CN110317902A - 人疱疹病毒ⅰ/ⅱ/ⅲ/ⅴ型核酸分型检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，所述试剂盒包括：病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。本发明引入了人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型特异性的多通道引物探针，既可减少工作量、又避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，还能实现同一体系多重同时检测四种病原体且各通道引物探针相互无干扰。本发明不仅首次公开了针对人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型分型检测的实时荧光定量PCR方法，同时具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而实现快速诊断是否感染疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型。本发明还提供了人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测的方法。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒及检测方法。
背景技术
疱疹病毒是一类具有包膜的DNA病毒，主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织。其感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感染的趋向，严重威胁人类健康。目前已知的人类疱疹病毒包括八种类型，分别为单纯疱疹病毒1型(人类疱疹病毒Ⅰ型)、单纯疱疹病毒2型(人类疱疹病毒Ⅱ型)、水痘带状疱疹病毒(人类疱疹病毒Ⅲ型)、EB病毒(人类疱疹病毒Ⅳ型)、巨细胞病毒(人类疱疹病毒Ⅴ型)、人类疱疹病毒Ⅵ型、人类疱疹病毒Ⅶ型、人类疱疹病毒Ⅷ型。
单纯疱疹(人类疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型，即HSV1和HSV2)属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180nm。根据抗原性的差别目前把该病毒分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型主要由口唇病灶获得，Ⅱ型可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触。从发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的50-90％，是最易侵犯人的一种病毒。
水痘带状疱疹病毒(人类疱疹病毒Ⅲ型，即VZV)是指在儿童初次感染引起水痘，恢复后病毒潜伏在体内，少数病人在成人后病毒再发而引起带状疱疹，故被称为水痘带状疱疹病毒。水痘是具有高度传染性的儿童常见疾病，好发于2-6岁，传染源主要是患者，患者急性期水痘内容物及呼吸道分泌物内均含有病毒。水痘带状疱疹病毒感染人有两种类型，即原发感染水痘和复发感染带状疱疹。健康儿童感染水痘常表现为罕见脑炎和肺炎并发症；成人水痘症状较严重，常并发肺炎，死亡率较高；有免疫缺陷的儿童和无免疫力的新生儿感染水痘，可能是一种致死性感染；如孕妇患水痘除病情严重外，并可导致胎儿畸形、流产或死亡。带状疱疹是成人、老年人或有免疫缺陷和免疫抑制患者常见的一种疾病，由潜伏病毒被激活所致。
巨细胞病毒(人类疱疹病毒Ⅴ型，即CMV)是一种疱疹病毒组DNA病毒，亦称细胞包涵体病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体。巨细胞病毒对宿主或培养细胞有高度的种特异性，人巨细胞病毒(HCMV)只能感染人，及在人纤维细胞中增殖。病毒在细胞培养中增殖缓慢，复制周期长，初次分离培养需30-40天才出现细胞病变，其特点是细胞肿大变圆，核变大，核内出现周围绕有一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。巨细胞病毒分布广泛，其他动物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。巨细胞病毒对人类的危害性很大，应积极预防其发生。
荧光定量PCR技术是一种传统的生物分子检测方法，具有高敏感、高特异、高准确性且能实现多重实时检测的优势，目前已被广泛用于核酸(DNA/RNA)分子检测。目前，涉及人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测的试剂主要有：
(1)一步法同时检EBV,CMV,HSV-6疱疹病毒的试剂盒及检测方法(CN201810172845.7)，其中EBV/CMV/HSV-6分别为人疱疹病毒Ⅳ/Ⅴ/Ⅵ型，检测方法为三重荧光定量PCR法；
(2)一步法同时检测HSV-1,HSV-2,VZV疱疹病毒的试剂盒及检测方法(CN201810172541.0)，其中HSV-1/HSV-2/VZV分别为人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型，检测方法为三重荧光定量PCR法；
(3)12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒及其应用(CN201510886216.7)，包括人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型检测，其检测方法为毛细管电泳法，操作较为繁琐、检测时间长、检测灵敏度低于荧光定量PCR法，且容易产生假阳性。
然而，在荧光定量PCR技术平台针对人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型的四重检测方法未见报道，因此，有必要利用该平台开发一种高敏感、高特异、高准确性的多重实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒，实现四重联合检测并区分人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种联合检测人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，实现多通道同时检测出待测标本中是否含人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型的病原体，实现快速、精确检测并对病毒进行定量，应用极为方便。
