IT202000016087A1

IT202000016087A1 - Metodo per la diagnosi in vitro di meningite e relativo kit diagnostico.

Info

Publication number: IT202000016087A1
Application number: IT102020000016087A
Authority: IT
Inventors: Marco Favaro; Carla Fontana
Original assignee: Univ Degli Studi Di Roma “Tor Vergata”
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2022-01-03

Description

Metodo per la diagnosi in vitro di meningite e relativo kit diagnostico

La presente invenzione riguarda un metodo per la diagnosi in vitro di meningite e relativo kit diagnostico. In particolare, la presente invenzione riguarda un metodo per la diagnosi in vitro di meningite in grado di rilevare, in un campione biologico, la presenza del DNA di tutti, di pi? di uno o di uno dei microrganismi scelti tra Neisseria meningitidis e suoi sierotipi, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Treponema pallidum e/o Cryptococcus neoformans e relativo kit diagnostico.

? noto che la sindrome meningitica pu? essere causata da un'ampia variet? di agenti infettivi, ma pu? essere anche una manifestazione ad eziologia non infettiva, ad esempio una risposta flogistica meningea pu? avvenire in risposta a neoplasie o a causa di malattie autoimmuni.

La meningite batterica ? l'infezione pi? comune del Sistema Nervoso Centrale. ? noto che l?infezione progredisce rapidamente, pu? causare danni permanenti, disabilit? di vario ordine e grado e pu? portare alla morte.

? questo il motivo per cui il solo sospetto di meningite in un paziente causa allarme e forti implicazioni emotive in tutto il personale sanitario coinvolto, dal medico di pronto soccorso al laboratorio chiamato alla diagnosi microbiologica. Proprio per quest?ultimo si pone la necessit? di un approccio metodologico basato sulla rapidit?, sulla accuratezza e soprattutto sulla scelta di sistemi che siano fortemente sensibili.

Ogni anno in Italia si verificano circa 900 casi di meningite batterica e, di questi, circa un terzo ? causato dal meningococco. A questo proposito si sta osservando una inversione di tendenza riguardo il gruppo prevalente di meningococco: il meningococco di gruppo B sta superando quello di gruppo C come responsabile di meningite, fatto probabilmente dovuto alla diffusione della vaccinazione verso il meningococco di gruppo C.

Un terzo dei casi di meningite batterica ? causato, invece, da pneumococco.

Il resto dei casi, per oltre la met?, ? dovuto a infezione da Haemophilus influenzae. In relazione a quest?ultimo, mentre in passato erano molto diffusi casi di meningite dovuti a H.influenzae tipo b, ceppo capsulato, recentemente sono stati segnalati vari casi causati da ceppi non capsulati. Ci?, probabilmente, ? il risultato della vaccinazione massiva della popolazione verso H.influenzae tipo b.

L'altra met? dei restanti casi (circa un sesto dei casi) ?, invece, causata da altri batteri quali: Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Cryptococcus neoformans. Sono meno frequenti, almeno in et? adulta, i casi di S. agalactiae. Infine, sono rari i casi di Treponema pallidum.

La meningite presenta una mortalit? importante dell?8-14%, in particolare nella sua forma fulminante. La mortalit? sale al 50% se non trattata tempestivamente, da qui l?emergenza di una diagnosi rapida.

Il contagio, in caso di N.meningitidis, avviene da persona a persona con contatti stretti, in ambienti affollati, poich? il batterio non riesce a sopravvivere nell'ambiente, n? in alimenti, in bevande o su oggetti. Pertanto, la prevenzione non si basa sulla disinfezione ambientale, perch? non v'? alcun rischio epidemico oltre al contatto stretto con i soggetti malati. In caso di contatto, lo sviluppo della malattia si pu? prevenire con l'apposita profilassi antibiotica.

In Italia, mentre sono rari gli episodi epidemici, sono pi? frequenti casi sporadici di meningite. Grandi epidemie di meningite sono, invece, ancora presenti in Africa, America latina e Asia, dove, in particolare, ? emergente un nuovo patogeno: Streptococcus suis, per via soprattutto della convivenza dei popoli locali con la popolazione suina.

La diagnosi precoce di meningite ? essenziale per la salute del paziente, poich? tanto pi? tempestiva ? la diagnosi e il relativo intervento terapeutico, migliori saranno le possibilit? di sopravvivenza, minori saranno i rischi di possibili sequele e le misure di profilassi pubblica saranno pi? efficaci.

Ad oggi la diagnosi di meningite si esegue mediante l?osservazione microscopica del liquor, coadiuvato dal test di agglutinazione al lattice, ai quali segue il test colturale.

Il test colturale viene effettato mediante una semina su terreni di coltura liquidi e solidi, quest?ultimi a media e bassa selettivit?. In particolare, all?arrivo in laboratorio il Liquor viene in parte seminato tal quale su mezzi di coltura liquidi. Questa fase di prearricchimento ? finalizzata ad aumentare la sensibilit? del metodo colturale, poich? la carica batterica, anche nelle meningiti franche, ? sempre molto contenuta: <1000 CFU/ml. La restante parte del Liquor viene citocentrifugato. Il citocentrifugato viene poi utilizzato per la semina sui terreni di coltura solidi (Mac Conkey Agar, Agar Cioccolato, Saboraoud destrosio Agar, Terreno selettivo per Listeria e Agar Sangue).

I test al lattice per la ricerca dei principali esoantigeni batterici (Neisseria A, B, C, Y W135, EcoliK1, S.agalactiae e S.pneumoniae eventuali test aggiuntivi per C.neoformans) si esegue sul liquor tal quale cimentando una goccia di liquor con una goccia degli antisieri corrispondenti. La presenza di un agglutinato indica la positivit?. Va detto che nessuna linea guida nazionale ed internazionale ne raccomanda l?utilizzo per via della scarsa sensibilit? ed affidabilit? del metodo.

Sia l?esame microscopico sia il test al lattice mostrano numerosi svantaggi, tra cui la scarsa sensibilit?. Inoltre, mediante il test al lattice, non ? possibile effettuare la diagnosi di meningiti causate da Listeria monocytogenes e Treponema pallidum. Il saggio al lattice pu?, inoltre, produrre risultati falsi positivi e falsi negativi.

La principale criticit? del metodo colturale risiede nella scarsa sensibilit? (circa 40%) inficiata ulteriormente dal fatto che spesso il paziente giunge all?osservazione gi? trattato con antibiotico (meningite decapitata). I risultati del test colturale infine, non sono disponibili prima di 24 ore. Tuttavia, il saggio colturale rimane il metodo di riferimento soprattutto per lo studio della farmaco-sensibilit? dei patogeni responsabili dell?infezione.

Ulteriori metodi di diagnosi di meningite ad oggi disponibili prevedono l?estrazione del DNA e sono basati sulla la curva di melting o sull?uso di sonde. Tuttavia, questi metodi sono caratterizzati da tempi di esecuzione lunghi e dall?utilizzo di target non comuni a tutti i microrganismi della meningite. Per la rivelazione dell?Haemophilus influenzae, ad esempio, i test noti sono per lo pi? basati sulla ricerca della presenza di geni target che codificano per la produzione della capsula. Tuttavia, esistono anche ceppi di Haemophilus influenzae privi di capsula che quindi non possono essere rilevati mediante i metodi disponibili ad oggi.

Alla luce di quanto sopra, appare evidente la necessit? di fornire nuovi metodi di diagnosi in vitro di meningite in grado di superare gli svantaggi dei metodi noti.

In questo contesto viene a inserirsi la soluzione secondo la presente invenzione, che si propone di fornire un metodo di diagnosi in vitro di meningite mediante il quale viene determinata la presenza di tutti batteri e lieviti noti come responsabili di meningite.

