CN104152584A - 羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊痘病毒属病毒的Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒。多重Taqman-MGB探针实时荧光PCR方法可对牛疙瘩皮肤病病毒（LSDV）、山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒（SPPV）进行快速检测。本检测方法以三种痘病毒靶序列的保守区域为基础，设计1对引物和3条Taqman-MGB探针。本发明只需要两步法扩增法及简单的反应条件就可以快速、高效、特异性、高灵敏度地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。可避免因进行琼脂糖电泳而可能造成的交叉污染，从而提高检测的准确率和可信度。

Description

羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及动物病毒分子生物学检验方法领域，具体涉及一种羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒。

背景技术

羊痘病毒属病毒（Capripoxvirus,CPV）包括山羊痘病毒（Goatpox Virus,GTPV）、绵羊痘病毒（Sheeppox Virus,SPPV）和牛疙瘩皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus,LSDV）三种，能引起山羊、绵羊和牛的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿，病畜产乳量急剧减少，皮毛品质极大下降，造成巨大经济损失。山羊痘、绵羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”，是羊的一种急性、热性、接触性传染病。绵羊痘和山羊痘，被我国列为一类传染病，对畜牧业养殖影响重大。根据不同毒株的毒力差异，易感羊群的致死率可达10%～58%或 75%～100%不等。羔羊致死率可达 100%，妊娠母羊极易流产。同时，因自由贸易受到限制造成了国家税收的下降，致使此病也成为了重要的经济疾病。该病呈世界性分布，我国近年来在如广西、贵州、黑龙江、甘肃等地也有发生。牛疙瘩皮肤病病毒引起牛的疙瘩皮肤病，又称牛结节性皮炎或牛结节疹、块状皮肤病，是以患牛发热、皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病，感染率为5%～85%，病死率为10%；我国目前尚无牛疙瘩皮肤病病毒流行的报导，国内也无检测该病的相关研究，由于印度和斯堪的纳维亚都有人类感染羊痘病毒的报道，因此，本病在公共卫生方面具有一定的意义。在印度，管理患病动物的人有的手和腿上发生红色丘疹，继而出现水疱并结痂，但未见有全身性的扩散。张瑞阳等（2003）首次报道了我国人感染羊痘的病例，病人手指、口唇、面颊等部位出现丘疹。携带有病毒的牛羊肉存在使人患病的可能性，对于肉制食品的安全存在潜在的隐患，因此，本发明的试剂盒和检测方法在动物产品及其食品的出入境的快速检验检疫中具有重大的意义。

羊痘病毒（Capripoxvirus,CPV）在分类上属于痘病毒科（poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（chordopoxrinae）中的羊痘病毒属（Capripoxvirus）。羊痘病毒为砖形病毒，在细胞浆内复制，其基因组为双链 DNA。其大小约为 290nm×270nm，属于较小的痘病毒，病毒粒子由1 个核心、2个侧体和2 层脂质外膜组成，羊痘病毒的衣壳为对称型，有囊膜，囊膜内含有病毒特异性蛋白。 该病毒对干燥有较强的抵抗力，在干燥的痂皮内可存活 3-6 个月，在干燥羊舍内可存活 6-8个月。反复冻融对其没有明显的灭活作用。对直射阳光、常用消毒药（酒精、碘酒等）以及乙醚或氯仿较敏感。放线菌素-D和溴脂氧尿苷可抑制病毒复制。 

山羊痘、绵羊痘和牛疙瘩皮肤病病毒很强的宿主特异性，自然条件下，不会发生交叉感染。但病毒对上皮细胞有特殊亲和力，因此无论通过哪种途径进入机体的病毒，最终都经血液达到皮肤和粘膜，在上皮细胞内增殖，引起一系列的炎症过程而发生特异性的痘疹。山羊和绵羊均为易感动物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑随风和灰尘吸入呼吸道而感染，也可以通过损伤的皮肤及消化道传染。丘疹中含大量病毒，黏膜上的丘疹破溃后可从鼻、口分泌物和泪液排泄病毒。病毒进入乳汁、尿液和精液也可成为病毒传播的重要来源。被病羊污染的用具、饲料、垫草，病羊的粪便、分泌物、皮毛和体外寄生虫（如羊虱）都可以成为传播媒介。该病以春秋两季多发，主要在冬季春初流行，常呈地方性或广泛流行。气候严寒、雨雪、霜冻、枯草和饲养管理不良等因素都有助于本病的发生和加重病情。目前控制该病最有效的方法还是使用高效疫苗对易感动物进行免疫接种。本发明的试剂盒和检测方法在排查上述饲养用具、饲料、垫草，病羊的粪便、分泌物等是否含有羊痘病毒属病毒也具有重要意义。

 TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5^，末端，淬灭基团则在3^，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3^，端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5^，外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。

    TaqMan—MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。

中国发明专利（申请号为：200910103457.4 、200910094278、200480005196.8、201310009019.8 、201180015187.7 、201110143186.2、201110279330.5 、200910200396.3、200910200393.X 、200910094272.1、200910094279.3 等）分别公开了采用荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan—MGB探针荧光定量PCR扩增技术检测三种羊痘病毒属病毒的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种羊痘病毒属病毒TaqMan—MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的使用方法。

为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：

羊痘病毒属病毒Taqman—MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物，其特征在于：包括羊痘病毒属病毒通用上游引物，其NDA序列为SEQ ID NO.1;羊痘病毒属病毒通用下游引物，其NDA序列为SEQ ID NO.2；牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针，其NDA序列为SEQ ID NO.3；山羊痘病毒MGB探针，其NDA序列为SEQ ID NO.4；绵羊痘病毒MGB探针，其NDA序列为SEQ ID NO.5。

为了实现上述第二目的，本发明采用的技术方案是：

一种羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测方法试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管 管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的羊痘病毒属病毒通用上游引物1.6μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmol/L的羊痘病毒属病毒通用下游引物1.6μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针0.6μL；

DNA序列为SEQ ID NO.4的10μmol/L的山羊痘病毒MGB探针0.3μL；

DNA序列为SEQ ID NO.5的10μmol/L的绵羊痘病毒MGB探针3.0 μL；

2×Premix Ex Taq^TM缓冲液 8 μL；

灭菌去离子水 1.9 μL；

合计17μL，为单次反应的用量；

    所述阳性对照管，管内为牛疙瘩皮肤病病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒三种羊痘病毒属病毒阳性重组质粒混合DNA，体积各为20μL；。

所述阴性对照管，管内为无三种羊痘病毒属病毒感染的上皮组织基因组DNA，体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

为了实现上述第三目的，本发明提供一种羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测的方法：

包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的DNA提取试剂盒，提取待检样品中的基因组DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：18μL扩增反应液，；2μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

3）三种羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增：将配制好 的步骤2）的扩增反应体系进行PCR管反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s（使用ABI 7500建议采用34s） 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集。

4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

   本发明的原理是：针对三种羊痘病毒属病毒500bp左右的靶序列保守区域设计1对通用引物和3条MGB探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。山羊痘病毒、牛疙瘩皮肤病病毒和绵羊痘病毒三条探针的5^，端分别标记有报告基团分别为FAM、VIC、NED,它们的3^，端均标记有非淬灭基团，非淬灭基团本身不产生荧光，可以大大降低本低信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，可以将MGB探针设计得更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率大为提高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR 固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。

TaqMan—MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测。现有检测周期较长，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需50min左右。

本发明的优点是（1）、不需要特殊试剂与设备；（2）、高特异性：应用保守区段，1对通用引物及3条MGB探针，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.5%，假阳性率小于0.1%；（3）、快速、高效扩增：检测时间50min左右；（4）、灵敏度高：最低检测极限达分别达到LSDV为1.48拷贝/μL，GTPV为3.29 拷/μL，SPPV为2.67拷/μL。标本的检出率达到99.3%；（5）、鉴定简便：通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精确的，无需电泳等其他任何分析步骤；（6）、用途：可用于三种羊痘病毒属病毒及其相关产品的快速检测及分型。

