CN102337261A

CN102337261A - 对脑膜炎奈瑟氏菌抗原特异的核苷酸及其应用

Info

Publication number: CN102337261A
Application number: CN2010102308964A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 朱宏飞; 王荃; 冯露
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明涉及一种对脑膜炎奈瑟氏菌抗原特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸包括1)SEQ ID NO：1-24所示的核苷酸中的至少一种；2)与SEQ IDNO：1-24所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测脑膜炎奈瑟氏菌用PCR试剂盒、基因芯片或微阵列。本发明的对脑膜炎奈瑟氏菌抗原特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列的实用性强，PCR试剂盒等配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。

Description

对脑膜炎奈瑟氏菌抗原特异的核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及一种核苷酸及其应用，尤其涉及一种对脑膜炎奈瑟氏菌抗原特异的核苷酸及其应用。

背景技术

脑膜炎奈瑟氏菌是一种革兰氏阴性菌，常在人的鼻咽部中发现，当寄居在人鼻咽部的脑膜炎奈瑟氏菌偶尔穿过鼻咽部的上皮进入血液或者进入脑脊液的时候，它就会在其中快速的繁殖，向全身快速的散播。它是儿童和成人细菌性脑膜炎和脓毒血症的主要致病因子，零星感染和较大范围的流行都可以见到。尽管抗生素可以有效地治疗这种疾病，但是病死率仍然很高，并且幸存者通常留有严重的肢体后遗症和严重的听力障碍。

引起脑膜炎病菌致病的必需毒力因子是它们的细胞外的多糖构成的荚膜。荚膜在细菌入侵宿主的时候起着特异或者非特异的防护作用。根据脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖的反应性和化学结构的不同分为13个血清群，它们是A、B、C、D、Y、W-135、29E、X、Z、H、I、K和L[Holst，J.(2007)，“Strategies for Development of Universal Vaccines Against MeningococcalSerogroup B Disease”.Human Vaccines.3：6，290-294，November/December2007]。其中A、B、C、W-135和Y是最常见的病原菌。血清群B，C，Y和W-135表达的荚膜全部含有唾液酸或者组成是唾液酸与葡萄糖或半乳糖相连，而血清群A由N-乙酰甘露糖1-磷酸组成的。

因为K-抗原是极强的抗原，是脑膜炎奈瑟氏菌重要的致病因素之一，同时它又具有较强的多样性。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。2006年爱尔兰的Bennett，D.等用多重PCR方法分出了七个群，2008年希腊的Drakopoulou，Z.等发明了能够检测A、B、C、Y、W-135等五个血清群的方法，这些方法都准确地分出了预定的血清群，能够快速有效地达到检测的目的。但这些分群方法没能把12个血清群的脑膜炎奈瑟氏菌都从分子生物学的角度上区分开来。本发明的检测血清群的数量几乎覆盖了全部。这种检测方法主要运用PCR技术。

聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，实现检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清群，为细菌性脑膜炎的防控提供有效技术支持是十分重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对脑膜炎奈瑟氏菌抗原特异的核苷酸，所述核苷酸包括：

1)SEQ ID NO：1-24所示的核苷酸中的至少一种；

2)与SEQ ID NO：1-24所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。

上述的核苷酸可以用于制备检测脑膜炎奈瑟氏菌用PCR试剂盒、基因芯片或微阵列。

本发明还提供一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸。优选地，所述的PCR引物包括SEQ ID NO：1-24所示的核苷酸中的至少一种。

本发明还提供一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸。优选地，所述寡核苷酸探针包括SEQ ID NO：1-24所示的核苷酸中的至少一种。

本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸。优选地，所述核苷酸包括SEQ ID NO：1-24所示的核苷酸中的至少一种。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)实用性强

本发明提供血清群检测所用到的特异性的引物，利用该多重PCR方法可以对临床标本进行检测。最终能够利用多重PCR的方法检测到13个血清群中的12个血清群，其中除了血清群D以外。

