KR20160093337A - 색소옥수수 판별용 특이 ssr 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 71개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수를 판별하기 위한 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수를 판별하기 위한 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 색소옥수수를 판별하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명의 색소옥수수 판별용 특이 SSR 프라이머를 통하여 색소옥수수 및 비색소옥수수의 효율적인 식별이 가능할 뿐만 아니라, 색소옥수수 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

Description

색소옥수수 판별용 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도{Specific SSR primers for discriminating colored maize and uses thereof}

본 발명은 색소옥수수를 판별하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 71개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수 판별용 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수 판별용 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 색소옥수수를 판별하는 방법을 제공한다.

옥수수(Zea mays L.)는 세계 3대 중요 작물 중 하나이며, 식용뿐만 아니라 사료용, 공업용 및 바이오에너지 등 다양한 용도로 이용되고 있다. 최근 웰빙(well-being)에 대한 관심이 높아지면서, 자연적으로 생성되는 천연성분을 함유한 고품질, 고기능성을 갖는 작물이나 이를 이용한 가공품을 선호하고 있다. 더욱이 검은콩, 흑미, 흑깨 등 웰빙 건강식으로 블랙푸드가 각광을 받으면서 이러한 블랙푸드에 함유된 안토시아닌(anthocyanin) 색소에 대한 관심이 높아지고 있다. 안토시아닌 색소는 식물에 존재하는 천연 색소로 자색, 청색, 적색을 나타내며 인체에 무해한 성분이다. 안토시아닌 색소는 천연 착색료로 이용될 뿐 아니라, 항산화, 항암, 항당뇨에 효과가 있다. 현재 안토시아닌 색소는 포도에서 주로 추출되어 이용되고 있다. 이러한 안토시아닌 색소의 중요성과 기능성 등을 고려하여, 강원도농업기술원 옥수수시험장에서는 안토시아닌 색소뿐만 아니라 유용 기능성 물질을 다량 보유하고 있는 기능성 옥수수의 개발에 관심을 가지고 있다. 하지만 현재까지 색소옥수수 품종의 개발 및 분자생물학적 연구가 매우 제한적이며, 다양한 특성을 갖는 색소옥수수 품종의 개발이 절실히 요구된다.

색소옥수수의 품종개발을 위해서는 우수 형질을 지니고 있는 다양한 유전자원의 수집과 수집된 유전자원들의 유전학적 특성을 명확히 밝히는 것이 육종의 효율을 높이기 위해 매우 중요하다. 특히 타식성 작물인 옥수수 품종의 경우, 다양한 지역에서 수집되어 고정된 육종재료들에서 유전자원들의 유전학적 특성을 밝히고, 우수한 자식계통을 선정하기 위해서 수집된 재료들의 유전적 다양성(genetic diversity), 계통유연관계(genetic relationship) 및 집단구조(population structure)를 명확히 평가하는 것이 신품종 개량을 위한 자식계통 육성 및 발굴 그리고 교배조합 예측 등에 효율적으로 이용될 수 있고, 이형집단에서 자식계통의 선발과 품종 보호 등에도 매우 중요하다. 특히 본 발명에 이용한 SSR(simple sequence repeat) 분석법은 PCR을 이용하는 분석기법으로 재현성이 매우 뛰어나며, 식물 집단들 내에서 유전자좌(gene locus)마다 많은 대립인자들을 가지고 있고 대립유전자의 특성을 명확하게 나타낼 수 있어 옥수수와 같은 작물의 유전적 다양성, 계통유연관계 및 집단구조를 분석하고 핑거프린팅(fingerprinting)과 분자 매핑(molecular mapping) 등에 활용되고 있다.

강원도 농업기술원 옥수수 연구소에서는 고품질의 색소옥수수 품종을 개발하기 위해서 육성한 6개의 색소옥수수 자식계통과 6개의 비색소옥수수 자식계통의 핵심집단에 대하여 SSR 분자 마커를 이용하여 색소옥수수 및 비색소옥수수 그룹에서 특이적으로 증폭되는 대립단편을 확인하여 색소옥수수 판별용 분자 마커 개발 및 육종연구에 유용한 정보를 제공하고자 하였다.

