CN102676694B - 一种羊口疮病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于病毒的分子生物学检测技术领域。本发明的羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒包括SEQ ID NO：1～2所示核苷酸序列的一对引物和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的TaqMan探针。本检测试剂盒能快速、准确检测出样品中的羊口疮病毒，且检测灵敏度高，取样简便，检测效率大大提高，并且能够有效防止污染。对进出口动物检验检疫领域中有较大的实际意义。

Description

一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种可以对羊口疮病毒进行早期快速诊断的羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

羊口疮（Orf），又称为羊传染性脓疱皮炎（contagious ecthyma），是由羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）引起的山羊和绵羊的一种急性接触性传染病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂为特征。ORFV主要感染山羊和绵羊，也可感染人和其它动物，是一种人畜共患性疾病，世界动物卫生组织规定的法定报告传染病。羊口疮在许多养羊国家分布广泛，在我国北方、西北等养羊较多的地方也较常见，是羊的主要疫病之一。由于病毒的抵抗力强，羊群一旦被感染则不易清除，可持续危害羊群多年，给畜牧业造成较大的经济损失。在羊群中，羊口疮病毒主要感染羔羊和小羊，其病死率比成年羊要高，国内外近年有不少相关的病例报道。而最近也有包括猫、驯鹿、骆驼、鬣羚等动物感染羊口疮病毒的报道，提示羊口疮病毒的宿主范围有所扩大。ORFV初次感染时皮肤损害经过大约6~8周逐渐恢复，留下结痂，而结痂就成为病毒存储场所，并可能污染周围环境。如果出现继发感染，病羊的死亡率会明显上升。

ORFV也能感染人，易感人群为经常接触病羊者，如饲养员、杀羊的屠夫和兽医等。病人通常出现手指，手掌或指关节处的丘疹，有时也会在脸部、嘴唇等其他部位发病。除局部损害外，偶尔也会有发热、乏力、淋巴结肿大等症状。病毒在人与人之间的传播目前还没有报道，但也不能完全排除其可能性。通常，皮肤损害经过4~12周左右逐渐减弱，最后在病变区留下疤痕。一般情况，病人症状都不太严重，并且疾病有很好的自限性。但也有个别免疫功能不全的病例会发生严重的损害。

由于ORFV在世界范围内分布广泛，具有典型的动物传染性，因此成为动物痘病毒里仅次于牛痘病毒的研究最为广泛的病毒。ORFV为双链DNA病毒，属于痘病毒科，脊椎动物痘病毒亚科，副痘病毒属。这个属的其他成员还包括小牛侵蚀性口炎病毒（bovine papular stomatitis virus，BPSV）和伪牛痘病毒（pseudocowpox virus，PCPV）等。ORFV的基因组全长约140kb，编码133个蛋白，大约80%左右的基因位于基因组中心位置相对保守，与其它痘病毒基因高度同源。病毒粒子呈砖形或椭圆形，其表面呈绳索样纵横交错排列结构，颗粒外面有一层膜，该病毒可在牛、绵羊、山羊的肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞内生长，并产生细胞病变。

对于受ORFV感染的动物，目前还没有特效的治疗药物。常用的处理措施是对损伤部位的局部清洗，并使用抗生素控制继发感染。在国内，会使用有去腐生肌、消炎止痛作用的中药辅助治疗羊口疮。而在国外，化疗药物也被用于治疗感染ORFV的人及动物。其中，西多福韦对多种痘病毒具有很强的对抗作用。它能减轻病羊的损伤程度和皮肤损伤持续时间，减少存在于皮肤损伤部位的病毒数量。最近有报道使用西多福韦/硫糖铝混合胶体喷洒药剂治疗感染ORFV的羊羔，但都不能彻底消除ORFV的重复感染现象，并且目前还没有很好的ORFV疫苗能够提供长时间有效的保护。

羊口疮目前还没有国际通用的诊断标准，主要根据典型的临床症状并结合实验室检查来诊断。诊断时需要与口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）和羊痘（Capripox）区分开来，有时还要与蓝舌病和细菌性疾病进行鉴别。由于缺乏有效的疫苗，症状上鉴别非常困难，因此，对于ORFV的感染防控形势还十分严峻，急需开发一种早期快速诊断羊口疮病毒感染的试剂盒。

