CN111996287A - 一种羊口疮病毒lamp可视化检测试剂盒 - Google Patents

一种羊口疮病毒lamp可视化检测试剂盒 Download PDF

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索朗达
四朗玉珍
巴贵
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Abstract

本发明涉及一种羊口疮病毒LAMP可视化检测试剂盒，所述试剂盒中的检测引物针对羊口疮病毒保守的VIR序列，能够特异性的检测羊口疮病毒；且采用恒温反应的检测手段，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖；该LAMP检测试剂盒可以实现羊口疮病毒的快速现场检测，检测结果可以直接目测，适合现场检测；所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的羊口疮病毒的基层检测手段。

Description

一种羊口疮病毒LAMP可视化检测试剂盒
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羊口疮病毒的LAMP可视化检测试剂盒。
背景技术：
羊口疮疾病是由羊口疮病毒引起的一种急性、接触性、嗜上皮性传染病。患病羊主要表现在口唇部严重溃烂、结痂，导致其采食困难，营养摄入不足，大大降低了成年山羊生产性能和羔羊的生长发育。羊口疮疾病是目前世界上流行最为广泛的病毒病之一，主要感染山羊、绵羊等小型反刍动物，调查发现羊口疮疾病的发病率在羔羊中高达 100%，由二次感染导致的死亡率也达到 15%，到目前为止，高的发病率与死亡率已经给养羊业带来了巨大的经济损失。但是由于羊口疮病毒独特的免疫逃避机制，反复感染特性以及当前市场上没有合适的治疗药物，疫苗生产又处于“有苗无货”的尴尬状态，羊口疮疾病的防治仍然是世界范围内的难题。羊口疮近年来在我国各地山羊养殖场发生的频度不断上升，给养殖业造成严重的的经济损失。但迄今为止，关于我国羊口疮疾病的流行病学特点还不甚清楚。
临床上，羊口疮病毒产生特征性损伤，依次是丘疹，水泡，脓包，结痂的形成。脓包的产生时间很短，且脓包的破裂会导致溃疡形成，伴随而行的就是厚层痂皮的形成。这些非典型个例身体部分的损伤在诊断时可能会产生混乱。同样，溃疡性损伤会与口蹄疫（FMD）混淆，尤其是在绵羊身上。在 2001 年发生在英国的一例疑似 FMD 的病例诊断中，羊口疮就是一个被考虑在内，这也暗示了实验室诊断的必要性。羊口疮感染同时也需要同山羊痘病毒感染区分开来，因为他们都产生相似的临床症状，偶尔也要与蓝舌病进行区分。根据临床症状能够很容易的诊断出来，然而，临床损害有时候会与其他病毒疾病比如口蹄疫（FMD），少数情况下的蓝舌病或者细菌病比如葡萄球菌性皮炎或者噬皮菌病。在这些情况下，实验室诊断是非常必要的。实验室检测经常用用到的方法包括：电镜观察，ELISA，细胞转染（CFT）和血清中和试验；感染组织的组织病理学；以及核酸检测，包括 PCR 和实时定量 PCR（RFLP）。发明专利申请CN201210123595.0公开了一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒；发明专利申请CN201610542627.9公开了一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重PCR检测引物，能够在1个反应体系中快速鉴定山羊痘病毒和羊口疮病毒，而且可以同时确定是否为这两种病毒混合感染，在临床样品快速筛检和疾病快速确诊等方面有重要的应用价值；发明专利申请CN201610397352.4公开了一种用于鉴别羊口疮病毒和羊痘病毒的二重PCR检测试剂盒。然而，以上核酸检测方法虽然能够实现羊口疮病毒的准确检测，但是其都是属于实验室检测手段，需要借助复杂的仪器和严苛的实验条件，并不适合大规模的流行病学调查和运用到基层单位的现场检测，例如乡镇一级或者县级的兽医检测通常不配备PCR或荧光定量PCR仪器和相关操作人员。发明专利申请CN201210183987.6公开了一种羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法，其利用犊牛睾丸原代细胞，通过羊口疮病毒的连续传代培养，获得的第六代细胞培养液作为原核克隆的模板，通过原核表达获得可溶性表达蛋白，其表达的蛋白作为包被抗原，制备羊口疮抗体检测试剂盒，通过分析确定羊口疮的流行病学特点，为羊口疮流行病学调查提供依据。发明专利申请CN201810805441.7公开了一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用，该检测方法中涉及一种试剂盒，所述试剂盒以ORFV-B2Ls表达蛋白为包被抗原，表达并纯化了可性的B2L蛋白表达，使其具有良好的生物学活性；可用于羊口疮病毒抗体的检测。以上免疫学检测手段虽然无需借助昂贵的核酸检测仪器，但是，其不能检测病毒本身，不能有效的区分病毒感染导致的血清学阳性还是由于疫苗接种导致的血清学阳性。因此，申请人针对羊口疮检测中存在的问题，开展了羊口疮病原的快速检测方法的多项研究，采用多种检测手段，旨在解决流行病学调查和基层检测中不方便的问题。