한편, 한국특허등록 제1032868호에는 '미흑찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제1055173호에는 '미백2호옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 색소옥수수 판별용 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 강원도 농업기술원 옥수수연구소에서 육성하여 개발한 색소옥수수 자식계통들에 대하여 SSR 분자마커를 이용하여 유전적 다양성, 계통유연관계 및 집단구조를 분석하여 최종적으로, 색소옥수수 및 비색소옥수수를 특이적으로 판별할 수 있는 효과적인 SSR 프라이머를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 71개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수를 판별하기 위한 SSR 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 색소옥수수를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 색소옥수수 판별용 특이 SSR 프라이머를 통하여 색소옥수수 및 비색소옥수수의 효율적인 식별이 가능할 뿐만 아니라, 색소옥수수 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 300개의 SSR 프라이머 세트를 이용하여 색소 및 비색소옥수수의 12 계통에서 증폭된 1,331개의 대립단편의 빈도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 색소 및 비색소옥수수의 12 계통에서 SSR 프라이머를 이용하여 확인된 대립단편의 분석결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에 따른 SSR 프라이머 bnlg1867을 이용하여 색소 및 비색소옥수수의 12 계통에 대한 SSR 프로필의 예를 나타낸 결과이다. ★는 중국의 색소옥수수 3 계통에 대한 특이적인 대립단편; ▲는 일반 색소옥수수 3 계통에 대한 특이적인 대립단편이다.
도 4는 본 발명에 따른 특이 SSR 마커에 기초한 UPGMA 계통도(dendrogram)를 나타낸 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 71개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수 판별용 SSR 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 SSR 프라이머 세트는 구체적으로 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 83 및 84의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 89 및 90의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 99 및 100의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 103 및 104의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 105 및 106의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 107 및 108의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 109 및 110의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 111 및 112의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 113 및 114의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 115 및 116의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 117 및 118의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 119 및 120의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 125 및 126의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 127 및 128의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 129 및 130의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 133 및 134의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 135 및 136의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 137 및 138의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 139 및 140의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 141 및 142의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 SSR 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 71개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상, 31개 이상, 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 41개 이상, 42개 이상, 43개 이상, 44개 이상, 45개 이상, 46개 이상, 47개 이상, 48개 이상, 49개 이상, 50개 이상, 51개 이상, 52개 이상, 53개 이상, 54개 이상, 55개 이상, 56개 이상, 57개 이상, 58개 이상, 59개 이상, 60개 이상, 61개 이상, 62개 이상, 63개 이상, 64개 이상, 65개 이상, 66개 이상, 67개 이상, 68개 이상, 69개 이상, 70개 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 71개의 SSR 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 83 및 84의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 89 및 90의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 99 및 100의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 103 및 104의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 105 및 106의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 107 및 108의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 109 및 110의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 111 및 112의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 113 및 114의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 115 및 116의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 117 및 118의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 119 및 120의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 125 및 126의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 127 및 128의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 129 및 130의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 133 및 134의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 135 및 136의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 137 및 138의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 139 및 140의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 141 및 142의 SSR 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.

상기 71개의 SSR 프라이머 세트를 동시에 이용하면 색소옥수수 자식계통을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.

상기 SSR 프라이머는 각 SSR 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10트; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 서열번호 45 및 46; 서열번호 47 및 48; 서열번호 49 및 50; 서열번호 51 및 52; 서열번호 53 및 54; 서열번호 55 및 56; 서열번호 57 및 58; 서열번호 59 및 60; 서열번호 61 및 62; 서열번호 63 및 64; 서열번호 65 및 66; 서열번호 67 및 68; 서열번호 69 및 70; 서열번호 71 및 72; 서열번호 73 및 74; 서열번호 75 및 76; 서열번호 77 및 78; 서열번호 79 및 80; 서열번호 81 및 82; 서열번호 83 및 84; 서열번호 85 및 86; 서열번호 87 및 88; 서열번호 89 및 90; 서열번호 91 및 92; 서열번호 93 및 94; 서열번호 95 및 96; 서열번호 97 및 98; 서열번호 99 및 100; 서열번호 101 및 102; 서열번호 103 및 104; 서열번호 105 및 106; 서열번호 107 및 108; 서열번호 109 및 110; 서열번호 111 및 112; 서열번호 113 및 114; 서열번호 115 및 116; 서열번호 117 및 118; 서열번호 119 및 120; 서열번호 121 및 122; 서열번호 123 및 124; 서열번호 125 및 126; 서열번호 127 및 128; 서열번호 129 및 130; 서열번호 131 및 132; 서열번호 133 및 134; 서열번호 135 및 136; 서열번호 137 및 138; 서열번호 139 및 140; 및 서열번호 141 및 142 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 및 서열번호 2의 SSR 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 SSR 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10트; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31 및 32; 서열번호 33 및 34; 서열번호 35 및 36; 서열번호 37 및 38; 서열번호 39 및 40; 서열번호 41 및 42; 서열번호 43 및 44; 서열번호 45 및 46; 서열번호 47 및 48; 서열번호 49 및 50; 서열번호 51 및 52; 서열번호 53 및 54; 서열번호 55 및 56; 서열번호 57 및 58; 서열번호 59 및 60; 서열번호 61 및 62; 서열번호 63 및 64; 서열번호 65 및 66; 서열번호 67 및 68; 서열번호 69 및 70; 서열번호 71 및 72; 서열번호 73 및 74; 서열번호 75 및 76; 서열번호 77 및 78; 서열번호 79 및 80; 서열번호 81 및 82; 서열번호 83 및 84; 서열번호 85 및 86; 서열번호 87 및 88; 서열번호 89 및 90; 서열번호 91 및 92; 서열번호 93 및 94; 서열번호 95 및 96; 서열번호 97 및 98; 서열번호 99 및 100; 서열번호 101 및 102; 서열번호 103 및 104; 서열번호 105 및 106; 서열번호 107 및 108; 서열번호 109 및 110; 서열번호 111 및 112; 서열번호 113 및 114; 서열번호 115 및 116; 서열번호 117 및 118; 서열번호 119 및 120; 서열번호 121 및 122; 서열번호 123 및 124; 서열번호 125 및 126; 서열번호 127 및 128; 서열번호 129 및 130; 서열번호 131 및 132; 서열번호 133 및 134; 서열번호 135 및 136; 서열번호 137 및 138; 서열번호 139 및 140; 및 서열번호 141 및 142의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 색소옥수수 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

