CN104388569B - 一组pcr鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法 - Google Patents

一组pcr鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组PCR鉴别引物，该组引物由三条引物组成，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明还提供以前述引物组鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用前述引物组对其进行PCR扩增；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测。在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。本发明提供的方法能快速、准确鉴定白及的原植物、饮片药材和粉末药材，又能同步鉴别黄花白及的原植物、饮片药材和粉末药材，并能实现与其他植物的鉴别。

Description

一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，特别是涉及一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法。
背景技术
中药白及具有收敛止血、消肿生肌的功效，可用于咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂的治疗。历版中国药典收载均为兰科白及属植物白及Bletilla striataRchb.f.，同时，白及作为珍稀濒危植物，野生资源匮乏，而栽培资源尚难以满足市场需求，使药材价格逐年上涨。但由于该物种的分布具有地域性，一些地区性的中药材标准以黄花白及B.ochracea Schltr.植物作为白及的替代药用品种(《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)，《四川省中药材标准》(2010年版))，但作为地区性品种其资源使用受到一定局限。发明人在对白及药材市场进行实地走访和调查发现，以黄花白及的块茎冠以正品白及药材出售的现象极为普遍，而且以同属、同科植物块茎作为白及药材混淆使用的现象也屡见不鲜。
由于白及和黄花白及在非花期植物形态很难准确分辨，而且这2种物种的块茎在表观性状、组织构造、理化成分上也极为相似，当块茎被加工为饮片、粉末时鉴别难度就更大，既便是有丰富鉴定学知识和鉴别经验者也会筹措难定。白及B.striata Rchb.f.是国家药典明确规定的中药白及品种，黄花白及的经济、药用价值与白及尚有一定差距。目前，运用DNA分子标记技术对白及属植物进行鉴定上，有学者运用过SCAR分子标记方法对黄花白及B.ochracea Schltr.与白及B.striata Rchb.f.、小白及B.formosana Schltr.和云南独蒜兰(又名独叶白芨)Pleione yunnnanensis(Rolfe)Rolfe进行鉴定区别(赵爽，黄春球，杨耀文，等.黄花白及的SCAR分子标记转化研究.中草药，2012，43(10):2036-2039)，也有学者采用SRAP标记技术，拟探索建立一个分析白及物种遗传多样性的实验体系(蒋瑞彬，徐旭栋，蓝小明，等.野生白及SRAP-PCR反应体系的优化，中华中医药学刊，2013，31(2):353-355)，但以白及B.striata Rchb.f.为研究对象，将之与黄花白及和其他植物进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。本发明提供的一组PCR鉴别引物及以之鉴别白及、黄花白及的方法，只需在一个扩增体系内进行PCR扩增反应，即能快速、准确鉴定白及的原植物、饮片药材和粉末药材，又能同步鉴别黄花白及的原植物、饮片药材和粉末药材，并能实现白及和黄花白及与其他植物的鉴别。在提交本发明申请之前，尚无任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR鉴别引物组及同步鉴别白及、黄花白及的分子鉴定方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一组PCR鉴别引物。
本发明的另外一个目的在于提供上述鉴别引物组在白及、黄花白及鉴定中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一组PCR鉴别引物，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
前述的PCR鉴别引物组在白及、黄花白及鉴别中的应用。
包括前述引物的试剂盒。
一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用前述引物组对其进行PCR扩增；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测。在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。
具体的说，所述的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，优选的，所述的PCR扩增反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液6～8μL，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3各2～5pmol，模板DNA 20～160ng，ddH2O补足25μL。所述的PCR反应程序为95℃预变性1～5min，25～40个循环(95℃变性1～20s、52～68℃退火延伸1～30s)。
