KR102028543B1 - 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 ssr 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 ssr 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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박대현
남궁민
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 54개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 홍미찰옥수수 품종을 구분하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 홍미찰옥수수 품종 구분용 특이 SSR 프라이머를 통하여 홍미찰옥수수 품종의 효율적인 식별이 가능할 뿐만 아니라, 홍미찰옥수수 품종과 같은 색소옥수수 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

Description

홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도{Specific SSR primers for discriminating waxy corn cultivar Hongmichal and uses thereof}
본 발명은 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것이다.
옥수수(Zea mays L.)는 세계 3대 중요 작물 중 하나이며, 식용뿐만 아니라 사료용, 공업용 등 다양한 용도로 이용되고 있다. 최근 웰빙(well-being)에 대한 관심이 높아지면서, 천연성분을 함유한 고품질, 고기능성 작물이나 이를 이용한 가공품의 선호도가 증가하고 있다. 더욱이 웰빙 건강식으로 블랙푸드가 각광을 받으면서 안토시아닌(anthocyanin) 색소에 대한 관심이 높아지고 있다. 안토시아닌 색소는 식물에 존재하는 천연 색소로 자색, 청색, 적색을 나타내며 인체에 무해하여 천연 착색료로 이용될 뿐만 아니라, 항산화, 항암, 항당뇨에 효과가 있다고 알려져 있다. 이러한 안토시아닌 색소의 중요성과 기능성 등으로 인해 고구마, 감자 등에서는 안토시아닌 함량이 높은 품종 육성이 상당 부분 추진되어 관련 품종이 있는 실정이지만, 옥수수 분야의 경우, 안토시아닌이 다량 함유된 색소옥수수의 육성은 현재 시작단계에 놓여있다.
색소옥수수의 품종개발을 위해서는 우수 형질을 지니고 있는 다양한 유전자원의 수집과 수집된 유전자원들의 유전학적 특성을 명확히 밝히는 것이 육종의 효율을 높이기 위해 매우 중요하다. 특히 타식성작물(allogamous crops, outcrossing crops)인 옥수수 품종의 경우, 다양한 지역에서 수집되어 고정된 육종재료들에서 유전자원들의 유전학적 특성을 밝히고, 우수한 자식계통을 선정하기 위해서 수집된 재료들의 유전적 다양성(genetic diversity), 계통유연관계(genetic relationship)를 명확히 평가하는 것이 신품종 개량을 위한, 자식계통 육성 및 발굴 그리고 교배조합 예측 등에 효율적으로 이용될 수 있고, 이형집단에서 자식계통의 선발과 품종 보호 등에도 매우 중요하다.
특히 본 발명에서 이용한 SSR(simple sequence repeat) 분석법은 PCR을 이용하는 분석기법으로 재현성이 매우 뛰어나며, 식물 집단들 내에서 유전자좌(gene locus)마다 많은 대립인자들을 가지고 있고 대립유전자의 특성을 명확하게 나타낼 수 있어 옥수수와 같은 작물의 유전적 다양성, 계통유연관계를 분석하고 핑거프린팅(fingerprinting)과 분자 매핑(molecular mapping) 등에 활용되고 있다.
강원도농업기술원 옥수수연구소는 2003년부터 색소옥수수 육성을 진행하여 왔으며, 최근 미백2호 찰옥수수 품종의 모본과 부분에서 여교잡으로 육성한 색소찰 근동질 계통들 중에서 유용 계통을 선발하여 적색과피를 갖는 홍미찰을 개발하였으며, 개발된 홍미찰 옥수수는 안토시아닌이 다량 함유된 풋옥수수나 알곡용으로 활용될 것으로 예상된다. 따라서 본 발명에서는 강원도 농업기술원 옥수수연구소에서 개발한 홍미찰 품종에 대하여 SSR 분자마커를 이용하여 양친 자식계통들에서 다형성을 나타내는 SSR 분자마커를 선발하여 홍미찰의 품종식별 및 품종보호 그리고 1대잡종 종자들의 순도검정에 활용하고자 한다.