옥수수에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 색소옥수수를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 옥수수 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(프로메가사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SSR 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 SSR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물재료와 DNA 추출

본 발명에 이용된 색소 및 비색소옥수수 계통들은 강원도 농업기술원 옥수수 연구소에서 기능성 색소옥수수 신품종 육성을 위해서 이전의 김 등(Kim et al., 2012, Kor. J. Breed. Sci. 44(3): 301-311)의 연구를 통하여 31계통의 색소 및 비색소옥수수에서 각각 집단들을 대표할 수 있는 12 계통의 옥수수 핵심집단(색소옥수수 6계통, 비색소옥수수 6계통)을 선발하였으며(표 1), 색소옥수수 계통들은 여교잡을 통하여 자식계통으로 육성 중에 있다. 더욱이 선발된 12 계통의 옥수수 핵심집단은 300개의 SSR 프라이머를 이용하여 실험을 수행하였다. 옥수수 게놈(Genomic) DNA는 유묘기의 어린 잎에서 델라포르타 등(Dellaporta et al., 1983, Mol Biol Rep 1:19-21)의 방법을 약간 변형하여 추출하였다.

본 발명에 이용된 색소 및 비색소옥수수 12 계통의 핵심집단

코드 번호	엔트리 번호	계통	소스
1	10S4015	차이나 컬렉션 1-1	색소 커널, 일반 옥수수
2	10S4026	차이나 컬렉션 1-4	색소 커널, 일반 옥수수
3	10S4032	차이나 컬렉션 1-7	색소 커널, 일반 옥수수
4	11CS4117	HW9 BC2	색소 커널, 찰옥수수
5	11CS4124	HW9 BC2	색소커널, 찰옥수수
6	11CS7014	HW9 BC1	색소 커널, 찰옥수수
7	Mo17	Mo17	일반 옥수수, 자식계통
8	B14A	B14A	일반 옥수수, 자식계통
9	HW7	HW7	찰옥수수, 자식계통, 블랙 커널
10	KW7	KW7	찰옥수수, 자식계통, 화이트 커널
11	HW9	HW9	찰옥수수, 자식계통, 화이트 커널
12	HW3	HW3	찰옥수수, 자식계통, 화이트 커널

2. SSR 프라이머 선발과 PCR 증폭

색소 및 비색소옥수수 핵심집단에 대한 유전적 다양성 및 집단구조 분석을 위해서 선발된 SSR 프라이머들은 MaizeGDB(http://www.naizegdb.org/) 정보를 기초하여 옥수수 전체 게놈을 포함할 수 있도록 각 염색체 당 30개씩 총 300개의 SSR 프라이머 세트를 분석에 사용하였다.

PCR 증폭을 위한 용액의 조성은 총 30㎕로 구성되며, 20ng의 게놈 DNA와 1×PCR 버퍼, 0.3μM의 프라이머, 0.2mM의 dNTP 그리고 1 유닛(unit)의 Taq 폴리머라제(Biotools, B&M Labs, Madrid)로 구성하였다. PCR 반응은 처음 94℃에서 5분간 인큐베이션을 시킨 후, 1 사이클로 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 65℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 2분간 연장(extension)을 하고, 2번째 사이클부터 마지막까지 1℃씩 낮추며 최종 55℃까지 낮추었다. 마지막 사이클은 20번 반복하고, 사이클 완료 후 72℃에 10분간 연장하였다.

