CN110904253A

CN110904253A - 脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN110904253A
Application number: CN201911309126.6A
Authority: CN
Inventors: 杨孙孝; 朱兆奎
Original assignee: Shanghai Berger Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Berger Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明公开了一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，试剂盒包括：核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；脑炎脑膜炎核酸检测试剂包括：肺炎链球菌基因的扩增引物和探针；脑膜炎奈瑟菌基因的扩增引物和探针；流感嗜血杆菌基因的扩增引物和探针；内参RNP基因的扩增引物和探针。同时还提供了脑炎脑膜炎核酸分型检测方法。本发明引入了脑炎脑膜炎特异性的多通道引物探针，既可减少工作量，又避免其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，还能实现同一体系多重同时检测三种病原体且各通道引物探针相互无干扰，具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而快速诊断是否感染三种病原体。

Description

脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种RT-PCR扩增技术，具体涉及一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法。

背景技术

脑膜炎和脑炎是一类可由细菌，病毒，酵母菌引起的主要威胁儿童生命的综合征。发病率和死亡率很高，尤其是细菌真菌类脑膜炎。我国五岁以下的儿童中的急性细菌脑膜炎的发病率为(6.95～22.3)/10,000，脑膜炎和脑炎都是由于中枢神经系统的感染所致，有40％的病人感染后，病程进展较快，直接导致死亡，存活者也会留下神经功能方面的缺陷。脑炎和脑膜炎可能同时存在，成为脑炎脑膜炎，或者有相同的症状，例如头痛发热。据报道，肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌，是最为流行的三种病原菌。

肺炎链球菌(pneumococcus)属于革兰染色阳性菌，肺炎球菌主要的致病物质是肺炎球菌溶血素及荚膜。荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。此菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病，是世界范围内引起儿童和成人感染脑膜炎的主要病原菌，澳大利亚在2016年共有1636例肺炎球菌的病例，被诊断为脑膜炎的共有126例，在澳大利亚的侵入性疾病中对盘尼西林敏感的占到10～12％，因此在讨论经验性治疗方案时，这是非常值得考虑的。在三个月到五岁的儿童中，肺炎链球菌是导致细菌性脑膜炎的主要病因，据估计在我国每年在一个月到五十个月的儿童中，肺炎球菌脑膜炎的发病率为14/10万。

脑膜炎奈瑟菌，也叫脑膜炎双球菌，是一群革兰染色阴性双球菌。脑膜炎双球菌(meningococcus)的流行程度因地理位置而不同，A血清型主要在亚撒哈拉的脑膜炎地带(到非洲和中东的旅行者推荐注射针对该病原菌的疫苗)，B血清型主要在发达国家，据报道在2015年，澳大利亚的182例脑膜炎球菌感染的患者中，有53例被诊断为脑膜炎球菌脑膜炎。从2005～2010 年，我国的脑膜炎球菌的发病率平均为0.09/每10万人，新疆为发病率最高的地方，安徽省占据大多数案例，1岁以下的儿童发病率最高，在已确认的病例中，ABC三种血清型所占的比例分别为37.2％、11.5％和42.7％。

流血嗜血杆菌简称流感细菌，是寄居于人类上呼吸道的正常菌群，属嗜血杆菌属，本属细菌因人工培养时必须加新鲜血液或血液成分方能生长，故名嗜血杆菌。流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属中最常见的对人有致病性的细菌，可引起原发性化脓性感染和呼吸道继发感染。流感嗜血杆菌还是导致儿童脑膜炎，肺炎，会厌炎的主要病原菌，尤其是在五岁以下的儿童中，世界范围内每年致使2000万新增病例，30万死亡病例，作为儿童防疫工作的一部分，在使用了流血嗜血杆菌疫苗的国家，感染情况已经大大减少。在美国由于使用了疫苗，十年间，每年的五岁以下发病人数已由10000例减少至200例。

