CN115725727B

CN115725727B - 一种用于检测ar-v7及ar基因表达的锁式探针及试剂盒

Info

Publication number: CN115725727B
Application number: CN202110982454.3A
Authority: CN
Inventors: 叶定伟; 孙艳玲; 李勇; 许宝芝
Original assignee: Delutong Shijiazhuang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Delutong Shijiazhuang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-25
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2041-08-25
Also published as: CN115725727A

Abstract

本发明涉及一种用于检测AR‑V7及AR基因表达的锁式探针及试剂盒。所述用于检测AR‑V7及AR基因表达的锁式探针包括AR‑V7锁式探针和AR锁式探针，所述AR‑V7锁式探针包括SEQIDNO.1～SEQIDNO.12所示的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合，所述AR锁式探针包括SEQIDNO.13～SEQIDNO.21所示的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。所述锁式探针特异性更高，并具有纠错能力，可降低碱基错配率，且可利用滚环扩增方式放大信号，能够直接以细胞为样本，进行原位反转录及原位检测AR‑V7及AR基因表达，能够实现低成本、快速检测，并显著提高检测灵敏度。

Description

一种用于检测AR-V7及AR基因表达的锁式探针及试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种用于检测AR-V7及AR基因表达的锁式探针及试剂盒。

背景技术

前列腺癌是一种常见的恶性肿瘤，雄激素剥夺治疗(Androgen deprivationtherapy，ADT)是目前主要的治疗方法，尽管在ADT治疗初期前列腺癌被不同程度的控制，但经过一段时间的治疗后，大部分患者的疾病逐渐且不可逆地进展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostate cancer，CRPC)。

目前已有的药物阿比特龙与蒽杂鲁胺对于CRPC患者的治疗有较好的效果，但仍然有20％～40％的患者PSA维持在较高的水平，没有明显的疗效，且多数经阿比特龙与蒽杂鲁胺治疗的患者后期几乎都会发生获得性耐药，有研究表明，雄激素受体信号通路的异常属于耐药发生的可能机理之一，AR-V7是雄激素受体(AR)的一种截短形式的剪接异构体，AR-V7缺少配体结合区，可以不依赖雄激素的结合而对下游的信号通路进行持续的活化，引起细胞的异常增殖。

进一步的研究也表明，AR-V7阳性与经阿比特龙与蒽杂鲁胺治疗的CRPC患者的PSA响应率以及存活率呈明显的负相关，因此，AR-V7的检测在表征CRPC患者治疗效果方面具有重要意义，除了有助于指导前列腺癌的临床用药，在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌等其他肿瘤疾病治疗中进行AR-V7表达的检测，同样有助于内分泌类药物疗效以及耐药监测。

关于AR-V7的检测，目前主要的方法包括采集病人的样本(包括循环肿瘤细胞、血液细胞或外泌体等)后，进行mRNA的分离提取以及逆转录，最后通过qRT-PCR或dPCR法完成AR-V7的检测，如CN111500728A公开了一种检测人AR-V7及AR基因表达的引物探针组合物、试剂盒及检测方法，利用特异性的引物及探针分别扩增血液细胞RNA中的AR全长及AR-V7剪接体分子，进行基因表达检测；CN110923299A公开了一种用于AR-V7荧光qRT-PCR法快速定量检测用引物、探针及试剂盒，利用qRT-PCR法对AR-V7基因表达进行检测，但上述方案中需采用正向引物、反向引物及荧光探针，并采用qRT-PCR或dPCR等方法，存在成本高，周期长，扩增步骤繁琐，以及特异性低等问题。

综上所述，提供一种有效、快速、灵敏的AR-V7的检测试剂盒，对于指导前列腺癌等的临床用药具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测AR-V7及AR基因表达的锁式探针及试剂盒，所述锁式探针特异性更高，并具有强纠错能力，可降低碱基错配率，且能利用滚环扩增方式放大信号，更简单、快速且经济，并能显著提高检测灵敏度。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于检测AR-V7及AR基因表达的锁式探针，所述用于检测AR-V7及AR基因表达的锁式探针包括AR-V7锁式探针和AR锁式探针，所述AR-V7锁式探针包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合，所述AR锁式探针包括SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.21所示的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，首次创造性设计针对AR-V7及AR基因的锁式探针(padlock探针)，所述锁式探针具备高特异性及纠错能力，能够高特异性地与靶序列结合，并经DNA连接酶特异性催化形成环形分子，随后可利用滚环扩增高效放大环形分子信号，更简单、快速且经济，并显著提高检测灵敏度及特异性。