4. 전기영동과 은 염색( Silver - staining )

5㎕의 PCR 산물을 10㎕의 로딩 버퍼(98% 포름아미드, 0.02% BPH, 0.02% 자일렌 C, 및 5mM NaOH)와 혼합하였다. 그 후 변성(denaturation) 처리를 한 후 얼음에 냉각하여, 6% 변성 아크릴아미드-비스아크릴아미드 겔(19:1, 7.5M 우레아)에 1×TBE 버퍼를 채운 후 2㎕의 시료를 로딩하고, 1800V, 60W에 2시간 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 은 염색 키트(프로메가사, 미국)을 이용하여 DNA 밴드를 확인하였다.

5. 데이타 통계 분석

통계분석은 SSR 프라이머들에서 증폭된 DNA 단편을 대립단편의 유무에 따라 1(유)과 0(무)으로 기록하였다. 로커스(Locus)당 대립단편 수, MAF(major allele frequency), GD(gene diversity), PIC(polymorphic information content)는 PowerMarker V3.25 프로그램을 이용하여 분석하였다(Liu and Muse, 2005, Bioinformatics 21: 2128-2129).

유전적 다양성(GD, gene diversity) 값은 다음과 같은 공식으로 계산하였으며, 여기서 plu는 u번째 대립단편 빈도, f는 자식계수(inbreeding coefficient), n은 샘플 크기를 나타낸다.

그리고 PIC값은 보스테인 등(Bostein et al., 1980, Am. J. Genet. 32: 314-331)의 계산 방식에 따라 아래와 같은 공식을 이용하였으며, 여기서 plu는 u번째의 대립단편 빈도, plv는 v번째의 대립단편 빈도를 나타낸다.

유전적 유사성(GS, genetic similarities) 값은 Dice similarity index (Dice, 1945,Ecology 26: 297-302)를 이용하여 계산하였고, 덴드로그램(SAHN 클러스터링)은 NTSYS-pc.V.2.1 프로그램을 이용하여 UPGMA(un-weighted pair group methods using arithmetic averages algorithm) 방법(Rohlf, 1998, Exeter Software, Setauket, New York)에 따라 작성하였다. 한편, 색소 및 비색소옥수수 계통들에 대한 집단구조 분석은 모델기초 프로그램인 STRUCTURE 2.3를 이용하여 프리차드 등(Pritchard et al., 2003, Documentation for STRUCTURE software, version 2)가 제안한 방법에 의해 계산하였다. STRUCTURE 프로그램을 이용한 분석에서 혼합모델은 100,000의 번인(burn-in), 100,000의 런렝스(run length)로 1~10의 범위에서 각 K값 당 5반복을 실시하여 평균 우도값(likelihood value)인 LnP (D)값을 계산하였으며, STRUCTURE 프로그램에서 측정된 데이터의 로그확률(log probability)인 LnP (D)값은 에반오 등(Evanno et al., 2005, Mol. Ecol. 14: 2611-2620)가 제안한 ad hoc criterion (ΔK)를 이용하여 K값을 결정하였다.

실시예 1. 색소 및 비색소옥수수 핵심집단의 유전적 다양성 및 색소 특이적 마커 선발

색소 및 비색소옥수수 31계통에서 선발된 12 계통(색소옥수수 6 계통, 비색소옥수수 6 계통)에 대하여 300개의 SSR 프라이머를 이용하여 색소 및 비색소옥수수 계통들간의 유전적 변이성을 분석하였다.

그 결과, 대립단편(allele bands)의 크기가 54~396bp의 범위로 나타났으며, 총 1,331개의 대립단편을 증폭하였다. 본 발명의 SSR 프라이머에 대하여 증폭된 대립단편들은 2개에서 10개까지 나타났으며, 평균 4.44개가 증폭되었다. 300개의 SSR 프라이머에서 측정된 주요 대립인자 빈도(MAF, Major allele frequency)는 0.25에서 0.92의 범위로 나타났고, 평균값은 0.48을 나타내었다. 유전적 다양성(GD, Genetic diversity) 값은 0.15에서 0.88의 범위로 나타났으며, 평균 0.64의 값을 나타내었다. 다형성 정보량(PIC, polymorphic information content) 값은 0.14에서 0.86의 범위로 나타났으며, 평균 0.59의 값을 나타내었다(표 2).