目前所采用的实验室诊断，常用的包括PCR、ELISA、电镜，其他的还有组织病理学、免疫荧光、Western blotting、限制性片段长度多态性（RFLP）分析等等。但这些方法存在着一定的不足之处，这些建立起来的方法，相当一部分是针对细胞培养病毒液，很少直接将方法应用于病毒载量较低的临床样本检测，检测灵敏度较低，容易出现假阳性结果。病毒培养并进行病毒的全基因组序列测定，虽可以确定羊口疮病毒感染，但无法为临床诊断及时提供结果，且灵敏度较低。因此卫生部印发的《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》中推荐用实时荧光（Real-time）PCR方法进行检测，由于其方法学上具有简便快速、灵敏度和特异性高的特点，可以实现早期快速诊断。但目前国内外均尚未开发出检测羊口疮病毒实时荧光PCR试剂盒，因此开发该试剂盒成为当务之急。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术, 使用一种带有核电偶联装置（CCD）的PCR扩增仪, 通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。探针法实时荧光定量PCR技术是实时荧光PCR技术的一种，是一种直接快速检测DNA的方法，在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

与传统的PCR相比较，实时荧光PCR技术具有如下优点： 1、通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值（Ct）的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；2、具有更高的灵敏度，更低的检测限，对病毒的感染可以实现早期检测；4、由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；5、由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在DNA样品的检测和分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

我国食品与药品管理局（SFDA）已经批准了病原体的实时荧光PCR检测试剂盒的生产与临床应用。因此，通过实时荧光PCR方法开发一种检测ORFV的试剂盒在技术上是可行的，它的应用将极大满足ORFV快速检测与监测工作的需要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的一对引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针，TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基因，3’端标记有淬灭荧光基团。

众所周知，在使用已知的实时荧光PCR技术检测和定量分析样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计、筛选及制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明的引物和探针是根据羊口疮病毒ORFV024基因的保守区域 [ORFV NZ2病毒株基因组（GenBank accession No.DQ184476.1）23758bp-23844bp]设计的，用以定量检测样本中羊口疮病毒的核酸拷贝数。其中TaqMan探针的5’端标记优选为荧光报告基因FAM，3’端标记优选为淬灭荧光基团Tamara。

更具体一点，试剂盒中还包括PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品。

上述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，优选的试剂盒组成为：

TaqMan探针引物混合液1管：浓度为10μM 的SEQ ID NO:1所示引物和浓度为10μM 的SEQ ID NO:2所示引物，浓度为5μM的SEQ ID NO:3所示TaqMan探针，按体积比为1:1:1组成的混合液；

TaqMan Mix 1管：10×PCR反应缓冲液、25mM的dNTP和10U 的DNA聚合酶以及酶稀释液按体积比为25:4:5:1组成的混合液；

阳性质控品1管：浓度为0.5ng/μL的羊口疮病毒ORFV024基因片段样品；

阴性质控品1管：0.01M PBS；

无菌水1管。

上述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，实时荧光定量PCR反应体系为25μL，其中5μM的TaqMan探针1μL，10μM的上、下游引物各1μL，样品DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM的dNTP 0.4 μL，10 U DNA聚合酶0.5 μL，0.1μL酶稀释液，无菌水补足到25μL；或按照上述比例配制。其中DNA聚合酶优选中山大学达安基因股份有限公司的HotStar Taq酶。

一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，实时荧光定量PCR反应条件为： 95℃ 10min；95℃ 15s，58℃ 45s，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

上述使用方法，还包括先用不同稀释度的含羊口疮病毒ORFV024基因片段样品作为标准品进行实时荧光定量PCR，以ORFV024基因片段拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，再将待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测结果。

所述含羊口疮病毒ORFV024基因片段样品优选为含有ORFV024基因片段的质粒；所述ORFV024基因片段是以SEQ ID NO:4~5所示核苷酸序列为引物，以羊口疮病毒基因组DNA为模板扩增得到的。所述稀释浓度分别为：1.06×10⁸copies/μL（拷贝/微升）； ②1.06×10⁷copies/μL；③1.06×10⁶copies/μL；④1.06×10⁵copies/μL；⑤1.06×10⁴copies/μL；⑥1.06×10³copies/μL；⑦1.06×10²copies/μL；⑧1.06×10¹copies/μL；⑨1.06×10⁰copies/μL。

