CN103820573A

CN103820573A - 四种常见人疱疹病毒荧光定量pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN103820573A
Application number: CN201410026784.5A
Authority: CN
Inventors: 舒强; 尚世强; 杜立中; 陶然; 李伟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2014-05-28

Abstract

本发明提供一种同时检测常见人疱疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV的实时荧光定量PCR试剂盒，由定量PCR反应液、定量反应液、HSV-1标准品、HSV-2标准品、EBV标准品、HCMV标准品、阴性对照品、HSV-1阳性对照品、HSV-2阳性对照品、EBV阳性对照品、HCMV阳性对照品、说明书和盒体组成。本发明试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和同一反应体系中双特异荧光探针，检测范围涵盖最常见的四种人疱疹病毒，对样品中的四种人疱疹病毒能进行同时分型检测，能实时准确定量，可满足早期、快速、准确诊断的需要，为流行病学调查和及时制定针对性治疗方案提供有力依据。

Description

四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测患者血液、尿液、脑脊液等样本中单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）、爱泼斯坦-马尔病毒（EBV）和人巨细胞病毒（HCMV）四种常见人疱疹病毒的新型试剂盒。

背景技术

疱疹病毒科是一群中等大小、有包膜的DNA病毒，现已发现100种以上。已知与人类疾病相关的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒1型和2型（HSV-1、HSV-2）、水痘－带状疱疹病毒（VZV）、爱泼斯坦－马尔病毒（EBV）、人巨细胞病毒（HCMV）、人疱疹病毒6型、7型和8型（HHV-6、HHV-7、HHV-8），临床上最常见的为前四种病毒。当机体免疫功能低下或受抑制时，易引起疱疹病毒感染，导致严重致死性疾病，而早期诊断和及时抗病毒治疗可明显改善预后，降低病死率。因疱疹病毒感染的临床表现多样，且不同病毒感染的症状和体征多无特异性，因此早期诊断和及时治疗需依赖实验室检测。

传统的疱疹病毒检测方法主要包括病毒分离培养和血清学检测，前者曾为疱疹病毒的诊断“金标准”，但存在需时长（3-30天）、敏感性低（尤其在抗病毒药物治疗后）、分型困难等缺陷；后者又分为抗原直接检测法和抗体间接检测法，抗原直接检测法由于某些病毒不产生可检测的抗原而导致敏感性低，抗体间接检测法由于疱疹病毒感染后需1周左右才产生有效浓度的抗体而无法进行早期诊断，且不同疱疹病毒间存在交叉反应，抗体特异性不高。

随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）技术，特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了新方向。实时荧光定量PCR技术的基本原理是利用Taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通PCR基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团（R）和淬灭基团（Q）；探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，Q基团的抑制作用消失，R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算初始模板量，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对PCR产物的后处理，避免了交叉污染。

目前的实时荧光定量PCR技术随着材料和仪器的进一步发展，通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料（FAM、HEX、ROX等）及多通道荧光定量PCR仪，可以实现基因分型、基因突变检测、SNP分析等研究。

发明内容

本发明提供一种同时检测常见人疱疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV的实时荧光定量PCR试剂盒，由定量PCR反应液、定量反应液、HSV-1标准品、HSV-2标准品、EBV标准品、HCMV标准品、阴性对照品、HSV-1阳性对照品、HSV-2阳性对照品、EBV阳性对照品、HCMV阳性对照品、说明书和盒体组成，

其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、耐热DNA聚合酶、通用上游扩增引物、通用下游扩增引物、HSV-1荧光探针和HSV-2荧光探针。

定量反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、耐热DNA聚合酶、通用上游扩增引物、通用下游扩增引物、EBV下游扩增引物、EBV荧光探针和HCMV荧光探针。

PCR扩增引物序列为：

通用上游扩增引物：5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’；

通用下游扩增引物：5’-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3’；

EBV下游扩增引物：5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’。

检测各疱疹病毒的荧光探针和荧光标记物为：

HSV-1荧光探针：5’FAM-GCGGCACAGCACAAAGATG-BHQ-1-3’；

HSV-2荧光探针：5’HEX-GCGGCACAAAACGAAAATG-BHQ-1-3’；

EBV荧光探针：5’FAM- GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’；

HCMV荧光探针：5’HEX- GAAAGCGGACAAACACGCT-BHQ-1-3’。

HSV-1标准品序列为：TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATCTTTG TGCTGTGCCG CGGCCTCACG GCCGCCGGGC TGACGGCCGT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTT CTGTCCCCCA TCAAACTCGA GTGCGAAAAG ACGTTCACCA AGCTGCTGCT GATCGCCAAG AAAAAGTACA TCGGCGTCAT CTACGGGGGT AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG。

