CN109487014B - 单纯疱疹病毒ii型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病原微生物的检测技术领域,尤其涉及单纯疱疹病毒II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法。发明以HSV基因组中反向重复序列RS1为靶标区域,一方面基因组内有2个拷贝,可进一步提高检测灵敏度,另一方面型间核酸相似度低,不易造成交叉反应。
Description
技术领域
本发明涉及病原微生物的检测技术领域,尤其涉及单纯疱疹病毒II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法。
背景技术
单纯疱疹是一种由单纯疱疹病毒所致的病毒性皮肤病,能引起人类多种疾病,如龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。
单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒科a病毒亚科,病毒质粒大小约180 纳米。根据抗原性的差别目前把该病毒分为I型(HSV-1)和II型(HSV-2)。 HSV-1主要由口唇病灶获得,HSV-2可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触,是最易侵犯人的一种病毒,但在临床仅有一部份发病。此病可分为:口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹、卡波西病等,有时也是脑膜炎、脑炎的病因。
HSV可通过胎盘感染,影响胚胎细胞分裂,造成流产、胎儿畸形、智力低下等先天性疾病,新生儿在通过HSV-2感染的产道时会被感染,出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变。必要的产检并且进行早期抗感染治疗,可以有效减少HSV-2患者将病毒传播给下一代。
HSV基因组为一线性DNA分子,由共价连接的长片段(L)和短片段(S) 组成,每片段均含有单一序列和反转重复序列,其中长片段单一序列分别为 UL1-UL56,另有2条命名为UL26.5和UL49A,长片段反转重复序列分别为RL1 和RL2,短片段单一序列分别为US1-US12,另有1条命名为US8A,短片段反转重复序列为RS1。基因组共编码70多种各异的蛋白质,其中除24种蛋白的特性还不清楚外,有18种编码蛋白组成病毒DNA结合蛋白及各种酶类,参与病毒DNA合成,包装及核苷酸的代谢等。30多种不同蛋白组成病毒结构蛋白(如衣壳蛋白、囊膜蛋白),在保护HSV的DNA,以及HSV的致病作用和诱导机体免疫应答中起重要作用。
目前,单纯疱疹病毒的检测方法主要有细菌的分离培养、免疫学诊断和分子生物学诊断,三种方法具有以下特点:
1)病毒分离培养是当今临床上明确诊断疱疹病毒感染的可靠依据。可采集皮肤、生殖器等病变部位的水疱液、脑脊液、角膜刮取物、唾液等标本,接种人二倍体成纤维细胞株WI38及其它传代细胞株如Vero、BHK等,经24~ 48小时后,细胞则出现肿胀、变圆、细胞融合等病变。病毒分离培养时间周期长、操作繁琐、需要专业操作人员和严苛的实验室条件,因此临床快速诊断方面应用很少。
2)免疫学诊断诊断还存在滞后性,不能准确反映当前是否感染或携带病原体,难以满足早期诊断的要求。
3)病原体核酸检测:具有快速、准确、检测窗口短、高灵敏度等优点,能够对病原物作出早期诊断,给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。
其中实时定量PCR检测平台已成为最简捷和可靠的核酸检测方法,在目前国内外的核酸诊断中应用最为广泛,检测原理为,检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸,当探针完整时,由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光,引物延伸时,与模板结合的探针被 Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断,报告基团与淬灭基团分离,产生荧光信号。在每次PCR循环中,都有新的报告基团被剪切,因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比,可实时监控扩增情况。
