西红花特异性鉴别引物及PCR方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,涉及中药及中药材鉴定领域,特别涉及一种能够快速鉴定中药材西红花的特异性引物及PCR扩增方法。
背景技术
西红花为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。又名藏红花、番红花等,西红花以柱头入药,产量极低,价格高,由于经济利益驱动,市场偶见使用其他植物的花柱或花丝等组织染色后冒充西红花销售。掺伪品包括菊科植物菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的舌状花冠,红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花,睡莲科植物莲(Nelum bonucifera Gaertn.)的干燥雄蕊,伞形科胡萝卜属胡萝卜(Daucus carota)的干燥细丝等。因此建立快速、准确鉴别西红花的方法,对于市场监管、保证临床用药安全是十分重要的。
性状、显微、理化、化学和生物鉴定构成了现代中药材鉴别方法的五大领域,其中以DNA分子标记为代表的生物鉴定方法已广泛应用于中药材分子真伪鉴别。目前使用的DNA分子标记(Dodgson JB,Cheng HH,Okimoto R.DNA marker technology:a revolution in animal genetics.Poult Sci,1997,76(8):1108~1114.)主要包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性(PCR-RFLP)、简单重复序列间区多态性(ISSR)、ITS序列分析、DNA条形码技术等。与传统鉴别方法相比,DNA分子标记不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制,其数量丰富、遗传稳定(Shah MM,Hassan SW,Maqbool K,et a1.Comparisons of DNA marker~based genetic diversity with phenotypic estimates in maize grown in Pakistan..Genet Mol Res,2010,9(3):1936~1945.),对生物体的影响表现“中性”,即可以对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测;具有快速、微量、特异性强以及操作简便的特点。
本研究针对西红花和其掺伪品的核酸序列差异设计特异引物,进行西红花的分子鉴别,通过PCR扩增和电泳等基本操作,不需要进行测序,可更快速、简便、高效的鉴别西红花真伪。在本发明被公布之前,尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR特异性鉴别引物和鉴别体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种贵细药材西红花的鉴定方法,该PCR鉴定方法操作简单、样品量少,能快速、准确的鉴定西红花的样品,并能检测西红花是否有掺杂,具有非常强的实用 性。
1、一种鉴定西红花的特异引物P421F、P421R,471QCF、471QCR、121CsR、386AdR,其序列为:
2、一种西红花的PCR鉴定方法,其特征在于,包括下列步骤:
a)从待鉴定样品中提取到DNA样品;
b)用权利要求1所述的引物P421F+P421R进行PCR反应,扩增反应体系包括:总体积25μL,其中10×buffer缓冲液2.5μL,dNTP20nmol,P421F、P421R引物各5pmol,rTap酶1U,BSA0.5μL,DNA20ng,灭菌蒸馏水16.8μL;反应条件:94℃预变性4min后,94℃变性30S,56℃退火45S,72℃延伸1min,35个循环后72℃延伸8min,获得PCR产物,通过2.5%的琼脂糖凝胶电泳,并用核酸染色试剂进行染色观察;
c)用权利要求1所述的引物471QCF+471QCR+121CsR+386AdR进行PCR反应:总体积25μL,其中10×buffer缓冲液2.5μL,dNTP20nmol,471QCF引物用量为10pmol,471QCR的用量为1.25pmol,121CsR用量3.75pmol,386AdR用量5pmol,rTap酶1U,BSA0.5μL,DNA20ng,灭菌蒸馏水14.8μL;反应条件:94℃预变性4min后,94℃变性30S,56℃退火45S,72℃延伸1min,35个循环后72℃延伸8min,获得PCR产物,通过2.5%的琼脂糖凝胶电泳,并用核酸染色试剂进行染色观察;
d)PCR扩增产物电泳后,如果b)产物存在分子量约为421bp的单一条带,则初步证明所检材料含西红花;b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带,则证明所检材料不含西红花;如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带,且c)产物只存在分子量约为121、471bp的两条带,则确定所检材料含西红花;如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带,且c)产物存在121、471、386bp三条带,则确定材料中含有西红花,且可能存在胡萝卜、红花或莲须;如果b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带,c)产物不存在分子量约为121bp的 条带,则确定所检材料无西红花。
3、一种西红花的PCR鉴定方法,其特征在于,待测定样品为西红花饮片、西红花粉碎后的粉末、或含有粉碎后西红花粉末的复方。
附图说明
图1:P421F+P421R特异引物鉴别,该引物能扩增获得西红花样品(Cs)和西红花psbA片段克隆质粒(CspsbApMD19)421bp的鉴别条带,而对其它混淆品和伪品没有扩增产物。P421F+P421R鉴别效果:“+”CspsbApMD19,“-”negative control,M100bp ladder.Cs:西红花,Dm菊花,Dc胡萝卜,Nm莲,Ct红花(以下缩写同)
图2:471QCF+471QCR+121CsR+386AdR多重PCR鉴别体系,对样品的鉴别结果显示,使用多重PCR鉴别体系,西红花样品(Cs)和西红花rbcL片段克隆质粒(CsrbcLpMD19)能扩增出471bp的通用条带和121bp鉴别条带。胡萝卜、莲、红花能扩增出471bp的通用条带和386bp的伪品条带,而菊花仅能扩增出471bp的通用条带。471QCF+471QCR+121CsR+386AdR多重PCR鉴别效果:“+”CsrbcLpMD19,“-”negative control,M:DL2000ladder.