한편, 한국특허등록 제1861592호에는 '청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제1427103호에는 '아리찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 강원도 농업기술원 옥수수연구소에서 육성하여 개발한 안토시아닌이 다량 함유된 찰옥수수 홍미찰 품종의 교배친 계통인 HCW4와 HCW3 자식계통에 대하여, 10개의 염색체에서 총 331개의 SSR 프라이머를 제작하고, 이를 분석하여 양친 자식계통들에서 다형성을 나타내는 최종 54개의 SSR 프라이머를 선발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 54개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 SSR 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 홍미찰옥수수 품종을 구분하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 홍미찰옥수수 품종 구분용 SSR 프라이머를 통하여 안토시아닌이 다량 함유된 홍미찰옥수수 품종 식별 및 품종보호, F1 잡종의 순도검정 그리고 홍미찰옥수수와 같은 색소옥수수 유전자원들을 효율적으로 평가할 수 있는 최적의 SSR 마커 선발과 분자육종연구 등에 유용한 정보를 제공할 것으로 기대한다.
도 1은 본 발명에 따른 54개 SSR 프라이머 세트를 이용하여 홍미찰 품종의 두 교배친에 대한 SSR 프로필의 예를 보여주는 결과이다.♀, HCW4; ♂, HCW3.
도 2는 SSR 마커에 근거한 홍미찰 품종의 두 교배친에서의 대립유전자 특성 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 54개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 홍미찰옥수수 품종 구분용 SSR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 SSR 프라이머 세트는 구체적으로, 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 109 및 110의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 111 및 112의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 145 및 146의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 161 및 162의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 169 및 170의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 203 및 204의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 205 및 206의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 211 및 212의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 217 및 218의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 225 및 226의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 227 및 228의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 241 및 242의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 243 및 244의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 289 및 290의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 295 및 296의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 305 및 306의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 313 및 314의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 317 및 318의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 321 및 322의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 341 및 342의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 361 및 362의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 391 및 392의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 397 및 398의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 413 및 414의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 415 및 416의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 419 및 420의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 421 및 422의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 427 및 428의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 443 및 444의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 453 및 454의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 459 및 460의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 463 및 464의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 465 및 466의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 477 및 478의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 487 및 488의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 515 및 516의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 517 및 518의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 525 및 526의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 531 및 532의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 539 및 540의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 587 및 588의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 595 및 596의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 597 및 598의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 631 및 632의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 643 및 644의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 651 및 652의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 653 및 654의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 657 및 658의 SSR 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 SSR 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 54개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상, 31개 이상, 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 41개 이상, 42개 이상, 43개 이상, 44개 이상, 45개 이상, 46개 이상, 47개 이상, 48개 이상, 49개 이상, 50개 이상, 51개 이상, 52개 이상, 53개 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 54개의 SSR 프라이머 세트 모두를 포함할 수 있다.
상기 54개의 SSR 프라이머 세트를 동시에 이용하면 홍미찰옥수수 품종을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.