In particolare, secondo la presente invenzione ? stato messo a punto un saggio diagnostico in Real Time PCR che prevede l?uso di primers specifici in combinazione con l?utilizzo di sonde fluorescenti per l?identificazione nel liquor di microorganismi responsabili di meningite, quali Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Treponema pallidum e Cryptococcus neoformans (variante neoformans, grubii e gattii). Per la sola Neisseria meningitidis il metodo secondo la presente invenzione ? in grado di determinarne il sierotipo A, B, C, W, Y o X, fornendo cos? indicazioni utili circa l?efficacia e la protezione da parte dei vaccini nei soggetti vaccinati. Inoltre, secondo la presente invenzione, sono stati disegnati anche degli specifici primer e probe per la rivelazione della presenza di beta-actina al fine di valutare l?idoneit? del campione (ossia che il campione sia effettivamente un campione di origine biologica umana o che il campione non contenga sostanze che possano inibire la reazione di PCR).

Infine, il metodo secondo la presente invenzione prevede l?utilizzo di specifici primer e probe per la rivelazione della presenza di un target generico batterico, al fine di valutare l?eventuale presenza di microorganismi non rivelabili dalle sonde specifiche. Ci? permette di individuare anche le meningiti causate da patogeni diversi da quelli ricercati.

Il metodo secondo la presente invenzione risulta essere particolarmente vantaggioso rispetto a quelli attualmente noti, in quanto consente di diagnosticare con precisione la presenza dei microrganismi sopra menzionati responsabili della meningite e consente di farlo in tempi molto rapidi, ossia in un tempo inferiore a un?ora dall?arrivo del campione in laboratorio.

Il metodo secondo la presente invenzione presenta una maggiore specificit? e una maggiore sensibilit? rispetto ai metodi noti. I vantaggi della presente invenzione dipendono dal tipo di gene che si usa per il test (dal quale deriva la specificit? e in alcuni casi la sensibilit?), dalla combinazione dei fluorofori e dei quancher (dai quali derivano la sensibilit?), dalla lunghezza dell?amplificato dipendente dalla scelta dei primer (che contribuisce alla sensibilit?).

Il metodo secondo la presente invenzione consente la determinazione della presenza sia di ceppi di Haemophilus influenzae capsulati sia di ceppi di Haemophilus influenzae acapsulati.

Un ulteriore aspetto vantaggioso della presente invenzione ? che tale metodo non richiede necessariamente l?estrazione del DNA, ma pu? essere applicato direttamente sul campione di liquor tal quale.

La presente invenzione pu? prevedere l?uso di una Taq polimerasi ad alta processivit? con un tempo di attivazione minimo, in combinazione con specifici primers e probes, in un protocollo termico che, se applicato con la tecnologia che sfrutta i chip di silicio, consente la risposta in circa 45 minuti/30 minuti.

Pertanto, il metodo secondo la presente invenzione presenta i seguenti vantaggi:

? rapidit? di esecuzione;

? rapidit? di risposta;

? estrazione del DNA non necessaria;

? costi ridotti a causa del volume di reazione, che pu? essere ad esempio di 10 o 5 microlitri (tecnologia CHIP)

? rilevazione di numerosi possibili patogeni implicati nella meningite; e

? determinazione indiretta del sierotipo in caso di N. meningitidis.

Forma, pertanto, oggetto specifico della presente invenzione un metodo di diagnosi in vitro di meningite, detto metodo comprendendo rilevare, in un campione biologico, la presenza di tutti, pi? di uno o uno dei seguenti microrganismi: Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Treponema pallidum e/o Cryptococcus neoformans mediante rilevazione di tutte, pi? di una o una delle seguenti sequenze:

SEQ ID NO:1

GCAGAGATTCCAACGGTATATCGTGTGAATATGGCTGATGCGCATTCGCT ATTTTCTATGCAGCGCTTTCCTGTGAAGAATAAAGATGTATTGTATGTGTCGAAT GCGCCGTTGGCTGAAGTGCAGAAATTCTTGTCGTTTGTGTTCTCGC

per la rilevazione di Neisseria meningitidis;

SEQ ID NO:2 TGAAAAACTAAATTAAATTATCAAGAAATTACCCCCCAGGATAGGCGCCA AGAATATTATACCCACTTGATAATGGTAAGTTTTATGCTAAAAATGCAGTTTACT TGTAATAATGTTAAATATAGGGGGAAAGAAAGCGCTTTGACGACCTTTTGGACAA GTAGTAAGATACCAACATGGGCCCTGTAAATTAAAAATACTGCAGTAGAA

per la rilevazione di Streptococcus agalactiae;

SEQ ID NO:3 ATGAAAAAAACACTTGCAGCATTAATCGTTGGTGCATTCGCAGCTTCAGC AGCAAACGCGGCTGTTGTTTATAACAACGAAGGGACTAACGTAGAATTAGGTGGT CGTTTAAGCATTATC

per la rilevazione di Haemophilus influenzae;

SEQ ID NO:4 GGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAA TGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGTGTACCGGGCTTGCCTGGGAATGG TGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACG

per la rilevazione di Streptococcus pneumoniae; SEQ ID NO:5 TTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTA AATATGTATTTGCTAAAGCGGGTATCTCCCTTCCACGTACATCTGGCGCACAATA TGCTAGCACTACAAGAATTTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTC TTCGACTATGGTAGCGGAAT

per la rilevazione di Listeria monocytogenes;

SEQ ID NO:6 GACGTCAAACTGATCGAAGTCCCGGTTGAGTACATCGCAGGTAAAGTGGT TGCTAAAGACTATATTGATGAGTCTACCGGCGAGCTGATCTGCGCAGCGAACATG GAGCTGAGCCTGGATCTGCTGGCTAAGCTGAGCCAGTCTGGTCACAAGCGTATCG AAACGCTGTTCACCAACGATCTGGATCACGGCCCATATATCTCTGAAACC per la rilevazione di Escherichia coli;

SEQ ID NO:7 GGCATGTTCGATGCAGTTTCTCGCGCAACCCACGGGCATGGCGCGTTCCG TCAGCAATTTCAGTACGCGGTTGAGGTATTGGGCGAAAAGGTTCTCTCGAAGCAG GAGACCGAAGACAGCAGGGGAAGAAAAAAGTGGGAGTACGAGACTGACCCAAGCG TTACTAAGATGGTGCGTGCC

per la rilevazione di Treponema pallidum; e/o

SEQ ID NO: 8 GACGTCGGCTCGCCTTAAATGTGTTAGTGGGAAGGTGATTACCTGTCAGC CCGGCGTAATAAGTTTCGCTGGGCCTATGGGGTAGTCTTCGGCTTGCTGATAACA ACCATCTCTTTTTGTTTGACCTCAAATCAGGTAGG

per la rilevazione di Cryptococcus neoformans, come Cryptococcus neoformans var. grubii, Cryptococcus neoformans var.gattii e Cryptococcus neoformans var. neoformans.

Il metodo secondo la presente invenzione pu? essere vantaggiosamente applicato direttamente al campione biologico, come il liquido cefalorachidiano, senza dover procedere con l?estrazione del DNA.

La rilevazione di dette sequenze pu? essere condotta mediante una tecnica scelta nel gruppo che consiste in PCR, Real Time PCR e PCR end point.