本发明引入了人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型特异性的多通道引物探针，既可减少工作量、又避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，还能实现同一体系多重同时检测四种病原体且各通道引物探针相互无干扰。本发明不仅首次公开了针对人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型分型检测的实时荧光定量PCR方法，同时具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而实现快速诊断是否感染疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型。基于此，本试剂盒适合感染性疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型大规模筛查及诊断的推广应用，具有广泛的应用前景。
为实现上述目的提供一种人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测方法及检测试剂盒，本发明采用了以下技术方案：
一种人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，所述试剂盒包括：病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。
优选地，所述病毒核酸快速提取试剂包含：pH为10.0的400mM Tris-HCl、体积比为5％Tween20、500mM异硫氰酸胍、40mM KCl、pH为8.0的4mM EDTA。
优选地，所述PCR扩增试剂包含：1.5×PCRbuffer、4mM MgCl2、pH为10.0的50mMTris-HCl、0.5mM dNTP、0.02U/μl DNA聚合酶、5wt％BSA。
优选地，所述人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂包含：人疱疹病毒Ⅰ型基因的扩增引物和探针、人疱疹病毒Ⅱ型基因的扩增引物和探针、人疱疹病毒Ⅲ型基因的扩增引物和探针、人疱疹病毒Ⅴ型基因的扩增引物和探针；
探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P4的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
引物探针序列为：
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人疱疹病毒Ⅱ型-R2：5’-GACATCCACGGGTTCCTG-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-P2：5’-VIC-CCTCCATCAACTTGACYCCCT-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-F3：5’-ACGCCTCGTTACTGCTCGC-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-R3：5’-TGGAGTCGCAACGACTCCA-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-P3：5’-CY5-ACCGTGCYCTACTCACGC-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-F4：5’-CGTGATGATGGACATTCAT-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-R4：5’-ACTCCTATCGGTCATCGGC-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-P4：5’-ROX-CCACGCTTAAACGAACGAC-BHQ-3’。
进一步的，各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
优选的，所述所述阳性对照品为：将人疱疹病毒Ⅰ型的特异性扩增片段、人疱疹病毒Ⅱ型的特异性扩增片段、人疱疹病毒Ⅲ型的特异性扩增片段和人疱疹病毒Ⅴ型的特异性扩增片段分别连接到四个pUC57质粒载体上，四个质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将四个稀释后的质粒等体积混合，作为最终的阳性对照。
优选的，所述阴性对照品为DEPC H2O。
本发明还提供了一种人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测方法，包括如下步骤：
S1、将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后直接用于PCR检测；
S2、以步骤S1中的混合物为模板，同时使用阳性对照品和阴性对照品，利用检测人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂进行四重荧光定量PCR检测：
S3、数据处理：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
在数据处理步骤中，根据实际情况分别调节FAM、VIC、CY5和ROX通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在3～15、End值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM和VIC通道的Ct值。
根据所得FAM和VIC通道的Ct值；进行：
S31、有效性判断：阴/阳性对照品检测结果需满足表1要求，否则，本次实验结果无效；
表1.阴/阳性对照品判读标准
| 荧光通道 | 阴性对照品 | 阳性对照品 |
| FAM通道 | 无Ct值 | Ct≤35 |
| VIC通道 | 无Ct值 | Ct≤35 |
| CY5通道 | 无Ct值 | Ct≤35 |
| ROX通道 | 无Ct值 | Ct≤35 |
S32、结果判读：
a.人疱疹病毒Ⅰ型阳性判读：FAM通道CT≤39。