发明内容：
为了解决羊口疮病毒血清学检测方法不能区分病毒感染或是疫苗接种的情形，而常规核酸检测手段不便、对仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测等技术问题，本发明旨在提供一种羊口疮病毒LAMP可视化检测试剂盒，其中的LAMP检测引物针对羊口疮病毒保守的VIR序列，能够特异性的检测羊口疮病毒；且采用恒温反应的检测手段，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖；该LAMP检测试剂盒可以实现羊口疮病毒的快速现场检测，检测结果可以直接目测，适合现场检测；所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的羊口疮病毒的基层检测手段。
为了实现上述目的，本发明提供一种羊口疮病毒LAMP可视化检测试剂盒，所述试剂盒由HNB-LAMP Mix、Primer Mix、5M Betain、Bst DNA Polymerase、去离子水、阴性对照和阳性对照组成，所述Primer Mix包含SEQ ID No.1- SEQ ID No.6的引物组；
其核苷酸序列分别如下所示：
外引物：
ORFV-F3 AGAGGCTGGGTGCGATAC （SEQ ID NO:1）
ORFV-B3 GCAACGACCTTTCCGGATA（SEQ ID NO:2）
内引物：
ORFV-FIP ACCGCACTGACCGGGTTAAGAGCGACATCGACATCATGACT（SEQ ID NO:3）
ORFV-BIP TAGAGTTCTGCGAGACGCGTTC-GTGATGGTGCAGGTGAAGA（SEQ ID NO:4）
环引物：
ORFV-LF GCGCATCACGGAAGACTG（SEQ ID NO:5）
ORFV-LB TGGCGGCAAGGATCACT（SEQ ID NO:6）。
所述HNB-LAMP Mix、5M Betain、Bst DNA Polymerase均为购自海基生物科技有限公司的LAMP-HNB变色扩增试剂盒中的2×HNB LAMP Mix、5M Betain、Bst2.0 DNAPolymerase，货号：A3802。
所述外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:5:10。
所述阳性对照为含有目的基因VIR片段的质粒DNA，所述目的基因VIR片段的序列如SEQ ID No.7所示；所述阴性对照为去离子水。
本发明还涉及一种羊口疮病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品DNA；
（2）环介导等温扩增反应：配置25μL反应体系，所述反应体系含有HNB LAMP Mix 12.5μl，Primer mix 7.5μl，5M Betain 2 μl，模板DNA 2μl，Bst DNA Polymerase 1μl，总量25μl，然后于63-68℃下反应30-60min；
（3）结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变色，若呈现天蓝色判定为阳性，呈现紫罗兰色则判定为阴性。
所述方法可以用于诊断目的，例如羊场中羊口疮病毒的流行病学调查；也可以用于非诊断目的，例如羊口疮病毒的实验室确认，或者新鲜羊肉或羊血种是否存在病毒污染。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
第一，本发明基于LAMP技术特异性高的特点，所设计的引物仅能特异性扩增羊口疮病毒的基因组序列，且引物设计科学，避免了引物二聚体的形成，保证了反应的顺利进行。选取羊口疮病毒的保守基因序列VIR作为检测的目标基因，干扰素抗性基因 VIR 定位在ORFV 基因组的左边末端，编码单链 RNA 结合蛋白，此蛋白抑制 interferons 的抗病毒活性，该VIR基因高度保守，可以保证检测结果的准确性，避免漏检的出现。
第二，本发明的羊口疮病毒LAMP检测方法灵敏度高，最低检测极限是10拷贝阳性质粒DNA，高于现有技术报道的LAMP检测方法。
第三，操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要恒温水浴即可反应，反应条件温和；而且可以通过肉眼观察颜色变化判定检测结果，适合羊场或者基层检测单位的现场检测。
附图说明：
图1：阳性质粒验证图：M，Marker；2，PCR鉴定VIR片段。
图2：LAMP检测结果图： 1，质粒pUC57-VIR作为模板进行检测；2，检测去离子水；其中管1显示天蓝色，管2显示紫罗兰色。
图3：LAMP特异性试验结果图: 1，羊口疮病毒；2，山羊痘病毒核酸；3，小反刍兽疫病毒核酸；4，蓝舌病病毒核酸；5，口蹄疫病毒核酸；6，羊大肠杆菌核酸；7，羊沙门氏菌核酸；8，健康羊淋巴结核酸；其中管1显示天蓝色，管2-8显示紫罗兰色。