In particolare, la rilevazione di dette sequenze pu? essere condotta mediante l?utilizzo di tutte, pi? di una o una delle seguenti coppie di primer:

primer forward: TTTCTATGCAGCGCTTTCCT (SEQ ID NO:9) primer reverse: GCGAGAACACAAACGACAAR (SEQ ID NO:10)

per la rilevazione di SEQ ID NO:1;

primer forward: CAGGATAGGCGCCAAGAAT (SEQ ID NO:11) primer reverse: TTTACAGGGCCCATGTTGGT(SEQ ID NO:12) per la rilevazione di SEQ ID NO:2;

primer forward: CAGCATTAATCGTTGYTGCAT (SEQ ID NO:13)

primer reverse: ACYTTAGTCCCTTCGTTGTT (SEQ ID NO:14)

per la rilevazione di SEQ ID NO:3;

primer forward: GCAGGATTTAACGGCTCACT (SEQ ID NO:15)

primer reverse: TACGCACTAGTGGCAAATCG (SEQ ID NO:16)

per la rilevazione di SEQ ID NO:4;

primer forward: GGTGGTAACGGACCAACTAC (SEQ ID NO:17)

primer reverse: TCACCAGGTTTTGCTTGAGA (SEQ ID NO:18)

per la rilevazione di SEQ ID NO:5;

primer forward: CGCAGGTAAAGTGGTTGCTA (SEQ ID NO:19)

primer reverse: CATTGGTGAACAGCGTTTCG (SEQ ID NO:20)

per la rilevazione di SEQ ID NO:6;

primer forward: GCGTTCCGTCAGCAATTTC (SEQ ID NO:21) primer reverse: ACTCCCACTTTTTTCTTCCCC (SEQ ID NO:22)

per la rilevazione di SEQ ID NO:7;

primer forward: TCGGCTCGCCTTAAATGTGT (SEQ ID NO:23)

primer reverse: AGACTACCCCATAGGCCCAG (SEQ ID NO:24)

per la rilevazione di SEQ ID NO:8.

Il metodo secondo la presente invenzione pu? comprendere ulteriormente l?utilizzo di tutte, pi? di una o una delle seguenti sonde:

sonda: TCGAATGCGCCGTTGGCTGAAGTGCA (SEQ ID NO:25) in combinazione con i primer SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10;

sonda: GGGGGAAAGAAAGCGCTTTGACG (SEQ ID NO:26) in combinazione con i primer SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12;

sonda: CGCAGCTTCAGCAGCAAAYGCRGCT (SEQ ID NO:27) in combinazione con i primer SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14;

sonda: CCGGGCTTGCCTGGGAATGGTGGCG (SEQ ID NO:28) in combinazione con i primer SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:16;

sonda: GGGAATCTCCCTTCCACGTACTTCTGGCGC (SEQ ID NO:29)

in combinazione con i primer SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18;

sonda: ACC GGC GAG CTG ATC TGC GCA GCG A (SEQ ID NO:30)

in combinazione con i primer SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20;

sonda: TTC TCT CGA AGC AGG AGA CCG AAG ACA G (SEQ ID NO:31)

in combinazione con i primer SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22;

sonda: ACC TGT CAG CCC GGC GTA AT (SEQ ID NO:32) in combinazione con i primer SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24.

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, quando ? rilevata la presenza di Neisseria meningitidis, detto metodo pu? comprendere ulteriormente rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis, ad esempio tra sierotipo A, B, Y, W, C o X.

In particolare, i sierotipi A, B, Y, W, C o X possono essere rilevati mediante la rilevazione delle seguenti sequenze:

SEQ ID NO:33 del gene sacC per la rilevazione del sierotipo A

TACATTGTATTATTCAATTATTATCGAATACAAATCAAGAGATACCTA CCTTTTGGGTTCAAGTAAAGGTGGCGTTGGCGCACTTCTACTCGGTCTTACATAT AATTATCCTAATATAATTATTAATGCTCCTCAAGCCAAATTAGCAGATTATATCA AAACACGCTCGAAAACCATTCTTTCATATATGCTTGGAACCTCTAAAAGATTTCA AGATATTAATTACGATTATATCAATG;

SEQ ID NO:34 del gene synD per la rilevazione del sierotipo B

TGGAAATAATCTTAATATTAAAGGATATATAGATCATTTTGACATATT GCATGTCCCCTTTCCTGAATATGCTAAAAAAATATTTAATGCAAAAAAATATAAC CGGTTTTTTGCGCATGCTGGAGGAATAAGCATTAATAATAACATTGCAAACTTAC AGAAAAAATATCAAATATCTAAATTTTTGTTAGTCAACGCTACCCCATTTCAGAT GATTTGTATTATAAGAG;

SEQ ID NO:35 del gene synF per la rilevazione del sierotipo Y

TTATTTAATGACATTCCAGAAAATGTTAGCTGCCGAAATATTCCTTTT TATTCTATCCATCAACAATTCTTCAAAGCCGAATACAGTGCCCACTATAAGCATG TTTTGATGAAAATTGAATCTTTATTATCTGAAGAAGATAGCATTATCTTCACTCA TCCTCTTCAACTGGAAATGTAT;

SEQ ID NO:36 del gene synG per la rilevazione del sierotipo W

TTTGCTGAAGAAGGACTGGATGTTCATTTAATTAATTTTGTTGGCAAT ATTACTGGAGCAGAGCATTTATACCCCCCATTCCACTTACATCCCAATGTCAAAA CCTCCAGCAGCATAGAT;

SEQ ID NO:37 del gene synE per la rilevazione del SIEROTIPO C CAACCTGCACACCTTTATGTTATGTCTTTTGCTGGGCATTATTCCTCT CTGCTCAGCTTAGCAAAAAAAATGAATATCACAACACATTTAGTAGAAGAGGGAA CCGCAACCTATGCCCCACTCTTAGAATCATTTACATACAAACCCACAAAATTTGA GCAACGTTTTGTGGGTAACAAC;

SEQ ID NO:38 del gene xcbC per la rilevazione del sierotipo X

AATGTTCCGATGATGATCCGGTTGGTTGTACGCATATTAAATTTATAACG AAACAACCTCGCACGATGGTTGGATTAGACGAAAAGCGTAATTATTTATACCTTG TCGTGATAGATGGCAGGCTGCCTAA.

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, i sierotipi A, B, Y, W, C o X possono essere rilevati mediante l?utilizzo delle seguenti coppie di primer:

primer forward: GTTCAAGTAAAGGTGGCGTTG (SEQ ID NO:39)

primer reverse: AAGAATGGTTTTCGAGCGTG (SEQ ID NO:40)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:33 del sierotipo A;

primer forward: ATTGCATGTCCCCTTTCCTG (SEQ ID NO:41)

primer reverse: TGAAATGGGGTAGCGTTGAC (SEQ ID NO:42)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:34 del sierotipo B;

primer forward: GCCGAAATATTCCTTTTTATTCT (SEQ ID NO:43)

primer reverse: TCCAGTTGAAGAGGATGAGT (SEQ ID NO:44)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:35 del sierotipo Y;

primer forward: TTGCTGAAGAAGGACTGGAT (SEQ ID NO:45)

primer reverse: ATCTATGCTGCTGGAGGTTT (SEQ ID NO:46)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:36 del sierotipo W;

primer forward: GTTATGTCTTTTGCTGGGCA (SEQ ID NO:47)

primer reverse: CGTTGCTCAAATTTTGTGGG (SEQ ID NO:48)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:37 del sierotipo C;

primer forward: ATCCGGTTGGTTGTACGCAT (SEQ ID NO:49)

primer reverse: GCCTGCCATCTATCACGACA (SEQ ID NO:50)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:38 del sierotipo X.

Il metodo secondo la presente invenzione pu? comprendere ulteriormente l?utilizzo delle seguenti sonde:

sonda: TGCTCCTCAAGCCAAATTAGCAGATT (SEQ ID NO:51) in combinazione con i primer SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:40;

sonda: TGCGCATGCTGGAGGAATAAGCA (SEQ ID NO:52) in combinazione con i primer SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42;

sonda: TCTTCAAAGCCGAATACAGTGCCCACT (SEQ ID NO:53) in combinazione con i primer SEQ ID NO:43 e SEQ ID NO:44;

sonda: ACCCCCCATTCCACTTACATCCCAATGTC (SEQ ID NO:54)

in combinazione con i primer SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46;

sonda: AGGGAACCGCAACCTATGCCCCACT (SEQ ID NO:55) in combinazione con i primer SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:48; e/o

sonda: ACAACCTCGCACGATGGTTGGA (SEQ ID NO:56) in combinazione con i primer SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:50.

Inoltre, il metodo secondo la presente invenzione pu? comprendere ulteriormente rilevare la presenza di beta-actina umana e/o di 16s rDNA.