目前产品大部分采取针对HSV-1/HSV-2单一的荧光定量PCR检测方法,必须对一个临床样本进行分管检测,才能分别得出结论,增加了检测成本和操作繁琐度。国内外已有大量报道,介绍HSV-1/HSV-2核酸分型检测,应用到的靶标主要包括:糖蛋白G(US4,核酸相似度78.4%)、糖蛋白J(US5,核酸相似度69.8%)、糖蛋白D(US6,核酸相似度79.2%)、糖蛋白I(US7,核酸相似度69.6%)、糖蛋白E(US8,核酸相似度67.3%)、糖蛋白B(UL27,核酸相似度77.3%)、DNA聚合酶(UL30,核酸相似度89.1%;UL42,核酸相似度76.6%)、胸苷激酶(UL23,核酸相似度79.9%)等。以上靶基因均为单拷贝,由于丰度不足,在检测过程中易造成漏检。而由于两种HSV型间核酸相似度均在65%以上,甚至有些基因的相似度高达80%~90%。HSV-1与 HSV-2两者之间的高相似度,造成了对HSV分型检测的困难。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供单纯疱疹病毒II 型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法。
本发明提供了RS1片段作为HSV-2病毒检测标志物的应用。
HSV的RS1片段在基因组中共有2个拷贝,且该片段在HSV-1和HSV-2 之间存在着较大的差异(核酸相似度58.1%)。本发明对HSV-2进行检测的特异性靶基因片段序列为:GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCAGACGAGG AGGCGGATGCAGACGAGGAGGAGGAGGCGGAGGAGGAGGCGGAGGACGCCGACGACGAGGATCCGGATTTTGATGAGTCAGAGGCGGCCGAG(SEQ ID NO.7)。
本发明提供了HSV-2病毒检测试剂盒,其包括:SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的2条引物。
本发明所述的试剂盒中,还包括SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针。
本发明所述的引物和探针针对RS1片段设计,具有良好的准确性、灵敏度、特异性,即便在同一个扩增体系中进行检测,也能够良好的区分HSV的 I型和II型。其最低检测限可达5拷贝。
本发明所述的探针的荧光报告基团选自FAM、JOE或HEX或VIC、ROX、 CY3或CY5、Texas Red;荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1、 MGB和TAMRA。本发明实施例中,所述HSV-2病毒检测探针的荧光基团为 FAM,淬灭基团为BHQ1。
本发明所述的试剂盒中,还包括荧光定量PCR检测试剂和/或样本提取试剂;
所述荧光定量PCR检测试剂包括qPCR Master Mix酶混合液、qPCR Master Mix反应缓冲液;
所述样本提取试剂包括NaOH、TritonX-100和TE缓冲液。
所述qPCR Master Mix酶混合液,包括Taq酶和UNG酶,所述的Taq酶为AnstartTaqDNA聚合酶,所述的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。
所述样本提取液包括NaOH终浓度为0.01%~0.5%,优选为0.1%。
所述样本提取液包括TritonX-100终浓度为0.01%~0.5%,优选为0.1%。
进一步的,所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。
本发明的阴性对照品为DEPC水。
本发明的阳性对照品为含有HSV-2靶基因片段的质粒溶液。所述HSV-2 特异性靶基因片段序列为:GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCAGACGAGGAG GCGGATGCAGACGAGGAGGAGGAGGCGGAGGAGGAGGCGGAGGACGC CGACGACGAGGATCCGGATTTTGATGAGTCAGAGGCGGCCGAG(SEQ ID NO.7)。作为优选的,含有HSV-2靶基因片段的质粒溶液浓度为10000拷贝/μL,对应的Ct值在23左右。
进一步的,所述试剂盒中,还包括内参引物和探针。本发明采用的内参基因为HBB,所述HBB特异性靶基因片段序列为:TCTGACTCCTGAGG AGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAG TTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATG(SEQ ID No.8)。针对HBB的引物包括:SEQ ID NO:4~5所示核苷酸序列的2条引物。针对HBB的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。HBB-P探针荧光基团为ROX,猝灭基团为 BHQ1。
