CN103667425A - 检测结核菌的方法及试剂盒 - Google Patents

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陈子智
陈文彬
曹郁屏
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明提供一种检测结核菌的引物。本发明还提供了一种检测结核菌的方法,其步骤是用环介导核酸等温扩增法对检体中结核菌的IS6110基因扩增,得到大量核酸片段,再用电泳胶、焦磷酸镁混浊法或SYBRGreen荧光法等方法检测扩增后的核酸片段,可正确有效的检测出检体是否有结核菌。本发明另外提供了一种检测结核菌的试剂盒。

Description

检测结核菌的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用来检测结核菌的引物,尤其是用环介导核酸等温扩增法检测结核分枝杆菌的引物对。
背景技术
[0002] 结核病 是一个世界性关注的疾病,在1993年4月,世界卫生组职宣布结核病为一个全球性紧急疾病,呼吁各国共同合作防治。根据世界卫生组织(WHO)的估计,目前全世界约有三分之一人口已经遭受结核菌感染,全世界几乎每一秒钟就有一个人新发生结核病,也导致全世界每年将近两百万人死于结核病。另外,估计今后十年还可能会有三亿人受到感染,94万人发病,三千万人因此死亡。此外,台湾卫生署疾病管制局统计,2007年台湾所有法定传染病患病人数总计4932人,其中结核病就有1448人,约占全部的三分之一。
[0003] 结核病的病原是结核分枝杆菌复合体(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC),包含有 M.tuberculosis、M.bovis> M.africanum、M.microti 及 M.canetti,其中在人体中造成结核病的最主要病菌为结核分枝菌(M.tuberculosis),而遭受结核菌感染的最主要部位为肺部。然而,一般人受到感染后不一定会发病成为结核病患者,只有十分之一会发病称初次感染(primary TB),其余的人为结核菌潜伏感染(latent tuberculosisinfection, LTBI),这些人可能终其一生都不会发病,但是约有5%的人因免疫力的的改变而发病称活动性肺结核(Reactivation TB),若能对“潜伏结核感染者”及早进行诊断,将有效监控、并减少结核病传染。
[0004]目前临床上诊断结核病的方法,主要方式包括涂片耐酸性染色镜检及结核菌培养,其中涂片镜检虽然简单,但是敏感度较低,只有50%至60%,通常在痰检体中,需要至少一万只的结核菌,才可以在显微镜下被发现;使用结核菌培养法,其特异性虽然很高,但是需要六到八周的时间才能得到确定诊断,因此这些缺点限制了这两种方法在诊断及治疗上的时效及功效性。目前,虽有许多使用PCR方法检测结核杆菌,但其敏感度只有60%到80%左右,且所需时间也要六至七小时,因此临床上迫切需要一种更快、更准确的诊断方法,为医师提供早期诊断及治疗的数据。
发明内容
[0005] 从所述背景技术中得知,在现有的结核菌检测技术中,存在操作程序复杂、诊断时间长、测试敏感度低等缺点,本发明提供一种快速、灵敏、准确的结核菌检测方法。
[0006]为克服现有技术的不足,本发明提供一种检测临床检体中结核菌的引物对,尤其是用环介导等温核酸扩增法(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)来检测结核菌的新颖的引物对,包括SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 6,此引物对可检测检体中单个结核菌的IS6110基因,具有高灵敏性。
[0007] 本发明又提供一种快速检测结核菌的方法,其中是以细胞分解试剂处理样品后,不进行DNA萃取,直接进行核酸增幅。包括下列步骤:(a)用细胞分解试剂处理样品;
(b)将该样品与引物混合,其中该引物包括SEQ ID NO: 1~ SEQ ID NO: 6的一种或几
种;
(c)用核酸扩增技术放大该样品标的DNA ;
(d)检测该标的DNA ;
其中该核酸增幅方法为环介导等温核酸扩增法。
[0008] 在具体实施例中,步骤(b)所使用的引物是一组外引物对,序列为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO: 2,及一组内引物对,序列为SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4,在较佳实施例中,步骤(b)同时加入一对环形引物,序列为SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6,用以加强扩增标的产物。
[0009] 本发明为解决现有技术的缺点所采用的技术手段主要为利用一种细胞分解试剂处理样品,并利用结核菌IS6110基因的引物对用环介导等温核酸扩增法检测结核菌。
[0010] 本发明另外提供一种检测结核菌的试剂盒,包括:
(a)引物,选自:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ IDNO: 5或SEQ ID NO: 6所构成的群组;及
(b)核酸扩增 试剂。
[0011] 其中该核酸扩增试剂是环介导等温核酸扩增剂,其中该引物是SEQ ID NO: USEQID NO: 2、SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4。较佳的实施例中,该引物进一步包括SEQ IDNO: 5 及 SEQ ID NO: 6。
[0012] 本发明可带来以下技术效果:快速、高效、准确及灵敏的结核菌检测方法。
附图说明
[0013]图1至图3为检测疑似结核病患者临床检体的结果,其中“一”是结核菌培养为阴性检体;“ + ”是结核菌培养为阳性检体;“NC”是阴性对照组及“M”是DNA标准品。
具体实施例
[0014] 为了能更好的让本领域技术人员了解本发明的目的、特征及优点,举出以下实施例。
[0015] 用本发明的新颖的引物对来检测结核菌的方法实际上主要包括三步骤:
〈一〉细胞分解试剂处理样品,
〈二〉将标的DNA用环介导等温核酸扩增放大,及
〈三〉以DNA电泳胶或焦磷酸镁混浊法或SYBR Green荧光法检测被扩增的DNA。
[0016] 以下为具体的实施步骤。
[0017] 1.检体制备及处理
44个临床痰液检体样本,将这些检体加入等量的氢氧化钠-柠檬盐酸- N-乙酰-L -半胱氨酸(NaOH - citirate - Nacetyl -L- cysteine)溶液,置于室温下15分钟,离心之后,将沉淀物以ImL的磷酸盐缓冲液(PBS,pH.7.4)重新悬浮取100 μ I悬浮液加入400 μ I DNA细胞分解试剂(cell lysis buffer,益生生技),加热95°C,5分钟,高速离心,5分钟,取出上清液(由国泰医院实验室提供,并依临床结核菌培养方法,判断其为阳性或阴性检体)。
[0018] 2.引物对设计:
本发明使用的引物是以M.tuberculosis IS6110基因片段的序列(GenBankaccession N0.X17348)为基础并以 LAMP 引物设计软件设计(http://primer explorer.JP/e/mdex.html) 0本发明所使用的引物及其序列如表一所示,包括FO (SEQ ID NO:1)、BO (SEQ ID NO: 2)、FI (SEQ ID NO: 3)、BI (SEQ ID NO: 4)、FL (SEQ ID NO: 5)及 FB(SEQ ID NO: 6)等引物。
[0019]表1。
Figure CN103667425AD00051
[0020] 3.环介导等温核酸扩增法(LAMP)试验
本发明LAMP试验反应混合液总体积25 μ I包含:0.2 μ M FO及BO引物、1.6 μ M FI及BI 引物及 0.8 μ M FL及BL 引物,1.5 mM dNTP、0.8 M甜叶素(betaine)、20 mM Tris-HCl(pH.8.8) UO mM KClUO mM (NH4)2SO4,6 mM MgS04、0.l%Triton X_100、8 U Bst DNA 聚合酶(New England Biolabs)及2 μ I检体萃取的上清液。LAMP反应条件为65°C,60分钟及80°C,5分钟。反应结束后用1.5%洋菜胶电泳分析LAMP产物。
[0021] 4.临床检体的评估
不同诊断方法的灵敏性、专一性、阳性预测值及阴性预测值,以下列方式计算:
灵敏性=真阳性数*100/ (真阳性数+伪阴性数)
专一性=真阴性数*100/ (真阴性数+伪阳性数)
阳性预测值=真阳性数*100/ (真阳性数+伪阳性数)
阴性预测值=真阴性数*100/ (真阴性数+伪阴性数)。
[0022] 5.实验结果
用临床检体共44个,其中31个阳性检体,13个阴性检体,来测试本发明所提供的技术方案,结果如图1 (A)IC)所示,13个阴性检体检测结果皆为真阴性,31个阳性检体,测试的结果仅有一检体为伪阴性其余为真阳性反应,临床检体的评估方式如表2,测试结果其敏感性及专一性值分别为96.8%及100%,阳性及阴性预测值分别为100%及92.9%,表示本发明所提供的技术方案可有效的正确的评估结核病疑似病患是否感染结核病,且本发明从检体处理到检测结果,仅需约两个小时,更为快速,若以焦磷酸镁混浊法或SYBR Green荧光呈色法检测LAMP产物,可直接由肉眼判断结果,在使用上更便利及迅速。
[0023]表 2
Figure CN103667425AD00061
培养的检测结果是国泰医院实验室检测的结果。
[0024]敏感性=30/31*100%=96.8%
专一性=13/13*100%=100%
阳性预测值=30/30*100%=100%
阴性预测值=13/14*100%=92.9%