본 발명에 따른 색소 및 비색소옥수수의 12 계통에서 대립인자 수(NO. of allele), 주요 대립인자 빈도(MAF), 유전적 다양성(GD) 및 다형성 정보량(PIC)를 포함하는 300개의 SSR 프라이머의 특성 분석결과

염색체	대립인자 수	주요 대립인자 빈도	유전적 다양성	다형성 정보량
1	4.20	0.48	0.65	0.59
2	4.83	0.47	0.66	0.61
3	3.90	0.55	0.58	0.53
4	4.83	0.43	0.67	0.62
5	4.37	0.46	0.64	0.59
6	4.73	0.50	0.62	0.58
7	4.37	0.48	0.64	0.60
8	4.40	0.47	0.64	0.59
9	4.47	0.49	0.63	0.58
10	4.27	0.48	0.62	0.57
합계	1,331
평균	4.44	0.48	0.64	0.59

한편, 300개의 SSR 프라이머를 이용하여 색소 및 비색소옥수수 계통들에 대하여 증폭된 1,331개의 대립단편들의 빈도를 분석하였다. 그 결과, 증폭된 1,331개의 대립단편들 중에서 406개(30.5%)의 대립단편들은 개별 대립유전자(private allele)를, 566개(42.5%)의 대립단편들은 희소 대립유전자(rare allele, 빈도 <0.1)를, 681개(51.1%)의 대립단편들은 중간 대립유전자(intermediate allele, 빈도 0.1∼0.5)를, 그리고 84개(6.3%)의 대립단편들은 풍부한 대립유전자(abundant allele, 빈도 >0.5)를 각각 나타내었다.

또한 본 발명에 따른 총 12 계통의 옥수수에서 확인된 1,331개의 대립단편들 중에서 각 그룹(색소 및 비색소) 별로 특이적으로 나타나는 대립단편을 분석하였다. 그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 총 221개의 대립단편들이 색소옥수수 계통들에서만 특이적으로 나타났으며, 총 408개의 대립단편은 비색소옥수수 계통들에서만 특이적으로 확인되었다. 더욱이 나머지 702개의 대립단편들은 색소와 비색소 계통들에서 공통으로 증폭되었다. 한 예로 SSR 프라이머 bnlg1867의 경우, 6개의 색소옥수수 대립단편이 특이적으로 나타났으며, 그 중에, 중국의 색소옥수수 3 계통과 일반 색소옥수수 3 계통이 나누어져 특이적인 대립단편이 나타났다(도 3).

실시예 2. 색소 및 비색소옥수수 핵심집단의 계통유연관계 및 집단구조

본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 색소 및 비색소옥수수의 12 계통들에 대한 집단구조와 계통유연관계를 분석하였다. 집단구조 분석을 위해 STRUCTURE 프로그램을 이용하여 분석한 결과, ΔK 값이 K=3에서 가장 높은 값이 확인되었다. ΔK 값이 K=3일 때, 분석 결과를 보면 그룹 I, II, III 및 혼합(admixed)으로 구분되었고, 그 중에 그룹 I은 중국의 색소옥수수 3 계통(10S4015, 10S4026 및 10S4032)이며, 그룹 II는 색소종실옥수수 3 계통(11CS4117, 11CS4124 및 11CS7014)과 찰옥수수 계통인 HW9이며, 그룹 III는 비색소옥수수 4 계통(Mo17, B14A, HW7 및 HW3)으로 나타났고, 혼합(admixed) 그룹은 찰옥수수 계통인 KW7으로 구성되어 있었다(도 4).

한편, 본 발명에서 색소 및 비색소옥수수 계통들간의 계통유연관계를 명확히 보기 위해서 UPGMA법에 의한 덴드로그램(dendrogram)을 작성하였다(도 4). 그 결과, 12 계통의 옥수수 집단들은 유전적 유사성이 30% 수준에서 크게 4개의 그룹으로 나누어졌다. 그룹 I은 중국의 색소옥수수 3 계통(10S4015, 10S4026 및 10S4032)과 종실옥수수 계통인 Mo17을 포함하고 있었고, 그룹 II는 색소종실옥수수 3 계통(11CS4117, 11CS4124 및 11CS7014)과 찰옥수수 계통인 HW9과 KW7을 포함하였고, 그룹 III는 비색소옥수수 계통인 B14A와 HW3를 포함하였다. 그리고 그룹 Ⅳ는 찰옥수수 계통인 HW7을 포함하였다. 그룹 I의 경우, 유전적 유사성 33% 수준에서 2개의 서브그룹으로 나누어졌다. 첫 번째 서브그룹에는 중국의 색소옥수수 3 계통(10S4015, 10S4026 및 10S4032)이 포함되었고, 두 번째 서브그룹에는 종실옥수수인 Mo17이 포함되었다. 그룹 II의 경우는 유전적 유사성 44.5% 수준에서 2개의 서브그룹으로 나누어졌다. 첫 번째 서브그룹에는 색소종실옥수수 3 계통(11CS4117, 11CS4124, 11CS7014)과 찰옥수수 계통인 HW9이 포함되었고, 두 번째 서브그룹은 찰옥수수 계통인 KW7이 포함되었다(도 4).