本发明提供了检测HSV-2病毒的方法,其包括:SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的2条引物和SEQ ID NO:3所示的探针对待测样品DNA进行实时荧光定量PCR检测,产生S型扩增曲线则为阳性。
所述实时荧光定量PCR的体系包括:
水补足至25μL。
体系中,所述引物浓度为100~1000nM,优选为500nM。所述探针浓度为 10~500nM,优选为200nM。
所述反应缓冲液为qPCR Master Mix反应缓冲液,一些实施例中,采用 AnstartqPCR Master Mix反应缓冲液。
所述酶混合液为qPCR Master Mix酶混合液。一些实施例中,采用Anstart qPCRMaster Mix酶混合液。
所述实时荧光定量PCR的程序包括:
50℃2分钟;
95℃5分钟预变性;
95℃15秒→60℃35秒,45个循环。
本发明提供了检测HSV-2病毒的方法,其包括:SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的2条引物对待测样品DNA进行实时荧光定量PCR检测,产生S 型扩增曲线则为阳性。
所述实时荧光定量PCR的体系包括:
体系中,所述引物浓度为100~1000nM,优选为500nM。所述探针浓度为 10~500nM,优选为200nM。
所述反应缓冲液为含染料(如SybrGreen、EvaGreen)的qPCR Master Mix 反应缓冲液,一些实施例中,采用含染料的Anstart qPCR Master Mix反应缓冲液。
qPCR Master Mix酶混合液。一些实施例中,采用Anstart qPCR Master Mix 酶混合液。
所述实时荧光定量PCR的程序包括:
50℃2分钟;
95℃5分钟预变性;
95℃15秒→60℃35秒,45个循环。
对于结果的判断,具体包括:
待检样品DNA的扩增曲线Ct值<38且有典型S型扩增曲线,为阳性结果;
待检样品DNA的扩增曲线Ct值等于45(或显示为Undet)或无典型S 型扩增曲线,为阴性结果;
待检DNA样品的扩增曲线38≤Ct值<45,为灰色区域,如重测结果仍为 Ct值<45,且有典型S型扩增曲线,则判定为阳性结果;如Ct值仍不显示或无典型S型扩增曲线,则判定为阴性结果;
待检样品HSV-2为阴性的情况下,考察HBB扩增情况,或HBB没有S 型扩增曲线,或者Ct值大于35,表明取样失败、提取失败或加样错误,需重新试验。
对于设置阳性对照的实验,还应满足:阳性对照,CY5通道、ROX通道均有明显的扩增,具有典型S型扩增曲线,且Ct值小于30;
对于设置阴性对照的实验,还应满足:阴性对照,CY5通道、ROX通道 Ct值=45(或显示为undet)或无典型S型扩增曲线,进行后续判断,否则应进行问题查找。
本发明所述的引物和探针可用于多种来源样品的检测。对生物样品的检测可以判断该样品是否被HSV-2感染,而对非生物样品的检测可以判断该样品是否被HSV-2污染。因此,本发明所述的试剂盒可用于样品的非诊断目的的检测。本发明中,所述检测的样品来自疱疹、阴道、泌尿道、医疗器械、药品、食品或化妆品。一些具体实施例中,所述的待测样品阴道分泌物、泌尿道分泌物和/或疱疹疱液。
本发明的有益效果至少包括:
(1)发明以HSV基因组中反向重复序列RS1为靶标区域,一方面基因组内有2个拷贝,可进一步提高检测灵敏度,另一方面型间核酸相似度低,不易造成交叉反应;
(2)发明针对HSV-2/HBB的保守区域,共特异性设计了4条引物和2 条Taqman探针,与目的基因的保守区域结合,具有很高的特异性,与铜绿假单胞菌菌株CMCC10104、金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29108、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29204、干酪乳杆菌株CMCC34103、大肠埃希氏菌株CMCC44103、变形杆菌株CMCC49102、伤寒沙门氏菌株CMCC50096、福氏志贺氏菌株CMCC51573、白色念珠菌株CMCC98001、人型支原体(MH)、弓形虫(GD)、人乳头瘤病毒(HPV)、人巨细胞病毒(HCMV)、肺炎支原体(MP)、生殖支原体(MG)、加德纳杆菌(GV)、白色念珠菌(CC)、阴道毛滴虫(Tv)、淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)、细小脲原体(UP)、HSV-1病毒均没有交叉反应;
(3)靶标基因片段较短,均在100~150bp之间,若过短会影响UNG酶的去污染效果,若过长会造成反应效率下降,因此本发明既能有效避免污染,又能保证反应的高效性和灵敏度,均能检测到低至5个拷贝的HSV-2DNA;