Claims (10)

1.一种用于检测结核菌的引物,其特征在于包含下列序列:
2.如权利要求1所述的引物,其特征在于进一步包含下列序列:
Figure CN103667425AC00021
3.一种用于检测结核菌的方法,其特征在于包括下列步骤: 用细胞分解试剂处理样品; 混合该样品与如权利要求1所述的引物; (c)用核酸扩增法放大该样品标的DNA; (d)检测该标的DNA。
4.如权利要求3所述的用于检测结核菌的方法,其特征在于该步骤(c)的核酸扩增法是环介导核酸等温扩增法。
5.如权利要求4所述的用于检测结核菌的方法,其特征在于该步骤(b)所使用的引物是一对外引物对,序列为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO: 2,及一对内引物对,序列为SEQ IDNO: 3 及 SEQ ID NO: 4。
6.如权利要求5所述的用于检测结核菌的方法,其特征在于该步骤(b)同时加入一对环介导用引物,序列为SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6,用来加强扩增标的产物。
7.一种用于检测结核菌的试剂盒,其特征在于,包括: (a)引物,选自:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ IDNO: 5或SEQ ID NO: 6中的一种或几种; (b)核酸扩增试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,该核酸扩增试剂是环介导等温核酸扩增剂。
9.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,引物是SEQ ID NO: USEQ ID NO: 2,SEQID NO: 3 及 SEQ ID NO: 4。
10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于该引物进一步包括SEQ ID NO: 5及SEQID NO: 6。
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