CN103834735B - 一种鉴别铁皮石斛的核苷酸序列、分子探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴别铁皮石斛的核苷酸序列、分子探针及其应用。本发明鉴别铁皮石斛的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于鉴别铁皮石斛的核苷酸分子探针上游SHF：如SEQ ID NO.2所示；下游SHR：如SEQ ID NO.3所示。用于鉴别铁皮石斛的核苷酸分子探针SHF/SHR在鉴别铁皮石斛上的应用。本发明样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作；准确、灵敏度高，SHF/SHR为铁皮石斛专一性分子探针，若为其他石斛种类，为阴性反应；方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成。
Description
技术领域
本发明属于利用分子生物学方法鉴别铁皮石斛的技术领域，涉及一种鉴别铁皮石斛的核苷酸序列、分子探针及其应用。
背景技术
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）的植物，主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区。铁皮石斛最早在《本草纲目》中被列为药用，在《神农本草经》中被列为上品，在《道藏》中和天山雪莲、三两重人参、花甲之茯从、百二十年首乌、深山灵芝、冬虫夏草等一起被列为“中华九大仙草”，铁皮石斛位于“九大仙草”之首，具有滋阴养胃、润肺止咳、清热明目的功效，另外，还有增强人体免疫力，消除肿瘤，抑制癌症等作用。由于铁皮石斛非常名贵，人为过度采收和生境破坏严重，加上铁皮石斛生境独特，繁殖困难，铁皮石斛野生资源处于极度濒危状态，被国家列为重点保护的野生珍贵药材品种。另外，目前市场上商品铁皮石斛以假乱真现象十分常见，严重影响了商品铁皮石斛的质量。因此，寻找有效的鉴别铁皮石斛的方法是十分重要的。
DNA分子标记数量非常多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测。本实验采用目标起始密码子多态（start codontargeted Polymorphism,SCoT）分子标记方法，对铁皮石斛及其他一些石斛种类的遗传多样性进行研究，获得了石斛SCoT指纹图谱，从中筛选出铁皮石斛特异性条带，通过克隆、测序等，设计了特异性探针，应用于铁皮石斛的鉴定，为解决药材市场上铁皮石斛药材混乱和品质优劣等问题，产业可持续发展和利用提供有效的分子技术依据。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种鉴别铁皮石斛的核苷酸序列。
本发明用于鉴别铁皮石斛的特征性核苷酸序列来源于SCoT通用引物13扩增所得的铁皮石斛特异性核苷酸序列，具体序列为：
ACGACATGGCGACCATCGGGGGTCACTCTGGCTACGGTTGGGAAGAAACTTCGACAATGGTCGAGAAGAAACTCCGGTGATAGTCGGGAAGAAAACTCCTGTGACAATCAGGAAGAAACTCTGACTAAGATTGGGAGAAACTCCGACGGTGGTTAGAAACGGCTAGAACTCTGACGGAGATTGGGAGGAACTCTGACGATGGTCGCCATGTCGTA，如SEQ ID NO.1所示；
本发明的第二个目的是提供基于上述鉴别铁皮石斛的核苷酸序列设计的用于鉴别铁皮石斛的核苷酸分子探针（SHF/SHR），该核酸分子探针序列如下：
上游引物SHF：5’-GGGGTCACTCTGGCTACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
下游引物SHR：5’-TACGACATGGCGACCATC-3’，如SEQ ID NO.3所示。
上述核苷酸分子探针（SHF/SHR），具有极高的专一性，仅与铁皮石斛发生反应，而不与其他石斛种类反应。利用该探针通过常规PCR扩增可以快速的对铁皮石斛进行鉴别。
本发明的第三个目的是提供上述鉴别铁皮石斛的分子探针的应用。
本发明采用上述核酸分子探针（SHF/SHR）作为特异性扩增引物，以铁皮石斛基因组DNA为模板，经PCR扩增，电泳检测，获得清晰的铁皮石斛特异性条带，实现对铁皮石斛的鉴别。
本发明具有的有益效果：
1)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作；
2)准确、灵敏度高，SHF/SHR为铁皮石斛专一性分子探针，若为其他石斛种类，为阴性反应；
3)方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成。
附图说明
图1是采用SCoT引物13进行PCR扩增的电泳图（箭头所指的条带是铁皮石斛特有的条带，分子量为200bp左右）；
图2是采用铁皮石斛特异性核酸分子探针SHF/SHR对36种的38份石斛样品（见表1）进行检测的PCR扩增电泳图；