本发明所配制的PCR试剂盒等配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低。

(2)准确性高

本发明通过对脑膜炎奈瑟氏菌的各血清群荚膜基因簇内特异区段和种的独有基因ctrA和porA的PCR反应，每个样品要得到三个目的扩增子，一个是群特异条带，另两个是种的特异条带。将得到目的片段与已知的扩增子长度相比较，就可以得到脑膜炎奈瑟氏菌所属的血清群，将近缘菌和环境中存在的其他致病菌区分开。

(3)灵敏度高

本发明提供的检测引物及脑膜炎奈瑟氏菌检测试剂盒等具有较高的敏感性，检测精度高，可以检测到1ng/μl的DNA模板。

以上所述，仅是本发明的操作和实施方法而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

附图说明

图1表示ctrA基因P3和P4引物的筛选，目的条带为250bp，其余的血清群没有任何条带。

图2表示A血清群P5和P6引物的筛选，目的条带为469bp，其余的血清群没有任何条带。

图3表示B血清群P7和P8引物的筛选，目的条带为574bp，其余的血清群没有任何条带。

图4表示H血清群P15和P16引物的筛选，目的条带为1453bp，其余的血清群没有任何条带。

图5表示L血清群P17和P18引物的筛选，目的条带为988bp，其余的血清群没有任何条带。

图6是多重PCR结果图，其中：

从左边起的第1个泳道是100bp ladder marker，第2个泳道开始依次是A群扩增子为469bp，B群为574bp，I/K群为892bp，29E群为692bp，C群为380bp，2-6泳道是Assay 1的样品。从第7泳道开始依次是H群为1453bp，L群为988bp，X群为766bp，W/Y群为518bp，Z群为655bp；

第12泳道是I/K群单独检测的I群扩增子为1960bp；W/Y群单独检测的I群扩增子为485bp；每个泳道中的最小条带是porA的扩增子157bp，中间的条带是ctrA基因的目的条带250bp。

图7是试剂盒多重PCR结果图，其中：

从左边起的第1个泳道是100bp ladder marker，第2个泳道开始依次是A群扩增子为469bp，B群为574bp，I/K群为892bp，29E群为692bp，C群为380bp，2-6泳道是Assay 1的样品。从第7泳道开始依次是H群为1453bp，L群为988bp，X群为766bp，W/Y群为518bp，Z群为655bp；第12泳道是I/K群单独检测的I群扩增子为1960bp；7-11泳道是Assay2，W/Y群单独检测的I群扩增子为485bp；每个泳道中的最小条带是porA的扩增子157bp，中间的条带是ctrA基因的目的条带250bp。

图8表示Assay 1和Assay 2中分别可以检测出C群和X、X、X(766bp)和W/Y(518bp)。Assay 1和Assay 2的第1泳道是100bp ladder marker，第2泳道是X群的模板，以后的以此类推至第6泳道W/Y。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。总技术方案：

提供血清群检测所用到的特异性的引物的步骤总体如下：

1)序列破译；2)引物设计；3)引物筛选；4)引物组合进行多重PCR；5)优化多重PCR的反应体系；6)分离样品检测；7)灵敏度和特异性评价。以下分别叙述各个步骤的实施过程。

1)序列破译

(1)基因组的提取

(2)通过LA-PCR扩增脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜基因簇

(3)构建荚膜基因簇文库

(4)对文库中的克隆测序

(5)核苷酸序列的拼接及分析

2)引物设计

引物设计是该发明的核心部分。设计引物首先要根据文献中叙述的有关检测用的基因作为目的基因，从而选定用于分群和鉴定种的目的基因。基因的选定在本发明中分为两类：种鉴定基因和群鉴定特异基因。