In particolare, la rilevazione della beta-actina umana e/o di 16s rDNA pu? essere condotta mediante l?utilizzo delle seguenti coppie primer:

primer forward: AATGAGGCCAAGTGTGACTTT (SEQ ID NO:57)

primer reverse: ACCTGCACTCTGGGTAAGG(SEQ ID NO:58) opzionalmente in combinazione con la sonda: TGGCTGGGTTGGGGGCAGCAGAGGG (SEQ ID NO:59) per la rilevazione di beta-actina umana;

primer forward: TTGACGTTACCCGCAGAAGAA (SEQ ID NO:60)

primer reverse: GCTTGCACCCTCCGTATTACC(SEQ ID NO:61)

opzionalmente in combinazione con la sonda: CACCGGCTAACTCCGTGCCAGC (SEQ ID NO:62)

per la rilevazione di 16s rDNA.

Secondo il metodo della presente invenzione le sonde possono essere legate a un fluoroforo e a un quencher, ad esempio nelle combinazioni FAM--BHQ1, HEX-BHQ1, ROX-BHQ2, CY5-BHQ3 650, CY5.5-BHQ3650. Preferibilmente, sono usati fluorofori che abbiano il valore di QY pi? vicino a 1 e i quencher che abbiano la maggiore capacit? di assorbire l?energia emessa dal fluoroforo. Secondo la presente invenzione, sono stati usati i fluorofori che forniscono i migliori risultati in termini di emissione di fluorescenza che, tradotta nel test, significa migliore sensibilit?, ossia la possibilit? di rilevare quantit? minori di target. Analogamente sono stati usati i quencher BHQ specifici per i fluorofori utilizzati, ossia quelli che consentono l?abbattimento migliore del segnale del fluoroforo con il quale sono accoppiati. Le mix di primer e sonde possono comprendere un fluoroforo diverso per ciascun target, ad esempio cinque fluorofori diversi tra loro.

Secondo il metodo della presente invenzione, il campione biologico pu? essere scelto tra liquido cefalorachidiano tal quale, una coltura di microrganismi, DNA estratto da liquido cefalorachidiano o dalla coltura.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un kit per la diagnosi in vitro di meningite, detto kit comprendendo una o pi? coppie di primer, eventualmente in combinazione con sonde, per rilevare, in un campione biologico, la presenza di tutti, pi? di uno o uno dei seguenti microrganismi: Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Treponema pallidum e/o Cryptococcus neoformans mediante rilevazione di tutte, pi? di una o una delle seguenti sequenze:

SEQ ID NO:1 GCAGAGATTCCAACGGTATATCGTGTGAATATGGCTGATGCGCATTCGCT ATTTTCTATGCAGCGCTTTCCTGTGAAGAATAAAGATGTATTGTATGTGTCGAAT GCGCCGTTGGCTGAAGTGCAGAAATTCTTGTCGTTTGTGTTCTCGC

per la rilevazione di Neisseria meningitidis;

per la rilevazione di Streptococcus agalactiae;

per la rilevazione di Haemophilus influenzae; SEQ ID NO:4 GGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAA TGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGTGTACCGGGCTTGCCTGGGAATGG TGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACG

per la rilevazione di Listeria monocytogenes;

SEQ ID NO:6 GACGTCAAACTGATCGAAGTCCCGGTTGAGTACATCGCAGGTAAAGTGGT TGCTAAAGACTATATTGATGAGTCTACCGGCGAGCTGATCTGCGCAGCGAACATG GAGCTGAGCCTGGATCTGCTGGCTAAGCTGAGCCAGTCTGGTCACAAGCGTATCG AAACGCTGTTCACCAACGATCTGGATCACGGCCCATATATCTCTGAAACC

per la rilevazione di Escherichia coli;

per la rilevazione di Treponema pallidum; e/o

per la rilevazione di Cryptococcus neoformans, come Cryptococcus neoformans var. grubii, Cryptococcus neoformans var.gattii e Cryptococcus neoformans var.

neoformans.

Secondo la presente invenzione, dette una o pi? coppie di primer del kit possono essere scelte tra:

per la rilevazione di SEQ ID NO:1;

primer forward: CAGCATTAATCGTTGYTGCAT (SEQ ID NO:13)

primer reverse: ACYTTAGTCCCTTCGTTGTT (SEQ ID NO:14)

per la rilevazione di SEQ ID NO:3;

primer forward: GCAGGATTTAACGGCTCACT (SEQ ID NO:15)

primer reverse: TACGCACTAGTGGCAAATCG (SEQ ID NO:16)

per la rilevazione di SEQ ID NO:4;

primer forward: GGTGGTAACGGACCAACTAC (SEQ ID NO:17)

primer reverse: TCACCAGGTTTTGCTTGAGA (SEQ ID NO:18)

per la rilevazione di SEQ ID NO:5;

primer forward: CGCAGGTAAAGTGGTTGCTA (SEQ ID NO:19)

primer reverse: CATTGGTGAACAGCGTTTCG (SEQ ID NO:20)

per la rilevazione di SEQ ID NO:6;

per la rilevazione di SEQ ID NO:7;

primer forward: TCGGCTCGCCTTAAATGTGT (SEQ ID NO:23)

primer reverse: AGACTACCCCATAGGCCCAG (SEQ ID NO:24)

per la rilevazione di SEQ ID NO:8.

Inoltre, dette sonde possono essere scelte tra: sonda: TCGAATGCGCCGTTGGCTGAAGTGCA (SEQ ID NO:25) quando i primer sono SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10;

sonda: GGGGGAAAGAAAGCGCTTTGACG (SEQ ID NO:26) quando i primer sono SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12;

sonda: CGCAGCTTCAGCAGCAAAYGCRGCT (SEQ ID NO:27) quando i primer sono SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14;

sonda: CCGGGCTTGCCTGGGAATGGTGGCG (SEQ ID NO:28) quando i primer sono SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:16;

sonda: GGGAATCTCCCTTCCACGTACTTCTGGCGC (SEQ ID NO:29)

quando i primer sono SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18;

sonda: ACC GGC GAG CTG ATC TGC GCA GCG A (SEQ ID NO:30)

quando i primer sono SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20;

sonda: TTC TCT CGA AGC AGG AGA CCG AAG ACA G (SEQ ID NO:31)

quando i primer sono SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22;

sonda: ACC TGT CAG CCC GGC GTA AT (SEQ ID NO:32) quando i primer sono SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24.

Secondo la presente invenzione, il kit pu? comprendere ulteriormente primer e/o sonde per rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis, ad esempio tra sierotipo A, B, Y, W, C o X.

In particolare, detti primer e/o sonde del kit per rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis possono essere primer e/o sonde per la rilevazione delle seguenti sequenze:

SEQ ID NO:33 del gene sacC per la rilevazione del sierotipo A

SEQ ID NO:34 del gene synD per la rilevazione del sierotipo B

SEQ ID NO:35 del gene synF per la rilevazione del sierotipo Y

SEQ ID NO:36 del gene synG per la rilevazione del sierotipo W

SEQ ID NO:38 del gene xcbC per la rilevazione del sierotipo X

18) Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16-17, in cui detti primer per rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis sono scelti tra:

primer forward: GTTCAAGTAAAGGTGGCGTTG (SEQ ID NO:39)

primer reverse: AAGAATGGTTTTCGAGCGTG (SEQ ID NO:40)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:33 del sierotipo A;

primer forward: ATTGCATGTCCCCTTTCCTG (SEQ ID NO:41)

primer reverse: TGAAATGGGGTAGCGTTGAC (SEQ ID NO:42)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:34 del sierotipo B;

primer forward: GCCGAAATATTCCTTTTTATTCT (SEQ ID NO:43)

primer reverse: TCCAGTTGAAGAGGATGAGT (SEQ ID NO:44)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:35 del sierotipo Y;

primer forward: TTGCTGAAGAAGGACTGGAT (SEQ ID NO:45)

primer reverse: ATCTATGCTGCTGGAGGTTT (SEQ ID NO:46)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:36 del sierotipo W;

primer forward: GTTATGTCTTTTGCTGGGCA (SEQ ID NO:47)

primer reverse: CGTTGCTCAAATTTTGTGGG (SEQ ID NO:48)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:37 del sierotipo C;

primer forward: ATCCGGTTGGTTGTACGCAT (SEQ ID NO:49)

primer reverse: GCCTGCCATCTATCACGACA (SEQ ID NO:50)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:38 del sierotipo X.