图3是采用铁皮石斛特异性核酸分子探针SHF/SHR对15份不同来源的铁皮石斛（见表2）进行检测的PCR扩增电泳图。
具体实施方式
本发明可以从分子水平上客观准确的鉴定铁皮石斛，具体包括：1.提供用于铁皮石斛鉴定的DNA片段；2.提供来源于上述DNA片段的石斛专一性核酸分子探针；3.提供上述核酸分子探针的应用。
在采用SCoT分子标记研究石斛属植物遗传多样性时发现，SCoT通用引物13扩增的带型中，铁皮石斛有特异性条带，能将其与其他石斛种类区别开。因此，可根据此特异性条带合成特异性的核酸分子探针，建立简便、快速、准确鉴定铁皮石斛的分子生物学方法。
本发明提供的用于鉴别铁皮石斛的核苷酸序列来源于采用SCoT通用引物13扩增得到的铁皮石斛特异性序列，该序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的铁皮石斛专一性核酸分子探针是以上述铁皮石斛核苷酸序列为基础，利用Primer Primer5.0软件设计得到的。分子探针(SHF/SHR)如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
本发明所提供的铁皮石斛的鉴定方法，可采用PCR方法：以本发明的核酸分子探针（SHF和SHR）为PCR引物，进行PCR反应。具体步骤和过程按常规PCR方法进行，采用该PCR方法可快速、准确地鉴定铁皮石斛，且样品用量少。
通过具体实施例、附图对本发明做进一步说明：
实施例1：铁皮石斛特异性核苷酸序列的制备
1.基因组DNA的提取
针对石斛材料多糖等次生产物含量多的特点，实验采取以下方法：
（1）取0.3g左右新鲜叶片，用研钵研磨至粉末状。将粉末迅速转移至1.5ml离心管中，加入1ml抽提缓冲液（200mmol/L Tris-HCl，50ml/L乙二胺四乙酸EDTA，250mmol/L NaCl，体积分数为2﹪的β-巯基乙醇），混匀后冰上静止15min，于4℃，8000r/min离心10min。去上清，如果上清液比较粘稠，则按上述方法再进行离心，直到上清液变清澈，目的是除去多糖等次生代谢物。
（2）在步骤（1）得到的沉淀中加入500μl65℃预热的抽提缓冲液（3﹪CTAB，100mmol/L Tris-HCl（PH=8.0），25ｍＭEDTA；体积分数为1﹪的β-巯基乙醇），混匀后65℃水浴30至40分钟，得到混合液。
（3）步骤（2）混合液冷却至常温，加入与步骤（2）混合液等体积的氯仿/异戊醇溶液（氯仿与异戊醇的体积比为24：1）轻轻颠倒混匀1min～2min，直到没有明显的分层为止。常温静止5min后，于4℃，10000r/min离心10min。
（4）取步骤（3）上清至新离心管中，用酚-氯仿-异戊醇溶液（酚、氯仿、异戊醇的体积比=25：24：1）重复抽提一次。
（5）转移步骤（4）上清至离心管中，加入1/2倍步骤（4）上清体积的5mol/L NaCl、2倍步骤（4）上清体积的无水乙醇，然后轻微上下颠倒几次，常温静止20min至30min。取白色沉淀至新的离心管中进行离心（若沉淀物较少的于4℃，12000r/min离心2min获得沉淀）。
（6）用体积分数为70﹪的乙醇洗涤2次，接着去除乙醇后自然风干，用500μl TE缓冲液溶解，然后加入1μl10ng/mL核糖核酸酶Rnase，37℃水浴10min，降解RNA。
（7）在步骤（6）降解RNA后的溶液中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇溶液（酚、氯仿、异戊醇的体积比=25：24：1）抽提一次，然后方法同步骤（5）得到DNA沉淀，将DNA沉淀用体积分数为70﹪的乙醇洗涤2次，接着去除乙醇后自然风干，用500μl TE缓冲液溶解，得到石斛基因组NA溶液。
（8）用0.8﹪琼脂糖凝胶电泳检测步骤（7）DNA溶液中石斛基因组DNA质量。
2.SCoT–PCR扩增
用SCoT通用引物13进行PCR扩增，扩增体系如下表所示：
PCR程序为：94℃预变性4min；35个循环（94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min）；最后于72℃下延伸10min。
PCR产物电泳结果见图1，箭头标的条带（分子量为200bp左右），是采用SCoT引物13(5’-ACGACATGGCGACCATCG-3’)进行PCR扩增时寻找到的铁皮石斛特有的条带。如图1(图中，通道1～38为来自36种的38份石斛样品，如表1；通道M为DNA分子量标准marker DL2000)所示，仅铁皮石斛（通道1～3）在分子量200bp左右有条带出现，而其他石斛种类在分子量200bp左右没有条带出现。因此，此条带为铁皮石斛的特有条带。
3.序列测定
