CN112646927A

CN112646927A - 一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型raa试剂盒及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN112646927A
Application number: CN202011537202.1A
Authority: CN
Inventors: 翟少伦; 娄亚坤; 魏文康; 吕殿红; 温肖会; 翟颀; 杨楠
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN112646927B

Abstract

本发明公开了一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型RAA试剂盒及其检测方法和应用。该试剂盒包括特异性引物HW‑LSD‑F和HW‑LSD‑R，以及RAA‑exo探针HW‑LSD‑LP。本发明提供的试剂盒利用等温扩增反应，在37～42℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，可在20min内实现牛结节性皮肤病病毒的检测，特异性为100％，检测敏感性为12copies/μL。本发明中的试剂盒操作简单、快速、灵敏，为牛结节性皮肤病病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制牛结节性皮肤病病毒的传播具有非常重要意义。

Description

一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型RAA试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型RAA试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)是一种牛痘病毒病，由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起，又被称为“牛疙瘩皮肤病”或“牛结节疹”，可引起牛皮肤、黏膜和内脏组织出现结节，淋巴结节增大、发热、食欲不振、消瘦等症状。该病可使母牛暂时性泌乳减少、公牛暂时性或永久不育、继发细菌感染导致死亡，由此给养牛业带来较大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为法定通报的动物疫病，属于《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类动物传染病，农业农村部暂时将其作为二类动物疫病管理。

重组酶介导链替换核酸扩增技术(Recombinase-aid Amplification，RAA)，是一种恒温核酸快速扩增技术。RAA利用从细菌或真菌中获得的重组酶，该重组酶在常温下可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记、生物素标记的引物和核酸内切酶酶切，可以实现定时定量的结果分析，通常20min就可以得到荧光检测结果。

目前，LSD尚无有效疫苗预防及治疗方法，短期内，依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制，采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。OIE推荐的HAD、ELISA、IFA等血清学检测方法，耗时长，操作复杂，不适用于牛结节性皮肤病病毒的快速检测。因此，亟需开发出一种操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低、适用于牛结节性皮肤病病毒的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性引物组；

本发明的另一目的在于提供一种RAA-exo探针；

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂；

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒；

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的使用方法；

本发明的另一目的在于提供上述特异性引物组和/或上述RAA-exo探针在制备牛结节性皮肤病病毒检测制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

特异性引物组，该特异性引物组特异性用于扩增牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF132基因；

其中，上述特异性引物组的核苷酸序列如下所示：

HW-LSD-F：5′-TATAMTGGTCTATTTTTAACTTTTTTATGCAAT-3′(SEQ ID NO.1)；

HW-LSD-R：5′-GARAACAACACTTTTTCCTTATCTAAAGAGRC-3′(SEQ ID NO.2)。

其中，根据本领域常识，M和R均为简并碱基，M指A或C，R指A或G。

上述特异性引物组是根据GenBank上收录的牛结节性皮肤病病毒参考毒株ORF132基因的保守区设计得到的，特异性引物组的上游引物序列(HW-LSD-F)与LSDV疫苗株有6个碱基的差异，相比山羊痘疫苗AV41株基因全长的第119673～119676位核苷酸缺失4个“T”碱基，下游引物序(HW-LSD-R)与LSDV疫苗株有5个碱基的差异。