Secondo la presente invenzione, dette sonde del kit per rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis possono essere scelte tra:

sonda: TGCTCCTCAAGCCAAATTAGCAGATT (SEQ ID NO:51) quando i primer sono SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:40;

sonda: TGCGCATGCTGGAGGAATAAGCA (SEQ ID NO:52) quando i primer sono SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42;

sonda: TCTTCAAAGCCGAATACAGTGCCCACT (SEQ ID NO:53) quando i primer sono SEQ ID NO:43 e SEQ ID NO:44; sonda: ACCCCCCATTCCACTTACATCCCAATGTC (SEQ ID NO:54)

quando i primer sono SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46;

sonda: AGGGAACCGCAACCTATGCCCCACT (SEQ ID NO:55) quando i primer sono SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:48; e/o sonda: ACAACCTCGCACGATGGTTGGA (SEQ ID NO:56) quando i primer sono SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:50.

Secondo una forma di realizzazione, il kit pu? comprendere ulteriormente primer e/o sonde per rilevare la presenza di beta-actina umana e/o di 16s rDNA.

In particolare, i primer per la rilevazione della beta-actina umana e/o di 16s rDNA possono essere scelti tra:

primer forward: AATGAGGCCAAGTGTGACTTT (SEQ ID NO:57)

primer forward: TTGACGTTACCCGCAGAAGAA (SEQ ID NO:60)

primer reverse: GCTTGCACCCTCCGTATTACC(SEQ ID NO:61)

per la rilevazione di 16s rDNA.

Secondo una forma di realizzazione, le sonde del kit possono essere legate a un fluoroforo e a un quencher, ad esempio nelle combinazioni FAM--BHQ1, HEXBHQ1, ROX-BHQ2, CY5-BHQ3 650, CY5.5-BHQ3 650.

Per necessit? tecnica legate ai limiti degli strumenti, le miscele di primer e sonde dovranno essere combinate in modo da sfruttare al massimo la possibilit? dello stesso di leggere tutti i colori disponibili. Ad esempio, nel caso di uno strumento che legga 5 fluorofori, le miscele saranno due o pi?.

Nel caso in cui non si abbia a disposizione un termociclatore che consenta la lettura simultanea di cinque fluorofori, il kit pu? essere assortito e suddiviso in pi? reazioni e quindi su pi? tubi (due o pi?).

Nella configurazione ottimale il kit prevede due miscele contenenti ognuna una miscela di primer e sonde per la determinazione di quattro target e un controllo. Per quanto riguarda la determinazione del sierotipo per la sola Neisseria meningitidis, questa si effettuer? solo sui campioni risultati positivi al test per la meningite.

La presente invenzione verr? ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo una sua forma preferita di realizzazione, con particolare riferimento ad esempi e alle figure dei disegni allegati, in cui:

- la Figura 1 mostra l?amplificazione di Neisseria meningitidis. Il test ? stato eseguito con sospensione di Neisseria.

- la Figura 2 mostra l?amplificazione di Haemophilus influenzae. Il test ? stato eseguito con sospensione di Haemophilus.

- la Figura 3 mostra la linearit? delle reazioni di amplificazione di Neisseria (quadrato) e di Haemophilus (triangolo);

- la Figura 4 mostra l?amplificazione di Cryptococcus neoformans; il test ? stato eseguito con sospensione di lievito;

- la Figura 5 mostra la linearit? della reazione di amplificazione di cryptococcus.

ESEMPIO 1: Identificazione di primer e sonde per la diagnosi in vitro di meningite mediante PCR multitarget.

In riferimento al materiale biologico di origine umana utilizzato in questo studio, si dichiara che per il tipo di studio riportato nel presente esempio non ? richiesta l?acquisizione del foglio informativo relativo al consenso informato, in quanto i campioni biologici in studio sono campioni destinati alla distruzione e anonimizzati, senza la possibilit? di risalire all?identit? del soggetto. Lo studio, inoltre, non riguarda il materiale biologico del paziente, ma i microrganismi in esso contenuti. Lo studio ? stato approvato dal Comitato Etico Indipendente (CEI) della Fondazione PTV (Policlinico Tor Vergata). I campioni sono stati raccolti in Italia presso il Policlinico Tor Vergata.

I primers e le sonde sono stati studiati allineando le sequenze fruibili in banca dati utilizzando il sito dell?NCBI all?indirizzo internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.

Per ogni target, la sequenza consensus https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/moleblast/moleblast.cgi ? stata usata per lo studio dei primers e delle sonde sul sito dell?NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast.

I primers e le sonde ritenuti validi sono stati controllati utilizzando l?allineamento delle sequenze sul sito https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/treeview/treeView.cg i.

Sequenze dei primers e delle sonde

Nelle tabelle 1, 2 e 3, sono riportate rispettivamente le sequenze dei primer forward (FWD), dei primer reverse (REW) e delle sonde (PROBE),secondo la presente invenzione, per la rilevazione dei microrganismi Neisseria meningitidis (NM), Streptococcus agalactiae (AGA), Haemophilus influenzae (HAE), Streptococcus pneumoniae (PNE), Listeria monocytogenes (LIS), Escherichia coli (COLI), Treponema pallidum (TP), Cryptococcus neoformans (CRYPT), della beta-actina umana (beta act Human) e del 16s rDNA (16 S). In tabella 4 sono riportate le sequenze dei primer forward (fwd), dei primer reverse (rew) e delle sonde (probe) per la rivelazione del sierotipo A, B, Y, W, C o X di Neisseria meningitidis. La R e la Y indicano che in quel punto la sequenza pu? mostrare una variazione in un nucleotide, la Y significa che in quel punto pu? essere presente una C o una T, mentre la R indica una G o una A.

Tabella 1

Tabella 2

Tabella 3

Tabella 4

I primers e le sonde sono stati suddivisi in due miscele in modo tale che i fluorofori fossero differenti in ciascuna miscela. Ad esempio, miscela 1: contenente i primer e le sonde sopra menzionate per i microrganismi NM, AGA, HAE, Coli e per il controllo beta actina; e miscela 2 contenente i primer e le sonde sopra menzionate per i microrganismi PNE, LIS, CRYPT, TP e per il controllo 16S.

Fluorofori e Quencher

Nella fase di studio delle marcature delle sonde (o probes) sono stati scelti, rispetto alle varianti disponibili per i vari gruppi di Fluorofori (o Reporter), quelli che offrivano le migliori garanzie di risposta, in termini di separazione del segnale, per garantire una migliore sensibilit?. Anche per la scelta dei quencher sono valide le stesse considerazioni e sono stati scelti specifici quencher per ottenere il miglior effetto di blocco del segnale in relazione al fluoroforo (Reporter) utilizzato. ? sempre possibile ottenere un analogo risultato, anche se in misura meno efficiente di quello progettato, utilizzando combinazioni di fluorofori e quencher diversi. Una lista dei possibili fluorofori (Reporter) secondo la presente invenzione ? riportata in tabella 5.

Tabella 5

I possibili Quencher utilizzabili sono i seguenti: Dabcyl- 400-550 nm

Eclipse- 390-625 nm

BHQ1- 480-580 nm

BHQ2- 520-650 nm

BHQ3- 620-730 nm

BBQ650- 550-750 nm

TAMRA- 520-600 nm

Le combinazioni di fluorofori e quencher usate negli esperimenti sono: FAM--BHQ1; HEX-BHQ1; ROX-BHQ2; CY5-BHQ3 650; CY5.5 BHQ3 650.