상기 SSR 프라이머는 각 SSR 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 9 및 10; 서열번호 19 및 20; 서열번호 31 및 32; 서열번호 45 및 46; 서열번호 95 및 96; 서열번호 109 및 110; 서열번호 111 및 112; 서열번호 131 및 132; 서열번호 145 및 146; 서열번호 161 및 162; 서열번호 169 및 170; 서열번호 203 및 204; 서열번호 205 및 206; 서열번호 211 및 212; 서열번호 217 및 218; 서열번호 225 및 226; 서열번호 227 및 228; 서열번호 241 및 242; 서열번호 243 및 244; 서열번호 289 및 290; 서열번호 295 및 296; 서열번호 305 및 306; 서열번호 313 및 314; 서열번호 317 및 318; 서열번호 321 및 322; 서열번호 341 및 342; 서열번호 361 및 362; 서열번호 391 및 392; 서열번호 397 및 398; 서열번호 413 및 414; 서열번호 415 및 416; 서열번호 419 및 420; 서열번호 421 및 422; 서열번호 427 및 428; 서열번호 443 및 444; 서열번호 453 및 454; 서열번호 459 및 460; 서열번호 463 및 464; 서열번호 465 및 466; 서열번호 477 및 478; 서열번호 487 및 488; 서열번호 515 및 516; 서열번호 517 및 518; 서열번호 525 및 526; 서열번호 531 및 532; 서열번호 539 및 540; 서열번호 587 및 588; 서열번호 595 및 596; 서열번호 597 및 598; 서열번호 631 및 632; 서열번호 643 및 644; 서열번호 651 및 652; 서열번호 653 및 654; 및 서열번호 657 및 658 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 9의 SSR 프라이머(24개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호의 서열 내의 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 SSR 프라이머는 서열번호 9 및 10; 서열번호 19 및 20; 서열번호 31 및 32; 서열번호 45 및 46; 서열번호 95 및 96; 서열번호 109 및 110; 서열번호 111 및 112; 서열번호 131 및 132; 서열번호 145 및 146; 서열번호 161 및 162; 서열번호 169 및 170; 서열번호 203 및 204; 서열번호 205 및 206; 서열번호 211 및 212; 서열번호 217 및 218; 서열번호 225 및 226; 서열번호 227 및 228; 서열번호 241 및 242; 서열번호 243 및 244; 서열번호 289 및 290; 서열번호 295 및 296; 서열번호 305 및 306; 서열번호 313 및 314; 서열번호 317 및 318; 서열번호 321 및 322; 서열번호 341 및 342; 서열번호 361 및 362; 서열번호 391 및 392; 서열번호 397 및 398; 서열번호 413 및 414; 서열번호 415 및 416; 서열번호 419 및 420; 서열번호 421 및 422; 서열번호 427 및 428; 서열번호 443 및 444; 서열번호 453 및 454; 서열번호 459 및 460; 서열번호 463 및 464; 서열번호 465 및 466; 서열번호 477 및 478; 서열번호 487 및 488; 서열번호 515 및 516; 서열번호 517 및 518; 서열번호 525 및 526; 서열번호 531 및 532; 서열번호 539 및 540; 서열번호 587 및 588; 서열번호 595 및 596; 서열번호 597 및 598; 서열번호 631 및 632; 서열번호 643 및 644; 서열번호 651 및 652; 서열번호 653 및 654; 및 서열번호 657 및 658의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
색소옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 홍미찰옥수수 품종을 구분하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 색소옥수수 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SSR 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 SSR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물재료
강원도 농업기술원 옥수수연구소에서 육성하여 개발한 홍미찰 품종의 교배친 계통인 HCW3과 HCW4 자식계통을 실험재료로 사용하였다(표 1).
홍미찰 품종의 두 교배친 정보
품종 Accession 번호 계통 홍미찰의 모부본계통
홍미찰 1 HCW4 홍미찰 모(♀)
2 HCW3 홍미찰 부(♂)
2. DNA 추출
옥수수 게노믹 DNA는 Dellaporta 등(1983, Mol Biol Rep 1:19-21)의 방법을 약간 수정하여 신선한 어린 잎으로부터 추출하였다. 식물체의 어린 잎 조직을 잘라내어 1.5 ㎖ 튜브에 액체 질소를 부어넣은 후 막자사발을 이용하여 곱게 갈아주었다. 65℃ 항온수조에 미리 넣어 준비한 추출 버퍼(1M Tris-HCl pH 8.0, 0.5M EDTA, 5M NACl 및 20% SDS)에 0.16 g의 아황산수소나트륨(sodium bisulfate)를 넣은 후 튜브에 600 ㎕를 넣고 탭핑(tapping)하였다. 그리고 그 튜브에 다시 600 ㎕의 바이오 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(Bio phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, 50:24:1)을 첨가하고 탭핑한 후 65℃ 항온수조에 15분간 반응시키고, 그 후 바로 13,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층액은 새 튜브에 옮겼다. 상층액에 클로로포름:이소아밀알콜(24:1) 용액 600 ㎕를 첨가한 후 탭핑하고 다시 14,500 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮겨 95% 에탄올 600 ㎕를 넣은 후 인버팅(inverting)하고 14,500 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 침전된 펠렛이 떨어지지 않게 모든 용액을 버린 후 70% 에탄올 600 ㎕를 넣고 가볍게 탭핑한 후, 10,000 rpm에서 원심분리하고 에탄올을 버린 후 대기 건조시켰다. 그 후 30 ㎕의 증류수로 녹이고, RNAase를 1 ㎕ 첨가하여 RNA를 완전히 제거하였다.