附图说明

图1为三种羊痘病毒属病毒的特异性试验结果；

图2为LSDV的灵敏度试验结果；图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别为1.48×10⁷拷贝/μL、1.48×10⁶拷贝/μL、1.48×10⁵拷贝/μL、1.48×10⁴拷贝/μL、1.48×10³拷贝/μL、1.48×10²拷贝/μL、1.48×10¹拷贝/μL、1.48拷贝/μL；

图3为GTPV的灵敏度试验结果；图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别为3.29×10⁷拷贝/μL、3.29×10⁶拷贝/μL、3.29×10⁵拷贝/μL、3.29×10⁴拷贝/μL、3.29×10³拷贝/μL、3.29×10²拷贝/μL、3.29×10¹拷贝/μL、3.29拷贝/μL；

图4为SPPV的灵敏度试验结果；图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别为2.67×10⁷拷贝/μL、2.67×10⁶拷贝/μL、2.67×10⁵拷贝/μL、2.67×10⁴拷贝/μL、2.67×10³拷贝/μL、2.67×10²拷贝/μL、2.67×10¹拷贝/μL、2.67拷贝/μL；

图5为三种羊痘病毒属病毒的重复性试验结果；

图6为LSDV的标准曲线；

图7为GTPV的标准曲线；

图8为SPPV的标准曲线。

具体实施方式

实施例1，引物的设计及筛选

三种羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增引物及探针，其设计是根据GenBank公布的牛疙瘩皮肤病病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒三种羊痘病毒属病毒参考序列，用MEGA5进行比对，分析序列并分别在其保守区域进行引物与探针的设计。采用探针设计软件Primer Express 3.0，设计3套荧光定量引物，由英骏（上海）有限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控，对不同引物组及探针扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的1组荧光定量PCR扩增引物与3条探针，分别标记为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5。其中引物与探针的的浓度分别为10 μmol/L，10 μmol/L ，10 μmol/L。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分别为：PCR上游引物：SEQ ID NO.6；PCR下游引物：SEQ ID NO.7；它们的体积比为1:1。

SEQ ID NO.1代表的序列为：5’- CCACCCCAATATTCTGCTGC -3’

SEQ ID NO.2代表的序列为：5’- ACATTAGGGAATCATGTGCAGTGA -3’

SEQ ID NO.3代表的序列为:5’ VIC-TCTTGCTAAAATgCCA-MGB 3’

SEQ ID NO.4代表的序列为：5’ FAM-TCTTGCTAAAATaCC-MGB 3’

SEQ ID NO.5代表的序列为：5’ NED-CTTGCTAAAATtCCA-MGB 3’

SEQ ID NO.6代表的序列为：5’ -TTGTCAGAAACGAGG -3’

SEQ ID NO.7代表的序列为：5’- ATGCCTCACTTGTATTTGG -3’ 。

实施例2，阳性对照品的制备

牛疙瘩皮肤病病毒阳性质粒的制备：用试剂盒提取牛疙瘩皮肤病病毒细胞培养物的核酸，将其核酸进行PCR及电泳鉴定，采用PCR上游引物SEQ ID NO.6和PCR下游引物 SEQ ID NO.7进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1：10的比例和PMD19T载体进行连接反应，4℃连接过夜，转化DH5α菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之间。山羊痘病毒阳性质粒和绵羊痘病毒阳性质粒的制备方法同牛疙瘩皮肤病病毒阳性质粒的制备。

实施例3，阴性对照品的制备

用试剂盒提取无羊痘病毒属病毒感染的上皮组织的DNA，进行PCR及电泳鉴定。

实施例4，三种羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的DNA提取试剂盒，提取待检样品中的基因组DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：17μL扩增反应液；3μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

3）三种羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增：将配制好的步骤2）的扩增反应体系进行PCR管反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s（使用ABI 7500建议采用34s） 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集。

4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。

实施例5，三种羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增的特异性试验

采用实施例4的反应体系及反应条件进行特异性的试验，所采用的模板分别牛疙瘩皮肤病病毒，山羊痘病毒，绵羊痘病毒，牛痘病毒，羊口疮病毒，阴性对照。

参见图1的结果显示，图中三条扩增曲线表示检测出牛疙瘩皮肤病病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒。