SEQ ID NO.1：

AAAAATTCCGGGTTGTTCCTTTTACGACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTCTTCGGATGACTCTGGGAG。

SEQ ID NO.2：

GGCTGACTTGCCTCATTAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCGGCTATCACCAGACCCTGAAGAAA。

SEQ ID NO.3：

GGTTACCACTCATGTAGAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCGCCTATCGGGCTGTAGAAGTAATAGT。

SEQ ID NO.4：

TGCTTTTCGTGGTGTAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCGTCTATCTCTGGCTCAGTCGCT。

SEQ ID NO.5：

TGTCTGTCTGAGGTTCCTAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCGACTATCTTGGACAAGAAGCAACTG。

SEQ ID NO.6：

CTAGCCTTCTGGATCCCAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCCGCTATCTATTTCCCCCTTAGGTT。

SEQ ID NO.7：

AGCTGATCCACAGAAGTTAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCATCTATCACTGAGCTGAAGGTAGT。

SEQ ID NO.8：

GTCCGACTTTCCCTCTTAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCCTCTATCCACACTGAGAGACTACA。

SEQ ID NO.9：

TGCTTCTCTTCATCAGTAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCCACTATCTGCTCTCTCACATCACA。

SEQ ID NO.10：

CCATAGCTTCCATATTGACAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCAGCTATCATCTTGTTCTCTCTCTGCT。

SEQ ID NO.11：

GGATGCAGTGAAGCAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCGGCTATCACTGACTCAGGC。

SEQ ID NO.12：

TCAACACAGACTTTAACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCGGCTATCTAGGTTTTTGCTCC。

SEQ ID NO.13：

AGTGGATGGGCTGAAAACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCAACTATCCTCTTCAGCATTATTCC。

SEQ ID NO.14：

TCTACCAGCTCACCAAACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCTACTATCCCTGCTCAAGACGCT。

SEQ ID NO.15：

GCGAGAGAGCTGCATAACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCACCTATCTCCGTGCAGCCTATT。

SEQ ID NO.16：

TCATCTCTGTGCAAGTAACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCTTCTATCAAATGATGGCAGAGA。

SEQ ID NO.17：

TCTATTTCCACACCCAGTAACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCTGCTATCGGAAAGTCAAGCCCA。

SEQ ID NO.18：

TTTTTCTTCTTCCCTCCCAACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCTCCTATCCTCTTTCTCTCCTTTC。

SEQ ID NO.19：

GGGCCAAGGCCTTGCCTGGCCTCAATGCACATGTTTGGCTCCTAAAGTCGGAAGTACTACTCTCTCTTGTACACGTGGTCAAGT。

SEQ ID NO.20：

AAAATCCCACATAACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCAACTATCTGCATGCAAAAGAA。

SEQ ID NO.21：

AACTTCGAATGAAACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAATGCGTCTATTTAGTGGAGCCAACTATCAATTCTTTGATG。

本发明中，可将AR基因作为检测AR-V7基因表达的内参基因。

第二方面，本发明提供第一方面所述的用于检测AR-V7及AR基因表达的锁式探针在制备AR-V7及AR基因表达检测产品中的应用。

第三方面，本发明提供一种检测AR-V7及AR基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测AR-V7及AR基因表达的锁式探针。

优选地，所述试剂盒还包括细胞处理试剂、反转录试剂、锁式探针结合试剂、扩增试剂、检测试剂或循环上皮细胞采样针中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述细胞处理试剂包括固定液、清洗液或透化液中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述固定液包括多聚甲醛。

优选地，所述多聚甲醛的质量分数为2％～5％，包括但不限于2.5％、3％、3.5％、4％、4.2％、4.6％或4.8％。

优选地，所述清洗液包括磷酸盐吐温缓冲液(PBST)。

优选地，所述磷酸盐吐温缓冲液的体积分数为0.02％～0.08％，包括但不限于0.03％、0.04％、0.05％、0.06％或0.07％。

优选地，所述所述透化液(HCl-DEPC-H₂O)包括浓盐酸和焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC-H₂O)。