3. SSR 프라이머 선발과 PCR 증폭
홍미찰 품종의 교배친 자식계통(HCW4와 HCW3)들에 대한 다형성 분석을 위해서 분석에 이용한 SSR 프라이머는 10개의 염색체에서 총 331개의 SSR 프라이머 세트를 선발하여 사용하였다(표 2 내지 표 8).
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PCR 증폭에서 용액의 조성은 총 30 ㎕로 구성되며, 20 ng의 게노믹 DNA와 1x PCR 버퍼, 0.3 μM의 프라이머, 0.2 mM의 dNTP 및 1 unit의 Taq 중합효소(Biotools, B&M Labs, Madrid)를 혼합하였다. PCR 반응은 처음 94℃에서 5분간 반응시킨 후, 1사이클로 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 65℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 2분간 연장(extension)을 하고, 2번째 사이클부터 마지막까지 1℃씩 낮추며 최종 55℃까지 낮추었다. 마지막 사이클은 20번 반복하고, 사이클 완료 후 72℃에 10분간 연장하였다.
4. 전기영동과 은 염색(Silver-staining)
5 ㎕의 PCR 산물을 10 ㎕의 로딩 버퍼(98% formamide, 0.02% BPH, 0.02% Xylene C 및 5 mM NaOH)와 섞고, 끓는 물에 변성시킨 후 바로 얼음에 냉각시켰다. 6% 아크릴아미드:비스아크릴아미드 겔(19:1)에 0.5x TBE 버퍼를 채운 후 2 ㎕의 샘플을 로딩하고, 250 V에서 30분 동안 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 은 염색 키트(Promega, 미국)를 이용하여 DNA 밴드를 확인하였다.
실시예 1. 홍미찰의 교배친 자식계통들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라 이머 선발
홍미찰 품종의 전체 게놈을 대표할 수 있도록 옥수수 10개 염색체에서 확인된 총 331개의 SSR 프라이머 세트(표 2 내지 표 8)를 선택하여 색소옥수수 품종인 홍미찰의 교배친 자식계통들에서 유전적 다형성을 나타내는 SSR 마커를 선발하였다.
그 결과, 분석에 이용된 331개 SSR 프라이머 세트들 중에서 홍미찰의 교배친 자식계통인 HCW4와 HCW3 계통들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머 세트를 129개를 선발하였다. 나머지 202개 SSR 프라이머 세트 중에서 33개의 SSR 프라이머 세트들은 두 교배친 자식계통들에서 증폭되지 않았으며(null), 130개의 프라이머 세트들은 자식계통 HCW3과 HCW4에서 같은 사이즈의 대립단편을 증폭시켜 다형성을 나타내지 못하였다(mono-morphic band). 그리고 나머지 39개의 SSR 프라이머 세트들은 두 교배친 자식계통들 중에서 어느 한쪽에서만 DNA 밴드가 증폭되었다(dominant band)(표 9).
홍미찰 품종의 두 교배친에서 331개 SSR 프라이머의 증폭 경향 분석
증폭 경향 프라이머 개수
null 33
mono 130
dominant 39
codominant 129
또한, 상기 선발된 129개의 SSR 프라이머 세트 중에서, 75개의 SSR 프라이머 세트는 동일 발명자의 이전 연구에서 다른 옥수수 품종을 구별하기 위해 사용된 SSR 프라이머 세트와 동일한 것으로 확인되어 제외시켰고, 최종 54개의 SSR 프라이머 세트를 홍미찰옥수수 품종의 구분을 위한 특이 마커로 선발하였다(도 1 및 표 10).
