CN106086205A - 利用双亲混合dna鉴定水稻品种亲缘关系的方法 - Google Patents

利用双亲混合dna鉴定水稻品种亲缘关系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，包括：提取双亲和待测样品DNA，双亲DNA混合样品和待测样品分别进行PCR反应，然后利用双亲DNA混合样品的PCR产物和待检测样品的PCR产物进行电泳检测进行亲缘关系比较。本发明利用双亲混合DNA与对照样品进行PCR产物比较确定水稻品种亲缘关系，不仅减少了样品量，而且准确性强，直观性好。

Description

利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说是利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法。
背景技术
随着生物技术的不断发展，基于PCR技术为基础的分子标记已广泛应用于杂交种子亲缘关系的分析，打击市场上的假冒种子。但目前采用的方法是利用中华人民共和国农业行业标准的48对引物分别对父本、母本和检测样品进行比较分析(图1所示)，确定子一代与父本、母本是否存在亲缘关系，子一代存在的多态性是否是父本和母本互补的带型，此方法存在直观性较差的问题。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法。本发明利用双亲混合DNA与对照样品进行PCR产物比较确定水稻品种亲缘关系，不仅感少了样品量，而且准确性强，直观性好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，提取双亲和待测样品DNA，双亲DNA混合样品和待测样品分别进行PCR反应，然后利用双亲DNA混合样品的PCR产物和待检测样品的PCR产物进行电泳检测进行亲缘关系比较。
进一步的，所述待测样样品DNA提取步骤为：剪取1cm长的幼苗或叶片放入2mL的离心管中，加入40μL DNA提取试剂Ⅰ，沸水处理30s，然后加入40μL DNA提取试剂Ⅱ和20μL DNA提取试剂Ⅲ,放入沸水处理2min备用。
进一步的，所述DNA提取试剂Ⅰ为250mM的NaOH，所述DNA提取试剂Ⅱ为250mM的HCl，所述DNA提取试剂Ⅲ为500mM的Tris(pH8.0)、0.25％(V/V)的IGEPAL-630。
进一步的，所述双亲DNA提取步骤为：0.5g老叶用液氮研磨成粉末，加入装有0.5mL2倍CTAB提取缓冲液的2mL离心管中，充分混匀后，加入0.5mL CTAB缓冲液，55-65℃恒浴30min，加入0.5-1mL体积比为24:1的氯仿:异戊醇，充分摇动5min，8000转/min室温下离心5min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min 4℃离心5min，沉淀用0.8mL高盐缓冲液充分溶解，15000转/min离心2min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min 4℃离心5min，沉淀用400μL双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％的冷乙醇，-20℃冰箱中2小时以上后15000转离心20分钟，用70％的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200μl 0.1倍TE缓冲液溶解备用。
进一步的，所述PCR反应体系为
反应体系用ddH2O补足到总体积10μL。
进一步的，所述PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃30s、55℃30s、72℃1min、35个循环，最后72℃延伸7min。
本发明的有益技术效果是：本发明利用双亲混合DNA与对照样品进行PCR产物比较确定水稻品种亲缘关系，不仅检少了样品量，而且准确性强，直观性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是现有技术利用父本、母本和鉴定样品DNA的PCR产物的电泳图谱；图中：M、DNA分子量标准，1、不育系Y58S(母本)，2、恢复系HR-2(父本)，3、杂种F1代两优2号(鉴定样品)；引物依次为RM274、RM336、RM219、RM1195、RM481、RM224、RM17、RM493。
图2是本发明利用父母本混合DNA和鉴定样品DNA的PCR产物的电泳图谱；图中：M、DNA分子量标准，1、不育系Y58S和恢复系HR-2的混合DNA(父、母本混合DNA)，2：杂种F1代两优2号DNA(鉴定样品)，引物依次为RM274、RM336、RM219、RM1195、RM481、RM224、RM17、RM493。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)幼苗的DNA提取
剪取1cm长的幼苗或叶片放入2mL的离心管中，加入40μL DNA提取试剂Ⅰ(250mMNaOH)，沸水处理30s，然后加入40μL DNA提取试剂Ⅱ(250mM HCl)和20μL DNA提取试剂Ⅲ(500mM Tris(pH8.0)、0.25％(V/V)IGEPAL-630),放入沸水处理2min备用；
(2)老叶的DNA提取(CTAB方法)
0.5g老叶用液氮研磨成粉末，加入装有0.5mL 2倍CTAB提取缓冲液(2％CTAB(w/v),100mM Tris(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.4M NaCl,1％PVP(polyvinylpyrrolidone)Mw40,000)的2mL离心管中，充分混匀后，加入0.5mL CTAB缓冲液，55-65℃恒浴30min，加入0.5-1mL体积比为24:1的氯仿:异戊醇，充分摇动5min，8000转/min室温下离心5min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min 4℃离心5min，沉淀用0.8mL高盐缓冲液(10mM Tris(pH8.0),1mM EDTA(pH8.0),1M NaCl)充分溶解，15000转/min离心2min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min 4℃离心5min，沉淀用400μL双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％的冷乙醇，-20℃冰箱中2小时以上后15000转离心20分钟，用70％的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200μl 0.1倍TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0))溶解备用。