HSV-2标准品序列为：TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATTTTCG TTTTGTGCCG CGGCCTCACG GCCGCGGGCC TGGTGGCCAT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTC CTCCCCCCGA TCAAGCTCGA GTGCGAAAAA ACGTTCACCA AGCTGCTGCT CATCGCCAAG AAAAAGTACA TCGGCGTCAT CTGCGGGGGC AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG。

EBV标准品序列为：TCATCTACGG GGACACGGAC TCGCTGTTTA TCGAGTGCCG GGGGTTTTCA GAGAGCGAGA CCCTGCGCTT TGCCGAGGCC CTGGCCGCCC ACACCACCCG GAGCCTGTTT GTGGCCCCCA TCTCCCTGGA GGCCGAGAAG ACCTTCTCCT GCCTGATGCT GATTACAAAG AAGAGATATG TGGGGGTGCT GACGGACGGC AAGACCCTGA TGAAGGGGGT GGAGCTC。

HCMV标准品序列为：TCATCTACGG GGACACGGAC AGCGTGTTTG TCCGCTTTCG TGGCCTGACG CCGCAGGCTC TGGTGGCGCG TGGGCCCAGC CTGGCGCACT ACGTGACGGC CTGTCTTTTT GTGGAGCCCG TCAAGCTGGA GTTTGAAAAG GTCTTCGTCT CTCTTATGAT GATCTGCAAG AAACGTTACA TCGGCAAAGT GGAGGGCGCC TCGGGTCTGA GCATGAAGGG CGTGGATCTG GTGCG。

阴性对照为无菌注射用水样品，HSV-1阳性对照1、HSV-2阳性对照2、EBV阳性对照3、HCMV阳性对照4分别为HSV-1、HSV-2、EBV、HCMV灭活病毒株样品。

本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，标准品用无菌去离子水稀释为1×10⁴－1×10⁷拷贝。

疱疹病毒DNA的提取：严格按照商品化的QIAamp DNA抽提试剂盒操作，从临床标本或病毒分离培养物中提取疱疹病毒DNA。

PCR扩增检测：在双色（或以上）荧光定量PCR仪上进行，每个模板（提取的疱疹病毒DNA、标准品、阳性或阴性对照）分别加入2个PCR反应体系，每个PCR反应体系的总体积为25ml，其中包括20mlPCR反应液1或PCR反应液2和5ml模板。探针检测模式为：在加PCR反应液1的体系中，FAM和HEX通道分别用于检测HSV-1和HSV-2；在加PCR反应液2的体系中，FAM和HEX通道分别用于检测EBV和HCMV。PCR反应条件：94℃ 5分钟预变性，94℃ 20秒→60℃ 60秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。

荧光定量结果报告：① 检测样品的扩增曲线无对数增长期或双探针CT（threshold cycle）值均≥40为阴性；② 检测样品某一探针CT值≤38且扩增曲线有明显对数增长期，则该探针对应的疱疹病毒为阳性；同一反应体系中双探针CT值均≤38且扩增曲线有明显对数增长期，则为两种疱疹病毒混合阳性；③检测样品某一探针38＜CT值＜40，需对样品重新进行DNA提取和PCR检测。

本发明采用实时荧光定量PCR技术和同一反应体系中双特异荧光探针，开发研制了用于常见人疱疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV分型和定量检测的试剂盒。该发明试剂盒的检测范围涵盖了临床感染中最常见的四种人疱疹病毒，对临床样品中的HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV不仅能进行同时分型检测，而且对阳性病毒能进行实时准确定量，可满足临床早期、准确诊断HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV这四种常见人疱疹病毒感染的迫切需要，为及时制定针对性治疗方案提供有力依据。本发明基于上述技术背景，设计针对HSV-1 、HSV-2、EBV和HCMV这四种临床最常见疱疹病毒的特异性探针，开发能同时分型和定量这四种疱疹病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，旨在满足临床常见疱疹病毒感染早期、快速诊断的需求，为临床常见疱疹病毒感染的流行病学调查和针对性治疗提供帮助。

附图说明

图1为本发明试剂盒的结构示意图。

图2为HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV浓度梯度标准品的标准曲线。

具体实施方式

本发明结合实施例和附图作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。

实施例1

参见图1，本发明提供的四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒，由定量PCR反应液1、定量反应液2、HSV-1标准品3、HSV-2标准品4、EBV标准品5、HCMV标准品6、阴性对照品7、HSV-1阳性对照品8、HSV-2阳性对照品9、EBV阳性对照品10、HCMV阳性对照品11、说明书12和盒体13组成。

其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物1、下游扩增引物2、HSV-1荧光探针和HSV-2荧光探针；