本发明的第二个方面，提供：

一种RAA-exo探针，该RAA-exo探针靶向牛结节性皮肤病病毒ORF132基因；其中，上述RAA-exo探针的核苷酸序列如下所示：

HW-LSD-LP：5′-TAATTCACTTTTAACTTTTTTATTATTAACTCCATCGATACATGTA-3′(SEQ IDNO.3)。

上述探针(HW-LSD-LP)与LSDV疫苗株有7个碱基的差异，可用于鉴别山羊痘疫苗毒株和LSDV毒株。

进一步地，上述RAA-exo探针按照5’至3’的顺序在第31位碱基T后依次连接荧光基团、THF残基(四氢呋喃)、猝灭基团；

上述荧光基团选自FAM、Alexa400和CF400；

上述猝灭基团选自BHQ-1和Eclipso。

当然，上述荧光基团还包括dT-荧光基团；上述猝灭基团还包括dT-猝灭基团。

更进一步地，上述荧光基团优选为FAM-dT；上述猝灭基团优选为BHQ-1-dT。

连接荧光基团、THF残基、猝灭基团的RAA-exo探针序列为：

5′-TAATTCACTTTTAACTTTTTTATTATTAACT[FAM-dT][THF][BHQ-1-dT]CCATCGATACATGTA-3′。

本发明的第三个方面，提供：

一种检测试剂，该试剂中含有上述的特异性引物组和/或上所述的RAA-exo探针。

该检测试剂的最低检出限可达到12copies/μL，能有效检测样品中的牛结节性皮肤病病毒，且具有强特异性，对牛多杀性巴氏杆菌核酸、牛健康组织核酸、山羊痘病毒核酸、牛传染性鼻气管炎病毒核酸均不会产生阳性反应。

本发明的第四个方面，提供：

一种检测试剂盒，该检测试剂盒中含有上述的检测试剂。

该检测试试剂盒含有上述的检测试剂，因此，其最低检出限可达到10copies/μL，能有效检测样品中的牛结节性皮肤病病毒，且具有强特异性，对牛多杀性巴氏杆菌核酸、牛健康组织核酸、山羊痘病毒核酸、牛传染性鼻气管炎病毒核酸均不会产生阳性反应。

本发明的牛结节性皮肤病病毒荧光型RAA检测试剂盒在检测LSDV的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需25min，大大减少手工操作和缩短时间。且本发明一次可检测多个样品，特别适合于大批样品的检测。

进一步地，上述检测试剂盒中还含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶、Buffer A、Buffer B、阴性对照和阳性对照；

其中，上述Buffer A为水解缓冲液；

上述Buffer B为醋酸镁溶液。

更进一步地，上述醋酸镁溶液优选为280mM的醋酸镁溶液。

更进一步地，上述链置换DNA聚合酶优选为链置换DNA聚合酶冻干酶粉。

本发明的第五个方面，提供：

上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)使用上述的试剂盒对步骤(1)所得样品DNA进行RAA扩增；

(3)根据扩增结果，判读样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒。

本发明中所采用的检测方法是基于上述特异性引物和/或RAA-exo探针，其涉及是基于选取牛结节性皮肤病病毒高度保守的ORF132基因，筛选高度保守区域，并比较LSDV毒株和山羊痘病毒AV41疫苗株之间的序列差异，选择差异位点较多的区域为靶基因，得到特异性引物及探针建立LSDV特异的荧光型RAA检测方法，可区分山羊痘疫苗毒株和牛结节性皮肤病病毒野毒株，以防因疫苗毒株污染影响临床结果诊断。

进一步地，上述样品DNA的提取方法可根据实际使用情况，采用任何本领域中常规的DNA提取方法或DNA提取试剂盒进行提取。

进一步地，上述RAA扩增体系为：

RAA扩增酶冻干粉	100mg
		模板DNA	2μL
20μmol/L HW-LSD-F	1μL
		20μmol/L HW-LSD-R	1μL
20μmol/L HW-LSD-LP	0.5μL
		Buffer B	2.5μL
Buffer A	42.5μL

进一步地，上述RAA扩增酶冻干粉取自杭州众测生物科技有限公司的RAA扩增酶冻干粉管。

进一步地，上述RAA扩增条件为：

39℃，40秒；39℃，30秒；40个循环。

进一步地，上述步骤(3)中判读样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒的标准为：

当阳性对照有扩增曲线，且出峰时间≤15min或Ct值≤30；和

阴性对照无扩增曲线，或出峰时间≥0min或Ct值≥40时，

若上述样品出峰时间≤17.5min或Ct值<35，判断为阳性，上述样品含有牛结节性皮肤病病毒；

若上述样品出峰时间≥20min或Ct值≥40，判断为阴性，上述样品不含有牛结节性皮肤病病毒；

否则，重新检测上述样品。

更进一步地，若重新检测上述样品后，出峰时间仍为17.5～20min或Ct值为35～40，可参照阴性对照出峰时间(或Ct值)，若阴性对照出峰时间≥20min(Ct值≥40)，则判断上述样品为阳性。