(3)PCR反应及电泳分析
PCR所用引物如表1所示。
表1引物信息
①PCR反应在10μl的反应体积中进行，包含1μmol引物，1μmol dNTP，0.2单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶，1μl10倍PCR反应液(100mmol Tris-Hcl，pH8.3，15mmol MgCl2，500mmolKCl，0.01％的明胶)，模板DNA为10ng。扩增反应条件为：94℃变性4min，94℃30s、55℃30s、72℃1min、35个循环，最后72℃延伸7min。
②反应在PE公司9700型基因扩增仪上进行。扩增产物在4％的Nusieve 3:1琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭染色后在紫外光下观察拍照。所采用的引物为中华人民共和国农业行业标准，水稻品种鉴定技术规程，SSR标记法，NY/T1433-2014。
(4)本发明方法(双亲混合DNA和待检测样品)和传统方法(利用父本、母本和待检测样品)进行亲缘关系结果的比较
本研究用不育系Y58S、恢复系HR-2和杂种F1代两优2号为材料，采用的48对引物为中华人民共和国农业行业标准，水稻品种鉴定技术规程，SSR标记法，NY/T1433-2014。
研究表明，采用不育系Y58S、恢复系HR-2和杂种F1代两优2号的电泳图谱表明：除完全表现一致的40对引物外，所有表现出双带的8对引物杂种F1代具有不育系Y58S和恢复系HR-2互补的带型，表明杂种F1代两优2号是不育系Y58S和恢复系HR-2的后代(如图1)。
而采用不育系Y58S和恢复系HR-2的混合DNA和杂种F1代两优2号DNA，除完全表现一致的40对引物外，通过具有不育系Y58S和恢复系HR-2互补的带型的8引物进行扩增，DNA指纹图谱完全一致，表明杂种F1代两优2号是不育系Y58S和恢复系HR-2的后代(如图2)。
(5)利用双亲混合DNA和检测样品进行亲缘关系的优点
从图1我们可以看出，要根据图谱来判断3是1和2的后代(杂种F1代两优2号是不育系Y58S和恢复系HR-2的后代)必须具有较强的分子生物学基础和经验。而从图2我们可以很清楚地看出1和2是同一品种，杂种F1代两优2号是不育系Y58S和恢复系HR-2的后代，直观性大大加强。此外，样本量由原来的3×48减为2×48。
利用双亲混合DNA和检测样品进行水稻亲缘关系直观性好，准确性强。同时可以用于其他农作物和动物及人类的亲缘关系鉴定。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于，提取双亲和待测样品DNA，双亲DNA混合样品和待测样品分别进行PCR反应，然后利用双亲DNA混合样品的PCR产物和待检测样品的PCR产物进行电泳检测进行亲缘关系比较。
2.根据权利要求1所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于，所述待测样样品DNA提取步骤为：剪取1cm长的幼苗或叶片放入2mL的离心管中，加入40μLDNA提取试剂Ⅰ，沸水处理30s，然后加入40μL DNA提取试剂Ⅱ和20μL DNA提取试剂Ⅲ,放入沸水处理2min备用。
3.根据权利要求2所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于，所述DNA提取试剂Ⅰ为250mM的NaOH，所述DNA提取试剂Ⅱ为250mM的HCl，所述DNA提取试剂Ⅲ为500mM的Tris(pH8.0)、0.25％(V/V)的IGEPAL-630。
4.根据权利要求1所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于，所述双亲DNA提取步骤为：0.5g老叶用液氮研磨成粉末，加入装有0.5mL 2倍CTAB提取缓冲液的2mL离心管中，充分混匀后，加入0.5mL CTAB缓冲液，55-65℃恒浴30min，加入0.5-1mL体积比为24:1的氯仿:异戊醇，充分摇动5min，8000转/min室温下离心5min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min 4℃离心5min，沉淀用0.8mL高盐缓冲液充分溶解，15000转/min离心2min，上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下静止30min，5000转/min4℃离心5min，沉淀用400μL双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％的冷乙醇，-20℃冰箱中2小时以上后15000转离心20分钟，用70％的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200μl0.1倍TE缓冲液溶解备用。
5.根据权利要求1所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为
反应体系用ddH2O补足到总体积10μL。
6.根据权利要求1所述利用双亲混合DNA鉴定水稻品种亲缘关系的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：94℃变性4min，94℃30s、55℃30s、72℃1min、35个循环，最后72℃延伸7min。
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