(1)种鉴定基因的选定和引物设计方法

根据文献的叙述ctrA和porA这两个基因是脑膜炎奈瑟氏菌的特有基因，都可以作为种鉴定的特异基因。所以在NCBI中http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中下载ctrA和porA这些序列，每个基因至少下载6个DNA序列。用软件ClustalX对这些序列进行比较，选出基因内的保守序列作为引物的设计区段。将保守区段导入Primer Premier 5进行引物设计，引物的长度最好在15～24bp之间，Tm值在51～55℃。每个基因设计两对引物选用在每个群中都有单一目的条带的引物。这样可以确保这两对检测引物只能在脑膜炎奈瑟氏菌中扩增出两条带，其它的种属则不能。

(2)血清群鉴定的特异基因的选定

在脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜基因簇中的寡糖单位聚合酶和多聚唾液酸转移酶的DNA序列都是特异的，适合用于型或者群特异性的检测，所以选取这类基因作为鉴定血清群的目的基因，每个基因设计两对候选的引物。

①血清群A中选择sacD作为特异基因，它是一种糖基转移酶，下载Z2491参考菌株的DNA序列作为模板设计引物。

②血清群B和C中选取siaD作为特异基因，它是一种糖基转移酶，下载MC58、FAM18和053442的参考菌株的DNA序列作为模板设计引物。

③血清群I(N.meningitidis CMCC29044)和K(N.meningitidisCMCC29047)中的选取本实验室已经破译出来的糖基转移酶序列，由于这两个血清群的同一区段十分相似，所以设计共同引物即可：表1中的P11和P12。本实验室破译出来用于设计引物的基因序列如SEQ ID NO：31所示。

④血清群29E(N.meningitidis α-153)中要选取的荚膜基因簇内的sugar isomerase基因作为特异基因，设计引物即可。

⑤血清群H(N.meningitidis CMCC29031)中的选取本实验室已经破译出来的糖基转移酶序列：表1中的P15和P16序列，设计共同引物。用于设计引物的基因序列如SEQ ID NO：32所示。

⑥血清群L(N.meningitidis ATCC43828)中的选取本实验室已经破译出来的双工酶(bifunctional enzyme)序列：表1中的P17和P18，设计共同引物。L群中用于设计引物的序列如SEQ ID NO：33所示。

⑦血清群Z(N.meningitidis ATCC35562)中的选取本实验室已经破译出来的糖基转移酶序列：表1中的P23和P24，设计共同引物。Z群中用于设计引物的序列如SEQ ID NO：34所示。

⑧血清群W135(N.meningitidisα-275)和Y中选取siaD作为特异基因，它是一种糖基转移酶，下载GenBank中的gi：254671786和gi：4688950的DNA序列作为模板设计两对引物。由于这两个群的siaD基因相似度高达96％，用软件ClustalX对这些序列进行比较，选出基因内的保守序列作为引物的设计区段，所以设计共同引物即可。

⑨血清群X中选择的xcbA基因，它是一种聚合酶，特异性也很高，所以选用这个基因作为特异性的检测基因来设计引物。

⑩由于血清群H和I，还有W135和Y的特异性检测使用的都是共同引物，在共有的特性检测出来后，还要根据它们的差异性设计一对引物(分别为SEQ ID NO：25-26)P25：5’-CGAAGGTTTCCAAAGGCAG-3’和P26：5’-TATTGGTTCGCATACTGTCATT-3’把血清群K和I，能够产生1960bp条带的是I血清群；不能产生任何条带的是K血清群。另一个就是W135和Y产生共同条带以后要用P27：5’-ACGGTATCTGATGAAATGCTG-3’和P28：5’-TCATATACAACGATTGGAATATCA-3’(分别为SEQ ID NO：27-28)区分开来，其中能够产生485bp单一条带的是W135血清群，不能产生的是Y血清群的。这里要设立阳性和阴性对照以排除假阳性和假阴性。

