此，长期以来双链DNA结合荧光染料qPCR方法无法广泛地应用于临床诊断。

通过Muscle and Coffee(MUSCLE 3.8.31for 64-bit linux，http://www.drive5.com/muscle/downloads3.8.31/muscle3.8.31_i86linux64.tar.gz；T-COFFEE Version_11.00.8cbe486，http://www.tcoffee.org/Packages/Stable/Latest/)软件进行系统结核菌基因组生物信息学分析，选择结核分支杆菌基因组内与人及其它微生物基因组DNA顺序不同源的Insertional Sequence 6110(IS6110)基因片段为靶目标，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

应用Oligo7软件，设计IS6110基因的qPCR引物，得到的引物序列如SEQ ID NO：1～2所示。

IS6110基因上游引物：5’-AGGTGGTTCATCGAGGAGGTAC-3’

IS6110基因下游引物：5’-ACCCACTTACGCACCGTCTC-3’

利用该引物扩增片段的长度为156bp，扩增出的基因序列如SEQ ID NO：6所示。

以β-actin基因作为内参基因，同样应用Oligo7软件,设计出β-actin基因的qPCR引物，其序列如SEQ ID NO:3～4所示，该引物对扩增出来的片段长度为125bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

β-actin基因上游引物：5’-GATTCCTATGTGGGCGAC-3’；

β-actin基因下游引物：5’-TTGTAGAAGGTGTGGTGCC-3’。

实施例2：标准曲线的制定。

本实施例中采用结核菌科研中常用的H37RV菌株作为标准菌株，计算结核菌标准定量曲线。为了获得准确的结核菌标准定量曲线，结核菌标准浓度由DNA定量和倍比稀释菌落培养两个方法来确定，从而增加数据的准确度和可靠性。

按照如下方法培养H37RV菌株：将H37RV菌株接种在结核菌培养皿中培养，待培养基上形成单个菌落后，取单个菌落接种于5ml结核菌培养液中，在摇床中培养12h。培养结束后，取2ml菌液用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京康为)提取结核菌DNA，与此同时，取0.5ml菌液用菌落培养方法来确定原始菌液中结核菌的浓度。

(1)DNA定量测定结核分枝杆菌的浓度。

提取标准品结核菌DNA后，运用紫外分光光度计进行浓度测定，然后根据结核菌基因组分子量计算出原始菌液中的细菌浓度。将结核菌DNA进行10倍浓度梯度稀释，分别稀释得到含有10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸个/ml结核菌基因组DNA，每个浓度实验设计2个重复，并设阴性空白对照，利用SEQ ID NO1～2中的引物对结核菌IS6110基因进行qPCR扩增，qPCR反应体系及PCR条件见表1和表2所示。Eva Green结核菌实时荧光定量qPCR检测如图2所示。利用平均CT值作图可得到标准曲线(见图3)。从图3分析可得出标准曲线检测的直线方程，相关系数是0.999，通过标准曲线的斜率(S＝-3.46)可以计算出扩增效率E(E＝10^-1/s-1)。

表1结核菌IS6110基因检测qPCR体系

表2 qPCR反应条件

UDG处理	37℃，10分钟
		DNA预变性	95℃，10分钟

变性	95℃，3秒钟
		退火/延伸	60℃，30秒钟
循环次数	40

(2)菌落定量测定结核分枝杆菌的浓度。

取0.5ml隔夜摇菌标准品按下述方法进行稀释，进行分析测定菌落而推算出菌液实际结核分枝杆菌浓度。

0.5ml标准品加至4.5ml生理盐水(10X稀释)

0.5ml10X稀释液加至4.5ml生理盐水(100X稀释)

0.5ml100X稀释液加至4.5ml生理盐水(1000X稀释)

0.5ml1000X稀释液加至4.5ml生理盐水(10000X稀释)

将上述稀释液充分混匀，每一稀释浓度分别取100μl混匀涂布在结核分枝杆菌固体培养基上，使菌液均匀平铺于平板上。置于37℃培养箱中，5％CO₂，静置培养3周，待结核菌菌落清晰可见后，计算结核菌浓度(CFU/ml＝2X菌落数X稀释倍数)。实验证明，通过菌落方法所测定的结核菌浓度与应用DNA定量方法所获得的理论结核菌浓度的误差在30％之内，证明DNA定量测定结核分枝杆菌的浓度可以应用于结核菌qPCR定量检测。*注：计算结果时选择以培养皿中含有30个到300个菌落之间的稀释倍数为准。

实施例3：检测结果分析方法。

待测标本中结核分枝杆菌最终浓度是以qPCR各样本反应结果的CT值来代表。样本CT值代表痰液内结核菌浓度的高低，CT值越高，样本内结核菌浓度越低。CT值小于35的标本qPCR检测结果都为结核分枝杆菌阳性，对于CT值大于35或无扩增的实验结果，在确认阳性对照β-actin基因扩增CT值小于35时即可判为结核分枝杆菌阴性。所有阳性对照β-actin基因扩增CT值大于35的实验结果为实验程序或操作错误，结核菌检测结果判定无效，应重新调整实验程序一直到阳性对照β-actin基因扩增CT值小于35才能做进一步结核菌实验检测。

实施例4：引物扩增特异性分析。

由于双链DNA结合荧光染料qPCR方法用于临床诊断的主要缺点在于非特异扩增与引物二聚体信号扩增。因此，该专利技术的主要技术改进主要是通过权利要求中所列各项独特实验设计来增加双链DNA结合荧光染料qPCR方法的特异性。