荧光定量PCR技术是一种传统的生物分子检测方法，具有高敏感、高特异、高准确性且能实现多重实时检测的优势，目前已被广泛用于核酸 (DNA/RNA)分子检测。

目前，在中国专利文献中公开的涉及脑炎脑膜炎核酸检测的试剂主要有：

中国专利文献CN201610296666.5公开了一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，能够快速检测六种细菌性脑膜炎病原体，肺炎链球菌 (SP)、无乳链球菌(GBS)、流感嗜血杆菌(HI)、单核细胞增生李斯特菌 (LM)、金黄色葡萄球菌(SA)、脑膜炎奈瑟菌(NM)，检测方法为多重PCR 法，通过电泳检测扩增结果；由于产物需开盖检测带来潜在污染的可能，而且该方法操作复杂，检测灵敏度低于荧光定量PCR法。

中国专利文献CN201310031419.9公开了一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法，可检测包括脑膜炎奈瑟菌、b型流感嗜血杆菌、葡萄球菌、肺炎链球菌等在内的病原体，其检测方法为毛细管电泳法，由于产物需开盖检测带来潜在污染的可能，并且操作较为繁琐，检测时间长，检测灵敏度低于荧光定量PCR法。

中国专利文献CN201110004826.1公开了一种对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS 特异的核苷酸及其应用，利用该荧光定量PCR试剂盒对人体及环境中的脑膜炎奈瑟氏菌进行检测，可用于食品和临床样品的监督和检测、食物中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，但是其主要不足在于检测样本时，目标过于单一。

虽然现有技术中针对脑炎脑膜炎的病原体检测试剂盒已经有很多，但是在荧光定量PCR技术平台针对肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌的三重检测方法未见报道，因此，本领域技术人员亟有必要利用该平台开发一种高敏感、高特异、高准确性的多重实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒，实现三重联合检测并区分肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种高敏感、高特异、高准确性的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法，能够快速检测三种细菌病原体，实现三重联合检测并区分肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌。

为实现上述目的之一提供一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，本发明采用了以下技术方案：

一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，所述试剂盒包括核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。

优选的，所述核酸快速提取试剂包括：pH为10.0的400mM Tris-HCl、 5vol％的Tween20、500mM异硫氰酸胍、40mM KCl、pH为8.0的4mM EDTA。

优选的，所述PCR扩增试剂包括：1.5×PCR buffer、4mM MgCl₂、pH 为10.0的50mMTris-HCl、0.5mM dNTP、0.02U/μl DNA聚合酶、5wt％BSA。

优选的，所述阳性对照品包括：将肺炎链球菌的特异性扩增片段、脑膜炎奈瑟菌的特异性扩增片段、流感嗜血杆菌的特异性扩增片段和内参RNP 的特异性扩增片段分别连接到四个pUC57质粒载体上，四个质粒分别用DEPC水进行10⁶倍稀释，然后将四个稀释后的质粒等体积混合，作为最终的阳性对照。

优选的，所述阴性对照品为DEPC H₂O。

优选的，所述脑炎脑膜炎核酸检测试剂包括：肺炎链球菌基因的扩增引物F1、R1和探针P1；脑膜炎奈瑟菌基因的扩增引物F2、R2和探针P2；流感嗜血杆菌基因的扩增引物F3、R3和探针P3；内参RNP基因的扩增引物 F4、R4和探针P4；

探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料 BHQ；

探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料 BHQ；

探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料 BHQ；

探针P4的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料 BHQ；

引物探针序列为：

肺炎链球菌-F1：5’-AAGCCGTTCTCAATATCATGCTTA-3’

肺炎链球菌-R1：5’-CACGTTGACCCTTATCCATATCTTG-3’

肺炎链球菌-P1：

5’-FAM-ACTGCTCACGGCTAATGCCCCATTT-BHQ-3’

脑膜炎奈瑟菌-F2：5’-GGTATATCGTGTGAATATGGCTGATG-3’