图4：LAMP灵敏度试验结果图: 1，质粒1×105拷贝/μL；2，质粒1×104拷贝/μL；3，质粒1×103拷贝/μL；4，质粒1×102拷贝/μL；5，质粒1×101拷贝/μL；6，质粒1×100拷贝/μL；7，羊口疮病毒核酸；8，检测去离子水；其中管1-5和7显示天蓝色，管6和8显示紫罗兰色。
具体实施方式：
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不局限于此。
实施例1：样品、引物设计和制备
（一）质粒及样品来源
根据Genebank上提供的羊口疮病毒VIR基因序列（GenBank: JN565697.1），选取其中的部分片段（SEQ ID No.7所示），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成质粒pUC57-VIR，溶解稀释至1.0×105拷贝/μL。
羊口疮病毒（ORFV）核酸，山羊痘病毒核酸、小反刍兽疫病毒核酸、蓝舌病病毒核酸、口蹄疫病毒核酸、羊大肠杆菌核酸、羊沙门氏菌核酸均由西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所提供。
健康羊淋巴结核酸提取物由北京康宝利华生物科技有限公司提供，所述健康羊是经血清学、PCR检测均为ORFV阴性的健康羊。
（二）阳性质粒的鉴定
采用本发明的外引物ORFV-F3、ORFV-B3对阳性质粒pUC57-VIR进行PCR扩增，验证质粒的正确性，结果表明，目的基因大小正确、电泳条带清晰、无杂带。结果如图1所示。
（三）ORFV LAMP 引物设计和筛选
根据Genebank公布的ORFV毒株VIR基因序列，通过http：// PrimerExplorer.jp设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示：
表1 羊口疮病毒ORFV LAMP检测引物组
引物名 序列（5’-3’）
ORFV-F3 AGAGGCTGGGTGCGATAC （SEQ ID NO:1）
ORFV-B3 GCAACGACCTTTCCGGATA（SEQ ID NO:2）
ORFV-FIP ACCGCACTGACCGGGTTAAGAGCGACATCGACATCATGACT（SEQ ID NO:3）
ORFV-BIP TAGAGTTCTGCGAGACGCGTTCGTGATGGTGCAGGTGAAGA（SEQ ID NO:4）
ORFV-LF GCGCATCACGGAAGACTG（SEQ ID NO:5）
ORFV-LB TGGCGGCAAGGATCACT（SEQ ID NO:6）
实施例2：羊口疮病毒LAMP检测试剂盒的建立
一种羊口疮病毒LAMP可视化检测试剂盒，所述试剂盒由HNB-LAMP Mix、Primer Mix、5MBetain、Bst DNA Polymerase、去离子水、阴性对照和阳性对照组成，所述Primer Mix包含表1中SEQ ID No.1- SEQ ID No.6的引物组。
所述HNB-LAMP Mix、5M Betain、Bst DNA Polymerase均为购自海基生物科技有限公司的LAMP-HNB变色扩增试剂盒中的2×HNB LAMP Mix、5M Betain、Bst2.0 DNAPolymerase，货号：A3802。
所述外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:5:10。
所述阳性对照为含有目的基因VIR片段的质粒DNA，所述目的基因VIR片段的序列如SEQ ID No.7所示；所述阴性对照为去离子水。
实施例3：羊口疮病毒的LAMP检测方法的建立
3.1 ORFV-LAMP反应体系的建立
根据实施例2的试剂盒，利用以上引物确定羊口疮病毒 LAMP 检测的25 μl反应体系中各组分的含量及比例，将其置于恒温容器中进行扩增。通过肉眼观察颜色变化，判断检测结果。其中25 μL反应体系如表2所示。
表2 25μl反应体系
名称 用量
HNB LAMP Mix 12.5 μl
引物 7.5 μl
5M Betain 2 μl
模板 DNA 2 μl
Bst DNA Polymerase 1 μl
总量 25 μl
将浓度为103拷贝的阳性质粒作为检测对象，经试验确定LAMP反应温度为64℃，最佳反应时间为35min。
结果表明在64℃的条件下反应35分钟，阳性质粒pUC57-VIR LAMP反应管呈现天蓝色，而检测去离子水则显示紫罗兰色（图2）。
实施例4 羊口疮病毒LAMP检测试剂盒的特异性试验
使用常规方法提取羊口疮病毒（ORFV）核酸，山羊痘病毒核酸、小反刍兽疫病毒核酸、蓝舌病病毒核酸、口蹄疫病毒核酸、羊大肠杆菌核酸、羊沙门氏菌核酸以及健康羊淋巴结核酸提取物作为模板，采用本发明研制的羊口疮病毒 LAMP检测试剂盒分别进行检测，观察其特异性。
实验结果表明，用该试剂盒检测山羊痘病毒核酸、小反刍兽疫病毒核酸、蓝舌病病毒核酸、口蹄疫病毒核酸、羊大肠杆菌核酸、羊沙门氏菌核酸以及健康羊淋巴结核酸提取物，结果全为阴性。检测已知羊口疮病毒（ORFV）核酸，结果为阳性。结果见表3、图3。
表3 ORFV LAMP的特异性测定
样品来源 样品种类 LAMP结果
西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所 羊口疮病毒（ORFV）核酸 阳性
