CN110241256B - 一种多重定量检测eb病毒和巨细胞病毒的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，包括PCR反应液、PCR反应酶系、定量标准品、阳性质控品以及阴性质控品，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、EB病毒和巨细胞病毒特异性的正、反向引物、EB病毒和巨细胞病毒特异性荧光探针；本发明应用实时荧光定量PCR技术，采用多重PCR引物和2种特异性荧光探针，通过双标准曲线法可以实现一个反应中同时对样本中的EB病毒和巨细胞病毒载量进行定值，可实现1管双重的定量检测，可广泛应用于EB病毒和巨细胞病毒相关疾病临床早期诊断、药物疗效、愈后监测及科学研究等多个领域，具有检测半自动化、检测速度快、灵敏高、适用样本范围广的特点。

Description

一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体来说是涉及一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒。
背景技术
EB病毒(EBV)和人巨细胞病毒(CMV)均属于人类疱疹病毒，在我国的感染率较高，是最常见病毒感染。多数人在幼年或青年时期获得感染，人巨细胞病毒原发感染和复发感染可以引起呼吸、神经、血液和消化系统等多系统疾病，严重者可危及患者生命，对人们的身体健康造成严重损害。EB病毒与传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、淋巴瘤等疾病密切相关。人巨细胞病毒感染可累及消化道、中枢神经系统和肺等多种器官,在血液肿瘤移植患者中，巨细胞病毒的感染率高达32％～45％，病死率可达75％～90％。准确、快速、定量诊断EBV和CMV感染的方法在早期诊断和治疗中起到日益重要的作用。
目前检测EB病毒和人巨细胞病毒的金标准是病毒培养。针对不同病毒，采用的细胞略有不同，被病毒感染的细胞，在形态上会出现变化，出现细胞病变效应。病毒的细胞培养通常在发病后采集患者临床样本进行检测，操作繁琐，耗时长，对病情的及时诊断和疾病暴发的控制不利，较低载量的病毒及隐性感染均会导致漏检。传统的血清学检测虽然简便快速，但是敏感性较差，且不能对病毒的载量进行检测，应用实时荧光定量PCR技术检测样本中的EBV DNA和CMVDNA，比常规PCR技术灵敏度更高，且可以同时对2种病毒的载量进行定值，能够更为精确地反映患者EBV和CMV感染的状态。
国内外常见的EB病毒或巨细胞病毒检测试剂盒均为单一病毒检测，无法同时对EB病毒和巨细胞病毒进行定量，国内也有比较多的单个病毒定量或定性检测的发明专利，如发明专利CN201810631220.2、CN201710427671.X、CN201810979964.3，这些专利均为单独检测无法同时对EBV和CMV进行检测。国内发明专利CN201610567706.5虽然可以同时对巨细胞病毒和EB病毒进行检测，但是无法对两种病毒进行定量，只可进行定性检测无法进行病毒载量的定值。本发明基于国内无同时对EBV和CMV定量检测的情况，同时结合临床检测的意义，开发了一种双重荧光定量检测试剂，可同时对EB病毒和巨细胞病毒进行定性和定量的检测，对患者血浆中EBVDNA和CMVDNA的水平变化进行检测，以监测病毒水平的动态变化与患者病毒感染的预防、诊断与治疗的关系。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PCR反应酶系、定量标准品、阳性质控品以及阴性质控品，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、EB病毒和巨细胞病毒特异性的正、反向引物、EB病毒和巨细胞病毒特异性荧光探针，其中，
所述EB病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’GTTTGAAGGATGCGATTAAGGAC-3’，所述EB病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GGCAAATCTACTCCATCGTCAA-3’；
所述巨细胞病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’ACGGGCGGTTTAATAATCACC-3’，所述巨细胞病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GTCGCGGTTACTAACACTCCT-3’；
所述EB病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’ATGCCAAAGCCCGCTCCTACCTG-3’；
所述巨细胞病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’CTACTCCCGAGCTCAGCCCGCGTA-3’。
作为优选的技术方案，所述定量标准品由定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4和定量参考品5组成，其浓度分别2ⅹ107copies/mL、2ⅹ106copies/mL、2ⅹ105copies/mL、2ⅹ104copies/mL、2ⅹ103copies/mL。
作为优选的技术方案，所述定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4和定量参考品5均由含EB病毒和巨细胞病毒序列的DNA组成，其序列为：