이러한 결과를 바탕으로 색소옥수수 핵십집단 3 계통(11CS4117, 11CS4124, 11CS7014)과 비색소옥수수 핵심집단 3 계통(Mo17, B14A, HW7)을 선발하여 색소 및 비색소옥수수 집단에서 특이적으로 나타나는 분자마커를 분석하였다. 그 결과, 300개의 SSR 프라이머 세트 중에서 163개의 프라이머 세트는 색소옥수수 핵심집단 3 계통들 중에서 어느 한쪽에서만 DNA 밴드가 증폭되었으며, 색소 특이적 대립단편의 수는 마커 별로 1~3개였으며, bnlg1036, bnlg1662, mmc0111, dupssr24, umc2278, bnlg1046, umc1248, umc1018, umc1002 SSR 마커에서 3개의 색소 특이적 대립단편이 확인되었다(Dominant)(표 3). 특히, 300개의 SSR 프라이머 세트를 이용하여 색소옥수수 및 비색소옥수수 핵심집단에서 분석한 결과, 공우성을 나타내는 SSR 프라이머 세트 71개를 선발하였다(Codominant)(표 4).

본 발명의 색소옥수수 판별용 특이 우성 SSR 마커 선별 결과

염색체수	프라이머 이름	색소 특이적 대립인자 수	염색체수	프라이머 이름	색소 특이적 대립인자 수	염색체수	프라이머 이름	색소 특이적 대립인자 수
1	umc1282	2	2	umc1934	1	4	umc1707	1
1	bnlg1112	1	2	phi101049	1	4	umc1719	1
1	umc1727	1	2	bnlg1662	3	4	umc1682	1
1	umc2100	1	2	umc2372	2	4	umc1757	1
1	umc1118	1	2	mmc0111	3	4	umc2365	1
1	umc1774	1	2	umc1861	1	4	umc1255	1
1	umc1269	1	2	nc131	1	4	umc1716	2
1	bnlg1203	2	2	umc1581	1	4	bnlg1784	1
1	umc1396	1	2	umc1079	2	4	umc1088	1
1	bnlg1025	1	2	dupssr24	3	4	umc2278	3
1	umc2228	1	2	dupssr30b	2	4	umc1011	1
1	umc1354	1	3	umc1814	1	4	umc1276	1
1	umc1976	1	3	umc2101	1	4	phi026	1
1	bnlg1811	2	3	umc1183	1	4	bnlg1444	2
1	phi037	2	3	umc2071	1	4	bnlg2162	1
1	umc2397	1	3	umc1844	1	5	umc1852	1
2	umc2096	1	3	phi099	1	5	umc1056	2
2	umc1756	1	3	umc2000	1	5	umc1192	1
2	bnlg1017	1	3	umc1392	2	5	umc1491	1
2	umc2246	1	3	bnlg1505	1	5	umc1692	1
2	umc2214	1	3	bnlg1117	1	5	umc1221	2
2	phi96100	2	3	umc2106	1	5	umc1221	1
2	umc1065	2	3	phi049	2	5	umc2161	1
2	umc1823	1	3	umc2255	1	5	umc2111	2
2	umc1992	1	3	umc2256	1	5	umc1224	1
2	umc1126	1	3	bnlg1638	2	5	umc2301	1
2	umc2110	1	3	umc1167	2	5	bnlg105	2
2	bnlg1036	3	4	umc1043	1	5	bnlg1046	3
2	bnlg1621	1	4	umc1101	2	5	bnlg1208	2
5	umc2164	1	7	umc1154	1	9	bnlg1129	2
5	bnlg1118	2	7	umc1546	1	10	umc1432	1
5	umc2308	1	7	phi112	1	10	umc1318	1
5	umc1894	1	7	mmc0411	2	10	umc2632	1
6	bnlg1043	2	7	phi116	1	10	umc1645	2
6	bnlg2191	1	7	phi150	1	10	bnlg1518	1
6	umc2059	1	7	dupssr9	1	10	phi084	1
6	umc1341	1	8	umc1360	1	10	umc1084	1
6	phi299852	1	8	bnlg2046	1	10	umc2016	1
6	bnlg1759	2	8	umc1712	1	10	bnlg2190	1
6	bnlg1867	2	8	umc2210	2	10	phi041	2
6	umc1248	3	8	umc2352	1	10	bnlg1655	1
6	umc1018	3	8	umc1034	1	10	umc1336	1
6	phi031	1	8	bnlg2235	2	10	umc1911	1
6	umc1002	3	8	bnlg2082	2	10	umc1678	1
6	bnlg238	1	8	umc2355	2	10	bnlg1028	1
6	umc1083	2	8	umc2503	1	10	bnlg1839	1
6	umc1918	1	9	umc1743	1	10	bnlg1451	1
7	umc1978	1	9	bnlg279	2
7	umc1632	1	9	umc1596	1
7	umc1666	1	9	bnlg1525	2
7	umc1936	1	9	umc1078	1
7	umc1944	1	9	umc1357	1
7	umc2332	1	9	umc2347	1
7	bnlg1022	1	9	bnlg2122	2
7	phi328175	1	9	bnlg1583	2
7	umc1456	1	9	bnlg244	2
7	umc2379	1	9	umc1094	1
7	umc2325	2	9	bnlg619	1