更优选的，所述的PCR反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液7μL，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3各4pmol，模板DNA 40ng，ddH2O补足25μL。所述的PCR反应程序为95℃预变性1min，30个循环(95℃变性2s、66℃退火延伸5s)。
一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，所述的步骤3)，其特征在于对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测，在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。
发明人进行了一系列实验，以优选本发明提供的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法的PCR扩增条件等，证明本发明鉴定方法的有效性。具体技术方案如下：
一、引物设计
在NCBI(National Center for Biotechnology Information，NCBI，美国国立生物技术信息中心)下载到白及与其近缘物种的核糖体基因序列和叶绿体基因序列，共246条。另选用通用引物对白及与其近缘物种进行扩增并测序，成功获取50条rDNA-ITS序列和15条psbA-trnH序列。运用ClustalX 2.1软件对以上序列进行排序、比对、分析，找出白及、黄花白及的特异性位点，针对此位点设计一组特异性鉴别白及和黄花白及的PCR引物，该组引物由3条引物组成，其核酸序列分别如下：
SEQ ID NO.1：5'—GCCCAGAACAGCCATCCAAGT—3'
SEQ ID NO.2：5'—TTGGCACGGAGCGACACG—3'
SEQ ID NO.3：5'—GCCGAGCAAGAAACAACGC—3'
二、PCR扩增条件优选
根据前述的鉴别引物组和扩增产物的Tm值、长度设置PCR扩增反应体系与扩增程序，以白及、黄花白及和其近缘种(小白及、华白及)的基因组DNA为模板进行PCR扩增。其具体如下：
PCR的反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液8μL，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3各3pmol，模板DNA 20ng，ddH2O补足25μL。
所述的PCR反应程序为95℃预变性1min，35个循环(95℃变性20s，62℃退火延伸30s)。
a.前述的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及方法的PCR扩增程序优选如下：
ⅰ退火延伸温度：考察了48℃、52℃、56℃、60℃、64℃、68℃的退火延伸温度。结果显示，52℃～68℃白及和黄花白及的扩增产物分别在354bp、519bp扩增出目的条带，条带亮度随温度的升高而增强，近缘种均未检测出条带。为保证退火延伸的有效进行，本发明选择退火延伸温度为66℃。图1为退火延伸温度优选的电泳检测图谱(M：D2000DNA Marker；1～4：白及、黄花白及、小白及、华白及)。
ⅱ退火延伸时间：基于上述退火延伸温度的特征，考察1s、2s、5s、10s、20s、30s的退火延伸时间。结果显示，各退火延伸时间下，白及、黄花白及均能有效扩增，条带亮度随着时间的延长而增强，5s～30s条带亮度无明显差异。为节约时间，本发明优选退火延伸时间为5s。图2为退火延伸时间优选的电泳检测图谱(M：D2000DNA Marker；1～4：白及、黄花白及、小白及、华白及)。
ⅲ变性时间：基于上述ⅱ，考察变性时间为1s、2s、5s、10s、15s、20s。结果显示，各变性时间下，白及、黄花白及均能有效扩增，尤其是2s～10s时条带亮度最强。为节约扩增时间，本发明选择变性时间为2s。图3为变性时间优选的电泳检测图谱(M：D2000DNA Marker；1～4：白及、黄花白及、小白及、华白及)。
ⅳ变性-退火延伸的循环次数(n)：根据上述ⅲ的特征，考察25、28、30、32、35、40次变性-退火延伸循环次数对PCR扩增的影响。结果显示，各个循环次数条件下，白及、黄花白及样品均能扩增，目的条带明亮清晰，尤其是在30次循环时的电泳条带亮度最均一。因此，本发明优选变性-退火延伸的循环次数为30次。图4为变性-退火延伸循环次数优选的电泳检测图谱(M：D2000DNA Marker；1～4：白及、黄花白及、小白及、华白及)。
ⅴ基于上述ⅳ，一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法PCR扩增程序最终优选为：
b.前述的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及方法的PCR扩增体系优选如下：
根据上述a.项下确定的扩增程序，对25μL PCR扩增体系中组分的用量进行以下优选：
ⅰTaq酶PCR预混液的用量：扩增体系中Taq酶PCR预混液的含量分别为4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL。结果显示，Taq酶PCR预混液用量在6μL～9μL时，白及、黄花白及均能有效扩增，尤其是7μL～8μL时，条带亮度最强，为节约鉴定成本，本发明选择在PCR反应体系中加入Taq酶PCR预混液的量为7μL。图5为Taq酶PCR预混液用量优选的电泳检测图谱(M：D2000DNAMarker；1～4：白及、黄花白及、小白及、华白及)。