(4)在反应管内加入人类β-珠蛋白基因特异性引物探针,可有效监控样本采样、样本提取、PCR检测全过程,克服提取过程中加入外标,不能有效监控样本采样成功与否的弊端。
本发明的试剂盒非常适合临床使用和推广,对我国的HSV-2的防控工作具有重要的意义。
附图说明
图1为实施例4特异性实验的HSV-2(FAM通道)荧光检测结果,各检测曲线对应的模板是1:铜绿假单胞菌菌株CMCC10104、2:金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、3:脑膜炎奈瑟菌株CMCC29108、4:干酪乳杆菌株 CMCC34103、5:大肠埃希氏菌株CMCC44103、6:变形杆菌株CMCC49102、 7:伤寒沙门氏菌株CMCC50096、8:福氏志贺氏菌株CMCC51573、9:白色念珠菌株CMCC98001、10:人型支原体(MH)、11:弓形虫(GD)、12:人乳头瘤病毒(HPV)、13:人巨细胞病毒(HCMV)、14:肺炎支原体(MP)、 15:生殖支原体(MG)、16:加德纳杆菌(GV)、17:白色念珠菌(CC)、18:阴道毛滴虫(Tv)、19:淋球菌(NG)、20:沙眼衣原体(CT)、21:解脲脲原体(UU)、22:细小脲原体(UP)、23:HSV-1病毒;
图2为实施例5灵敏度实验的HSV-2(FAM通道)荧光检测结果,各检测曲线对应的模板是1~7为含有HSV-2/HBB靶基因片段的质粒溶液,浓度依次为1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/μL;
图3为实施例6重复性试验的阳性对照100倍稀释品(R1)的HSV-2(FAM 通道)荧光检测结果。
具体实施方式
本发明提供了单纯疱疹病毒II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:用于快速检测HSV-2的引物探针对的设计
针对NCBI中HSV-2RS1基因HBB基因序列,设计引物对和探针,序列如下:
表1引物和探针序列
实施例2:用于快速检测HSV-2的实时荧光定量PCR试剂盒
用于快速检测人HSV-2的实时荧光定量PCR试剂盒,包括HSV-2引物、 HSV-2探针、HBB引物、HBB探针、酶混合液、反应缓冲液、样本提取液、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体。
其中引物HSV-2-F、HSV-2-R序列依次如SEQ ID NO.1-2所示,浓度 500nM;探针HSV-2-P序列如SEQ ID NO:3所示,荧光基团为FOM,猝灭基团为BHQ1,浓度为200nM。
其中引物HBB-F、HBB-R序列依次如SEQ ID NO.4-5所示,浓度500nM;探针HBB-P序列如SEQ ID NO:6所示,探针荧光基团为ROX,猝灭基团为 BHQ1,浓度为200nM。
其中Anstart qPCR Master Mix酶混合液、Anstart qPCR Master Mix5×反应缓冲液由菲鹏生物股份有限公司提供,Anstart qPCR Master Mix酶混合液稀释 25倍使用,Anstart qPCR Master Mix5×反应缓冲液稀释5倍使用。
其中样本提取液为含0.1%NaOH、0.1%TritonX-100的TE缓冲液。
其中阳性对照品,为含有HSV-2、HBB靶基因片段的质粒溶液,浓度为 10000拷贝/μL,对应的Ct值均在在23左右。
其中阴性对照品为DEPC水。
其中阳性对照:HSV-2特异性靶基因片段序列为:
GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCAGACGAGGAGGCGGATGCAGACGA GGAGGAGGAGGCGGAGGAGGAGGCGGAGGACGCCGACGACGAGGATC CGGATTTTGATGAGTCAGAGGCGGCCGAG(SEQ ID No.7)。
其中阳性对照:HBB特异性靶基因片段序列为:
TCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTG AACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGG TTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATG(SEQID No.8)。
实施例3:HSV-2核酸检测试剂盒的快速检测方法
利用实施例2的试剂盒快速检测人阴道分泌物、泌尿道分泌物、疱液样本中的HSV-2 ,具体步骤如下:
(1)核酸提取:分别向阴道分泌物4例(样本编号1-4)、泌尿道分泌物 3例(样本编号5-7)、疱液样本3例(样本编号8-10)(采用病毒分离培养和分型法测定是否被HSV-2感染,该方法为目前行业金标准)收集管中加入1mL 生理盐水,充分振荡洗涤棉拭子,然后将棉拭子靠壁挤干丢弃,取500μL液体转移至1.5mL的离心管中,13000rpm离心5分钟,弃上清,沉淀中加入1mL 生理盐水,打散沉淀,13000rpm离心5分钟,弃上清,沉淀中加入已振荡混匀的样本提取液50μL,漩涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀),100℃干浴或者水浴10分钟,13000rpm离心5分钟,上清液用于PCR 反应(吸取时不用触动管子底部的沉淀物)。
(2)实时定量荧光PCR:利用上述HSV-2实时荧光定量PCR检测试剂盒进行PCR扩增反应,分别以提取的待检样品DNA、阳性对照和阴性对照各 5μL为模板。
以单独的HSV-2引物、探针进行检测。
将模板与试剂盒的试剂混合,进行实时荧光定量PCR反应,PCR反应条件设置为:50℃2分钟UNG酶去污染,95℃5分钟预变性,95℃15秒→60℃ 35秒,Cy5、FAM、ROX通道用于收集检测荧光信号,共45个循环。
(3)结果判断:
①应满足:阳性对照,FAM通道、CY5通道、ROX通道均有明显的扩增,具有典型S型扩增曲线,且Ct值小于30;阴性对照,FAM通道、CY5 通道、ROX通道Ct值=45(或显示为undet)或无典型S型扩增曲线,进行后续判断,否则应进行问题查找;
②待检样品DNA的扩增曲线Ct值<38且有典型S型扩增曲线,为阳性结果;
③待检样品DNA的扩增曲线Ct值等于45(或显示为Undet)或无典型S 型扩增曲线,为阴性结果;
④待检DNA样品的扩增曲线38≤Ct值<45,为灰色区域,如重测结果仍为Ct值<45,且有典型S型扩增曲线,则判定为阳性结果;如Ct值仍不显示或无典型S型扩增曲线,则判定为阴性结果;
⑤待检样品HSV-2为阴性的情况下,考察HBB扩增情况,或HBB没有S型扩增曲线,或者Ct值大于35,表明取样失败、提取失败或加样错误,需重新试验。
判定结果如表2:
表2样品检测结果
结果显示,HSV-2阳性样品4份,阴性样品6份。结果与现有技术鉴定一致,准确率可达100%。
实施例4特异性实验
利用实施例2中的试剂盒、实施例3的方法分别对铜绿假单胞菌菌株 CMCC10104、金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29108、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29204、干酪乳杆菌株CMCC34103、大肠埃希氏菌株CMCC44103、变形杆菌株CMCC49102、伤寒沙门氏菌株 CMCC50096、福氏志贺氏菌株CMCC51573、白色念珠菌株CMCC98001、人型支原体(MH)、弓形虫(GD)、人乳头瘤病毒(HPV)、人巨细胞病毒(HCMV)、肺炎支原体(MP)、生殖支原体(MG)、加德纳杆菌(GV)、白色念珠菌(CC)、阴道毛滴虫(Tv)、淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)、细小脲原体(UP)及HSV-1病毒进行PCR检测,结果见图1,结果表明,各样本均为阴性。结果表明,本发明的检测试剂盒特异性高,与常见的阴道、生殖道感染样本均无交叉反应。
实施例5灵敏度实验
取阳性对照品(即含HSV-2/HBB靶基因片段的质粒溶液),测定其浓度并计算拷贝数,按照10倍的浓度梯度稀释,选取1.0×100~1.0×106拷贝/μL(相当于病毒浓度50CFU/mL~5×107CFU/mL)的浓度作为样品,用本发明的试剂盒和检测方法进行检测。
检测结果如图2所示,结果表明,本试剂盒对HSV-2的最低检出限浓度为1.0×100拷贝/μL(相当于病毒浓度为50CFU/mL),即最低检出限为5拷贝 (相当于病毒浓度50CFU/mL)。
实施例6重复性试验
取试剂盒中阳性对照的1000倍稀释品,命名为R1,用本发明的试剂盒和检测方法,连续重复10次试验,检测结果见图3、表3所示,结果显示阳性对照的100倍稀释品Ct值变异系数均小于5%。
表3重复性试验
模板 | HSV-2(FAM) |
R1 | 30.61 |
R1 | 30.84 |
R1 | 31.47 |
R1 | 30.82 |
R1 | 30.33 |
R1 | 30.29 |
R1 | 31.57 |
R1 | 30.88 |
R1 | 30.98 |
R1 | 30.56 |
平均值 | 30.84 |
标准差 | 0.43 |
CV值(%) | 1.39 |
实施例7妇科用药对样本检测影响