本发明的检测试剂盒可以应用于人体皮肤标本、动物皮肤结痂标本或其他生物制品中的羊口疮病毒检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1. 首次建立了以羊口疮病毒ORF024基因保守区域探针法实时荧光定量 PCR检测方法。目前国内尚未有羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂，国外有一些有关实时荧光定量PCR检测羊口疮病毒的报道，使用的检测靶序列选择ORFV 011(B2L)基因和DNA 聚合酶基因（Gallina L., Dal Pozzo F., Mc Innes C.J., Cardeti G., Guercio A., Battilani M., Ciulli S., Scagliarini A., 2006. A real time PCR assay for the detection and quantification of orf virus. J Virol Methods 134, 140-145；Bora D.P., Venkatesan G., Bhanuprakash V., Balamurugan V., Prabhu M., Siva Sankar M.S., Yogisharadhya R., 2011. TaqMan real-time PCR assay based on DNA polymerase gene for rapid detection of Orf infection. J Virol Methods 178, 249-252; Venkatesan G, Bhanuprakash V, Balamurugan V, Bora DP, Prabhu M, Yogisharadhya R, Pandey AB., 2012. Rapid detection and quantification of Orf virus from infected scab materials of sheep and goats. Acta Virol. 56, 81-83）在我们的发明中选择了不同的检测基因ORFV 024，该基因是最近发现具有NF-κB抑制作用的基因，最主要的是该基因与其它的痘病毒属病毒没有显著的同源性，与ORFV 011(B2L)基因和DNA 聚合酶基因相比对羊口疮病毒的检测具有更强的特异性，可以尽可能的避免假阳性结果。

2. 本检测试剂盒与羊口疮病毒的其它常规检测方法如病毒的分离培养鉴定、全病毒ELISA法和嵌套式PCR相比，具有灵敏度高，取样简便，检测效率大大提高，并且能够有效防止污染等特点。该试剂盒能快速、准确的检测出人和羊皮肤丘疹、水疱、脓疱和疣状结痂样品中的羊口疮病毒，对保障人类健康具有重要意义，本发明也可用于动物源性生物制品和实验室常用细胞培养物中外源性羊口疮病毒的污染监测，对控制人和动物源性相关生物制品的质量及进出口动物检验检疫领域中有着较大的实际意义，能够保证相关生物制品的质量，控制羊口疮病毒的传播和人民用药安全。

3. 本检测试剂盒及其使用方法不仅能够评价人和羊的羊口疮病毒感染状况，同时也为羊口疮病毒的流行病学、致病机理等相关领域的研究提供了依据。

4. 本检测试剂盒也可用于动物源性生物制品和实验室常用细胞培养物中外源性羊口疮病毒的污染监测，为生物制品的安全性检测提供了有效工具。

附图说明

图1 为10倍系列稀释pET21b-024质粒标准品的羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测扩增曲线。①1.06×10⁸copies/μL； ②1.06×10⁷copies/μL；③1.06×10⁶copies/μL；④1.06×10⁵copies/μL；⑤1.06×10⁴copies/μL；⑥1.06×10³copies/μL；⑦1.06×10²copies/μL；⑧1.06×10¹copies/μL；⑨1.06×10⁰copies/μL；⑩无菌水作为阴性对照。9份质粒阳性参考品中除了浓度为1.06×10⁰ copies/μL的标准质粒样品外Ct值大于33.0，可明确判定为阴性。其余样本均有明显阳性扩增。

图2为10倍系列稀释pET21b-024质粒标准品的羊口疮病毒的实时荧光定量PCR检测的标准曲线。横坐标为质粒的拷贝数，纵坐标为Ct值。该标准曲线的方程为y=-3.366 lgx+37.025，R ² 值为0.994，扩增效率为98.197%。