图3:西红花与胡萝卜或莲混合,混合品胡萝卜或莲含量从1%-50%都能扩出471、386、121bp的条带,且随浓度增加,各条带亮度有所变化,特别是伪品386bp条带亮度增加。471QCF+471QCR+121CsR+386AdR多重PCR鉴别混合样品的效果:1-6Cs+Dc,Dc的含量从1到6为:1%,2.5%,5%,10%,20%,50%。7-12Cs+Nm:Nm的含量从7到12为:1%,2.5%,5%,10%,20%,50%,M:DL2000ladder。
具体实施方式
1材料
西红花和混杂品药材的实验材料取自药材市场或药店,经中国中医科学院中药研究所金燕鉴定。具体见表1。
表1西红花及掺杂品
2特异性鉴别引物设计
选择通用引物psbA-trnH,rbcL1R-rbcL824R扩增获得西红花及掺杂品的序列,通过Genebank上查询已登录序列,使用Bio-edit软件进行比对,获得差异位点信息,使用primer5软件进行引物设计,分别设计针对psbA-tmH和rbcL的特异性引物,见表2。
表2鉴别引物
3DNA提取
将材料用球磨仪研磨成粉,取约0.02g粉末置于2.0mL的微量离心管中,加入900μL已灭菌的CTAB提取液(2%CTAB,100mmo1.L-1Tris-HCl,20mmol.L-1EDTA,1.4mol.L-1NaCl)、0.01g PVP40000、10μLβ-巯基乙醇充分振荡混匀,65℃水浴1.0-1.5h,期间轻摇2-3次。水浴结束后取出,冷却至室温,加入900μL氯仿-异戊醇(24:1),充分振荡混匀,12000×g离心10min。取上清,加入等体积氯仿-异戊醇(24:1),充分振荡混匀,12000×g离心10min。取上清,加入2/3体积预冷的异丙醇溶液,-20℃放置0.5h以上。取 出,12000×g离心10min,弃上清,沉淀用70%乙醇洗涤两次,无水乙醇洗涤一次,37℃挥干乙醇,用适量灭菌水溶解,然后-20℃保存。
4扩增检测及鉴定
a)将从待鉴定样品中提取到DNA样品,稀释到20ng·μL-1;
b)用权利要求1所述的引物P421F+P421R进行PCR反应,扩增反应体系包括:总体积25μL,其中10×buffer缓冲液2.5μL,dNTP20nmol,P421F、P421R引物各5pmol,rTap酶1U,BSA0.5μL,DNA20ng,灭菌蒸馏水16.8μL;可加入阳性质粒CspsbApMDl9做对照,反应条件:94℃预变性4min后,94℃变性30S,56℃退火45S,72℃延伸1min,35个循环后72℃延伸8min,获得PCR产物,通过2.5%的琼脂糖凝胶电泳,并用核酸染色试剂进行染色观察;
c)用权利要求1所述的引物471QCF+471QCR+121CsR+386AdR进行PCR反应:总体积25μL,其中10×buffer缓冲液2.5μL,dNTP20nmol,471QCF引物用量为10pmol,471QCR的用量为1.25pmol,121CsR用量3.75pmol,386AdR用量5pmol,rTap酶1U,BSA0.5μL,DNA20ng,灭菌蒸馏水14.8μL;可加入阳性质粒CsrbcLpMD19做对照,反应条件:94℃预变性4min后,94℃变性30S,56℃退火45S,72℃延伸1min,35个循环后72℃延伸8min,获得PCR产物,通过2.5%的琼脂糖凝胶电泳,并用核酸染色试剂进行染色观察;
d)取5μL扩增产物,采用2.5%的琼脂糖凝胶,用100ladder DN Amarker做参照,在电压100-150V下电泳15-20分钟,凝胶成像系统下观察并拍照。PCR扩增产物电泳成像后,如果b)产物存在分子量约为421bp的单一条带,则初步证明所检材料含西红花;b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带,则证明所检材料不含西红花;如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带,且c)产物只存在分子量约为121、471bp的两条带,则确定所检材料含西红花;如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带,且c)产物存在121、471、386bp三条带,则确定材料中含有西红花,且可能存在胡萝卜、红花或莲须;如果b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带,c)产物不存在分子量约为121bp的条带,则确定所检材料无西红花。通过以上描述做出鉴定结论。