选择市面上常见的妇科用药及清洁品,包括消糜栓、硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、美妇康卡波姆凝胶、宫炎洁卡波姆凝胶、氧氟沙星凝胶、氧氟沙星凝胶、甲硝唑呋喃酮栓、洁尔阴洗液,进行试验,验证其对试剂盒检测的影响。
结果表明,0.1mg/ml消糜栓、10mg/ml硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、 10mg/mL美妇康卡波姆凝胶、10mg/mL宫炎洁卡波姆凝胶、10mg/mL氧氟沙星凝胶、10mg/mL甲硝唑呋喃酮栓、0.1%洁尔阴洗液,对检测不存在干扰。本发明提供的试剂盒能够实现对药品中是否存在HSV-2感染。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中生方政生物技术股份有限公司
<120> 单纯疱疹病毒II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法
<130> MP1833641
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgtcgtcg tcgtcgtcgt c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcggccgcc tctgactcat c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctccgcctc ctcctccgcc 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctgactcct gaggagaagt ctgcc 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catgcccagt ttctattggt ctcctt 26
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccttgcccca cagggcagta acgg 24
<210> 7
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgtcgtcg tcgtcgtcgt cagacgagga ggcggatgca gacgaggagg aggaggcgga 60
ggaggaggcg gaggacgccg acgacgagga tccggatttt gatgagtcag aggcggccga 120
g 121
<210> 8
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctgactcct gaggagaagt ctgccgttac tgccctgtgg ggcaaggtga acgtggatga 60
agttggtggt gaggccctgg gcaggttggt atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac 120
caatagaaac tgggcatg 138
Claims (1)
1.检测RS1片段的试剂在制备HSV-2病毒检测试剂盒中的应用,所述RS1片段的序列如SEQ ID NO.7所示;
所述试剂包括:SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的2条引物;SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针。
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Applications Claiming Priority (1)
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-
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- 2019-01-09 CN CN201910019735.1A patent/CN109487014B/zh active Active
Patent Citations (3)
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单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立;刘继峰等;《医学研究杂志》;20081215;第37卷(第12期);摘要,第37页左栏第2-3段 * |
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