图3为羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测4份羊口疮病毒株的荧光扩增曲线。1为ORFV病毒ORFV-NA1/11株荧光扩增曲线；2为ORFV病毒ORFV-Nongan株荧光扩增曲线；3为ORFV病毒ORFV-Jilin株荧光扩增曲线；4为ORFV病毒ORFV-Fujian 1株荧光扩增曲线；5为牛痘病毒Tiantan株荧光扩增曲线； 6为绵羊痘病毒Nongan 株荧光扩增曲线；7为鸡痘病毒F2株荧光扩增曲线；8为鸡痘病毒F3株荧光扩增曲线；9为正常羊皮肤标本阴性对照扩增曲线，图中曲线5~9几乎重合。

具体实施方式

下面结合实施例进一步解释本发明，但不对本发明作任何限制，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均为常规实验步骤或Sambrook等人编著的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂生产商建议的条件实施。所用引物及Taqman探针合成以及所有序列的测定工作均委托上海英潍捷基贸易有限公司完成。

实施例1 用于对羊口疮病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物及Taqman探针的设计

参照GenBank收录的羊口疮病毒ORFV NZ2株基因组全序列（GenBank accession No.DQ184476.1），选择ORFV 024基因保守区域，即[ORFV NZ2病毒株基因组（GenBank accession No.DQ184476.1）23758bp-23844bp片段，采用ABI Primer Express 3.0 和Primer 5.0引物设计软件设计合成实时荧光定量PCR引物及探针。探针的5’端选择FAM作为荧光标记报告发光基团，3’端Tamara作为淬灭基团。

序列如下：

上游引物（ORFV-Forward primer）：5’-TCTGTGCATGCTCAAGATCCT -3’（序列表中SEQ ID NO:1）；

下游引物（ORFV-Reverse primer）：5’-GCCAAGTTGCAGGTTTTTCTT -3’ （序列表中SEQ ID NO:2）；

Taqman探针：5’-6Fam-ACCTGGCCGGCTTCATCCGC -Tamra-3’ （序列表中SEQ ID NO:3）。

实施例2 羊口疮病毒的实时荧光定量PCR检测

一、标准曲线的建立

1. 构建pET21b-ORFV024重组质粒

（1）克隆目的基因羊口疮病毒ORFV024基因

       严格按照要求在P2实验室负压生物安全柜内进行羊口疮病毒基因组DNA的提取。具体步骤为：无菌条件下收取羊口疮病毒感染的羊口唇部痂皮，碾钵碾磨后，生理盐水重悬粉末，取含有病毒的混悬液200μL，使用Roche High Pure Viral Nucleic Acid Kit（购自美国Roche公司） 按照说明书提取病毒基因组DNA。

PCR的反应体系为50μL，依次加入下列成分：5μL 10×PCR buffer（购自美国Promega公司），2.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP Mixture，1.25U Go Taq DNA聚合酶（购自美国Promega公司），0.6μM的上、下游引物，2μL病毒基因组DNA。

扩增引物序列如下：

上游引物（ORFV-Forward primer）：5’- AAGAATTCATGGCTTCCTACATC -3’（序列表中SEQ ID NO:4）

下游引物（ORFV-Reverse primer）：5’- ATAAGCTTCTACACGTAAACCGTGTG -3’ （序列表中SEQ ID NO:5）

PCR反应按照以下条件进行：95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 1min，共35个循环；72℃ 5min，扩增得到羊口疮病毒ORFV024基因片段（SEQ ID NO:6）：

（2）羊口疮病毒ORFV024基因重组质粒的构建

将上述步骤扩增的羊口疮病毒ORFV024基因片段用EcoR I 和HindⅢ内切酶（购自TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司）进行双酶切，酶切反应体系为20μL：EcoR I 1μL，HindⅢ1μL，10×H buffer 2μL，ORFV024基因片段1μg左右，灭菌水补至20μL。酶切反应按照以下条件进行：37℃反应3小时。

pET21b(＋)载体（购自美国Novagen公司）用EcoR I and HindⅢ内切酶（购自TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司）进行双酶切，酶切反应体系为20μL：EcoR I 1μL，HindⅢ1μL，10×H buffer 2μL，pET21b(＋)质粒1μg左右，灭菌水补至20μL。酶切反应按照以下条件进行：37℃反应3小时。