홍미찰 품종의 두 교배친에서 공우성 SSR 마커
품종 F1 잡종의 교배조합 공우성 SSR 마커
홍미찰 HCW4×HCW3 umc1015, umc1034, umc1101, umc1339, umc1365, umc1401, umc1447, umc1549, umc1557, umc1585, umc1642, umc1649, umc1666, umc1715, umc1718, umc1747, umc1785, umc1805, umc1844, umc1862, umc1936, umc1962, umc2006, umc2026, umc2067, umc2075, umc2111, umc2137, umc2177, umc2180, umc2182, umc2221, umc2240, umc2269, umc2270, umc2290, umc2313, umc2328, umc2332, umc2333, umc2344, umc2373, umc2395, umc2400, umc2540, bnlg128, bnlg434, bnlg1079, bnlg1094, bnlg1176, bnlg1200, bnlg1380, bnlg1662, bnlg1810
실시예 2. 홍미찰의 품종식별 및 품종보호용 SSR 분자마커
분석에 이용된 331개의 SSR 프라이머들은 홍미찰의 교배친 자식계통인 HCW4와 HCW3 계통들에서 총 427개의 대립단편(allele bands)들을 증폭시켰다. 그 중에서 149개의 대립단편은 홍미찰의 모본인 HCW4에 특이적으로 나타났으며, 148개의 대립단편은 홍미찰의 부본인 HCW3에 특이적으로 나타나는 것으로 확인되었다. 나머지 130개의 대립단편들은 HCW4과 HCW3 자식계통 모두에서 확인할 수 있었다(도 2).
상기의 결과를 토대로, 본 발명에서 이용된 총 331개의 SSR 프라이머 세트 중에서 교배친 자식계통(HCW4 및 HCW3)들에서 공우성 마커를 나타내는 54개의 SSR 마커 umc1015, umc1034, umc1101, umc1339, umc1365, umc1401, umc1447, umc1549, umc1557, umc1585, umc1642, umc1649, umc1666, umc1715, umc1718, umc1747, umc1785, umc1805, umc1844, umc1862, umc1936, umc1962, umc2006, umc2026, umc2067, umc2075, umc2111, umc2137, umc2177, umc2180, umc2182, umc2221, umc2240, umc2269, umc2270, umc2290, umc2313, umc2328, umc2332, umc2333, umc2344, umc2373, umc2395, umc2400, umc2540, bnlg128, bnlg434, bnlg1079, bnlg1094, bnlg1176, bnlg1200, bnlg1380, bnlg1662 및 bnlg1810들은 앞으로 홍미찰옥수수 품종식별 및 품종보호 그리고 1대잡종 종자들에 대한 순도검정 등에 유용한 분자마커로 이용될 수 있을 것이다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Specific SSR primers for discriminating waxy corn cultivar Hongmichal and uses thereof <130> PN18393 <160> 662 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cccagctcct gttgtcggct cagac 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tccagatccg ccgcacctca cgtca 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atcagattcc gaagggtcca taat 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtagtgaaat gaatcgtgag agcg 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgatcagatc atacacaacc ttgc 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gaggatcgat tcttggcgag t 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgctgtctga cgatctctca aatc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial 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<220> <223> primer <400> 614 tgtgatgacc atgaatgtaa gctg 24 <210> 615 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 615 atgagttcat gacagagcgc tacc 24 <210> 616 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 616 gagtttgttc gtttgtgtgt ggag 24 <210> 617 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 617 atcaacacac ctttcgattt ctgg 24 <210> 618 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 618 cggtgattag tcgatgaaga gtga 24 <210> 619 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 619 tgagagccac cttcttgagc tact 24 <210> 620 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 620 ttccttgaag gcgaaggtag gtat 24 <210> 621 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 621 agcaaagaag ccaaagagca act 23 <210> 622 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 622 gtcaccaccg tctgctggta 20 <210> 623 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 623 ctctagctac gagcctacga gca 23 <210> 624 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 624 ccgtcgagtc aactagagaa agga 24 <210> 625 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 625 tacacgcagc tctgggtttt g 21 <210> 626 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 626 gtgatccggg tagaggaatg tg 22 <210> 627 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 627 ccgaacaaaa caagtaagca caca 24 <210> 628 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 628 gaagacagct agccatcatc gg 22 <210> 629 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 629 catcgtcatc agttcttcca tgag 24 <210> 630 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 630 gtgattgaca gaggaccatc agaa 24 <210> 631 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 631 ttcaatccgt aggtctggtg ctat 24 <210> 632 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 632 caataatttc tttcgccttg ttcg 24 <210> 633 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 633 tgacagggag cacagaaaca atag 24 <210> 634 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 634 ggtcttctcc ccctcattct ctt 23 <210> 635 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 635 gatttcctca ctcacatacc gctc 24 <210> 636 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 636 tactgtacag catcacaact cggg 24 <210> 637 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 637 aagttggaat aattcgggca gttc 24 <210> 638 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 638 ggtagcagta ggagcagagg tgtg 24 <210> 639 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 639 aatggtctga cgatagacct ccag 24 <210> 640 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 640 acggtcccta accctaagag agac 24 <210> 641 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 641 acgagcagca gtctcttggg 20 <210> 642 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 642 acatggggca caagaagcaa t 21 <210> 643 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 643 ataagtgggg gaggcgagct a 21 <210> 644 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 644 gagaaccaac caccaaagaa