TCACGATACAGCCGGCGGTATCGATAATCTTGTTGCGGTACTGGATGGTAAAGTCGGGCTCGGGCTTGATGTCTTCCTGTTTGATGAGGGGCAGCATGATAGGCGCGGGAGGCACGGGCGGTTTAATAATCACCTTGAAAGGACGCGTGGTTTTGCGCGGTTTCTTACGCGGGCTGAGCTCGGGAGTAGCGGATGCCCCGGGGAGAGGAGTGTTAGTAACCGCGACGCTGGTGGGGGTCGGCTTGTTAAGAGGGGCGCTGCTAACGCTGCAAGAGTGGGTTGTCAGCGTGGGGCCGGTGCTACTGGAATCGATACCGGCATGATTGACAGCCTGGGCGAGGATGTCACCTGATGGTGATAAGAAGACACGGGAGACTTAGTACGGTTTCACAGGCGTGACACGTTTATTGAGTAGGATTACAGAGTATAACATAGAGTATAATATAGAGTATACAATAGTGACGTGGGATCCATAACAGTAACTGATATATATATTTTTACAAACTCATATATTTGCTGAGGGTTTGAAGGATGCGATTAAGGACCTTGTTATGCCAAAGCCCGCTCCTACCTGCAATATCAAGGCGACTGTGTGCAGCTTTGACGATGGAGTAGATTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATGGTGGAAGGGGCTGCCGCGGAGGGTGATGACGGAGATGACGGAGATGACGGAGATGAAGG。
作为优选的技术方案，所述PCR缓冲液由50mmol/L Tris-HCl、3～8mmol/L MgCl2和150～350mmol/L KCl组成。
进一步，PCR缓冲液中Tris-HCl的pH值为8.2。
作为优选的技术方案，所述PCR反应酶系由UDG酶、热启动Taq酶、dUTPs组成，每人份PCR反应酶系中UDG酶的用量为1～3U，最佳用量2U；热启动Taq酶的用量为2～5U，最佳用量3U；dNTPs为6～12mmol，最佳用量10mmol。
进一步，PCR扩增的条件为：50℃2分钟，95℃10分钟；95℃10秒，58℃35秒，45个循环(58℃时收集荧光信号)。
作为优选的技术方案，所述EB病毒特异性荧光探针的5’标记有VIC荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1。
作为优选的技术方案，所述巨细胞病毒特异性荧光探针的5’标记有FAM荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1。
作为优选的技术方案，所述EB病毒正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.15μmol/L，所述巨细胞病毒特异性正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.08μmol/L，所述EB病毒特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.08μmol/L，所述巨细胞病毒特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。
作为优选的技术方案，所述阴性质控品为生理盐水。
作为优选的技术方案，所述阳性质控品为基因合成方式制备的含EB病毒和巨细胞病毒的全长DNA，且浓度在1ⅹ104copies mL-2ⅹ104copies/mL。
本发明的有益效果为：可实现检测半自动化、速度快、灵敏度高且适用样本范围广；同时适用于血清、血浆、全血、咽拭子等多种样本类型。
附图说明
图1是本发明的荧光定量PCR反应程序图；
图2是本发明的阴性质控品的扩增曲线图；
图3是本发明的阳性质控品的扩增曲线图；
图4是本发明的定量标准品的FAM通道(CMV)扩增曲线图；
图5是本发明的定量标准品的VIC通道(EBV)扩增曲线图；
图6是本发明的定量标准品的FAM通道(CMV)标准曲线图；
图7是本发明的定量标准品的VIC通道(EBV)标准曲线图；
图8是本发明特异性样本的扩增曲线图。
具体实施方式
首先，本技术方案在实际制备过程中根据GenBank中登录的EB病毒和巨细胞病毒序列，应用DNAMAN软件进行同源性分析，并找出各个病毒的保守区。应用PrimerExpress3.0软件根据每种病毒基因的保守区基因设计特异性的引物及探针，并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。EB病毒和巨细胞病毒的探针分别用VIC、FAM标记，以便于在检测中区分。这些引物、探针在含有UDG酶、耐热DNA聚合酶，高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的PCR反应酶系以及含有Mg2+等成份的PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增，基于此，本技术方案开发了一种可实现检测半自动化、速度快、灵敏度高且适用样本范围广的多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，下述具体的应用实例。
结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1、多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒及其使用；
1、制备包括下列组成成分的试剂盒：PCR反应液1管，PCR反应酶系1管，阳性质控品1管，阴性质控品1管，定量标准品5管；
2、实时荧光定量PCR扩增及检测；
2.1、试剂准备：PCR反应液25μl、PCR反应酶系5μl，充分混匀后备用。