b.人疱疹病毒Ⅱ型阳性判读：VIC通道CT≤39。
c.人疱疹病毒Ⅲ型阳性判读CY5通道CT≤39。
d.人疱疹病毒Ⅴ型阳性判读：ROX通道CT≤39。
e.人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型阴性判读：FAM通道/VIC通道/CY5通道/ROX通道CT＞39或CT无数值。
优选的，所述四重荧光定量PCR的扩增体系包括：
PCR扩增试剂16μl、人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂4μl、模板/阳性对照品/阴性对照品5μl。
步骤S2中四重荧光定量PCR的扩增体系如下表2所示。
表2.PCR扩增体系
优选的，所述四重荧光定量PCR的反应条件包括：
延伸温度50℃条件下反应2分钟循环1次；延伸温度95℃条件下反应5分钟循环1次；延伸温度95℃条件下反应10s循环40次；延伸温度95℃条件下反应40s循环40次。
步骤S2中四重荧光定量PCR的扩增程序如下表3所示。
表3.PCR扩增程序
本发明的有益效果在于：
1)本发明引入了人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型特异性的多通道引物探针，既可减少工作量、又避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，还能实现同一体系多重同时检测四种病原体且各通道引物探针相互无干扰。本发明不仅首次公开了针对人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型分型检测的实时荧光定量PCR方法，同时具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而实现快速诊断是否感染疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型。基于此，本试剂盒适合感染性疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型大规模筛查及诊断的推广应用，具有广泛的应用前景。
2)本发明公开的病毒核酸快速提取试剂使用了KCl，有利于引物退火，从而促进PCR扩增效率；同时使用了EDTA螯合剂，防止非特异扩增，增强PCR扩增特异性。
3)本发明开发的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂分别在人疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型的特异性靶标区域设计引物，既能高效、特异性地捕获目的序列，又能保证同一体系当中的四种引物探针对之间无相互干扰，保证在四重荧光定量PCR同时扩增的条件下每个荧光通道的扩增效率均不受其它通道的影响。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为依据本发明建立的多重荧光PCR方法对人疱疹病毒Ⅰ型阳性(HSV1)样本及阳性质粒的荧光通道检测结果。
图2为依据本发明建立的多重荧光PCR方法对人疱疹病毒Ⅱ型阳性(HSV2)样本及阳性质粒的荧光通道检测结果。
图3为依据本发明建立的多重荧光PCR方法对人疱疹病毒Ⅲ型阳性(VZV)样本及阳性质粒的荧光通道检测结果。
图4为依据本发明建立的多重荧光PCR方法对人疱疹病毒Ⅴ型阳性(CMV)样本及阳性质粒的荧光通道检测结果。
图5为FAM荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对1000、100、10、2、0TCID50/L浓度的人疱疹病毒Ⅰ型进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。
图6为VIC荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对500、100、10、5、0TCID50/L浓度的人疱疹病毒Ⅱ型进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。
图7为CY5荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对500、100、10、2、0TCID50/L浓度的人疱疹病毒Ⅲ型进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。
图8为ROX荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对200、50、10、0TCID50/L浓度的人疱疹病毒Ⅴ型进行扩增检测的结果，对应从A至D的扩增曲线。
图9为从人疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型疑似患者的20份临床样本中提取病毒DNA，用本发明荧光PCR方法进行检测的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是,在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
下列实施例中，采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1——一种人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒
一种利用实时荧光定量PCR检测人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型的试剂盒，包括：病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。其中：
(1)所述病毒核酸快速提取试剂包括裂解试剂，具体包含：Tris-HCl(pH10.0)、Tween20、异硫氰酸胍、KCl、4mM EDTA(pH8.0)，试剂配制方法如表4所示：
表4：病毒核酸快速提取试剂配方
(2)所述PCR扩增试剂包括PCRbuffer、MgCl2、Tris-HCl(pH10.0)、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、DNA聚合酶、BSA，试剂配制方法如表5所示：
表5：PCR扩增试剂配方