ⅱ引物含量：根据上述ⅰ，考察体系中如序列表所示，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3的含量各为：1pmol、2pmol、3pmol、4pmol、5pmol。结果显示，当SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3含量各为2pmol～5pmol时，白及、黄花白及均能有效扩增；当为3pmol～5pmol时条带亮度较强，尤其是4pmol时条带亮度最强。因此，本发明选择加入SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3的量各为4pmol。图6为引物用量优选的电泳检测图谱(M：D2000DNA Marker；1～4：白及、黄花白及、小白及、华白及)。
ⅲ模板DNA用量：在上述ⅱ的基础上，对体系中含5ng、10ng、20ng、40ng、80ng、160ng的模板DNA用量进行考察。结果显示，体系中模板DNA含量为20ng～160ng时，白及、黄花白及均能有效扩增，尤其是40ng、80ng时条带亮度最强。为节约模板DNA的用量，本发明选择其用量为40ng。图7为模板DNA用量优选的电泳检测图谱(M：D2000DNA Marker；1～4：白及、黄花白及、小白及、华白及)。
ⅳ根据上述ⅰ～ⅲ，一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及方法的PCR扩增反应体系(25μL)中，各组分含量优选值为：
三、重现性考察
根据上述二优选出的扩增条件，对其确定的方法进行重现性考察，具体操作如下：
i分别使用Mastercycler(德国Eppendof)、Applied Biosystems VeritiTM96(美国ABI)、GeneAmp PCR system 9700(美国ABI)三台不同厂家型号的PCR仪扩增，考察仪器对PCR反应稳定性的影响；
ii运用2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技术有限公司)、2×TaqPCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)、2×Easy Taq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)、2×UTaq PCR MasterMix(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)四种Taq酶PCR预混液进行扩增，考察不同厂家酶的反应重现性。
iii使用分别由上海生工生物科技有限公司、北京博迈德生物有限公司合成的2个批次的引物组，考察不同厂家合成引物组对PCR反应重现性的影响。
iv前述的ⅰ～ⅲ的试验结果显示，不同厂家型号的PCR仪及不同厂家的Taq酶PCR预混液均能扩增出白及、黄花白及的目的片段，能准确的鉴别白及与黄花白及，而不同批次的鉴别引物组对PCR扩增结果也无明显差异。因此，本发明提供的一组PCR鉴别引物和以其鉴别白及、黄花白及的方法，可以快速、准确的鉴别白及和黄花白及，操作简捷，实用性强，适于大规模推广应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
附图说明
图1为退火延伸温度优选的电泳检测图谱；
图2为退火延伸时间优选的电泳检测图谱；
图3为变性时间优选的电泳图检测谱图；
图4为变性-退火延伸循环次数优选的电泳检测图谱；
图5为Taq酶PCR预混液用量优选的电泳检测图谱；
图6为引物用量优选的电泳检测图谱；
图7为模板DNA用量优选的电泳检测图谱；
图8实施例1电泳检测图谱；
图9实施例2电泳检测图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1)材料
a.在药材市场上收集到白及药材样品27份，每份样品约250g。
b.试剂琼脂糖(西班牙Biowestagarose)；D2000DNA Marker(北京索莱宝科技有限公司)；2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技术有限公司)；溴化乙锭(北京天根生化科技有限公司)；引物为上海生工生物科技有限公司合成。
c.仪器PCR仪(Applied Biosystems VeritiTM96，美国ABI)；凝胶成像系统(GGM/D2，英国SYNGENE)；电脑三恒多用电泳仪(DYY-12，北京六一仪器厂)。
2)基因组DNA提取：取待鉴定样品10mg，采用碱提法提取各药材样品基因组DNA，于-20℃保存。
3)特异性PCR扩增：
运用如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的特异性引物扩增，反应采用25μL体系，其组分含量为：
扩增程序为：
扩增产物检测及结果：
取6μL PCR扩增产物加入含溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中，85V稳定电压电泳30min，紫外凝胶成像系统观察。结果显示，8份样品在354bp处产生条带，10份样品在519bp处扩增出条带，9份样品未产生条带。
经专家鉴定在354bp处产生条带的8份样品均为白及，在519bp处产生条带的10份样品均为黄花白及，未产生条带的9份样品分别为：2份小白及，1份华白及，1份独蒜兰，2份苞舌兰，2份长距美冠兰，1份竹叶兰。图8为实施例1电泳图谱(CK：阴性对照；M：D2000DNAMarker；1：竹叶兰；2、6：苞舌兰；3、5：长距美冠兰；4：独蒜兰；7、9：小白及；8：华白及；10～14、16～19、27：黄花白及；15、20～26：白及)。
实施例2
1)材料、试剂与仪器
a.材料
收集到白及、黄花白及，以及与之同科或同属的植物样本43个批次，共346株样本。其中，白及样品8个批次，共72株样本；黄花白及10个批次，共103株样本；同属植物2种(小白及、华白及)，8个批次，共45株样本；同科植物4种(独蒜兰、苞舌兰、长距美冠兰、竹叶兰)17个批次，共126株样本。样本数及来源见表1。