引物设计之后再要Genbank中进行BLAST，设计的引物不能与其它近缘细菌的序列相似多过高，这样就能确保该引物只在自己的预定位置进行扩增，而不与其它的近缘菌或者采集标本的环境中的近缘菌不产生阳性反应。这一点对于避免非特异条带的产生和实验的成败十分重要。

3)引物筛选

(1)种鉴定基因的引物筛选方法

ctrA和porA这两个基因的每对引物都要对12个血清群的基因组模板进行普通PCR，挑选能够在各个血清群中都产生清晰地单一条带的引物作为备用引物。porA和ctrA这两个基因筛选到的引物是P1和P2、P3和P4。P3和P4筛选结果请参照图1。

(2)血清群鉴定的特异基因的筛选方法

以血清群A为例：用含有A群引物的PCR体系去扩增其他11个血清群的基因组模板和负对照，如果只有A群的模板中产生特异条带，其他的11个血清群中都不产生任何条带的引物为合适引物，A群筛选到的引物是P5和P6，参照图2。以此类推其他的B(图3)、C、D、Y、W-135、29E、X、Z、H(图4)、I、K和L(图5)等血清群。筛选到的引物有P7-P24。本发明中经过筛选得到的引物序列全部总结在表1中。

4)组合引物进行多重PCR

本发明中最后分成并列的两管进行PCR反应，即Assay 1和Assay 2。

Assay 1中包括A、B、C、29E和I/K等五个群的特异引物。Assay 2中包含H、L、Z、W135/Y和X等五个群的特异引物。此外，每管中还要加入ctrA和porA这两个基因的检测引物，每管引物达到七对。具体结果参照图6。

表1用于多重PCR的引物序列

5)优化多重PCR的反应体系

这一步骤中主要调整的就是引物和基因组的用量，本发明中确定最终的条件总结在以下：

94℃，5分钟

72℃，5分钟

6)分离样品检测

①分离的样品要求

分离的样品可以是基因组可以是水煮细菌的裂解液。

②通过已知血清群的菌株来验证

本发明中的多重PCR分群方法的准确性需要通过已知群的分离株来验证，收集这些分离株提取基因组DNA后，用多重PCR来分群，然后统计分群的准确性。从上海疾病预防控制中心和中国疾病预防控制中心分别得到52和110株脑膜炎奈瑟氏菌，包括分离株和标准菌株，经过统计，血清群区分的准确率在97～99％。

7)本发明的灵敏度

最终的灵敏度就是20μl体系中要有至少1ng以上的模板才能检测得到。

实施例1：基因组的提取

在巧克力平板上培养脑膜炎奈瑟氏菌(包括Z、H、I、K和L等5个血清群)，在37℃含有5％的二氧化碳环境中培养之后收集细胞，使用Qiagen基因组提取试剂盒提取基因组。具体步骤如下：

(1)取400μl PBS溶液到1.5μl的离心管中，用接种环从巧克力平板上刮取的少量菌落洗脱到液体当中，震荡并混匀，洗涤菌体，8000rpm离心5min收集菌体，弃上清。

(2)向此离心管内加入180μl的Buffer ATL，震荡混匀56℃水浴1h。简单离心去掉盖上的液滴。

(3)再加入20μl的proteinase K(stock solution)溶液，再加入200μl的Buffer AL到样品中，震荡混匀，70℃水浴1～2h，确保样品全部溶解。简单离心去掉盖上的液滴后转入带有收集管的Mini spin column中。