Reazione di amplificazione

La reazione a catena della polimerasi o PCR ? una tecnica di biologia molecolare che consente l?amplificazione di frammenti di acidi nucleici di cui si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente materiale genetico in grandi quantit?. Per allestire una Real time-PCR, sono necessarie diverse componenti, ovvero:

Tampone di Reazione (che pu? contenere a seconda delle diverse formulazioni: MgCl2, con concentrazione finale generalmente 3mM. KCl con concentrazione finale generalmente 50mM, Tris OH con concentrazione finale generalmente 10mM pH 8.3, Tween 20 con concentrazione finale generalmente 0,01%, dNTPs (dATP,dGTP,dTTP,dCTP) con concentrazione finale generalmente 0.6mM ciascuno e Taq DNA polimerasi 2U. Il tampone di reazione pu? essere preparato a partire dai singoli componenti o reperito in commercio alla concentrazione 2X.

Al tampone di reazione si aggiungono la coppia di primer o le coppie di primer e la sonda o le sonde, a seconda che si allestisca una single-target reaction o multiple-target reactions. La concentrazione dei primer e/o delle sonde per quanto riguarda i termociclatori che utilizzano piastre o provette ? stata stabilita sperimentalmente utilizzando varie concentrazioni dei primer e probe, scegliendo quelle che fornivano risultati migliori. Per l?applicazione del protocollo con tecnologia su chip di silicio, la concentrazione della miscela di primer e probe varia rispetto a quella utilizzata per i normali termociclatori e, anche in questo caso, ? stata valutata sperimentalmente.

In Tabella 6 ? riportata la diluizione dei primer per l?uso su termociclatore cfx96 Biorad.

Tabella 6

In tabella 7 ? mostrata la diluizione delle sonde per l?uso su termociclatore cfx96.

Tabella 7

Allo scopo di mantenere il pi? possibile uniforme la mix di reazione e di contrarre i tempi di realizzazione del test, si ? optato per l?uso di una master mix gi? pronta, che utilizzasse una Taq polimerasi termostabile ad alta velocit? con basso tempo di attivazione. Al momento della messa a punto del protocollo sono state provate le uniche due taq disponibili che presentassero le caratteristiche desiderate:

PCR BIOSYSTEMS

2x Qpcrbio Probe Mix Separate-ROX (www.pcrbio.com) KAPA PROBE FAST qPCR Kit

MasterMix(2X) Universal (www.kapabiosystems.com) 2X qPCRBIO probe mix Separate- ROX

Il protocollo ? stato studiato per la ricerca di batteri e lieviti responsabili di meningite sia mediante estrazione del DNA dal campione sia applicando direttamente il campione di LCR alla mix di reazione secondo i seguenti protocolli:

? Estrazione del DNA caso 1: se il campione e torbido o presenta tracce di sangue prelevarne 200 ?l e procedere secondo quanto descritto nel protocollo dell? L?EZ1 advanced XL della Quiagen con kit di estrazione TISSUE e protocollo (card) Bacterial. Eluire l?acido nucleico in 50?l;

? Estrazione del DNA caso 2: se il campione non mostra torbidit? evidente pellettare il campione per 2? a 6000g. Risospendere il pellett in 200 ?l di sol G1 fornita nel kit di estrazione TISSUE e procedere secondo quanto descritto nel protocollo dell?EZ1 Advanced XL della Quiagen con kit di estrazione TISSUE e protocollo (card) Bacterial. Eluire l?acido nucleico in 50?l.

Il kit ? stato testato anche per la ricerca diretta dei microorganismi su liquor senza procedere all?estrazione del DNA.

? Analisi diretta del campione caso 1: il campione di liquor ? torbido, 1ml di liquor viene centrifugato per 2? a 6000g, scartare tutto il sopranatante e risospendere il pellet in 200 ?l di PBS, 5 ?l si useranno per la reazione di amplificazione.

? Analisi diretta del campione caso 2: il campione di liquor non mostra torbidit? evidenti. Centrifugare il campione per 5? a 6000g, scartare tutto il sopranatante e risospendere il pellet in 25 ?l di PBS, usare 5 ?l per la reazione di amplificazione.

? Esecuzione del test ?meningo test? in Real-Time PCR

? ppMIX 1(primer probe Mix)

? la ppMIX 1 contiene la miscela di primer e probe secondo le [conc.] della Tabella 6 per l?identificazione di:

? N.menigitidis; S.agalactiae, H.influenzae;

T.pallidum; CI batterico(16s)

? ppMIX 2

? la ppMIX 2 contiene la miscela di primer e probe secondo le [conc.] della Tabella 6 per l?identificazione di:

? S.pneumoniae; L.monocytogenes, C.neoformans;

E.coli; CI umano(?actina)

Preparazione della MIX di reazione

il test prevede l?uso di due tubi di reazione: uno per la ppMIX 1 e uno per la ppMIX 2

campione estratto 5?l 5?l

Protocollo termico per la Real-Time PCR

1 95?C 1?.30? per un ciclo

2 95?C 3?

3 60?C 30? (lettura fluorescenza) per 35 cicli

Tempo di risposta 60?

Protocollo termico per la Real-Time PCR per l?utilizzo della tecnologia a chip di silicio

1 98?C 90?? per un ciclo

2 98?C 5?

3 60?C 20? (lettura fluorescenza) per 45 cicli

Tempo di risposta 39?

Lettura e interpretazione dei risultati

Il test ? valido se il campione mostra amplificazione nel canale della ?actina. Se nel canale della ?actina non ? presente il segnale e nessun canale mostra una amplificazione il campione non ? idoneo e non pu? essere refertato. Il campione ? negativo se ? presente il solo segnale nella ?actina.

Il test ? positivo quando oltre alla ?actina ? presente un segnale in uno dei target.

Il test ? positivo anche se in assenza della ?actina ? presente uno dei target.

Il segnale del CI 16s deve essere sempre presente in presenza di uno dei target.

Se il segnale del CI 16s ? presente da solo ma in presenza del segnale del CI ?actina il campione va interpretato come positivo per specie batterica diversa dai target.

Se il segnale del CI 16s ? presente da solo potrebbe essere indice di contaminazione del campione in questo caso il campione deve essere ripetuto o riprelevato.

Calcolo della sensibilit?

La valutazione della sensibilit? ? stata effettuata con due modalit?: una prima modalit? ha previsto l?utilizzo del DNA estratto dai vari target e una seconda modalit? ha previsto l?utilizzo di diluizioni scalari di una sospensione 0,5McFarland dei campioni target, ossia i campioni batterici che contengono singolarmente i microorganismi che devono essere identificati dal test.

Sebbene il test possa rivelare anche quantit? pari a 10 ufc (unit? formanti colonie) per reazione, la media del limite nel quale la reazione si mantiene lineare ? pari a: 20 ufc per N.meningitidis, 26 ufc per S.pneumoniae, 22 ufc per H.influenzae, 50 ufc per S.agalactiae, 60 ufc per L.monocitogenes 100 ufc per C.neoformans. Questo valore ? stato ottenuto nel modo seguente: sono state preparate due sospensioni (A e B) pari al valore 0,5 della scala McFarland di una coltura over-night (o.n.) dei batteri target. Dalla sospensione A ? stato estratto il DNA che ? stato quindi sottoposto a diluizioni scalari in base 10.

La sospensione B ? stata diluita fino a 10<-6>. La diluizione ? stata usata come controllo positivo e la media dei valori dei CT (ciclo soglia) (stabilita raccogliendo i valori dei CT nei differenti test) ? stata usata come parametro limite per indicare la positivit? o la negativit? del campione.

Specificit?