表1样品来源表
b.试剂琼脂糖(西班牙Biowestagarose)；D2000(北京索莱宝科技有限公司)；2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技术有限公司)；溴化乙锭(北京天根生化科技有限公司)；引物为上海生工生物科技有限公司合成。
c.仪器PCR仪(Applied Biosystems VeritiTM96，美国ABI)；凝胶成像系统(GGM/D2，英国SYNGENE)；电脑三恒多用电泳仪(DYY-12，北京六一仪器厂)。
2)基因组DNA提取：取待鉴定样品20mg，采用改良的CTAB法提取各样品基因组DNA，于-20℃保存。
3)特异性PCR扩增：
运用如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的特异性引物扩增，反应采用25μL体系，其组分含量为：
扩增程序：
产物检测：
取6μL PCR扩增产物加入含溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中，85V稳定电压电泳30min，紫外凝胶成像系统观察。
8个批次的白及样品均在354bp处产生单一的条带，10个批次的黄花白及样品均在519bp扩增出单一条带，其他物种材料在354bp和519bp均未检测出条带。可以明显的区别白及和黄花白及，并实现了白及、黄花白及与其他植物材料的鉴别。图9为实施例2电泳检测图谱(其中，M：D2000DNA Marker；1～8：BJ-01、BJ-02、BJ-03、BJ-04、BJ-05、BJ-06、BJ-07、BJ-08；9～18：BO-01、BO-02、BO-03、BO-04、BO-05、BO-06、BO-07、BO-08、BO-09、BO-10；19～21：AG-01、AG-02、AG-03；22～24：EF-01、EF-02、EF-03；25～29：SP-01、SP-02、SP-03、SP-04、SP-05；30～35：BB-01、BB-02、BB-03、BB-04、BB-05、BB-06；36～38：BS-01、BS-02、BS-03；39～43：BF-01、BF-02、BF-03、BF-04、BF-05；CK：阴性对照)。
本发明提供了一组PCR鉴别引物及以之鉴别白及、黄花白及的方法，只需在一个扩增体系内进行PCR扩增反应，即能快速、准确鉴定白及的原植物、饮片药材和粉末药材，又能同步鉴别黄花白及的原植物、饮片药材和粉末药材，并能将白及和黄花白及与其他植物材料进行同步区别，其操作步骤简单，可推广应用。
本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，打破了依赖植物开花期作为白及和黄花白及物种鉴定的局限，此外，还解决了2种药材在表观性状、组织构造、理化成分难以鉴别的问题，对白及的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义。本发明操作流程简捷，所需仪器设备简单，实用性强，可为白及现场快速鉴定提供参考。本发明的施行，将从源头上提高和确保中药白及质量，为中药白及临床的用药安全和稳定有效提供了有效保障。

Claims (6)

1.一组PCR鉴别引物，其核苷酸序列为：
SEQ ID NO.1：5'—GCCCAGAACAGCCATCCAAGT—3'；
SEQ ID NO.2：5'—TTGGCACGGAGCGACACG—3'；
SEQ ID NO.3：5'—GCCGAGCAAGAAACAACGC—3'。
2.以权利要求1所述的一组PCR引物鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤：
1)以待鉴定样品的基因组DNA为模板，使用前述的一组鉴别引物对其进行扩增；
2)对步骤1)的PCR扩增产物进行电泳检测。
3.根据权利要求2所述鉴别白及、黄花白及的方法，其特征在于，步骤1)所述的PCR反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液6～8μL，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3各2～5pmol，模板DNA 20ng～160ng，ddH2O补足25μL；所述的PCR反应程序为95℃预变性1min～5min，25～40个循环：95℃变性1～20s、52℃～68℃退火延伸1s～30s。
4.根据权利要求3所述鉴别白及、黄花白及的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液7μL，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3各4pmol，模板DNA40ng，ddH2O补足25μL；所述的PCR反应程序为95℃预变性1min，30个循环：95℃变性2s、66℃退火延伸5s。
5.根据权利要求2所述鉴别白及、黄花白及的方法，其特征在于，步骤2)对步骤1)的PCR扩增产物进行电泳检测，在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。
6.权利要求2～5任一项方法在白及、黄花白及鉴别中的应用。
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白及属药用植物DNA 条形码的确立及其应用;吴劲松 等;《药学学报》;20141012;第49卷(第10期);摘要，表1-2，图1、3，第1469-1472页结果和讨论部分 *

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