将经过双酶切的羊口疮病毒ORFV024基因片段和pET21b(＋)质粒进行连接，连接反应体系20μL：2× Rapid Ligation Buffer 5μL（TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司试剂盒），pET21b(＋)质粒0.5μL，ORFV024基因片段4μL，T4 DNA连接酶 0.5μL（5U/μL）。 连接反应按照以下条件进行：16℃反应过夜。

然后将连接产物热击转化至大肠杆菌E.coli Top10（购自TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司）中，涂布含有氨苄抗生素的LB平板，37℃过夜培养。将选定的含有阳性克隆的单菌落进行培养，提取质粒DNA，用限制性内切酶EcoR I 和HindⅢ酶切鉴定并测序。酶切结果获得了867bp的目的条带及pET21b(＋)质粒条带，与预期结果相符。测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含有目的基因的重组质粒，命名为pET21b-ORFV024。测定质粒浓度，计算拷贝数，结果拷贝数为1.06×10¹⁰copies/μL（拷贝/μL，下同），-20℃保存。

2. 标准品检测

将pET21b-ORFV024质粒DNA作为模板进行羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测，建立标准曲线。具体操作如下：将质粒DNA进行10倍系列稀释成①1.06×10⁸copies/μL； ②1.06×10⁷copies/μL；③1.06×10⁶copies/μL；④1.06×10⁵copies/μL；⑤1.06×10⁴copies/μL；⑥1.06×10³copies/μL；⑦1.06×10²copies/μL；⑧1.06×10¹copies/μL；⑨1.06×10⁰copies/μL；⑩无菌水(作为阴性对照)。每个稀释度重复平行试验3次。

标准品检测反应体系为25μL，依次加入下列成分：上、下游引物（浓度各10pM，序列如SEQ ID NO:1~2所示），TaqMan探针（浓度5pM，序列如SEQ ID NO:3所示），样品基因组DNA 1μL，无菌水 18μL，TaqMan Mix （10×PCR buffer，10mM dNTP，10 U HotStar Taq，酶稀释液，中山大学达安基因股份有限公司）3.5μL。

标准品检测反应条件为95℃ 10min；95℃ 15s，58℃ 45s，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。标准品探针法实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示。9份质粒阳性参考品中除了浓度为1.06×10⁰ copies/μL的标准质粒样品Ct值大于33.0，可明确判定为阴性。其余样本均有明显阳性扩增。

3. 标准曲线绘制

根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线（图2），该标准曲线的方程为y=-3.366 lgx+37.025，R²值为0.994，荧光定量PCR反应的扩增效率为98.197%。标准曲线显示：本发明建立的羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法有8个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法具有非常高的灵敏度。

二、羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测

1．羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法的特异性

选用以下生物材料为研究对象：羊口疮病毒ORFV-Jilin株、ORFV-NA1/11株、ORFV-Nongan株和 ORFV-Fujian1株以及牛痘病毒Tiantan株、绵羊痘病毒Nongan 株、鸡痘病毒F2株和F3株以及正常羊皮肤标本。

其中ORFV病毒ORFV-Nongan株由本实验室保存，参考文献：Li H, Ning Z, Hao W, Zhang S, Liao X, Li M, Luo S. Identification and characterization of monoclonal antibodies against the ORFV059 protein encoded by Orf virus[J]. Virus Genes. 2012; Jan 12. DOI: 10.1007/s11262-011-0710-9；

ORFV-Fujian1株、ORFV-NA1/11株和绵羊痘病毒Nongan 株由本实验室保存；

ORFV-Jilin株由吉林大学高峰教授惠赠，参考文献：Zhao K, Song D, He W, Lu H, Zhang B, Li C, Chen K, Gao F. Identification and phylogenetic analysis of an Orf virus isolated from an outbreak in sheep in the Jilin province of China [J]. Vet Microbiol 2010; 142:408-415.）；

牛痘病毒Tiantan株由南方医科大学董文其教授惠赠，参考文献：Dong W, Li M, Bi H, Li Y, Wu J, Qu L. Assessment of a vaccinia virus vectored multi-epitope live vaccine candidate for Plasmodium falciparum. Int J Parasitol. 2001; 31:57-62.）；