gtcc 24 <210> 645 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 645 aaacaattgt catcttcttc tgcg 24 <210> 646 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 646 gtcagaccga cgcactcact aa 22 <210> 647 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 647 agagacgaca tgtctatcct tgcc 24 <210> 648 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 648 attgcattgc attcagctgt tgt 23 <210> 649 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 649 agaggttact acggagtgtg gcag 24 <210> 650 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 650 gtcagggtac tgcttctcga actc 24 <210> 651 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 651 acgataagtc tggaaagatc gtcg 24 <210> 652 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 652 gatctctcgc accacctgta tgta 24 <210> 653 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 653 atcagcatcg atagcgaaga aaga 24 <210> 654 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 654 attgctacta gggttgttgt tgcc 24 <210> 655 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 655 tcttgacaag gagcaagcct aatc 24 <210> 656 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 656 gggtgaaggc caggaggtag 20 <210> 657 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 657 caggcggata agaatgacga gtag 24 <210> 658 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 658 ataatgctac acttttgcgg ggtt 24 <210> 659 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 659 taaatacgct gagtccgcta cagg 24 <210> 660 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 660 agcagaggac gatacaagtg atgg 24 <210> 661 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 661 gtccacgacg ttatgtgtca gact 24 <210> 662 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 662 aggtgcgttg gtaacggtta tg 22

Claims (6)

  1. 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 109 및 110의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 111 및 112의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 145 및 146의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 161 및 162의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 169 및 170의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 203 및 204의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 205 및 206의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 211 및 212의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 217 및 218의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 225 및 226의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 227 및 228의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 241 및 242의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 243 및 244의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 289 및 290의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 295 및 296의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 305 및 306의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 313 및 314의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 317 및 318의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 321 및 322의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 341 및 342의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 361 및 362의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 391 및 392의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 397 및 398의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 413 및 414의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 415 및 416의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 419 및 420의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 421 및 422의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 427 및 428의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 443 및 444의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 453 및 454의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 459 및 460의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 463 및 464의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 465 및 466의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 477 및 478의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 487 및 488의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 515 및 516의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 517 및 518의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 525 및 526의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 531 및 532의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 539 및 540의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 587 및 588의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 595 및 596의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 597 및 598의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 631 및 632의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 643 및 644의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 651 및 652의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 653 및 654의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 657 및 658의 SSR 프라이머 세트;를 포함하는 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 SSR 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 SSR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 홍미찰옥수수 품종을 구분하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  5. 색소옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 홍미찰옥수수 품종을 구분하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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