(3)所述人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂包括：人疱疹病毒Ⅰ型特异性的引物和探针、人疱疹病毒Ⅱ型特异性的引物和探针、人疱疹病毒Ⅲ型特异性的引物和探针、人疱疹病毒Ⅴ型特异性的引物和探针；
具体的，特异性引物和探针为：
人疱疹病毒Ⅰ型-F1：5’-CGCCAGCGCTCGCACTA-3’
人疱疹病毒Ⅰ型-R1：5’-CCGCGTGGTAATAGAAGCT-3’
人疱疹病毒Ⅰ型-P1：5’-FAM-ACGAAGTGCGAACCGCTTCG-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-F2：5’-ATGCGACTCATGRAGAACAG-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-R2：5’-GACATCCACGGGTTCCTG-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-P2：5’-VIC-CCTCCATCAACTTGACYCCCT-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-F3：5’-ACGCCTCGTTACTGCTCGC-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-R3：5’-TGGAGTCGCAACGACTCCA-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-P3：5’-CY5-ACCGTGCYCTACTCACGC-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-F4：5’-CGTGATGATGGACATTCAT-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-R4：5’-ACTCCTATCGGTCATCGGC-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-P4：5’-ROX-CCACGCTTAAACGAACGAC-BHQ-3’。
特异性的引物和探针配方如表6所示：
表6：人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂
(4)阳性对照品：人疱疹病毒Ⅰ型质粒、人疱疹病毒Ⅱ型质粒、人疱疹病毒Ⅲ型质粒、人疱疹病毒Ⅴ型质粒，各质粒用DEPC水稀释为10μg/μl的质粒溶液，作为人疱疹病毒的阳性对照，其配方如表7所示：
表7：阳性对照品配方
(5)阴性对照品：DEPC H2O；
其中，各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
实施例2——一种甲型流感病毒H8N7的检测方法
一种人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型的实时荧光PCR多重检测方法，包括以下实验步骤：
(1)主要试剂、仪器：采用实施例1中的试剂盒试剂；荧光定量PCR仪为ABI7500。
(2)标本准备：阳性标本为人感染疱疹病毒Ⅰ型滴定后灭活病毒、人感染疱疹病毒Ⅱ型滴定后灭活病毒、人感染疱疹病毒Ⅲ型滴定后灭活病毒、人感染疱疹病毒Ⅴ型滴定后灭活病毒，然后用DEPC水进行不同倍数的稀释，阴性对照标本为健康人的唾液拭子。
(3)RNA提取：将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液直接用于PCR检测。
(4)特异性PCR扩增：
a.引物和探针的设计：根据人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型的特异性序列分别设计特异性的引物和探针，其引物探针序列为：
人疱疹病毒Ⅰ型-F1：5’-CGCCAGCGCTCGCACTA-3’
人疱疹病毒Ⅰ型-R1：5’-CCGCGTGGTAATAGAAGCT-3’
人疱疹病毒Ⅰ型-P1：5’-FAM-ACGAAGTGCGAACCGCTTCG-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-F2：5’-ATGCGACTCATGRAGAACAG-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-R2：5’-GACATCCACGGGTTCCTG-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-P2：5’-VIC-CCTCCATCAACTTGACYCCCT-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-F3：5’-ACGCCTCGTTACTGCTCGC-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-R3：5’-TGGAGTCGCAACGACTCCA-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-P3：5’-CY5-ACCGTGCYCTACTCACGC-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-F4：5’-CGTGATGATGGACATTCAT-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-R4：5’-ACTCCTATCGGTCATCGGC-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-P4：5’-ROX-CCACGCTTAAACGAACGAC-BHQ-3’。
b.阳性对照：本方法中的阳性对照为人疱疹病毒Ⅰ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，人疱疹病毒Ⅱ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，人疱疹病毒Ⅲ型的特异性扩增片段连接到一个pU C57质粒载体上，人疱疹病毒Ⅴ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，四种质粒原液(100ng/μl)分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将四种稀释后的质粒按照1:1:1:1比例混合混合，最终作为本方法中的阳性对照。