(4)向样品中加入200μl的无水乙醇，震荡15s混匀，将样品转移到提取柱中，转移的同时不可弄湿柱子的边缘以免影响以后的PCR扩增效果。

(5)8000rpm离心2min后，丢掉收集管，将柱子转入新的收集管中，向柱子内加入500μl的Buffer AW1 6000rpm离心1min。

(6)换上新的收集管后向柱子内加入500μl的Buffer AW2 6000rpm离心1min。

为了去掉残留的Buffer 14000rpm离心3min后，转入一个干净的1.5μl的Eppendorf离心管中。

(7)向柱子内加入100μl的ddH₂O，室温放置5min后，8000rpm离心3min，管内所得的液体即为基因组DNA。

(8)得到的基因组DNA要进行琼脂糖凝胶电泳，检验实验效果。然后再用Nanodrop分光光度计测定具体的DNA浓度，同时可以检验到是否有蛋白质和RNA的污染。

实施例2：序列破译

(1)通过LA-PCR扩增脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜基因簇。根据Genbank中的galE基因设计上游引物为wl-14395，5’-CGCCATTTCTTCCGCCAACACCA 3’，再根据tex基因设计下游引物为wl-143965’-GCGTTTGCGTGCAGCATCGACT-3’(分别为SEQ IDNO：29-30)；

PCR反应程序如下：在94℃预变性5分钟；然后94℃变性15秒，62℃退火30秒，68℃延伸8分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并10管50μl long PCR产物，并用Promega公司的WizardPCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

(2)构建荚膜基因簇文库：用shot-gun法构建K-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，经过核酸片段仪剪切成2～3kb片段、补平粘性末端、pUC18的载体连接(采用fastlink ligase)连接得到测序的基因文库。

(3)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的200个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到8～10倍的覆盖率，从而获得荚膜基因簇的所有序列。

(4)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列后，用美国国家生物技术信息学中心的orffinder发现基因，找到开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到脑膜炎奈瑟氏菌的基因簇的序列。

实施例3：引物筛选

(1)种鉴定基因的引物筛选方法

ctrA和porA这两个基因的每对引物都要对12个血清群的基因组模板进行普通PCR，挑选能够在各个血清群中都产生清晰地单一条带的引物作为备用引物。porA和ctrA这两个基因筛选到的引物是P1和P2、P3和P4。

(2)血清群鉴定的特异基因的筛选方法

以血清群A为例：用含有A群引物的PCR体系去扩增其他11个血清群的基因组模板和负对照，如果只有A群的模板中产生特异条带，其他的11个血清群中都不产生任何条带的引物为合适引物，A群筛选到的引物是P5和P6。以此类推其它的B、C、D、Y、W-135、29E、X、Z、H、I、K和L等血清群。筛选到的引物有P7-P24。

以上基因鉴定引物筛选用到的PCR体系(20μl)和反应条件如下：

超纯水 13.8μl

缓冲液(10X) 2μl

dNTP(10mM 0.8μl

引物1(5μM) 0.4μl

引物2(5μM) 0.4μl

DNA聚合酶(rTaq) 0.2μl(5u/μl)

模板DNA 0.4μl

这个步骤中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：

94℃，5分钟

72℃，5分钟

上述步骤在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：

①取2～5μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5∶1的体积比混合；

②将混合液上样于1.6％的琼脂糖凝胶上；

③将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；

④观察并记录结果。

引物筛选这个环节用到的基因组模板提取采用QIAamp DNA MiniKits试剂盒。操作步骤与前面的叙述相同。通过基本PCR反应之后引物筛选的工作基本结束，必要的长度调整对整体反应条件影响不大，本发明中用到的引物序列全部总结在下表2中。

实施例4：组合引物进行多重PCR及其体系优化

1.多重PCR

1)PCR试剂盒的组成，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，

其中Assay 1和Assay 2的PCR引物详见下表2。本发明单次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量为：Assay 1和Assay 2都是20μl。每个试剂盒可以检测20个样品。具体组成见下表2。

2)检测实验所需材料及设备的准备

其中MgCl₂、10×缓冲液、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH₂O由我们自行制备。实验的设备PCR仪(又名DNA热循环扩增仪)、电泳设备(包括电泳仪及电泳槽)、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2ml PCR薄壁管。