2.2、加样：向PCR反应管中，分别加入处理后的阴、阳性质控品，定量标准品各20μl，盖紧管盖，放入仪器样品槽。
2.3、编辑：(ABI Prism 7500荧光定量PCR仪)
打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择AddDetector，选择Reporter，FAM和Quencher为none，再选择Reporter，HEX和Quencher为none；在Passive Reference中选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃10秒，58℃35秒(收集荧光)，45个循环；Sample Volume 50(见附图1)。所有设置完成后保存文件，运行。
2.4结果分析：
反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amplification Plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：2-6e+3。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。
检测结果：阴性质控品的扩增曲线不呈S型(见附图2)；阳性质控品的FAM(CMV)和VIC(EBV)通道的扩增曲线均为明显S型曲线(见附图3)，其定量值分别为1.36eⅹ104copies/mL和1.22ⅹ104copies/mL；定量标准品的FAM检测通道(CMV)扩增曲线成S型(见附图4)，定量标准品的VIC检测通道(EBV)扩增曲线成S型(见附图5)，CMV和EBV标准曲线的相关系数分别为0.998和0.996(见附图6和图7)。
本次试验中，阴、阳性质控品的检测结果均为相应的阴或阳性，定量标准品在FAM和VIC通道具有明显的扩增曲线，且各自标准曲线的相关系数均在0.98以上，说明本试剂盒的质量可靠，可用于EBV和HCMV的病毒载量的检测。
实施例2，应用多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒检测特异性样品；
选取经过病毒培养方法分别鉴定为单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、合胞病毒、腺病毒、带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒阳性的血清样本各1例作为特异性样本，对所有样本进行核酸提取，PCR扩增及结果分析步骤参照实施例1进行，同时进行阴，阳性质控品的检测。
检测结果：阴性质控品的扩增曲线不呈S型，阳性质控品的FAM和VIC扩增曲线为明显S型曲线且定量值分别为1.36eⅹ104copies/mL和1.22ⅹ104copies/mL，阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，因此待检标本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒对纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、合胞病毒、腺病毒、带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等无非特异扩增(见附图8)。
本次试验中，7例标本的检测结果均为阴性，说明利用本试剂盒检测特异性是可行的，具有良好的特异性。
实施例3，应用多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒检测阳性样品；
选取临床上已定值的EB病毒血清样本(5例)和巨细胞病毒血清样本(4例)，对所有样本进行核酸提取，PCR扩增及结果分析步骤参照实施例1进行，同时进行阴、阳性质控品和定量标准品的检测。
检测结果：阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求，定量标准品扩增曲线的相关系数为0.998，因此待检标本的检测结果是有效的。5例EB病毒和4例巨细胞病毒样本检测结果均为阳性，其定量结果如表1。
本次试验中9例标本的检测结果与已知的病毒载量结果完全吻合，说明利用本试剂盒定量检测EB病毒和巨细胞病毒是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，且价格低廉，主要应用于EB病毒和巨细胞病毒的同时定量检测。
表1试剂盒定量检测值
样本编号 本试剂盒定量值(copies/mL) 对照值(copies/mL)
EBV-1 1.50ⅹ104 1.68ⅹ104
EBV-2 1.06ⅹ103 1.34ⅹ103
EBV-3 9.02ⅹ102 8.54ⅹ102
EBV-4 1.04ⅹ102 9.95ⅹ101
EBV-5 9.01ⅹ101 1.23ⅹ101
HCMV-1 1.22ⅹ104 1.08ⅹ104
HCMV-2 1.50ⅹ104 1.34ⅹ104
HCMV-3 1.06ⅹ103 9.91ⅹ101
HCMV-4 3.50ⅹ103 3.28ⅹ103
HCMV-5 3.81ⅹ103 3.77ⅹ103
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure BDA0002074298800000051
Figure BDA0002074298800000061

Claims (10)

1.一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PCR反应酶系、定量标准品、阳性质控品以及阴性质控品，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、EB病毒和巨细胞病毒特异性的正、反向引物、EB病毒和巨细胞病毒特异性荧光探针，其中，