Le coppie di primers e le sonde sono state valutate mediante confronto in banca dati (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). I campioni sia positivi sia negativi sono stati testati sia con metodo colturale del liquor sia con test molecolare commerciale di altro tipo. I risultati del test molecolare e del test sono stati sempre concordi. Il confronto con il test colturale per entrambi i sistemi molecolari (quello dell?invenzione e quello eseguito in laboratorio per la diagnosi) ha dato a volte un risultato discordante, ossia il microrganismo rivelato con sistema molecolare risultava negativo al test colturale. In questo caso, la discrepanza era dovuta all?assunzione da parte del paziente di terapia antibiotica precedente il prelievo del liquor. Nessun campione negativo al test molecolare ha dato esito positivo alla coltura. Da quanto osservato confrontando i risultati ottenuti dal kit secondo la presente invenzione e quelli ottenuti sia con il metodo tradizionale colturale sia con quello molecolare in uso per la diagnosi, la specificit? per i vari target ? stata pari al 100%.

Controlli

Nella reazione sono stati inseriti anche due controlli fondamentali per la corretta esecuzione del test e per l?interpretazione dei risultati. Il sistema dei controlli interni permette, grazie alla presenza di due coppie di primer e due probe, di fornire informazioni sia sulla cosiddetta competenza del campione ad essere amplificato, sia sulla presenza di DNA umano nel campione. La positivit? del primo controllo (ossia dei primer e dei probe per la beta actina umana) indica:

? se sono presenti o meno inibizioni della reazione di amplificazione;

? se il campione contiene o meno DNA di origine umana;

? la presenza nel campione di leucociti, che nel caso di meningite infettiva debbono essere presenti.

Un secondo controllo ? diretto verso un gene housekeeping batterico (ossia 16s), la cui presenza indica se, in assenza di uno dei target ricercati, si ? comunque in presenza di una meningite batterica causata da un altro tipo di microrganismo.

La presente invenzione ? stata descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma ? da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims

RIVENDICAZIONI

1) Metodo di diagnosi in vitro di meningite, detto metodo comprendendo rilevare, in un campione biologico, la presenza di tutti, pi? di uno o uno dei seguenti microrganismi: Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Treponema pallidum e/o Cryptococcus neoformans mediante rilevazione di tutte, pi? di una o una delle seguenti sequenze:

per la rilevazione di Neisseria meningitidis;

per la rilevazione di Streptococcus agalactiae;

per la rilevazione di Haemophilus influenzae;

SEQ ID NO:4 GGGCAGGATTTAACGGCTCACTTTACCACTAGTATTCCTTTAAAAGGGAA TGTTCGTAATCTCTCTGTCAAAATTAGAGAGTGTACCGGGCTTGCCTGGGAATGG TGGCGTACGGTTTATGAAAAAACCGATTTGCCACTAGTGCGTAAGCGGACG per la rilevazione di Streptococcus pneumoniae; SEQ ID NO:5 TTCATGGGGTGGTAACGGACCAACTACATTTGATTGCTCTGGTTACACTA AATATGTATTTGCTAAAGCGGGTATCTCCCTTCCACGTACATCTGGCGCACAATA TGCTAGCACTACAAGAATTTCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTGATTTAGTATTC TTCGACTATGGTAGCGGAAT

per la rilevazione di Listeria monocytogenes;

per la rilevazione di Escherichia coli;

per la rilevazione di Treponema pallidum; e/o

2) Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta rilevazione di dette sequenze ? condotta mediante una tecnica scelta nel gruppo che consiste in PCR, Real Time PCR e PCR end point.

3) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui detta rilevazione di dette sequenze ? condotta mediante l?utilizzo di tutte, pi? di una o una delle seguenti coppie di primer:

per la rilevazione di SEQ ID NO:1;

primer forward: CAGCATTAATCGTTGYTGCAT (SEQ ID NO:13)

primer reverse: ACYTTAGTCCCTTCGTTGTT (SEQ ID NO:14)

per la rilevazione di SEQ ID NO:3;

primer forward: GCAGGATTTAACGGCTCACT (SEQ ID NO:15)

primer reverse: TACGCACTAGTGGCAAATCG (SEQ ID NO:16)

per la rilevazione di SEQ ID NO:4;

primer forward: GGTGGTAACGGACCAACTAC (SEQ ID NO:17)

primer reverse: TCACCAGGTTTTGCTTGAGA (SEQ ID NO:18)

per la rilevazione di SEQ ID NO:5;

primer forward: CGCAGGTAAAGTGGTTGCTA (SEQ ID NO:19)

primer reverse: CATTGGTGAACAGCGTTTCG (SEQ ID NO:20)

per la rilevazione di SEQ ID NO:6;

per la rilevazione di SEQ ID NO:7;

primer forward: TCGGCTCGCCTTAAATGTGT (SEQ ID NO:23)

primer reverse: AGACTACCCCATAGGCCCAG (SEQ ID NO:24)

per la rilevazione di SEQ ID NO:8.

4)Metodo secondo la rivendicazione 3, che comprende ulteriormente l?utilizzo di tutte, pi? di una o una delle seguenti sonde:

sonda: GGGAATCTCCCTTCCACGTACTTCTGGCGC (SEQ ID NO:29)

in combinazione con i primer SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18;

sonda: ACC GGC GAG CTG ATC TGC GCA GCG A (SEQ ID NO:30)

in combinazione con i primer SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20;

sonda: TTC TCT CGA AGC AGG AGA CCG AAG ACA G (SEQ ID NO:31)

in combinazione con i primer SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22;

5) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui, quando ? rilevata la presenza di Neisseria meningitidis, detto metodo comprende ulteriormente rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis, ad esempio tra sierotipo A, B, Y, W, C o X.

6)Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui i sierotipi A, B, Y, W, C o X sono rilevati mediante la rilevazione delle seguenti sequenze:

SEQ ID NO:33 del gene sacC per la rilevazione del sierotipo A TACATTGTATTATTCAATTATTATCGAATACAAATCAAGAGATACCTA CCTTTTGGGTTCAAGTAAAGGTGGCGTTGGCGCACTTCTACTCGGTCTTACATAT AATTATCCTAATATAATTATTAATGCTCCTCAAGCCAAATTAGCAGATTATATCA AAACACGCTCGAAAACCATTCTTTCATATATGCTTGGAACCTCTAAAAGATTTCA AGATATTAATTACGATTATATCAATG;

SEQ ID NO:34 del gene synD per la rilevazione del sierotipo B

SEQ ID NO:35 del gene synF per la rilevazione del sierotipo Y

SEQ ID NO:36 del gene synG per la rilevazione del sierotipo W

SEQ ID NO:38 del gene xcbC per la rilevazione del sierotipo X

7) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6, in cui i sierotipi A, B, Y, W, C o X sono rilevati mediante l?utilizzo delle seguenti coppie di primer:

primer forward: GTTCAAGTAAAGGTGGCGTTG (SEQ ID NO:39)

primer reverse: AAGAATGGTTTTCGAGCGTG (SEQ ID NO:40)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:33 del sierotipo A;

primer forward: ATTGCATGTCCCCTTTCCTG (SEQ ID NO:41)

primer reverse: TGAAATGGGGTAGCGTTGAC (SEQ ID NO:42)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:34 del sierotipo B;

primer forward: GCCGAAATATTCCTTTTTATTCT (SEQ ID NO:43)

primer reverse: TCCAGTTGAAGAGGATGAGT (SEQ ID NO:44)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:35 del sierotipo Y;

primer forward: TTGCTGAAGAAGGACTGGAT (SEQ ID NO:45)

primer reverse: ATCTATGCTGCTGGAGGTTT (SEQ ID NO:46)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:36 del sierotipo W;

primer forward: GTTATGTCTTTTGCTGGGCA (SEQ ID NO:47)

primer reverse: CGTTGCTCAAATTTTGTGGG (SEQ ID NO:48)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:37 del sierotipo C;

primer forward: ATCCGGTTGGTTGTACGCAT (SEQ ID NO:49)

primer reverse: GCCTGCCATCTATCACGACA (SEQ ID NO:50)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:38 del sierotipo X.