实施例6，三种羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增的灵敏度试验

    将所建立的标准品进行10倍倍比稀释，采用实施例4的反应体系及反应条件进行灵敏度试验，结果显示出，建立的该方法最低能够检测出分别为：LSDV为1.48拷贝/μL，GTPV为3.29 拷/μL，SPPV为2.67拷/μL的DNA样品。

参见图2、图3和图4的结果显示。

实施例7，三种羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增的重复性试验

以重组质粒标准品1.48×10⁶拷贝/μL与 1.48×10⁷ 拷贝/μL为模板，采用实施例4的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数为0.58％~ 1.6％ ，表明该方法具有较好的重复性。

参见图5的结果显示。

实施例8，三种羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增的标准曲线的建立

      把重组的标准品质粒进行五个倍比稀释，进行标准曲线的制作，以荧光强度的对数值为横坐标，循环数为纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数都为R2=0.999，扩增效率分别达到：LSDV 为108％；GTPV为103.2％；SPPV为 103.2％；其扩增方程分别为：（LSDV）Y=‐3.34x+38.80,(GTPV) Y=‐3.25x+40.36,(SPPV) Y=‐3.24x+38.51。由此可见本实验所建立的标准曲线的扩增效率是较好，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性较好，准确度较高。

参见图6、图7和图8的结果显示。

<110>  重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>  羊痘病毒属病毒Taqman—MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、方法和试剂盒

<160>  7   

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400> SEQ ID NO.1

ccaccccaat attctgctgc                                                20

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.2

acattaggga atcatgtgca gtga                                           24

 

<210>  3

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.3

VIC-tcttgctaaa atgcca-MGB                                             16

 

<210>  4

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.4

FAM-tcttgctaaa atacc-MGB                                              15

 

<210>  5

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.5

NED-cttgctaaaa ttcca-MGB                                              15

 

<210>  6

<211>  15

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.6

ttgtcagaaa cgagg                                                      15

 

<210>  7

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  SEQ ID NO.7

atgcctcact tgtatttgg                                                   19

Claims (4)

1.羊痘病毒属病毒Taqman—MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物及探针，其特征在于：包括羊痘病毒属病毒通用上游引物，其NDA序列为SEQ ID NO.1;

羊痘病毒属病毒通用下游引物，其NDA序列为SEQ ID NO.2；

牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针，其NDA序列为SEQ ID NO.3；

山羊痘病毒MGB探针，其NDA序列为SEQ ID NO.4；

绵羊痘病毒MGB探针，其NDA序列为SEQ ID NO.5。

2.羊痘病毒属病毒Taqman—MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的羊痘病毒属病毒通用上游引物1.6μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmol/L的羊痘病毒属病毒通用下游引物1.6μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针0.6μL；

DNA序列为SEQ ID NO.4的10μmol/L的山羊痘病毒MGB探针0.3μL；

DNA序列为SEQ ID NO.5的10μmol/L的绵羊痘病毒MGB探针3.0 μL；

2×Premix Ex Taq缓冲液 8 μL；

灭菌去离子水 1.9 μL；

合计17μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管，管内为牛疙瘩皮肤病病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒三种羊痘病毒属病毒阳性重组质粒的混合DNA，体积为20μL；

所述阴性对照管，管内为无牛疙瘩皮肤病病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒三种羊痘病毒属病毒感染的上皮组织基因组DNA，体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

3.根据权利要求2所述羊痘病毒属病毒Taqman—MGB探针多重实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述DNA序列为SEQ ID NO.3的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探针的5^，端标记有VIC报告基团，3^，端标记有非淬灭基团；DNA序列为SEQ ID NO.4的山羊痘病毒MGB探针的5^，端标记有FAM报告基团，3^，端标记有非淬灭基团；DNA序列为SEQ ID NO.5的绵羊痘病毒MGB探针的5^，端标记有NED报告基团，3^，端标记有非淬灭基团。

4.利用权利要求2所述试剂盒进行羊痘病毒属病毒Taqman—MGB探针多重实时荧光定量PCR检测的非疾病诊断目的的检测方法，包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用市售化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待检样品的基因组DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：17μL扩增反应液；3μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

3）羊痘病毒属病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2）中配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s 40个循环；在60℃ 34s进行荧光信号的采集；

4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。