脑膜炎奈瑟菌-R2：5’-GGCGCATTCGACACATACAA-3’

脑膜炎奈瑟菌-P2：

5’-VIC-CGCTATTTTCTATGCAGCGCTTTCCTGTG-BHQ-3’

流感嗜血杆菌-F3：5’-TGCTGATCTTCAACAACGTTACAA-3’

流感嗜血杆菌-R3：5’-CAGCTGGCGTTGCATTTAAA-3’

流感嗜血杆菌-P3：

5’-CY5-TTCAAATCTTAGATGCGCACGCTGCA-BHQ-3’

RNP-F4：5’-CTGACCTGAAGGCTCTGC-3’

RNP-R4：5’-TGAATAGCCAAGGTGAGC-3’

RNP-P4：5’-ROX-GAGACAGCCGCTCACCTT-BHQ-3’。

优选的，各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。

本发明的目的之二是提供一种脑炎脑膜炎核酸分型检测方法，利用前述的检测试剂盒，包括以下步骤：

S1、将核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后直接用于PCR检测；

S2、以步骤S1中的混合物为模板，同时使用阳性对照品和阴性对照品，利用检测脑炎脑膜炎核酸检测试剂进行四重荧光定量PCR检测：

S3、数据处理：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

在数据处理步骤中，根据实际情况分别调节FAM、VIC、CY5和ROX 通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在3～15、End值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM、VIC、CY5和ROX 通道的Ct值。

根据所得FAM、VIC、CY5和ROX通道的Ct值；进行：

S31、有效性判断：阴/阳性对照品检测结果需满足表1要求，否则，本次实验结果无效；

表1.阴/阳性对照品判读标准

荧光通道	阴性对照品	阳性对照品
			FAM通道	无Ct值	Ct≤35
VIC通道	无Ct值	Ct≤35
			CY5通道	无Ct值	Ct≤35
ROX通道	无Ct值	Ct≤35

S32、结果判读：

a.FAM通道CT≤39，肺炎链球菌阳性；

b.VIC通道CT≤39，脑膜炎奈瑟菌阳性；

c.CY5通道CT≤39，流感嗜血杆菌阳性；

d.脑炎脑膜炎阴性判读：FAM通道/VIC通道/CY5通道CT＞39或CT 无数值且ROC通道Ct≤35，判断阴性。

优选的，步骤S2中四重荧光定量PCR的扩增体系包括：PCR扩增试剂 16μl、脑炎脑膜炎核酸检测试剂4μl、模板/阳性对照品/阴性对照品5μl。

四重荧光定量PCR的扩增体系如下表2所示：

表2.PCR扩增体系

试剂名称	用量
		PCR扩增试剂	16μl
脑炎脑膜炎核酸检测试剂	4μl
		模板/阳性对照品/阴性对照品	5μl

优选的，所述四重荧光定量PCR的反应条件包括：延伸温度50℃条件下反应2分钟循环1次；延伸温度95℃条件下反应5分钟循环1次；延伸温度95℃条件下反应10s循环40次；延伸温度55℃条件下反应40s循环40 次。

步骤S2中四重荧光定量PCR的扩增程序如下表3所示：

表3.PCR扩增程序

1)本发明创新性的引入了脑炎脑膜炎特异性的多通道引物探针，既可减少工作量、又避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，还能实现同一体系多重同时检测三种病原体且各通道引物探针相互无干扰。本发明不仅首次公开了针对肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌分型检测的实时荧光定量PCR方法，同时具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而实现快速诊断是否感染肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌。基于此，本试剂盒适合感染性肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌大规模筛查及诊断的推广应用，具有广泛的应用前景。