定量反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物1、下游扩增引物2、下游扩增引物3、EBV荧光探针和HCMV荧光探针。

PCR扩增引物序列为：

通用上游扩增引物：5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’；

通用下游扩增引物：5’-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3’；

EBV下游扩增引物：5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’。

检测各疱疹病毒的荧光探针和荧光标记物为：

HSV-1荧光探针：5’FAM-GCGGCACAGCACAAAGATG-BHQ-1-3’；

HSV-2荧光探针：5’HEX-GCGGCACAAAACGAAAATG-BHQ-1-3’；

EBV荧光探针：5’FAM- GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’；

HCMV荧光探针：5’HEX- GAAAGCGGACAAACACGCT-BHQ-1-3’。

本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

实施例2 四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒的敏感性和特异性试验

（一）材料：

选取病原微生物包括：实验组：HSV-1（F株）、HSV-2（G株）、HCMV（AD169株）由安徽医科大学微生物教研组提供，EBV（B95-8株）由北京病毒研究所提供；对照组：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组由浙江大学附属儿童医院细菌室、病毒室和基因扩增室提供。

（二）引物及探针的设计与合成：

对HSV-1、HSV-2、EBV、HCMV的保守区序列进行生物信息学分析，设计并筛选各疱疹病毒的PCR扩增引物和特异性荧光探针，委托上海生工生物公司合成。

通用上游扩增引物序列为：5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’；

通用下游扩增引物序列为：5’-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3’；

EBV下游扩增引物序列为：5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’；

HSV-1荧光探针序列为：5’FAM-GCGGCACAGCACAAAGATG-BHQ-1-3’；

HSV-2荧光探针序列为：5’HEX-GCGGCACAAAACGAAAATG-BHQ-1-3’；

EBV荧光探针序列为：5’FAM- GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’；

HCMV荧光探针序列为：5’HEX- GAAAGCGGACAAACACGCT-BHQ-1-3’。

（三）检测标准品的制备：

用上游扩增引物和下游扩增引物1扩增HSV-1、HSV-2、HCMV病毒株，用上游扩增引物和下游扩增引物2扩增EBV病毒株，各扩增片段纯化后插入pGEM-T-Easy克隆载体构建重组质粒，用分光光度计对各质粒进行定量，并用无菌去离子水以10倍比稀释各质粒进行荧光定量PCR敏感性试验。

（四）试剂盒的敏感性和特异性试验：

采用四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒对上述常见病原微生物进行检测，实验组四种疱疹病毒检测结果均为阳性且分型符合，对照组金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组等检测结果均为阴性，特异性为100%。构建的重组质粒标准品倍比稀释后检测敏感性可达10拷贝；用10⁴、10⁵、10⁶、10⁷四个定量的浓度梯度标准品作标准曲线，其CT值与质粒拷贝数之间具有良好的线性关系（图2）。

实施例3 四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒在临床样品检测中的应用

（一）临床样本检测：

采用四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒对128例临床疑为疱疹病毒感染患儿的血液样本进行检测，同时选择中山大学达安基因股份有限公司提供的、已获国家食品药品监督管理局批准的HSV-1、HSV-2、EBV、HCMV单一核酸检测试剂盒作为对照，用于评价本发明试剂盒的性能指标。

（二）检测结果：

本发明试剂盒共检出41例阳性样本，其中HSV-1 1例，HSV-2 1例，EBV 15例，HCMV 21例，HSV-2/HCMV混合感染1例，EBV/HCMV混合感染2例，与对照试剂盒检测结果的符合率为100%。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限度的范围。

<110> 浙江大学

<120> 四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒

<160> 11

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测人疱疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV通用上游引物序列

<400> 1

TCATCTACGGGGACACGGAC 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV通用下游引物序列

<400> 2

CGCACCAGATCCACGCCCTT 20

<210>3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测人疱疹病毒EBV下游引物序列

<400> 3

GAGCTCCACCCCCTTCATC 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人疱疹病毒HSV-1荧光探针序列

<400> 4

GAGCTCCACCCCCTTCATC 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人疱疹病毒HSV-2荧光探针序列

<400> 5

GCGGCACAAAACGAAAATG 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人疱疹病毒EBV荧光探针序列

<400> 6

GCACTCGATAAACAGCGAG 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人疱疹病毒HCMV荧光探针序列

<400> 7

GAAAGCGGACAAACACGCT 19

<210> 8

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据人疱疹病毒HSV-1 UL30基因序列设计的HSV-1荧光定量检测标准品序列

<400> 8

TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATCTTTG TGCTGTGCCG CGGCCTCACG GCCGCCGGGC 60

TGACGGCCGT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTT CTGTCCCCCA 120

TCAAACTCGA GTGCGAAAAG ACGTTCACCA AGCTGCTGCT GATCGCCAAG AAAAAGTACA 180

TCGGCGTCAT CTACGGGGGT AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG 232

