CN102643920B - 脑膜炎奈瑟氏菌的特异性检测和鉴别用引物探针组合和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中脑膜炎奈瑟菌核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。利用本发明的序列组合或试剂盒，可快速检测样品中是否存在脑膜炎奈瑟氏菌核酸，同时鉴定其是否为我国最为流行的A群或C群。该试剂盒对脑膜炎奈瑟氏菌(通用)的检测限为200拷贝每反应体系。对A群脑膜炎奈瑟氏菌的检测限为200拷贝每反应体系，对C群脑膜炎奈瑟氏菌的检测限为200拷贝每反应体系。整个反应可在2小时内完成，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

Description

脑膜炎奈瑟氏菌的特异性检测和鉴别用引物探针组合和试 剂盒

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中脑膜炎奈瑟菌核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。利用本发明的序列组合或试剂盒，可快速检测样品中是否存在脑膜炎奈瑟氏菌核酸，同时鉴别其是否为我国最为流行的A群或C群。该试剂盒对脑膜炎奈瑟氏菌(通用)的检测限为200拷贝每反应体系，对A群脑膜炎奈瑟氏菌的检测限为200拷贝每反应体系，对C群脑膜炎奈瑟氏菌的检测限为200拷贝每反应体系。整个反应可在2小时内完成，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

技术背景

脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)是流行性脑脊髓膜炎的病原菌。人类是脑膜炎奈瑟菌的唯一宿主。本菌可定植在人类鼻咽部的粘膜上，称为携带状态，在健康成人和儿童中本菌的携带率可达5％-15％。本菌借飞沫经空气传播，冬末春初为流行高峰，被感染者多为青少年和婴幼儿。感染后多数患者呈携带状态或隐性感染，少数出现上呼吸道感染症状，极少数发展成败血症，进而累及脑、脊髓膜，形成化脓性脑脊髓膜炎，严重者可迅速出现休克和散播性血管内凝血，或频繁痉挛惊厥，进而昏迷，不及时救治病死率极高。脑膜炎奈瑟菌有13种血清群，我国流行的血清群以A群为主，其次为C群，其他血清群如B、Y、W135和X在我国仅有散发的病例报导。

在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。此外，对于已知的致流行性脑脊髓膜炎病原菌的检测，发现有一些非A群也导致流行性爆发的能力，如C群脑膜炎奈瑟菌。实际检测过程中，对于一例待测样品，如果仅仅检测其中是否有A群脑膜炎奈瑟菌，或者相反，仅仅检测其中是否有C群脑膜炎奈瑟菌，并不能完全排除其致病性的危险。而分别进行两次检测的话，显然，其检测的时间成本会大大升高。所以，需要一种能够检测多种血清型的脑膜炎奈瑟氏菌，同时对我国两种主要致流行性脑膜炎奈瑟氏菌(A群和C群)是否存在的试剂和/或方法，以简化检测过程。

本发明分别针对脑膜炎奈瑟氏菌(通用)、脑膜炎奈瑟氏菌A群和脑膜炎奈瑟氏菌C群特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-time PCR的方法，用来快速检测样品中是否存在脑膜炎奈瑟氏菌核酸，同时鉴别脑膜炎奈瑟氏菌是否为我国最为流行的A群或C群。

发明内容

为了快速准确地检测样品中是否存在脑膜炎奈瑟氏菌，同时鉴别其血清群是否为我国最为流行的A群或C群。本发明提供一种特异性检测样品中脑膜炎奈瑟氏菌(通用)、脑膜炎奈瑟氏菌A群和脑膜炎奈瑟氏菌C群核酸的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，其特征在于序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于核酸扩增的引物为：

P1：5`-GGCTGCGGTAGGTGGTTC-3`，

P2：5`-TTCCAAAGCCACCGTGCG-3`，

P3：5`-ACGAAGAAATTATGCCACAAAGTG-3`，

P4：5`-GAAGTCGTCATTGCTGTAAATAAAATAG-3`。

P5：5`-TTCAATGCTAATGAATACCACCGT-3`，

P6：5`-GGTATTTGTCTTGAATTTTAGCAATAG-3`。

P1和P2为针对脑膜炎奈瑟氏菌基因组种特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物，可以检出各种血清型的脑膜炎奈瑟氏菌，P3和P4为针对脑膜炎奈瑟氏菌A群基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物，P5和P6为针对脑膜炎奈瑟氏菌C群基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物。