为进一步验证引物在实际样本检测中的特异性，运用本发明qPCR反应体系对人类基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA分别进行了检测。与无模板阴性对照一致，两种基因组模板检测结果CT值均为未检出，PCR产物凝胶电泳也未见任何条带。而用上述方法从结核杆菌液提取的DNA标准品经上述方法检测则显示为阳性(图4)，其CT值为24左右，溶解曲线分析为单峰。将PCR产物用于2％凝胶电泳可以得到大小为156bp的目的基因扩增条带，没有任何引物二聚体形成和模板非特异扩增(图5)。说明本专利技术所用引物与人及大肠杆菌基因组DNA无交叉反应，扩增为特异性。

实施例5：结核病人痰液标本实验。

本发明通过对现有双链DNA结合荧光染料qPCR技术的创新改进开发出一种新型实用结核菌双链DNA结合荧光染料qPCR检测试剂盒。该试剂盒包括两个反应体系：一个是结核菌检测反应，一个是样本制备及操作流程正确与否的监控反应体系。

以下结合12例结核病人痰液标本具体实施qPCR检测对本发明作进一步的说明与验证。但本专利技术并不局限于痰液标本应用，也同样适应于其他各类临床样本结核菌分子检测，包括对痰液、尿液、脊髓液、胸水、腹水、脓液，病理组织等标本的结核菌检测。

qPCR反应实验：临床结核病人样本12例，每例同时包括一个质控反应(β-actin阳性对照)，qPCR反应总体系为20μl。

本实施例中的实验样本来自于12例临床上已经被诊断为结核病人的痰液，痰液样本DNA按下列步骤提取：

a)痰液样本预处理：从每份痰液样本中取50μl移入1.5ml离心管中。在每个样本中加入200μl本试剂盒中的痰液液化剂(abm,温哥华，加拿大)，37℃水浴孵育30分钟，检查样本变得完全澄清无旋浊，无痰丝。

b)将步骤a)中经过预处理的样本在12000g条件下，离心10分钟，然后弃上清；再使用1.0ml 100mM的Tris-HCl缓冲液洗涤沉淀，重复以上步骤2次。

c)在沉淀中加入DNA提取液50μl，沸水浴煮10分钟，12000g离心10分钟，收集上清即为待检样本DNA溶液。应用Nanodrop 1000Spectrophotometer仪器测定所有样本DNA溶液浓度，所得DNA溶液的浓度应在15-120ng/μl之间才能满足qPCR检测的条件。取20μlDNA溶液直接进行后续qPCR检测，将剩余DNA溶液保存在-20℃冻存以备将来其它检查使用。

β-actin阳性对照qPCR反应体系中各组分的添加量如表1所示，结核菌IS6110基因检测qPCR体系中各组分的添加量如表2所示，按下述表3条件运行qPCR反应：

表1 β-actin阳性对照qPCR反应体系

表2结核菌IS6110基因检测qPCR体系

表3 qPCR反应条件

UDG处理	37℃，10分钟
		DNA预变性	95℃，10分钟
变性	95℃，3秒钟
		退火/延伸	60℃，30秒钟

循环次数

40

实施例6：qPCR检测结果与溶解曲线分析。

样本DNA浓度及质量检测：依据阳性对照β-actin基因的qPCR测试结果判断原始样本DNA的提取质量和相对浓度是否可靠以及实验操作是否正确。12例临床样本β-actin基因阳性对照检测结果显示12例病人样本β-actin基因扩增CT值均小于30(图6)，溶解曲线分析为单一峰值(图7)，证明样本DNA提取质量和实验操作正确，检测结果可以得到正确判读(表1)。

表1 12例结核病人痰液样本结核菌qPCR检测结果

注：*UD代表未检出。

病人痰液样本结核杆菌检测：通过IS6110基因qPCR扩增(图8)显示在所检测的12例病人痰液样本中，两例病人IS6110基因没有扩增，证明样本结核菌阴性，与临床菌培养检验结果一致,溶解曲线分析为形态清晰可辨的唯一单一峰值(图9)，证明其特异性准确非常可靠。其余10例病人结核菌样本均为阳性，但其中1例菌培养仍为阴性，说明该发明技术较目前的菌培养方法检测结核菌更为敏感。然而该例病人样本qPCR扩增CT值为27.99，与其它所有样本相比，CT值最高，证明其样本中结核菌浓度较其他病人低。

Claims

1.检测结核菌的qPCR引物对，其特征在于，包括如下引物序列：

2.权利要求1所述的检测结核菌的qPCR引物在制备结核菌检测试剂中的应用。

3.一种结核菌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：qPCR缓冲液、dNTP混合液、单链DNA结合蛋白、尿嘧啶-DNA糖基化酶、DNA聚合酶、聚合酶单克隆抗体、Eva Green荧光染料，其中，所述的dNTP混合液为将dATP、dGTP、dCTP和dUTP按照等摩尔数混合的水溶液。

5.根据权利要求4所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，所述的qPCR缓冲液的组成如下：KCl 50mM，Triton X-1000.5％v/v，BSA 0.5mg/ml，MgSO₄7.5mM，Glycerol17.0％v/v，(NH₄)₂SO₄50mM，Tris-H₂SO₄150mM，pH为9.75。

6.根据权利要求4所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA聚合酶为耐强碱性pH的DNA聚合酶。

7.根据权利要求4所述的结核菌检测试剂盒，其特征在于，所述的单克隆抗体为与DNA聚合酶特异性结合的单克隆抗体。

8.权利要求3～7中任一项所述的结核菌检测试剂盒在制备检测结核病试剂中的应用。