鸡痘病毒F2株和F3株由山东农业大学刘思当教授惠赠，参考文献：Wang G, Sun H, Yu Y, Wu Y, Lou B, Liu S. Identification of Fowlpox Virus (FPV) Integrated with Reticuloendotheliosisrus Virus(REV) Gene and Study on Pathology of Chickens Infected with REV-Integrated FPV. Sci Agric Sin 2009; 42:4077-4084.）。

以上生物材料公众可以从申请人处获得。

以上述病毒株和正常羊皮肤的基因组DNA为模板，进行羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测，评价反应系统的特异性，每份样本平行试验3次。本研究中Ct值大于33.0被视为阴性结果。

样本检测体系为25μL，依次加入下列成分：上、下游引物（浓度各10pM，序列如SEQ ID NO:1~2所示），TaqMan探针（浓度5pM，序列如SEQ ID NO:3所示），样品基因组DNA 1μL，无菌水 18μL，TaqMan Mix （10×PCR buffer，10mM dNTP，10 U HotStar Taq，酶稀释液，中山大学达安基因股份有限公司）3.5μL。

检测反应条件为：95℃ 10min；95℃ 15s，58℃ 45s，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

探针法实时荧光定量PCR检测特异性扩增曲线如图3所示。结果显示：以羊口疮病毒ORFV-Jilin 株、ORFV-NA1/11株、ORFV-Nongan株 和 ORFV-Fujian 1株基因组DNA为模板出现了目的荧光扩增曲线，而以牛痘病毒Tiantan株, 绵羊痘病毒Nongan株、鸡痘病毒F2株和F3株以及正常羊皮肤标本的基因组DNA为模板则没有出现目的荧光扩增曲线，结果说明：本发明用于对羊口疮病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针的特异性良好，定量反应体系特异性良好。

2．羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测方法最低检测限的确定

提取羊口疮病毒ORFV-Nongan株基因组DNA，测定其浓度为5ng/μL，进行10倍系列稀释成①5ng/μL；②500pg/μL；③50pg/μL；④5pg/μL；⑤500fg/μL；⑥50fg/μL；⑦5fg/μL；⑧0.5fg/μL。采用上述反应体系进行实时荧光定量PCR检测，每个稀释度重复平行试验3次。检测体系和反应条件同上所述。该检测方法的最低检测限为5fg，换算拷贝数为14copies/μL。

3、羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测方法的重复性分析

将含有羊口疮病毒ORFV024基因的重组质粒pET21b-ORFV024进行10倍系列稀释后作为模板（1.06×10⁸copies/μL ~1.06×10¹copies/μL），采用上述反应体系进行实时荧光定量PCR检测，每个稀释度重复平行试验3次，另外选择1.06×10⁷copies/μL、1.06×10⁵copies/μL、1.06×10³copies/μL三个浓度质粒进行实时荧光定量PCR检测，分3个批次进行，每次间隔5天，试验结果取平均Ct值，通过统计计算Ct标准差（SD）、Ct变异系数（CV）。重复性分析结果见表1：批内重复测定其变异系数CV值1.490±1.261%，批间重复测定CV值1.958±0.568%，均小于5%，达到检测试剂相关标准。以上结果说明本发明所建立的羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法的稳定性良好。

表1. 羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测方法的重复性试验结果

4. 羊口疮病毒临床标本的检测

分别从吉林农安、河南舞阳、福建南平三地采集了13例羊口疮病毒感染羊的皮肤脓疱和口唇部结痂样本，另外采集正常未感染羊的皮肤标本作为对照。按照前述方法分离病毒，提取基因组DNA为模板进行羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测，采用上述反应体系进行实时荧光定量PCR检测，每份样本平行试验3次。检测结果如表2所示， 结果显示：13例临床样本出现了目的荧光扩增曲线，均显示阳性结果，而正常未感染标本均为阴性结果。本研究中Ct值大于33.0被视为阴性结果。阳性结果用(+)表示，阴性结果用(-)表示。