c.PCR反应平台：总体积25μl的多重荧光PCR扩增体系中分别加入PCR扩增试剂16μl，人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂4μl，核酸标本5μl。。PCR扩增的反应条件为50℃孵育2min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火和延伸40s，40个循环。
d.数据处理：
反应结束后，根据实际情况分别调节FAM通道、VIC通道、CY5通道和ROX通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在3～15、End值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM和VIC通道的Ct值；
e.有效性判断：
阴/阳性对照品检测结果需满足表8要求，否则，本次实验结果无效。
表8阴/阳性对照品判读标准
| 荧光通道 | 阴性对照品 | 阳性对照品 |
| FAM通道 | 无Ct值 | Ct≤35 |
| VIC通道 | 无Ct值 | Ct≤35 |
| CY5通道 | 无Ct值 | Ct≤35 |
| ROX通道 | 无Ct值 | Ct≤35 |
f.结果判读：
a.人疱疹病毒Ⅰ型阳性判读：FAM通道CT≤39。
b.人疱疹病毒Ⅱ型阳性判读：VIC通道CT≤39。
c.人疱疹病毒Ⅲ型阳性判读CY5通道CT≤39。
d.人疱疹病毒Ⅴ型阳性判读：ROX通道CT≤39。
e.人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型阴性判读：FAM通道/VIC通道/CY5通道/ROX通道CT＞39或CT无数值。
(5)实验结果：
a.特异性检测结果：
如图1所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法分别针对人疱疹病毒Ⅰ型具有较好的特异性，人疱疹病毒Ⅰ型阳性(HSV1)样本及阳性质粒的FAM荧光通道检测结果显示阳性而VIC/CY5/ROX荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应；
如图2所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法分别针对人疱疹病毒Ⅱ型具有较好的特异性，人疱疹病毒Ⅱ型阳性(HSV2)样本及阳性质粒的VIC荧光通道检测结果显示阳性而FAM/CY5/ROX荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应；
如图3所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法分别针对人疱疹病毒Ⅲ型具有较好的特异性，人疱疹病毒Ⅲ型阳性(VZV)样本及阳性质粒的CY5荧光通道检测结果显示阳性而FAM/VIC/ROX荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应；
如图4所示，依据本发明建立的多重荧光PCR方法分别针对人疱疹病毒Ⅴ型具有较好的特异性，人疱疹病毒Ⅴ型阳性(CMV)样本及阳性质粒的ROX荧光通道检测结果显示阳性而FAM/VIC/CY5荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应。
b.灵敏性试验结果：
将已知高浓度的人疱疹病毒Ⅰ型的病毒原液分别稀释至1000、100、10、2、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测，如图5(FAM荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、2、0TCID50/L浓度的人疱疹病毒Ⅰ型进行扩增检测的结果，结果表明多重荧光PCR方法检测人疱疹病毒Ⅰ型的敏感性达到2TCID50/L；
将已知高浓度的人疱疹病毒Ⅱ型的病毒原液分别稀释至500、100、10、5、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测，如图6(VIC荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对500、100、10、5、0TCID50/L浓度的人疱疹病毒Ⅱ型进行扩增检测的结果，结果表明多重荧光PCR方法检测人疱疹病毒Ⅱ型的敏感性达到5TCID50/L；
将已知高浓度的人疱疹病毒Ⅲ型的病毒原液分别稀释至500、100、10、2、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测，如图7(CY5荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对500、100、10、2、0TCID50/L浓度的人疱疹病毒Ⅲ型进行扩增检测的结果，结果表明多重荧光PCR方法检测人疱疹病毒Ⅲ型的敏感性达到2TCID50/L；
将已知高浓度的人疱疹病毒Ⅴ型病毒原液分别稀释至200、50、10、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光PCR方法进行检测，
如图8(ROX荧光通道)所示，图中从A至D的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对200、50、10、0TCID50/L浓度的人疱疹病毒Ⅴ型进行扩增检测的结果，结果表明多重荧光PCR方法检测人疱疹病毒Ⅴ型的敏感性达到10TCID50/L。
c.临床样本的检测结果：从人疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型疑似患者的20份临床样本中提取病毒DNA，用本发明多重荧光PCR方法进行检测，结果如图9所示。其中，本发明方法检测出人疱疹病毒Ⅰ型阳性为3例(图中A至C的扩增曲线所示，FAM荧光通道)、人疱疹病毒Ⅱ型阳性为2例(图中D、E的扩增曲线所示，VIC荧光通道)、人疱疹病毒Ⅲ型阳性为2例(图中F、G的扩增曲线所示，CY5荧光通道)、人疱疹病毒Ⅴ型阳性为1例(图中H的扩增曲线所示，ROX荧光通道)。经测序确认，采用本发明多重荧光PCR方法检测该20份样本的阳性符合率为100％，由此可见，本发明方法具有高度准确性。