8) Metodo secondo la rivendicazione 7, che comprende ulteriormente l?utilizzo delle seguenti sonde:

sonda: ACCCCCCATTCCACTTACATCCCAATGTC (SEQ ID NO:54)

in combinazione con i primer SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46;

9) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, in cui detto metodo comprende ulteriormente rilevare la presenza di beta-actina umana e/o di 16s rDNA.

10) Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui la rilevazione della beta-actina umana e/o di 16s rDNA ? condotta mediante l?utilizzo delle seguenti coppie primer:

primer forward: AATGAGGCCAAGTGTGACTTT (SEQ ID NO:57)

primer forward: TTGACGTTACCCGCAGAAGAA (SEQ ID NO:60)

primer reverse: GCTTGCACCCTCCGTATTACC(SEQ ID NO:61)

per la rilevazione di 16s rDNA.

11) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4, 6 o 8, in cui dette sonde sono legate a un fluoroforo e a un quencher, ad esempio nelle combinazioni FAM--BHQ1, HEX-BHQ1, ROX-BHQ2, CY5-BHQ3 650, CY5.5-BHQ3650.

12) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il campione biologico ? scelto tra liquido cefalorachidiano tal quale, una coltura di microrganismi, DNA estratto da liquido cefalorachidiano o dalla coltura.

13) Kit per la diagnosi in vitro di meningite, detto kit comprendendo una o pi? coppie di primer, eventualmente in combinazione con sonde, per rilevare, in un campione biologico, la presenza di tutti, pi? di uno o uno dei seguenti microrganismi: Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Treponema pallidum e/o Cryptococcus neoformans mediante rilevazione di tutte, pi? di una o una delle seguenti sequenze:

per la rilevazione di Neisseria meningitidis;

per la rilevazione di Streptococcus agalactiae;

per la rilevazione di Haemophilus influenzae;

per la rilevazione di Listeria monocytogenes;

per la rilevazione di Escherichia coli;

per la rilevazione di Treponema pallidum; e/o

14) Kit secondo la rivendicazione 13, in cui dette una o pi? coppie di primer sono scelte tra:

per la rilevazione di SEQ ID NO:1;

primer forward: CAGCATTAATCGTTGYTGCAT (SEQ ID NO:13)

primer reverse: ACYTTAGTCCCTTCGTTGTT (SEQ ID NO:14)

per la rilevazione di SEQ ID NO:3;

primer forward: GCAGGATTTAACGGCTCACT (SEQ ID NO:15)

primer reverse: TACGCACTAGTGGCAAATCG (SEQ ID NO:16)

per la rilevazione di SEQ ID NO:4;

primer forward: GGTGGTAACGGACCAACTAC (SEQ ID NO:17)

primer reverse: TCACCAGGTTTTGCTTGAGA (SEQ ID NO:18)

per la rilevazione di SEQ ID NO:5;

primer forward: CGCAGGTAAAGTGGTTGCTA (SEQ ID NO:19)

primer reverse: CATTGGTGAACAGCGTTTCG (SEQ ID NO:20)

per la rilevazione di SEQ ID NO:6;

per la rilevazione di SEQ ID NO:7;

primer forward: TCGGCTCGCCTTAAATGTGT (SEQ ID NO:23)

primer reverse: AGACTACCCCATAGGCCCAG (SEQ ID NO:24)

per la rilevazione di SEQ ID NO:8.

15) Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-14, in cui dette sonde sono scelte tra:

sonda: TCGAATGCGCCGTTGGCTGAAGTGCA (SEQ ID NO:25) quando i primer sono SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10;

sonda: GGGAATCTCCCTTCCACGTACTTCTGGCGC (SEQ ID NO:29)

quando i primer sono SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18;

sonda: ACC GGC GAG CTG ATC TGC GCA GCG A (SEQ ID NO:30)

quando i primer sono SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20;

sonda: TTC TCT CGA AGC AGG AGA CCG AAG ACA G (SEQ ID NO:31)

quando i primer sono SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22;

16) Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-15, detto kit comprendendo ulteriormente primer e/o sonde per rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis, ad esempio tra sierotipo A, B, Y, W, C o X.

17) Kit secondo la rivendicazione 16, in cui detti primer e/o sonde per rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis sono primer e/o sonde per la rilevazione delle seguenti sequenze:

SEQ ID NO:33 del gene sacC per la rilevazione del sierotipo A

SEQ ID NO:34 del gene synD per la rilevazione del sierotipo B

SEQ ID NO:35 del gene synF per la rilevazione del sierotipo Y

SEQ ID NO:36 del gene synG per la rilevazione del sierotipo W

SEQ ID NO:37 del gene synE per la rilevazione del SIEROTIPO C

CAACCTGCACACCTTTATGTTATGTCTTTTGCTGGGCATTATTCCTCT CTGCTCAGCTTAGCAAAAAAAATGAATATCACAACACATTTAGTAGAAGAGGGAA CCGCAACCTATGCCCCACTCTTAGAATCATTTACATACAAACCCACAAAATTTGA GCAACGTTTTGTGGGTAACAAC;

SEQ ID NO:38 del gene xcbC per la rilevazione del sierotipo X

primer forward: GTTCAAGTAAAGGTGGCGTTG (SEQ ID NO:39)

primer reverse: AAGAATGGTTTTCGAGCGTG (SEQ ID NO:40)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:33 del sierotipo A;

primer forward: ATTGCATGTCCCCTTTCCTG (SEQ ID NO:41)

primer reverse: TGAAATGGGGTAGCGTTGAC (SEQ ID NO:42)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:34 del sierotipo B;

primer forward: GCCGAAATATTCCTTTTTATTCT (SEQ ID NO:43)

primer reverse: TCCAGTTGAAGAGGATGAGT (SEQ ID NO:44)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:35 del sierotipo Y;

primer forward: TTGCTGAAGAAGGACTGGAT (SEQ ID NO:45)

primer reverse: ATCTATGCTGCTGGAGGTTT (SEQ ID NO:46)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:36 del sierotipo W;

primer forward: GTTATGTCTTTTGCTGGGCA (SEQ ID NO:47)

primer reverse: CGTTGCTCAAATTTTGTGGG (SEQ ID NO:48)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:37 del sierotipo C;

primer forward: ATCCGGTTGGTTGTACGCAT (SEQ ID NO:49)

primer reverse: GCCTGCCATCTATCACGACA (SEQ ID NO:50)

per la rilevazione della sequenza SEQ ID NO:38 del sierotipo X.

19)Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16-18, in cui dette sonde per rilevare il sierotipo di Neisseria meningitidis sono scelte tra:

sonda: TCTTCAAAGCCGAATACAGTGCCCACT (SEQ ID NO:53) quando i primer sono SEQ ID NO:43 e SEQ ID NO:44;

sonda: ACCCCCCATTCCACTTACATCCCAATGTC (SEQ ID NO:54)

quando i primer sono SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46; sonda: AGGGAACCGCAACCTATGCCCCACT (SEQ ID NO:55) quando i primer sono SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:48; e/o sonda: ACAACCTCGCACGATGGTTGGA (SEQ ID NO:56) quando i primer sono SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:50.

20) Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-19, che comprende ulteriormente primer e/o sonde per rilevare la presenza di beta-actina umana e/o di 16s rDNA.

21) Kit secondo la rivendicazione 20 in cui i primer per la rilevazione della beta-actina umana e/o di 16s rDNA sono scelti tra:

primer forward: AATGAGGCCAAGTGTGACTTT (SEQ ID NO:57)

primer forward: TTGACGTTACCCGCAGAAGAA (SEQ ID NO:60)

primer reverse: GCTTGCACCCTCCGTATTACC(SEQ ID NO:61)

per la rilevazione di 16s rDNA.

22) Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-21, in cui dette sonde sono legate a un fluoroforo e a un quencher, ad esempio nelle combinazioni FAM--BHQ1, HEX-BHQ1, ROX-BHQ2, CY5-BHQ3 650, CY5.5-BHQ3 650.