本发明的的特征还在于，序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为：

Probe1：5`-X<sub>1</sub>-CCAATGTGCAGCTAACACGTGGCAATG-Y<sub>1</sub>-3`，

Probe2：5`-X<sub>2</sub>-CCAGCTTGCACCATATACCAGGAATTAGT-Y<sub>2</sub>-3`。

Probe3：5`-X<sub>3</sub>-TGCACATTCAGGCGGGATTAGCACA-Y<sub>3</sub>-3`。

X₁、X₂和X₃为荧光报告基团，Y₁、Y₂和Y₃为荧光淬灭基团。Probe1为针对脑膜炎奈瑟氏菌基因组种特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe2为针对脑膜炎奈瑟氏菌A群基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe3为针对脑膜炎奈瑟氏菌C群基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针。

本发明的特征还在于，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。

本发明的一优选实施方案为：序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的荧光基团分，Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为Hex，荧光淬灭基团Y₂为Eclipse，Probe3荧光报告基团X₃为Cy5，荧光淬灭基团Y₃为BHQ3。

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的包含上述三对特异性引物和三条特异性探针，属于三重实时荧光PCR检测，可在同一个反应体系中对脑膜炎奈瑟氏菌(通用)、脑膜炎奈瑟氏菌A群和脑膜炎奈瑟氏菌C群核酸进行检测。

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的PCR反应循环参数为95℃，10min；进入循环阶段：95℃变性10s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。

本发明的另一优选实施方案，试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA 2μl，加灭菌水至终体系20μl。

本发明提供的试剂盒对脑膜炎奈瑟氏菌(通用)核酸的检测下限为200个拷贝每反应体系；对脑膜炎奈瑟氏菌A群核酸的检测下限为200个拷贝每反应体系；对脑膜炎奈瑟氏菌C群核酸的检测下限为200个拷贝每反应体系。

本发明提供的试剂盒可以检出脑膜炎奈瑟氏菌(通用)、脑膜炎奈瑟氏菌A群和脑膜炎奈瑟氏菌C群的核酸，但不能检出非脑膜炎奈瑟氏菌病原体的核酸，说明试剂盒具有很好的特异性。

本发明提供的试剂盒3小时内即可完成检测，多重检测可节省60％的检测费用，可为脑膜炎奈瑟氏菌的疾病监测和临床诊断提供实验依据。

附图说明

图1为三重实时荧光PCR检测脑膜炎奈瑟氏菌阳性标准品(通用+A群)的扩增曲线图，平滑曲线为通用型，带有方框的曲线为A群。从左至右的每组曲线对应浓度依次为2X10^5-2X10¹拷贝每反应体系，试剂盒对脑膜炎奈瑟氏菌(通用)和脑膜炎奈瑟氏菌A群的检测限均为200拷贝每反应体系。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。

图2为三重实时荧光PCR检测脑膜炎奈瑟氏菌阳性标准品(通用+C群)的扩增曲线图，平滑曲线为通用型，带有方框的曲线为A群。从左至右的每组曲线对应浓度依次为2X10^5-2X10¹拷贝每反应体系，试剂盒对脑膜炎奈瑟氏菌(通用)和脑膜炎奈瑟氏菌A群的检测限均为200拷贝每反应体系。

图3为三重实时荧光PCR检测体系检测10种细菌基因组DNA的扩增曲线图。10种细菌包括：A群脑膜炎奈瑟氏菌、C群脑膜炎奈瑟氏菌和8种阴性对照微生物。A群脑膜炎奈瑟氏菌和C群脑膜炎奈瑟氏菌均出现两条S型扩增曲线(通用+A群，或通用+C群)，而其他8种呼吸道病原微生物未出现S型扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。

1、引物和TaqMan探针的设计与合成

利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的脑膜炎奈瑟氏菌(通用)、脑膜炎奈瑟氏菌A群和脑膜炎奈瑟氏菌C群基因组序列进行分析，分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列。各种血清群脑膜炎奈瑟氏菌在ctrA基因存在保守区，选择ctrA基因作为脑膜炎奈瑟氏菌(通用)的检测靶序列，脑膜炎奈瑟氏菌A群检测靶序列为sacB基因，脑膜炎奈瑟氏菌C群检测靶序列为siaD基因；并针对这三个检测靶序列设计和合成多套引物和探针(见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中脑膜炎奈瑟氏菌(通用)的检测探针5’端标记FAM荧光基团；3’端标记Eclipse荧光淬灭基团；脑膜炎奈瑟氏菌A群的检测探针5’端标记Hex荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团；脑膜炎奈瑟氏菌C群的检测探针5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ3荧光淬灭基团。

2、检测菌种的准备

本实施例中所使用的A群脑膜炎奈瑟氏菌、C群脑膜炎奈瑟氏菌、以及其他阴性对照菌株(肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌)均购买于中国药品生物制品检定所。