2)本发明采用的核酸快速提取试剂配方可用于核酸快速提取，既能有效裂解样本、抑制DNA和RNA酶的活性从而获得核酸，又能保证配方中的各试剂成分不影响后续PCR扩增。本提取试剂整个操作过程只需要常温静置5-10min，大大缩短了提取时间、提高了提取效率；而常规的核酸提取试剂需要30-90min。此外，本发明提供的核酸快速提取试剂配方加入一定量的 KCl，能够促进引物退火，从而对后续PCR扩增体系具有促进作用，提高 PCR检测效率；同时使用了EDTA螯合剂，防止非特异扩增，增强PCR扩增特异性。

3)本发明提供的脑炎脑膜炎核酸检测试剂分别在肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌的特异性靶标区域设计引物，既能高效、特异性地捕获目的序列，又能保证同一体系当中的四种引物探针对之间无相互干扰，保证在四重荧光定量PCR同时扩增的条件下每个荧光通道的扩增效率均不受其它通道的影响。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为依据本发明建立的多重荧光PCR方法对肺炎链球菌阳性样本及阳性质粒的荧光通道检测结果。

图2为依据本发明建立的多重荧光PCR方法对脑膜炎奈瑟菌阳性样本及阳性质粒的荧光通道检测结果。

图3为依据本发明建立的多重荧光PCR方法对流感嗜血杆菌阳性样本及阳性质粒的荧光通道检测结果。

图4为FAM荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对1000、100、10、 2、0CFU/mL浓度的肺炎链球菌进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。

图5为VIC荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对500、100、10、5、 0CFU/mL浓度的脑膜炎奈瑟菌进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。

图6为CY5荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对500、100、10、2、 0CFU/mL浓度的流感嗜血杆菌进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。

图7为从肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌疑似患者的20份临床样本中提取病毒DNA，用本发明荧光PCR方法进行检测的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是,在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

下列实施例中，采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1——一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒

本实施例利用实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌核酸分型的试剂盒，包括：核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。其中：

(1)所述核酸快速提取试剂包括裂解试剂，裂解试剂包含：Tris-HCl (pH10.0)、Tween20、异硫氰酸胍、KCl、4mM EDTA(pH8.0)，试剂配制方法如表4所示：

表4：核酸快速提取试剂配方

(2)所述PCR扩增试剂包括PCR buffer、MgCl₂、Tris-HCl(pH10.0)、 dATP、dCTP、dGTP、dTTP、DNA聚合酶、BSA。试剂配制方法如表5所示：

表5：PCR扩增试剂配方

(3)所述脑炎脑膜炎核酸检测试剂包括：肺炎链球菌特异性的引物和探针、脑膜炎奈瑟菌特异性的引物和探针、流感嗜血杆菌特异性的引物和探针、内参RNP特异性的引物和探针；

具体的，特异性引物和探针为：

肺炎链球菌-F1：5’-AAGCCGTTCTCAATATCATGCTTA-3’

肺炎链球菌-R1：5’-CACGTTGACCCTTATCCATATCTTG-3’

肺炎链球菌-P1：

5’-FAM-ACTGCTCACGGCTAATGCCCCATTT-BHQ-3’

脑膜炎奈瑟菌-F2：5’-GGTATATCGTGTGAATATGGCTGATG-3’

脑膜炎奈瑟菌-R2：5’-GGCGCATTCGACACATACAA-3’

脑膜炎奈瑟菌-P2：

5’-VIC-CGCTATTTTCTATGCAGCGCTTTCCTGTG-BHQ-3’

流感嗜血杆菌-F3：5’-TGCTGATCTTCAACAACGTTACAA-3’

流感嗜血杆菌-R3：5’-CAGCTGGCGTTGCATTTAAA-3’

流感嗜血杆菌-P3：

5’-CY5-TTCAAATCTTAGATGCGCACGCTGCA-BHQ-3’

RNP-F4：5’-CTGACCTGAAGGCTCTGC-3’

RNP-R4：5’-TGAATAGCCAAGGTGAGC-3’

RNP-P4：5’-ROX-GAGACAGCCGCTCACCTT-BHQ-3’