利用SCoT通用引物13进行PCR扩增结束后，PCR产物用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳，对只在铁皮石斛中出现的特异SCoT片段进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒（上海生工）回收纯化所切片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体（上海生工）上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后送生物公司测序（上海生工），得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成和排列。
实施例2：铁皮石斛特异性核苷酸分子探针SHF/SHR的制备，PCR扩增
在获得铁皮石斛特异性核苷酸序列的基础上，利用Primer Primer5.0软件设计得出SHF/SHR的核苷酸序列（分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的），引物由上海生工生物工程有限公司合成。然后利用设计合成的引物SHF/SHR，对36种的38份石斛样品进行扩增检测，PCR扩增体系为
反应程序为94℃预变性4min；35个循环（94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸2min）；最后于72℃下延伸10min。
用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，电泳图如图2所示，从图2(图中，通道1～38为来自36种的38份石斛样品，如表1；通道M为DNA分子量标准marker DL2000)可以看出，仅铁皮石斛（通道1～3）能扩增出特异性片段，而其他石斛种类没有扩增出任何条带，这表明本发明的核酸分子探针具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别铁皮石斛。
表1.发明实验中所用的来自36种的38份石斛样品
为了进一步验证核苷酸探针（SHF/SHR）的应用范围，利用设计合成的引物SHF/SHR，对15份不同来源的铁皮石斛样品进行扩增检测，电泳图如图3(图中，通道1～15为15份不同来源的铁皮石斛供试材料，如表2；通道M是DNA分子量标准marker DL2000)所示，结果显示所有铁皮石斛样品都能扩增出特异性条带，因此，本发明的核酸分子探针具有很好的专一性和实用性。
表2.15份不同来源的铁皮石斛供试材料
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州师范大学
<120> 一种鉴别铁皮石斛的核苷酸序列、分子探针及其应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
acgacatggc gaccatcggg ggtcactctg gctacggttg ggaagaaact tcgacaatgg 60
tcgagaagaa actccggtga tagtcgggaa gaaaactcct gtgacaatca ggaagaaact 120
ctgactaaga ttgggagaaa ctccgacggt ggttagaaac ggctagaact ctgacggaga 180
ttgggaggaa ctctgacgat ggtcgccatg tcgta 215
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggggtcactc tggctacg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tacgacatgg cgaccatc 18
Claims (3)
1.一种鉴别铁皮石斛的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列为：
ACGACATGGCGACCATCGGGGGTCACTCTGGCTACGGTTGGGAAGAAACTTCGACAATGGTCGAGAAGAAACTCCGGTGATAGTCGGGAAGAAAACTCCTGTGACAATCAGGAAGAAACTCTGACTAAGATTGGGAGAAACTCCGACGGTGGTTAGAAACGGCTAGAACTCTGACGGAGATTGGGAGGAACTCTGACGATGGTCGCCATGTCGTA，如SEQ ID NO.1所示。
2.利用如权利要求1所述的一种鉴别铁皮石斛的核苷酸序列设计的用于鉴别铁皮石斛的核苷酸分子探针SHF/SHR，其特征在于该核酸分子探针序列如下：
上游引物SHF：5’-GGGGTCACTCTGGCTACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
下游引物SHR：5’-TACGACATGGCGACCATC-3’，如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求2所述的用于鉴别铁皮石斛的核苷酸分子探针SHF/SHR在鉴别铁皮石斛上的应用。
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