西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所 山羊痘病毒核酸 阴性
西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所 小反刍兽疫病毒核酸 阴性
西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所 蓝舌病病毒核酸 阴性
西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所 口蹄疫病毒核酸 阴性
西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所 羊大肠杆菌核酸 阴性
西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所 羊沙门氏菌核酸 阴性
北京康宝利华生物科技有限公司 健康羊淋巴结核酸 阴性
实施例5 羊口疮病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度检测
羊口疮病毒阳性冻干质粒pUC57-VIR用去离子水将质粒充分溶解稀释到1×105个拷贝数，而后，将稀释到1×105拷贝/μl的质粒做10-0～10-5梯度稀释，分别对不同拷贝数的阳性质粒样本进行LAMP扩增和PCR扩增。结果显示，从10-1~10-4倍稀释的质粒溶液中均可扩增到预期的阳性，可测的质粒最低浓度为10拷贝/μl（见图5-6），而PCR检测的灵敏度为103拷贝/μL，相比而言，LAMP检测的灵敏度提高了100倍。对上述样品检测的灵敏度结果见表4和图4。
表4 LAMP检测实验样品的灵敏度检测结果
质粒pUC57-VIR稀释倍数（拷贝数个/μl） LAMP结果 PCR检测结果
质粒10<sup>-5</sup>（1×10<sup>0</sup>个） 阴性 阴性
质粒10<sup>-4</sup>（1×10<sup>1</sup>个） 阳性 阴性
质粒10<sup>-3</sup>（1×10<sup>2</sup>个） 阳性 阴性
质粒10<sup>-2</sup>（1×10<sup>3</sup>个） 阳性 阳性
质粒10<sup>-1</sup>（1×10<sup>4</sup>个） 阳性 阳性
质粒10<sup>-0</sup>（1×10<sup>5</sup>个） 阳性 阳性
实施例6：羊口疮病毒LAMP检测方法的灵敏度比较试验
在本发明研究过程中，对于引物进行了大量的优化工作，特别是环引物，研究发现，环引物对于LAMP检测的灵敏度具有重要的影响，以下表5为比较试验的方案：
表5 灵敏度比较试验设置
Figure DEST_PATH_IMAGE002
采用以上实施例5中“羊口疮病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度检测”的方法测定了本发明实施例1的引物以及以上对照组1-2的灵敏度，具体检测结果如下表6。
表6 LAMP检测实验样品的敏感性检测结果
拷贝数 10<sup>5</sup> 10<sup>4</sup> 10<sup>3</sup> 10<sup>2</sup> 10<sup>1</sup> 10<sup>0</sup>
实施例1 + + + + + -
对照1 + + + + - -
对照2 + + + + - -
可见，本发明所构建的羊口疮病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度为10拷贝/μl，其可测到的最小质粒数为10拷贝/μL。相比对照组的引物，本发明实施例1的引物组具有更高的灵敏度，对于羊场净化具有更重要的意义。
实施例7：临床检测试验
采用本发明的LAMP 检测方法对临床样品进行检测，对2016～2018 年西藏自治区的养羊场采集的150 份病料，应用本发明的羊口疮病毒LAMP检测试剂盒进行检测， 同时应用PCR 诊断方法进行检测。
LAMP 诊断方法检测150份病料中有96份为阳性，阳性率为64％。同时应用PCR 诊断方法（李前瑞，“羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立”，《动物医学进展》，2013,34（6）：36-38）进行检测，150份病料中有92 份为阳性，阳性率为61.3％，PCR检测的92份阳性样品，LAMP检测均为阳性；且对于LAMP检测为阳性，而PCR为阴性的样品采用ZL201210123595.0的荧光定量PCR方法进行检测，也同为阳性，表明本发明建立的LAMP检测试剂盒具有更高的灵敏度和准确性。
以上实施例是对本发明的进一步详细描述，给出实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
序列表
<110> 陕西诺威利华生物科技有限公司
西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种羊口疮病毒LAMP可视化检测试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> ORFV-F3(ORFV)