本发明的第六个方面，提供：

上述特异性引物组和/或上述RAA-exo探针在制备牛结节性皮肤病病毒检测制剂中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明中的特异性引物组及RAA-exo探针是基于牛结节性皮肤病病毒高度保守的ORF132基因涉及得到，灵敏度高，最低检出限可达12copies/μL；

2.本发明中的检测试剂盒具有高特异性，仅对于牛结节性皮肤病病毒具有特异性扩增，而对牛多杀性巴氏杆菌核酸、牛健康组织核酸、山羊痘病毒核酸、牛传染性鼻气管炎病毒核酸不产生阳性反应；

3.本发明中的检测方法检测方法简单，在检测LSDV的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，只需25min，大大缩短检测时间，提高检测效率。

附图说明

图1为本发明中的试剂盒的灵敏度测试扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

牛结节性皮肤病荧光型RAA特异性引物及探针设计

RAA引物设计思路：

RAA核酸扩增技术对于引物设计与常规PCR引物设计有一定的区别，有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30-35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出。探针设计序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有四个修饰位点，距离5端的≥35nt的中部位置标记一个四氢呋喃(THF)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基闭，两个基团的间距为2-4nt；THF距离3末端≥l5nt，并且3′末端标记一个修饰基团。

根据GenBank上收录的牛结节性皮肤病病毒参考毒株ORF132基因序列，筛选保守区域，并比较LSDV毒株和山羊痘病毒AV41疫苗株之间的序列差异，选择差异位点较多的区域为靶基因设计引物及探针，特异性引物HW-LSD-F和HW-LSD-R和原始探针HW-LSD-LP(未连接荧光基团、THF残基、猝灭基团)的核苷酸序列如下：

HW-LSD-F：5′-TATAMTGGTCTATTTTTAACTTTTTTATGCAAT-3′(SEQ ID NO.1)；

HW-LSD-R：5′-GARAACAACACTTTTTCCTTATCTAAAGAGRC-3′(SEQ ID NO.2)。

连接荧光基团、THF残基、猝灭基团的RAA-exo探针序列为：

对设计得到的引物及探针测序，发现涉及得到的LSDV上游引物序列(HW-LSD-F)与LSDV疫苗株有6个碱基的差异，相比山羊痘疫苗AV41株基因全长的第119673～119676位核苷酸缺失4个“T”碱基，下游引物序(HW-LSD-R)与LSDV疫苗株有5个碱基的差异，探针(HW-LSD-LP1)与LSDV疫苗株有7个碱基的差异，用于鉴别山羊痘疫苗毒株和LSDV毒株。

构建阳性载体

人工合成GenBank上登录的LSDV参考毒株(登录号：MH646674)ORF132基因，筛选高度保守区域，并比较LSDV毒株和山羊痘病毒AV41疫苗株之间的序列差异，选择差异位点较多的区域为靶基因克隆到pUC57载体上作为阳性对照(pUC57-ORF132)。

构建牛结节性皮肤病荧光型RAA扩增反应体系

使用本领域的常规手段或DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA。

将上述待测样品的DNA作为模板，使用上述实施例中设计得到的引物和探针，构建恒温扩增反应体系。

构建得到的RAA反应体系为：

RAA扩增酶冻干粉取自杭州众测生物科技有限公司的RAA扩增酶冻干粉管。

具体步骤为：

在RAA扩增酶冻干粉中加入42.5μL水解缓冲液(Buffer A)，加入20μmol/L HW-LSD-F和HW-LSD-R各1μL，20μmol/L HW-LSD-LP 0.5μL，然后加入2μL pUC57-ORF132质粒DNA作为模板，在反应管盖上加2.5μL 280mM醋酸镁(Buffer B)启动反应，盖上盖子离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测。