特异性的引物和探针配方如表6所示：

表6：脑炎脑膜炎核酸检测试剂

(4)阳性对照品：将肺炎链球菌的特异性扩增片段、脑膜炎奈瑟菌的特异性扩增片段、流感嗜血杆菌的特异性扩增片段和内参RNP的特异性扩增片段分别连接到四个pUC57质粒载体上，四个质粒分别用DEPC水进行 10⁶倍稀释，稀释为10μg/μl的质粒溶液，作为脑炎脑膜炎的阳性对照；然后将四个稀释后的质粒等体积混合，作为最终的阳性对照，其配方如表7所示：

表7：阳性对照品配方

(5)阴性对照品：DEPC H₂O；

各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。

实施例2——一种脑炎脑膜炎核酸分型检测方法

本实施例脑炎脑膜炎核酸分型的实时荧光PCR检测方法，包括以下实验步骤：

(1)主要试剂、仪器：采用实施例1的试剂盒试剂；荧光定量PCR仪为ABI7500。

(2)标本准备：阳性标本为人感染肺炎链球菌滴定后灭活病毒、人感染脑膜炎奈瑟菌滴定后灭活病毒、人感染流感嗜血杆菌滴定后灭活病毒，然后用DEPC水进行不同倍数的稀释，阴性对照标本为健康人的唾液拭子。

(3)RNA提取：将核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液直接用于PCR检测。

(4)特异性PCR扩增：

a.引物和探针的设计：根据肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟菌，流感嗜血杆菌的特异性序列分别设计特异性的引物和探针，其特异性引物和探针为：

肺炎链球菌-F1：5’-AAGCCGTTCTCAATATCATGCTTA-3’

肺炎链球菌-R1：5’-CACGTTGACCCTTATCCATATCTTG-3’

肺炎链球菌-P1：

5’-FAM-ACTGCTCACGGCTAATGCCCCATTT-BHQ-3’

脑膜炎奈瑟菌-F2：5’-GGTATATCGTGTGAATATGGCTGATG-3’

脑膜炎奈瑟菌-R2：5’-GGCGCATTCGACACATACAA-3’

脑膜炎奈瑟菌-P2：

5’-VIC-CGCTATTTTCTATGCAGCGCTTTCCTGTG-BHQ-3’

流感嗜血杆菌-F3：5’-TGCTGATCTTCAACAACGTTACAA-3’

流感嗜血杆菌-R3：5’-CAGCTGGCGTTGCATTTAAA-3’

流感嗜血杆菌-P3：

5’-CY5-TTCAAATCTTAGATGCGCACGCTGCA-BHQ-3’

RNP-F4：5’-CTGACCTGAAGGCTCTGC-3’

RNP-R4：5’-TGAATAGCCAAGGTGAGC-3’

RNP-P4：5’-ROX-GAGACAGCCGCTCACCTT-BHQ-3’

b.阳性对照：本方法中的阳性对照为肺炎链球菌的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，脑膜炎奈瑟菌的特异性扩增片段连接到一个pU C57质粒载体上，流感嗜血杆菌的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，内参RNP的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，四种质粒原液(100ng/μl)分别用DEPC水进行10⁶倍稀释，然后将四种稀释后的质粒按照1:1:1:1比例混合混合，最终作为本方法中的阳性对照。

c.RT-PCR反应平台：总体积25μl的多重荧光PCR扩增体系中分别加入PCR扩增试剂16μl，脑炎脑膜炎核酸检测试剂4μl，核酸标本5μl。PCR 扩增的反应条件为50℃孵育2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火和延伸40s，40个循环。

d.数据处理：

反应结束后，根据实际情况分别调节FAM通道、VIC通道、CY5通道和ROX通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start 值建议设在3～15、End值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM、VIC、CY5 和ROX通道的Ct值；