본 발명의 색소옥수수 판별용 특이 공우성 SSR 마커 선별 결과

프라이머명	서열번호	순방향 프라이머 염기서열	서열번호	역방향 프라이머 염기서열	염색체내 위치
bnlg1203	1	GACCCGTCTCTCTTGAGTGC	2	GTCTGTCTGCACCCGTTTTT	1
umc2228	3	GTGAGGTGAAAATGAAGCTGGAAC	4	ACCATACCTCTCTGAACATGAGCC	1
umc1976	5	TGCCGAGGCTTCTAGTAGACCAA	6	CGCTATATCTATCCCGCAGCAAC	1
phi037	7	CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGAC	8	TCCAGATCCGCCGCACCTCACGTCA	1
umc2397	9	CGCATATATACTTGTGCGCACTTT	10	TATGTATGTTCGTGTGCCTGTGTG	1
umc2096	11	AACGTACCATCCTTGTGCCTGTAT	12	CATTATTAGTACGGAGCGCTGGTC	1
bnlg1017	13	ATTGGAAGGATCTGCGTGAC	14	CAGCTGGTGGACTGCATCTA	2
phi96100	15	AGGAGGACCCCAACTCCTG	16	TTGCACGAGCCATCGTAT	2
umc1065	17	ACAAGGCCATCATGAAGAGCAGTA	18	CACGGTCTGGCACACTAACCTTAT	2
bnlg1036	19	GGGAGTATGGTAGGGAACCC	20	AAACCCTTGGAGCATACCCT	2
bnlg1662	21	GCACCCACATGAAGTATCCC	22	TTGTTTTTGCAGTGCCTCAG	2
umc2372	23	CACCAGGCGTAGTGAGACAGC	24	ACCCCTTGCGTTCTCTTCTGTT	2
mmc0111	25	TACTGGGGATTAGAGCAGAAG	26	AATCTATGTGTGAACAGCAGC	2
dupssr24	27	ACTGCACTGCACCTCTCTC	28	ACACAACGGCTTCTAACCTT	2
dupssr30b	29	TGATAGTTTATGGTAGCAACTCG	30	CATTGTGCGGGTAATGCT	2
umc2101	31	CCCGGCTAGAGCTATAAAGCAAGT	32	CTAGCTAGTTTGGTGCGTGGTGAT	3
umc1183	33	ATGTCATTTTTGGCTTCTCGAAAT	34	GCATGTACACAACACAACCTTTCA	3
bnlg1505	35	GAAAGACAAGGCGAAGTTGG	36	GCTTCTGAACTGGATCGGAG	3
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<110> Kangwon National University Industry Cooperation Foundation <120> Specific SSR primers for discriminating colored maize and uses thereof <130> PN14371 <160> 142 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gacccgtctc tcttgagtgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtctgtctgc acccgttttt 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtgaggtgaa aatgaagctg gaac 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 accatacctc tctgaacatg agcc 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgccgaggct tctagtagac caa 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgctatatct atcccgcagc aac 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cccagctcct gttgtcggct cagac 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 ctagaagcta cagcgagtga ggac 24 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 gaccgcccgg gactgtaagt 20 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 aggaaagaag gtgacgcgct tttc 24 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 gctgtgatgg tgagacgaga 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 gcaggcacta ctaaaaccgc 20 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 agcacacaga caagagagac aacg 24 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 gaccgacaac agagatcgag taca 24 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 cagagttgat gaactgaaaa agg 23 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 ctcttgcttc ccccctaatc 20 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 cttgccattt taatttggac gttt 24 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 cgaagttgcc caaatagcta cagt 24 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ggaaaaggag gaacagtgta agca 24 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 agcgtgatca gacgtacaat gcta 24 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 tcaagaacat aataggaggc ccac 24 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 agccagcttg atctttagca tttg 24 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 gcaacaggtt acatgagctg acga 24 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 ccagcgtgct gttccagtag tt 22 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 aacttttggc attgcactgg 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 cgtaagtgca cacggcatta 20 <210> 91 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 cttattgctt tcgtcataca cacacattca t 31 <210> 92 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 gagcatgagc ttgcatattt cttgtgg 27 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 cacaagaaca ttatgacgac cgag 24 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 aagcaggaga catcgtttaa gtcg 24 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 cgaaagtcga tcgagagacc 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 cctctcttca ccccttcctt 20 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 gggaagtgct ccttgcag 18 <210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 cggtaggtga acgcggta 18 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 ccaccacaag acaagacaag aatg 24 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 cctgatcgat ctcatcgtcg t 21 <210> 101 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 ctggtcttgg ccttggactt ct 22 <210> 102 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 gtcacagcaa agtcatcctc ctct 24 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 catgtgggtg ttaataagca aggg 24 <210> 104 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 gccttgtttg ctctctgaaa caat 24 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 ctcatcagtg ccgtcgtcca t 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 cagtcgcaag aaaccgttgc c 21 <210> 107 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 accgagttaa gattacatca cgcc 24 <210> 108 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 tgtttcccct aataaagcaa atgaa 25 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 ttggtgaaac ggtgaaatga 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 ctggtgagct tcaccctctc 20 <210> 111 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 attattggtc acaggcccta cctt 24 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 ttaggccctc gtcttgtaga cttg 24 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 gacggaaggt ggagcataga 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 