d.重复性检测结果：采用4例阳性样本(分别为人疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型阳性)，用本发明多重荧光PCR方法各重复检测6次检测，结果如表7所示，各样本重复6次检测结果CT值的CV＜1％(CV＝CT标准偏差÷CT平均值)，表明本依据本发明建立的多重荧光PCR方法的检测重复性较好。其中，CT值是扩增曲线的荧光信号达到阈值时所经历的循环数；CV值为变异系数，是衡量指标中各观测值变异程度的一个统计量，荧光PCR平台通常使用CT值的CV值来衡量检测重复性。
表7.人疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型核酸检测试剂的重复性检测结果
综上所述，本实施例中检测结果显示表明本发明方法的敏感性好、特异性高、重复性好且准确可靠。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。
2.根据权利要求1所述的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，其特征在于，所述病毒核酸快速提取试剂包括：
pH为10.0的400mM Tris-HCl、体积比为5％Tween20、500mM异硫氰酸胍、40mM KCl、pH为8.0的4mM EDTA。
3.根据权利要求1所述的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括：
1.5×PCR buffer、4mM MgCl2、pH为10.0的50mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、0.02U/μl DNA聚合酶、5wt％BSA。
4.根据权利要求1所述的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，其特征在于，所述人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂包括：
人疱疹病毒Ⅰ型基因的扩增引物和探针、人疱疹病毒Ⅱ型基因的扩增引物和探针、人疱疹病毒Ⅲ型基因的扩增引物和探针、人疱疹病毒Ⅴ型基因的扩增引物和探针；
探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P4的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
引物探针序列为：
人疱疹病毒Ⅰ型-F1：5’-CGCCAGCGCTCGCACTA-3’
人疱疹病毒Ⅰ型-R1：5’-CCGCGTGGTAATAGAAGCT-3’
人疱疹病毒Ⅰ型-P1：5’-FAM-ACGAAGTGCGAACCGCTTCG-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-F2：5’-ATGCGACTCATGRAGAACAG-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-R2：5’-GACATCCACGGGTTCCTG-3’
人疱疹病毒Ⅱ型-P2：5’-VIC-CCTCCATCAACTTGACYCCCT-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-F3：5’-ACGCCTCGTTACTGCTCGC-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-R3：5’-TGGAGTCGCAACGACTCCA-3’
人疱疹病毒Ⅲ型-P3：5’-CY5-ACCGTGCYCTACTCACGC-BHQ-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-F4：5’-CGTGATGATGGACATTCAT-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-R4：5’-ACTCCTATCGGTCATCGGC-3’
人疱疹病毒Ⅴ型-P4：5’-ROX-CCACGCTTAAACGAACGAC-BHQ-3’。
5.根据权利要求4所述的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，其特征在于：
各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
6.根据权利要求1所述的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括：
将人疱疹病毒Ⅰ型的特异性扩增片段、人疱疹病毒Ⅱ型的特异性扩增片段、人疱疹病毒Ⅲ型的特异性扩增片段和人疱疹病毒Ⅴ型的特异性扩增片段分别连接到四个pUC57质粒载体上，四个质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将四个稀释后的质粒等体积混合，作为最终的阳性对照。
7.根据权利要求1所述的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为DEPC H2O。
8.权利要求1～7所述的试剂盒用于人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后直接用于PCR检测；
S2、以步骤S1中的混合物为模板，同时使用阳性对照品和阴性对照品，利用检测人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂进行四重荧光定量PCR检测：
S3、数据处理：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
9.根据权利要求8所述的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测方法，其特征在于，所述四重荧光定量PCR的扩增体系包括：
PCR扩增试剂16μl、人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸检测试剂4μl、模板/阳性对照品/阴性对照品5μl。
10.根据权利要求8所述的人疱疹病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅴ型核酸分型检测方法，其特征在于，所述四重荧光定量PCR的反应条件包括：
延伸温度50℃条件下反应2分钟循环1次；
延伸温度95℃条件下反应5分钟循环1次；
延伸温度95℃条件下反应10s循环40次；
延伸温度95℃条件下反应40s循环40次。
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