<400> 1
agaggctggg tgcgatac 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> ORFV-B3(ORFV)
<400> 2
gcaacgacct ttccggata 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> ORFV-FIP(ORFV)
<400> 3
accgcactga ccgggttaag agcgacatcg acatcatgac t 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> ORFV-BIP(ORFV)
<400> 4
tagagttctg cgagacgcgt tcgtgatggt gcaggtgaag a 41
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> ORFV-LF(ORFV)
<400> 5
gcgcatcacg gaagactg 18
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> ORFV-LB(ORFV)
<400> 6
tggcggcaag gatcact 17
<210> 7
<211> 213
<212> DNA
<213> ORFV-VIR(ORFV)
<400> 7
agaggctggg tgcgatacgc tcttcggcgg cgacatcgac atcatgactc agtcttccgt 60
gatgcgcctc aaaagtctta acccggtcag tgcggtcaac gagttctgta tgatgacgca 120
cagatctcta gagttctgcg agacgcgttc tggcggcaag gatcactgtc cgctcttcac 180
ctgcaccatc acgatatccg gaaaggtcgt tgc 213
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> LB(ORFV)
<400> 8
tggcggcaag gatcactgtc 20

Claims (6)

1.一种羊口疮病毒LAMP可视化检测试剂盒，所述试剂盒由HNB-LAMP Mix、Primer Mix、5M Betain、Bst DNA Polymerase、去离子水、阴性对照和阳性对照组成，所述Primer Mix包含SEQ ID No.1- SEQ ID No.6的引物组；
其核苷酸序列分别如下所示：
外引物：
ORFV-F3 AGAGGCTGGGTGCGATAC （SEQ ID NO:1）
ORFV-B3 GCAACGACCTTTCCGGATA（SEQ ID NO:2）
内引物：
ORFV-FIP ACCGCACTGACCGGGTTAAGAGCGACATCGACATCATGACT（SEQ ID NO:3）
ORFV-BIP TAGAGTTCTGCGAGACGCGTTC-GTGATGGTGCAGGTGAAGA（SEQ ID NO:4）
环引物：
ORFV-LF GCGCATCACGGAAGACTG（SEQ ID NO:5）
ORFV-LB TGGCGGCAAGGATCACT（SEQ ID NO:6）。
2. 根据权利要求1所述的羊口疮病毒LAMP可视化检测试剂盒，所述HNB-LAMP Mix、5MBetain、Bst DNA Polymerase均为购自海基生物科技有限公司的LAMP-HNB变色扩增试剂盒中的2×HNB LAMP Mix、5M Betain、Bst2.0 DNA Polymerase，货号：A3802。
3.根据权利要求1所述的羊口疮病毒LAMP检测试剂盒，所述外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:5:10。
4. 根据权利要求1所述的羊口疮病毒LAMP检测试剂盒，所述阳性对照为含有目的基因VIR片段的质粒DNA，所述目的基因VIR片段的序列如SEQ ID No.7所示；所述阴性对照为去离子水。
5.一种羊口疮病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品DNA；
（2）环介导等温扩增反应：配置25μL反应体系，所述反应体系含有HNB LAMP Mix 12.5μl，Primer mix 7.5μl，5M Betain 2 μl，模板DNA 2μl，Bst DNA Polymerase 1μl，总量25μl，然后于63-68℃下反应30-60min；
（3）结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变色，若呈现天蓝色判定为阳性，呈现紫罗兰色则判定为阴性。
6.根据权利要求5所述的方法，所述方法用于非诊断目的，例如羊口疮病毒的实验室确认，或者新鲜羊肉或羊血中是否存在病毒污染。
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