3、菌株DNA的抽提

选用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(货号：51306)提取菌株DNA。具体步骤试剂盒参考操作说明书。

4、引物和探针的筛选

采用设计的多套引物和探针分别检测提取的A群脑膜炎奈瑟氏菌、C群脑膜炎奈瑟氏菌和阴性对照菌株的基因组DNA，经反复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合。(见序列表，脑膜炎奈瑟氏菌(通用)正向引物p1、反向引物p2和探针probe1；脑膜炎奈瑟氏菌A群正向引物p3、反向引物p4和探针probe2；脑膜炎奈瑟氏菌C群正向引物p5、反向引物p6和探针probe3)

5、标准品的构建与制备

利用p1和p 2引物扩增脑膜炎奈瑟氏菌A群(或C群)基因组DNA，利用p3和p4引物扩增脑膜炎奈瑟氏菌A群基因组DNA，利用p5和p6引物扩增脑膜炎奈瑟氏菌C群基因组DNA，分别将PCR产物克隆至pMD-18T载体，转化DH5α大肠杆菌，利用碱裂解法提取阳性克隆质粒，利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处DNA的吸光率，然后计算质粒浓度与纯度。然后10倍梯度稀释至10个拷贝每微升，制备三种脑膜炎奈瑟氏菌(通用、A群和C群)的阳性标准品。

6、反应条件优化

对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为：2×PCR缓冲液10μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、Takara聚合酶混合物0.4μl、模板2ul，加灭菌水至终体系20μl。

根据扩增片段长、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应退火温度和延伸时间进行了优化，最终确定的循环参数为：预变性95℃，10min；扩增和检测：95℃变性10s，60℃退火延伸1min，40个循环，每个循环在退火及延伸阶段采集荧光信号。

在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。

7、检测限的评价

以上述5中的阳性标准品评价本发明的提供的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度为：1×10⁵copies/μl，1×10⁴copies/μl，1×10³copies/μl，1×10²copies/μl，1×10⁵copies/μl，1×10⁵copies/μl，本发明提供的试剂盒对脑膜炎奈瑟氏菌(通用)核酸的检测下限为200个拷贝每反应体系；对脑膜炎奈瑟氏菌A群核酸的检测下限为200个拷贝每反应体系；对脑膜炎奈瑟氏菌C群核酸的检测下限为200个拷贝每反应体系。

8、检测特异性的评价

以上述2中的菌株DNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对脑膜炎奈瑟氏菌A群(或脑膜炎奈瑟氏菌C群)DNA进行检测时均可见明确的通用和A群(或通用型和C群)两条扩增曲线，对上述8种其他咽部常见病原微生物DNA检测时，未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他菌株之间不存在交叉反应。

尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、FAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LCGreen等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测脑膜炎奈瑟氏菌(通用)、脑膜炎奈瑟氏菌A群和脑膜炎奈瑟氏菌C群的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。

Claims (3)

1.一种检测脑膜炎奈瑟氏菌(通用)、脑膜炎奈瑟氏菌A群和脑膜炎奈瑟氏菌C群核酸的试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品；PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下：

P1：5`-GGCTGCGGTAGGTGGTTC-3`，

P2：5`-TTCCAAAGCCACCGTGCG-3`，

P3：5`-ACGAAGAAATTATGCCACAAAGTG-3`，

P4：5`-GAAGTCGTCATTGCTGTAAATAAAATAG-3`，

P5：5`-TTCAATGCTAATGAATACCACCGT-3`，

P6：5`-GGTATTTGTCTTGAATTTTAGCAATAG-3`；

PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下：

Probe1：5`-X1-CCAATGTGCAGCTAACACGTGGCAATG-Y1-3`，

Probe2：5`-X2-CCAGCTTGCACCATATACCAGGAATTAGT-Y2-3`，

Probe3：5`-X3-tgcacattcaggcgggattagcaca-Y3-3`；

Probe1荧光报告基团X1为Fam，荧光淬灭基团Y1为Eclipse，Probe2荧光报告基团X2为Hex，荧光淬灭基团Y2为Eclipse，Probe3荧光报告基团X3为Cy5，荧光淬灭基团Y3为BHQ3。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μL、10mmol/L dNTP 1.0μL、25μmol/L引物各0.5μL、10μmol/L探针各0.2μL、热启动Taq酶混合液0.4μL、样品DNA 2μL，加灭菌水至终体系20μL。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应循环参数为：

95℃，10min；进入循环阶段：95℃变性10s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。