反应程序为：39℃，40秒；39℃，30秒，40个循环，此处采集荧光信号。

同时，采用同样的RAA反应体系和反应程序检测阴性对照和阳性对照，采集荧光信号。

根据荧光信号，绘制扩增曲线图。

当阳性对照有扩增曲线，且出峰时间≤15min或Ct值≤30；和

阴性对照无扩增曲线，或出峰时间≥0min或Ct值≥40时，

若待测样品出峰时间≤17.5min或Ct值<35，判断为阳性，待测样品含有牛结节性皮肤病病毒；

若待测样品出峰时间≥20min或Ct值≥40，判断为阴性，待测样品不含有牛结节性皮肤病病毒；

否则，重新检测待测样品。

若重新检测上述待测样品后，出峰时间仍为17.5～20min或Ct值为35～40，可参照阴性对照出峰时间(或Ct值)，若阴性对照出峰时间≥20min(Ct值≥40)，则判断上述待测样品为阳性。

灵敏度测试

将上述实施例构建的pUC57-ORF132阳性载体作为模板，使用上述实施例中RAA反应体系和反应程序进行检测。

具体步骤为：

用紫外吸收法测重组质粒pUC57-ORF132的浓度，调整浓度至10⁶copies/μL，用ddH₂O对阳性质粒进行10倍倍比稀释，稀释范围为10^-1～10^-6，分别作为模板进行检测。按上述试剂盒的反应体系配制试剂并设置反应程序。

结果显示(图1)，本试剂盒的最低检出限为12copies/μL。

特异性测试

提取牛多杀性巴氏杆菌核酸、牛健康组织核酸、山羊痘病毒核酸、牛传染性鼻气管炎病毒核酸，分别使用上述实施例中RAA反应体系和反应程序进行检测。

结果显示，检测结果均为阴性，说明本试剂盒特异性良好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型RAA试剂盒及其检测方法和应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tatamtggtc tatttttaac ttttttatgc aat 33

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

garaacaaca ctttttcctt atctaaagag rc 32

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taattcactt ttaacttttt tattattaac tccatcgata catgta 46

Claims

1.特异性引物组，其特征在于，所述特异性引物组用于特异性扩增牛结节性皮肤病病毒ORF132基因。

2.根据权利要求1所述的特异性引物组，其特征在于，所述特异性引物组的核苷酸序列如下所示：

HW-LSD-F：5′-TATAMTGGTCTATTTTTAACTTTTTTATGCAAT-3′(SEQ ID NO.1)；

HW-LSD-R：5′-GARAACAACACTTTTTCCTTATCTAAAGAGRC-3′(SEQ ID NO.2)。

3.一种RAA-exo探针，其特征在于，所述RAA-exo探针靶向牛结节性皮肤病病毒ORF132基因。

4.根据权利要求3所述的RAA-exo探针，其特征在于，所述RAA-exo探针的核苷酸序列如下所示：

5.根据权利要求3或4所述的RAA-exo探针，其特征在于，所述RAA-exo探针按照5’至3’的顺序在第31位碱基T后依次连接荧光基团、THF残基、猝灭基团；

所述荧光基团选自FAM、Alexa400和CF400；

所述猝灭基团选自BHQ-1和Eclipso。

6.一种检测试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1或2所述的特异性引物组和/或权利要求3-5任一项所述的RAA-exo探针。

7.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有权利要求6所述的检测试剂。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶、Buffer A、Buffer B、阴性对照和阳性对照；

其中，所述Buffer A为水解缓冲液；

所述Buffer B为醋酸镁溶液。

9.权利要求7或8所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)使用权利要求7或8所述的试剂盒对步骤(1)所得样品DNA进行RAA扩增；

(3)根据扩增结果，判读样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒；

其中，所述RAA扩增体系为：

扩增反应条件为：

37～42℃，40秒；37～42℃，30秒；40个循环；

步骤(3)中判读样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒的标准为：

当阳性对照有扩增曲线，且出峰时间≤15min或Ct值≤30；和

阴性对照无扩增曲线，或出峰时间≥0min或Ct值≥40时，

若所述样品出峰时间≤17.5min或Ct值<35，判断为阳性，所述样品含有牛结节性皮肤病病毒；

若所述样品出峰时间≥20min或Ct值≥40，判断为阴性，所述样品不含有牛结节性皮肤病病毒；

否则，重新检测所述样品。

10.权利要求1或2所述的特异性引物组和/或权利要求3-5任一项所述的RAA-exo探针在制备牛结节性皮肤病病毒检测制剂中的应用。