e.有效性判断：

阴/阳性对照品检测结果需满足表8要求，否则，本次实验结果无效。

表8：阴/阳性对照品判读标准

f.结果判读：

f1.肺炎链球菌阳性判读：FAM通道CT≤39。

f2.脑膜炎奈瑟菌阳性判读：VIC通道CT≤39。

f3.流感嗜血杆菌阳性判读：CY5通道CT≤39。

F4.阴性判读：阳性判读以外的其它结果，均判为阴性。如FAM通道/VIC 通道/CY5通道CT＞39，判断阴性；CT无数值且ROC通道Ct≤35，判断阴性。

(5)实验结果

a.特异性检测结果：

如图1所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法针对肺炎链球菌具有较好的特异性，肺炎链球菌阳性样本及阳性质粒的FAM荧光通道检测结果显示阳性而VIC/CY5荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应(如表9所示)；

如图2所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法针对脑膜炎奈瑟菌具有较好的特异性，脑膜炎奈瑟菌阳性样本及阳性质粒的VIC荧光通道检测结果显示阳性而FAM/CY5荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应(如表9所示)；

如图3所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法针对流感嗜血杆菌具有较好的特异性，流感嗜血杆菌阳性样本及阳性质粒的CY5荧光通道检测结果显示阳性而FAM/VIC荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应(如表9所示)；

表9：脑炎脑膜炎核酸检测试剂对不同细菌性病原体类型的检测结果

b.灵敏性试验结果：

将已知高浓度的肺炎链球菌的原液分别稀释至1000、100、10、2、0C FU/mL，用本试剂盒提供的核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测，如图4(FAM荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、2、0 CFU/mL的肺炎链球菌进行扩增检测的结果，结果表明多重荧光PCR方法检测肺炎链球菌的敏感性达到2CFU/mL；

将已知高浓度的脑膜炎奈瑟菌的原液分别稀释至500、100、10、5、0 CFU/mL，用本试剂盒提供的核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测，如图5(VIC荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对500、100、10、5、0CFU /mL浓度的脑膜炎奈瑟菌进行扩增检测的结果，结果表明多重荧光PCR方法检测脑膜炎奈瑟菌的敏感性达到5CFU/mL；

将已知高浓度的流感嗜血杆菌的原液分别稀释至500、100、10、2、0 CFU/mL，用本试剂盒提供的核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测，如图6(CY5荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对500、100、10、2、0CFU /mL浓度的流感嗜血杆菌进行扩增检测的结果，结果表明多重荧光PCR方法检测流感嗜血杆菌的敏感性达到2CFU/mL；

c.临床样本的检测结果：

从肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌疑似患者的20份临床样本中提取病毒DNA，用本发明多重荧光PCR方法进行检测，结果如图7所示。其中，本发明方法检测出肺炎链球菌阳性为3例(FAM荧光通道)、脑膜炎奈瑟菌阳性为2例(VIC荧光通道)、流感嗜血杆菌阳性为2例(CY5 荧光通道)。经测序确认，采用本发明多重荧光PCR方法检测该20份样本的阳性符合率为100％，由此可见，本发明方法具有高度准确性。

d.重复性检测结果：

采用3例阳性样本(分别为肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌)，用本发明多重荧光PCR方法各重复检测6次检测，结果如表10所示，各样本重复6次检测结果CT值的CV＜2％(CV＝CT标准偏差÷CT平均值)，表明本依据本发明建立的多重荧光PCR方法的检测重复性较好。其中，CT 值是扩增曲线的荧光信号达到阈值时所经历的循环数；CV值为变异系数，是衡量指标中各观测值变异程度的一个统计量，荧光PCR平台通常使用CT 值的CV值来衡量检测重复性，表明本实施例依据本发明建立的多重荧光P CR方法的检测重复性较好。

表10：脑炎脑膜炎核酸检测试剂的重复性检测结果

综上所述，本实施例中检测结果显示表明本发明方法的敏感性好、特异性高、重复性好且准确可靠。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海伯杰医疗科技有限公司