表2. 临床样本的羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测结果

5．羊口疮病毒探针法实时荧光定量PCR检测试剂盒

将用于对羊口疮病毒进行实时荧光定量PCR检测ORFV 的TaqMan探针引物混合液（50μL/管）1管，TaqMan Mix （10×PCR buffer，dNTP，HotStar Taq，酶稀释液）175μL，阳性质控品（50μL/管）1管，阴性质控品（50μL/管）1管，以及无菌水共同包装，得到羊口疮病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒（50次反应）。

使用本试剂盒对已经分离鉴定的羊口疮病毒ORFV-Jilin株、ORFV-NA1/11株、ORFV-Nongan株和 ORFV-Fujian 1株以及牛痘病毒Tiantan株、绵羊痘病毒Nongan株、鸡痘病毒F2株和F3株以及正常羊皮肤标本进行检测，所得结果与本实施例二中1的结果一致。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南方医科大学

 

<120>  一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

tctgtgcatg ctcaagatcc t                                               21

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gccaagttgc aggtttttct t                                               21

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

acctggccgg cttcatccgc                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

aagaattcat ggcttcctac atc                                             23

 

 

<210>  5

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ataagcttct acacgtaaac cgtgtg                                          26

 

 

<210>  6

<211>  867

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

atggcttcct acatcagcgg cgctagcgcc agcgcgaaca ccgcccaggg cggcgattct     60

 

cagtacccac agtactatta tcacacacgc acctcccaag gcgacatccg cgacgaaagc    120

 

gaaggttgct tccacaccac ggacgacgag cacttggatc tgtccgacga ctacctcggc    180

 

gatggcgcac cacactgcgg acacagccac aaccacagtc gcagagatgg agatcggcac    240

 

cgccagcgcg caccgcggct ctatgaggac ccggtgcccg cgaacatcat ggtgcccacg    300

 

ctcagtctag agcagctgct ggaggaaacc tcggtcgcgg ggggccttct cggcggcagg    360

 

acagagaggg acgtggaaca gctcctggag gagttctccg cactctgtcc cggggaccag    420

 

atcaccgcgc tgcgctgcat ggcggcctcc ttttaccgcg acgcgctgtt cgcgccgtac    480

 

gcctgcatgc acctcatcgc cagtcggatg cgcgtgcact acgcgcgcga ggtcgtgcac    540

 

gtggccgagg acctcgcgga cgcgatgtct gcgaacagcg gcgtctgctt ccggcggtac    600

 

cgaaagcgcg tgctagagga catgctcgcg gaggagatgg gcgtgtacaa ttacctcgcg    660

 

cgcgccaacg cggacatctg cgaggacaac ctgctatcgg ccgtggagac gctgctgcgg    720

 

cgcttccgtc ggatgggctg ctaccgctct ctgtgcatgc tcaagatcct cgcgctgcag    780

 

cacgaggacc tggccggctt catccgccgc agcataagaa aaacctgcaa cttggcacac    840

 

gcgcgcacgc acacggttta cgtgtag                                        867

 

 

Claims (5)

1.一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的一对引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针，TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基因，3’端标记有淬灭荧光基团。

2.根据权利要求1所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述TaqMan探针的5’端标记的荧光报告基因为FAM，3’端标记的淬灭荧光基团为Tamara。

3.根据权利要求1所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒中还包括PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品。

4.根据权利要求3所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒组成为：

TaqMan探针引物混合液1管：浓度为5μM的TaqMan探针、浓度为10μM 的SEQ ID NO:1所示引物和浓度为10μM 的SEQ ID NO:2所示引物按体积比为1:1:1组成的混合液；

TaqMan Mix 1管：10×PCR反应缓冲液、25mM的dNTP和10U 的DNA聚合酶以及酶稀释液按体积比为25:4:5:1组成的混合液；

阳性质控品1管：浓度为0.5ng/μL的羊口疮病毒ORFV024基因片段样品；

阴性质控品1管：0.01M PBS；

无菌水1管。

5.根据权利要求3所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒实时荧光定量PCR反应体系为25μL，其中5μM的TaqMan探针1μL，10μM的上、下游引物各1μL，样品DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM的dNTP 0.4 μL，10 U DNA聚合酶0.5 μL，0.1μL酶稀释液，无菌水补足到25μL；或按照上述比例配制。