所述EB病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’GTTTGAAGGATGCGATTAAGGAC-3’，所述EB病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GGCAAATCTACTCCATCGTCAA-3’；
所述巨细胞病毒特异性正向引物的核苷酸序列为：5’ACGGGCGGTTTAATAATCACC-3’，所述巨细胞病毒特异性反向引物的核苷酸序列为：5’GTCGCGGTTACTAACACTCCT-3’；
所述EB病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’ATGCCAAAGCCCGCTCCTACCTG-3’；
所述巨细胞病毒特异性荧光探针的核苷酸序列为：5’CTACTCCCGAGCTCAGCCCGCGTA-3’。
2.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述定量标准品由定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4和定量参考品5组成，其浓度分别为2ⅹ107copies/mL、2ⅹ106copies/mL、2ⅹ105copies/mL、2ⅹ104copies/mL、2ⅹ103copies/mL。
3.根据权利要求2所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述定量参考品1、定量参考品2、定量参考品3、定量参考品4和定量参考品5均由含EB病毒和巨细胞病毒序列的DNA组成，其序列为：
TCACGATACAGCCGGCGGTATCGATAATCTTGTTGCGGTACTGGATGGTAAAGTCGGGCTCGGGCTTGATGTCTTCCTGTTTGATGAGGGGCAGCATGATAGGCGCGGGAGGCACGGGCGGTTTAATAATCACCTTGAAAGGACGCGTGGTTTTGCGCGGTTTCTTACGCGGGCTGAGCTCGGGAGTAGCGGATGCCCCGGGGAGAGGAGTGTTAGTAACCGCGACGCTGGTGGGGGTCGGCTTGTTAAGAGGGGCGCTGCTAACGCTGCAAGAGTGGGTTGTCAGCGTGGGGCCGGTGCTACTGGAATCGATACCGGCATGATTGACAGCCTGGGCGAGGATGTCACCTGATGGTGATAAGAAGACACGGGAGACTTAGTACGGTTTCACAGGCGTGACACGTTTATTGAGTAGGATTACAGAGTATAACATAGAGTATAATATAGAGTATACAATAGTGACGTGGGATCCATAACAGTAACTGATATATATATTTTTACAAACTCATATATTTGCTGAGGGTTTGAAGGATGCGATTAAGGACCTTGTTATGCCAAAGCCCGCTCCTACCTGCAATATCAAGGCGACTGTGTGCAGCTTTGACGATGGAGTAGATTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATGGTGGAAGGGGCTGCCGCGGAGGGTGATGACGGAGATGACGGAGATGACGGAGATGAAGG。
4.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液由50mmol/L Tris-HCl、3～8mmol/L MgCl2和150～350mmol/L KCl组成。
5.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应酶系由UDG酶、热启动Taq酶、dUTPs组成，每人份PCR反应酶系中UDG酶的用量为1～3U；热启动Taq酶的用量为2～5U；dNTPs为6～12mmol。
6.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述EB病毒特异性荧光探针的5’标记有VIC荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1。
7.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述巨细胞病毒特异性荧光探针的5’标记有FAM荧光基团，3’标记有淬灭基团BHQ1。
8.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述EB病毒正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.15μmol/L，所述巨细胞病毒特异性正、反向引物的扩增体系终浓度均为0.08μmol/L，所述EB病毒特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.08μmol/L，所述巨细胞病毒特异性荧光探针的扩增体系终浓度为0.04μmol/L。
9.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品为生理盐水。
10.根据权利要求1所述的一种多重定量检测EB病毒和巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为基因合成方式制备的含EB病毒和巨细胞病毒的全长DNA，且浓度在1ⅹ104copies mL-2ⅹ104copies/mL。
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