acgaacgtga tacgggtctc 20 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 ctactccccg aagccgtcta ag 22 <210> 116 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 cgggttgttg ttggagtagg ac 22 <210> 117 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 cactgcatgt actcgatttt gtcc 24 <210> 118 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 cataaaatat ggtgtggagg cgat 24 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 ctctcattag ttcgtgccag tcaa 24 <210> 120 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 ccagaaatca gaggaagctc tcag 24 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 gcatgcgtac cttcaagcta 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 tgtgttcatc ggcaattttg 20 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 ctcgagactc tggttcaatc caat 24 <210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 catgcacgta cttccctgat tttt 24 <210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 aacgtaggta gggtttggat ttca 24 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 acatgatgct tgttcctttt caca 24 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 aggcactagc aggcgagagg 20 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 gcgtagtaac atccatccaa ccaa 24 <210> 129 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 tcgtctaaac tgcataaaag ggga 24 <210> 130 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 acggagatag atgcacacaa acac 24 <210> 131 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 gaaaatgaag aataggagac attgttgc 28 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 atgcacatgc agttccttgg ttat 24 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 gagtacctcc gcccactcat c 21 <210> 134 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 ctaacgtaca cacatcttgg ctgg 24 <210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 tgaaaactct ttgcattttt gctg 24 <210> 136 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 gagatttggg agtgaaattg gttg 24 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 ggccatgata cagcaagaaa tgat 24 <210> 138 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 138 tactagatga tgactgaccc agcg 24 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 139 tcctccttca tccccttctt 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 140 cccagtatca ttgcccaatc 20 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 141 attaaaatct tgctgatggc g 21 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 142 ttctgttccc gcctgtactt 20

Claims (6)

1. 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 83 및 84의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 89 및 90의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 99 및 100의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 103 및 104의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 105 및 106의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 107 및 108의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 109 및 110의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 111 및 112의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 113 및 114의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 115 및 116의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 117 및 118의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 119 및 120의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 125 및 126의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 127 및 128의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 129 및 130의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 133 및 134의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 135 및 136의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 137 및 138의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 139 및 140의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 141 및 142의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수를 판별하기 위한 SSR 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서,
   서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 83 및 84의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 89 및 90의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 99 및 100의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 103 및 104의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 105 및 106의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 107 및 108의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 109 및 110의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 111 및 112의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 113 및 114의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 115 및 116의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 117 및 118의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 119 및 120의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 125 및 126의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 127 및 128의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 129 및 130의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 133 및 134의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 135 및 136의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 137 및 138의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 139 및 140의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 141 및 142의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 색소옥수수를 판별하기 위한 SSR 프라이머 세트.
3. 제1항 또는 제2항에 따른 SSR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 색소옥수수를 판별하기 위한 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
5. 옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 색소옥수수를 판별하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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