<120> 脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagccgttct caatatcatg ctta 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacgttgacc cttatccata tcttg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgctcacg gctaatgccc cattt 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtatatcgt gtgaatatgg ctgatg 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcgcattcg acacatacaa 20

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctattttc tatgcagcgc tttcctgtg 29

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgctgatctt caacaacgtt acaa 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagctggcgt tgcatttaaa 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcaaatctt agatgcgcac gctgca 26

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgacctgaa ggctctgc 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgaatagcca aggtgagc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagacagccg ctcacctt 18

Claims

1.一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒包括核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。

2.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：

所述核酸快速提取试剂包括：pH为10.0的400mM Tris-HCl、5vol％的Tween20、500mM异硫氰酸胍、40mM KCl、pH为8.0的4mM EDTA。

3.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：

所述PCR扩增试剂包括：1.5×PCR buffer、4mM MgCl₂、pH为10.0的50mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、0.02U/μl DNA聚合酶、5wt％BSA。

4.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：

所述阳性对照品包括：将肺炎链球菌的特异性扩增片段、脑膜炎奈瑟菌的特异性扩增片段、流感嗜血杆菌的特异性扩增片段和内参RNP的特异性扩增片段分别连接到四个pUC57质粒载体上，四个质粒分别用DEPC水进行10⁶倍稀释，然后将四个稀释后的质粒等体积混合，作为最终的阳性对照。

5.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：

所述阴性对照品为DEPC H₂O。

6.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：

所述脑炎脑膜炎核酸检测试剂包括：肺炎链球菌基因的扩增引物F1、R1和探针P1；脑膜炎奈瑟菌基因的扩增引物F2、R2和探针P2；流感嗜血杆菌基因的扩增引物F3、R3和探针P3；内参RNP基因的扩增引物F4、R4和探针P4；

探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；

探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；

探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；

探针P4的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；

引物探针序列为：

肺炎链球菌-F1：5’-AAGCCGTTCTCAATATCATGCTTA-3’

肺炎链球菌-R1：5’-CACGTTGACCCTTATCCATATCTTG-3’

肺炎链球菌-P1：

5’-FAM-ACTGCTCACGGCTAATGCCCCATTT-BHQ-3’

脑膜炎奈瑟菌-F2：5’-GGTATATCGTGTGAATATGGCTGATG-3’

脑膜炎奈瑟菌-R2：5’-GGCGCATTCGACACATACAA-3’

脑膜炎奈瑟菌-P2：

5’-VIC-CGCTATTTTCTATGCAGCGCTTTCCTGTG-BHQ-3’

流感嗜血杆菌-F3：5’-TGCTGATCTTCAACAACGTTACAA-3’

流感嗜血杆菌-R3：5’-CAGCTGGCGTTGCATTTAAA-3’

流感嗜血杆菌-P3：

5’-CY5-TTCAAATCTTAGATGCGCACGCTGCA-BHQ-3’

RNP-F4：5’-CTGACCTGAAGGCTCTGC-3’

RNP-R4：5’-TGAATAGCCAAGGTGAGC-3’

RNP-P4：5’-ROX-GAGACAGCCGCTCACCTT-BHQ-3’。

7.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：

各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。

8.一种脑炎脑膜炎核酸分型检测方法，利用如权利要求1～7任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：

所述四重荧光定量PCR检测的扩增体系包括：PCR扩增试剂16μl、脑炎脑膜炎核酸检测试剂4μl、模板/阳性对照品/阴性对照品5μl。

10.根据要求8所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测方法，其特征在于，所述四重荧光定量PCR检测的反应条件包括：

延伸温度50℃条件下反应2分钟循环1次；

延伸温度95℃条件下反应5分钟循环1次；

延伸温度95℃条件下反应10s循环40次；

延伸温度55℃条件下反应40s循环40次。