<210> 9

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据人疱疹病毒HSV-2 UL30基因序列设计的HSV-2荧光定量检测标准品序列

<400> 9

TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATTTTCG TTTTGTGCCG CGGCCTCACG GCCGCGGGCC 60

TGGTGGCCAT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTC CTCCCCCCGA 120

TCAAGCTCGA GTGCGAAAAA ACGTTCACCA AGCTGCTGCT CATCGCCAAG AAAAAGTACA 180

TCGGCGTCAT CTGCGGGGGC AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG 232

<210> 10

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据人疱疹病毒EBV BALF5基因序列设计的EBV荧光定量检测标准品序列

<400> 10

GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGC ACCCCCACAT ATCTCTTCTT 60

TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGG GGGCCACAAA 120

CAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGA 180

AAACCCCCGG CACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA 227

<210> 11

<211> 235

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据人疱疹病毒HCMV UL54基因序列设计的HCMV荧光定量检测标准品序列

<400> 11

TCATCTACGG GGACACGGAC AGCGTGTTTG TCCGCTTTCG TGGCCTGACG CCGCAGGCTC 60

TGGTGGCGCG TGGGCCCAGC CTGGCGCACT ACGTGACGGC CTGTCTTTTT GTGGAGCCCG 120

TCAAGCTGGA GTTTGAAAAG GTCTTCGTCT CTCTTATGAT GATCTGCAAG AAACGTTACA 180

TCGGCAAAGT GGAGGGCGCC TCGGGTCTGA GCATGAAGGG CGTGGATCTG GTGCG 235

Claims

1.四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒，所述常见人疱疹为HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV，该检测试剂盒由定量PCR反应液（1）、定量反应液（2）、HSV-1标准品（3）、HSV-2标准品（4）、EBV标准品（5）、HCMV标准品（6）、阴性对照品（7）、HSV-1阳性对照品（8）、HSV-2阳性对照品（9）、EBV阳性对照品（10）、HCMV阳性对照品（11）、说明书（12）和盒体（13）组成；

其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、耐热DNA聚合酶、通用上游扩增引物、通用下游扩增引物、HSV-1荧光探针和HSV-2荧光探针，

定量反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、耐热DNA聚合酶、通用上游扩增引物、通用下游扩增引物、EBV下游扩增引物、EBV荧光探针和HCMV荧光探针，

通用上游扩增引物：5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’，

通用下游扩增引物：5’-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3’，

EBV下游扩增引物：5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’，

HSV-1荧光探针：5’FAM-GCGGCACAGCACAAAGATG-BHQ-1-3’，

HSV-2荧光探针：5’HEX-GCGGCACAAAACGAAAATG-BHQ-1-3’，

EBV荧光探针：5’FAM- GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’，

HCMV荧光探针：5’HEX- GAAAGCGGACAAACACGCT-BHQ-1-3’，

HSV-1标准品序列为：TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATCTTTG TGCTGTGCCG CGGCCTCACG GCCGCCGGGC TGACGGCCGT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTT CTGTCCCCCA TCAAACTCGA GTGCGAAAAG ACGTTCACCA AGCTGCTGCT GATCGCCAAG AAAAAGTACA TCGGCGTCAT CTACGGGGGT AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG，

HSV-2标准品序列为：TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATTTTCG TTTTGTGCCG CGGCCTCACG GCCGCGGGCC TGGTGGCCAT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTC CTCCCCCCGA TCAAGCTCGA GTGCGAAAAA ACGTTCACCA AGCTGCTGCT CATCGCCAAG AAAAAGTACA TCGGCGTCAT CTGCGGGGGC AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG，

EBV标准品序列为：TCATCTACGG GGACACGGAC TCGCTGTTTA TCGAGTGCCG GGGGTTTTCA GAGAGCGAGA CCCTGCGCTT TGCCGAGGCC CTGGCCGCCC ACACCACCCG GAGCCTGTTT GTGGCCCCCA TCTCCCTGGA GGCCGAGAAG ACCTTCTCCT GCCTGATGCT GATTACAAAG AAGAGATATG TGGGGGTGCT GACGGACGGC AAGACCCTGA TGAAGGGGGT GGAGCTC，

2.根据权利要求1所述的四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，阴性对照为无菌注射用水样品，HSV-1阳性对照、HSV-2阳性对照、EBV阳性对照、HCMV阳性对照分别为HSV-1、HSV-2、EBV、HCMV灭活病毒株样品。

3.根据权利要求1所述的四种常见人疱疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，本发明试剂盒保存于-20℃，减少反复冻融。