表2PCR试剂盒的组成

成分	浓度	多重-PCRAssay 1(μl)	多重-PCRAssay 2(μl)
				ddH₂O		11.8	12.9
10×酶特异性反应缓冲液	10×	2	2
				MgCl₂	25mM	2	2
10mM dNTP	10mM	0.8	0.8
				Assay1的所有引物	5μM	3.2
Assay2的所有引物	5μM		2.1
				Taq酶	5U/μl	0.2	0.2
总体积		20	20

3)PCR试剂盒的使用具体实例

(1)待测样品的处理：如果有条件提取基因组也可以，为了节省时间和耗材，可以巧克力平板培养脑膜炎奈瑟氏菌之后直接刮取菌落至50μlddH₂O，震荡混匀之后，100℃煮沸15分钟，然后8000rpm离心3min，取上清为模板。

(2)分别取PCR试剂盒Assay 1和Assay 2的试剂各20μl于PCR管中，各加入1μl模板。

(3)PCR反应条件如下：

94℃，5分钟

72℃，5分钟

(4)1.6％的琼脂糖凝胶电泳检测试验结果。

(5)结果的分析和记录

使用试剂盒进行的多重PCR效果请参照附图7。

2.体系优化

Assay 1中包括A、B、C、29E和I/K等五个群的特异引物；Assay 2中包含H、L、Z、W135/Y和X等五个群的特异引物。此外，每管中还要加入ctrA和porA这两个基因的检测引物，每管引物达到七对。优化的多重PCR的反应体系列于表3之中。

本发明中的多重PCR反应最终的反应条件总结在以下：

94℃，5分钟

72℃，5分钟

实施例5：分离样品检测

(1)分离的样品要求

分离的样品可以是基因组在也可以是水煮细菌的裂解液；

(2)用实施例4中的体系和条件进行PCR；

(3)电泳检测；

(4)结果分析，请参照附图7。

实施例6：PCR试剂盒的应用

(1)PCR试剂盒的组成，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，

Assay 1和Assay 2试剂盒使用的最都是20μl为一个基本用量。每个试剂盒可以检测20个样品。

表3多重PCR体系的组成

(2)检测实验所需材料及设备的准备

其中MgCl₂、10×缓冲液、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH₂O由我们自行制备。实验的设备PCR仪、电泳设备、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2ml PCR薄壁管。

(3)PCR试剂盒的使用具体实例

①待测样品的处理。如果有条件提取基因组也可以，为了节省时间和耗材，可以巧克力平板培养脑膜炎奈瑟氏菌之后直接刮取菌落至50μlddH₂O，震荡混匀之后，100℃煮沸15分钟，然后8000rpm离心3min，取上清为模板。

②分别取PCR试剂盒Assay 1和Assay 2的试剂各20μl于PCR管中，各加入1μl模板。

③PCR反应条件如下：

94℃，5分钟

72℃，5分钟

④1.6％的琼脂糖凝胶电泳检测试验结果。

⑤结果的分析和记录，结果分析参照附图6。

实施例7：多重PCR和应用试剂盒方法

两种方法检测中国疾病预防控制中心的5株脑膜炎奈瑟氏菌，其中包括A群一株，X群3株，C群1株。

(1)从平板上刮取少量的菌落至50μl的水中，100℃煮沸15分钟，8000rpm离心5分钟，取上清。

(2)PCR体系的制作

①多重PCR的方法：按照表3中的组分和数量加入引物、dNTP、缓冲液和酶，取0.5μl的裂解液作为模板，制成两管(Assay 1和2)20.5μl的体系；

②试剂盒方法：分别取PCR试剂盒Assay 1和Assay 2的试剂各20μl于PCR管中，各加入0.5μl模板；

(3)按照实施例4中的条件进行PCR反应；。

(4)电泳检测；

(5)结果分析参照图8，Assay 1和Assay 2中分别可以检测出C群和X、X、X(766bp)和W/Y(518bp)。Assay 1和Assay 2的第1泳道是100bpladder marker，第2泳道是X群的模板，以后的以此类推至第6泳道W/Y。