CN103589783B - 一种利用scar技术鉴别金龙胆草及其混淆品的scar引物及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物及其方法，提取混淆品植物的基因组DNA，将样品的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，其SCAR-PCR扩增体系为：25μL体系中含有Mg2+2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，引物SC1、引物SC2各1.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U；扩增程序为：94℃预变性4min，然后进行40个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存；扩增结果有目的条带的即为金龙胆草真品。方法更为客观易行，时间短、准确性高，重复性好。

Description

一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物及其方法
技术领域
本发明涉及的是一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的方法。
背景技术
金龙胆草为菊科白酒草属植物苦蒿ConyzabliniiLévl.的干燥地上部分，分布于云南中、南部，四川攀西地区及贵州部分地区。系70年代四川省发掘的民间草药，具有清热化痰，止咳平喘，解毒利湿，凉血止血的功效，近年来的研究更报道其具有一定的抗肿瘤活性，应用前景广阔。
金龙胆草的民间俗称为“苦蒿”，但名为“苦蒿”的植物却不止一种，且部分植物在形态与化学成分上与金龙胆草相近，使得收购药材时很难识别混淆品，影响金龙胆草的品质。中草药传统的鉴定方法主要是性状或组织显微鉴别，以及有效成分含量的指纹图谱区分道地产品，这些方法各有优缺点或局限性，且需时较长。随着分子遗传标记技术的发展，利用分子手段进行药用植物的遗传分析，可以使鉴别过程不受样品形态、外部条件变化、发育时期、次生代谢物含量等因素的影响，更客观、可靠得提供准确鉴别。
RAPD技术是建立在PCR基础之上的一种DNA分子标记之一，可通过多个不同的随机引物给出覆盖整个基因组的多态性信息。因其具有快速、简便、高效、周期短等特点，近年来，在遗传育种及遗传多样性等方面都得到了广泛的运用，尤其在寻找不同样品间DNA的差异上被广泛应用。SCAR分子标记，即序列特异扩增区域标记，是以RAPD技术为基础的一种新型分子标记，在对RAPD特异扩增条带测序的基础上，设计一对特异引物，并利用此引物对基因组DNA进行PCR扩增，以检测样品是否为混淆品。此方法简单，稳定，重复性好，且带型简单，可直观利用“有或无”条带观测实验结果，因此，SCAR标记已逐渐成为分子遗传育种、植物品系鉴定的首选技术。
传统鉴定技术主要以性状或显微、化学鉴别为主，存在一定的局限性，无法准确区分化学成分相近，外观形态相似的金龙胆草及其混淆品。金龙胆草在外形上与白酒草属植物白酒草，蒿属植物艾草相似，同时由于民间俗名均为“苦蒿”，也易与青蒿混淆。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物包括引物SC1和引物SC2，引物SC1和引物SC2序列如序列表SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。
所述SCAR引物鉴别金龙胆草及其混淆品的方法，包括以下步骤：提取混淆品植物的基因组DNA，将样品的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，其SCAR-PCR扩增体系为：25μL体系中含有Mg2+2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，引物SC1、引物SC2各1.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U；扩增程序为：94℃预变性4min，然后进行40个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存；扩增结果有目的条带的即为金龙胆草真品。
本发明针对金龙胆草DNA序列的特异性，建立了金龙胆草基因组DNA的RAPD指纹图谱，成功获得一个特异SCAR标记，应用这个标记，可以根据凝结电泳判定样品是否为混淆品，方法更为客观易行，时间短、准确性高，重复性好。
附图说明
图1：18个金龙胆草样品的基因组DNA凝胶电泳图；
图2：H37的RAPD特异扩增图谱；
图3：SCAR转化后的金龙胆草特异扩增图谱；
图4：左起为marker，1-3分别为白酒草、青蒿和艾草的RAPD扩增谱图
图5：左起为marker，1-4分别为白酒草、青蒿、艾草和金龙胆草的SCAR扩增谱图
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
本发明涉及到的SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的方法，具体包括以下步骤：
1、采用改良的SDS法提取18个不同地区采集的金龙胆草基因组DNA（图1），方法为取约0.15g新鲜叶片（干样取三分之一重）置于研钵中以液氮快速研磨为粉末，将粉末快速转移至1.5mLEppendorf管中，加入800μL提取缓冲液（1.4%SDS，100mmol/LTris-Hcl，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，临用前加入0.1%14.4mol/Lβ-巯基乙醇及2%PVP），65℃水浴40min至溶液变为土黄色，加入150μlKAc，充分混匀，冰浴30min以沉淀蛋白质；室温下12000r/min离心15min，上清液加入200μl氯仿/异戊醇（24:1）混匀，12000r/min离心10min，反复操作2-3次；上清液加入0.6倍体积异丙醇（-20℃预冷），-20℃冷却30min；离心5min收集沉淀。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量，以λDNA/HindIII为Maker，核酸蛋白仪（Bio-Rad公司）测定DNA浓度和蛋白质残留。
表1供试实验材料
2、进行RAPD扩增以及检测，RPAD反应体系由本实验室预先优化的方法进行，即：25μL体系中含有Mg2+2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，Primer3.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U。PCR扩增在Bio-RadS1000ThermalCyclerPCR仪上进行。扩增程序为94℃预变性4min，然后进行40个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。结果共从100个随机引物(10bp)中筛选出能在18个样品均扩增出特异条带（SEQIDNO：1）的随机引物H37（图2），引物H37序列为AGCGCCATTG（SEQIDNO：2），再利用H37扩增出的特异条带进行克隆、测序，并以测序获得的序列结果设计SCAR引物SC1（SEQIDNO：3）和SC2（SEQIDNO：4）。
3、根据以上设计合成的SCAR引物，转化为稳定的SCAR标记（见图3），具体步骤为：将18份不同产地的金龙胆草药材以其基因组DNA为模板进行PCR扩增，其SCAR-PCR扩增体系为：25μL体系中含有Mg2+2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，引物SC1、SC2各1.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U。扩增程序为：94℃预变性4min，然后进行40个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。
4、提取混淆品植物的基因组DNA，本实验采用的易混淆药用植物分别为白酒草属白酒草、蒿属青蒿和艾草。将此三种样品的基因组DNA以引物H37进行RAPD扩增，显示DNA有丰富扩增条带；然后再进行SCAR-PCR扩增，扩增体系和程序与步骤3中一致。结果（图4、图5）显示扩增无目的条带，本结果能用以鉴别混淆品与金龙胆草。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物由引物SC1和引物SC2组成，引物SC1和引物SC2序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
2.使用权利要求1所述SCAR引物鉴别金龙胆草及其混淆品的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取混淆品植物的基因组DNA，将样品的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，其SCAR-PCR扩增体系为：25μL体系中含有Mg2+2.5mmol/L，dNTPs 4.5mmol/L，引物SC1、引物SC2各1.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U；扩增程序为：94℃预变性4min，然后进行40个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存；扩增结果有目的条带的即为金龙胆草真品。
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