优选地，所述HCl-DEPC-H₂O的浓度为0.05～0.2mol/L，包括但不限于0.06mol/L、0.07mol/L、0.08mol/L、0.1mol/L、0.12mol/L、0.14mol/L、0.16mol/L或0.18mol/L。

优选地，所述反转录试剂包括反转录引物、反转录酶(TranscriptMe RT)、核糖核酸酶抑制剂(RNase inhibitor)、缓冲液(RT buffer)、dNTP混合物(dNTP Mix)、牛血清白蛋白(BSA)或焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC-H₂O)中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述反转录试剂包括反转录引物、TranscriptMe RT、RNase Inhibitor、RT Buffer、dNTP Mix、BSA和DEPC-H₂O。

优选地，所述反转录引物包括AR-V7反转录引物和AR反转录引物。

优选地，所述AR-V7反转录引物包括SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.26所示的核酸序列。

SEQ ID NO.22：AAGCCACATTACAGGAAACA。

SEQ ID NO.23：ACAAATAAAGATGGCCACAG。

SEQ ID NO.24：AAGGCTAGATGTAAGAGG。

SEQ ID NO.25：GACTCCACTTCTCCACTA。

SEQ ID NO.26：GGGTCTGGTCATTTTGAGATGC。

优选地，所述AR反转录引物包括SEQ ID NO.27～SEQ ID NO.36所示的核酸序列。

SEQ ID NO.27：TGATTTTTCAGCCCA。

SEQ ID NO.28：GAGTTCCTTGATGTAGT。

SEQ ID NO.29：GATTAGCAGGTCAAAAGTG。

SEQ ID NO.30：AGAAAGGATCTTGGGCAC。

SEQ ID NO.31：TTCCAATGCTTCACT。

SEQ ID NO.32：TGGGGTGGGGAAATAGG。

SEQ ID NO.33：GAAGACATCTGAAAGGGGG。

SEQ ID NO.34：TGGGAGGGTTAGATAGGGAG。

SEQ ID NO.35：AATGGGAAGCAAAGTCTGAA。

SEQ ID NO.36：CCATCTGGTCGTCCACGTGTAAGTT。

优选地，所述TranscriptMe RT的终浓度为15～20U/μL，包括但不限于16U/μL、17U/μL、18U/μL或19U/μL。

优选地，所述AR-V7反转录引物的终浓度为0.5～1μM，包括但不限于0.6μM、0.7μM、0.8μM或0.9μM。

优选地，所述AR反转录引物的终浓度为0.5～1μM，包括但不限于0.6μM、0.7μM、0.8μM或0.9μM。

优选地，所述RT Buffer的终浓度为1×。

优选地，所述dNTP Mix的终浓度为0.2～0.5mM，包括但不限于0.25mM、0.3mM、0.34mM、0.36mM、0.4mM或0.48mM。

优选地，所述BSA的终浓度为0.2～0.4μg/μL，包括但不限于0.22μg/μL、0.23μg/μL、0.25μg/μL、0.28μg/μL、0.3μg/μL、0.32μg/μL、0.34μg/μL、0.36μg/μL或0.38μg/μL。

优选地，所述锁式探针结合试剂包括DNA连接酶(Ampligase)、核糖核酸酶H(RNaseH)、DNA连接酶缓冲液(AMP Buffer)、牛血清白蛋白(BSA)、氯化钾(KCl)、甲酰胺或焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC-H₂O)中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述锁式探针结合试剂包括Ampligase、RNase H、AMPBuffer、BSA、KCl、甲酰胺和DEPC-H₂O。

优选地，所述Ampligase的终浓度为0.2～0.5U/μL，包括但不限于0.25U/μL、0.3U/μL、0.34U/μL、0.36U/μL、0.4U/μL或0.48U/μL。

优选地，所述RNase H的终浓度为0.2～0.4U/μL，包括但不限于0.25U/μL、0.3U/μL、0.34U/μL、0.36U/μL、0.37U/μL或0.38U/μL。

优选地，所述AMPBuffer的终浓度为1×。

优选地，所述BSA的终浓度为0.2～0.4μg/μL，包括但不限于0.22μg/μL、0.24μg/μL、0.26μg/μL、0.3μg/μL、0.32μg/μL、0.36μg/μL或0.38μg/μL。

优选地，所述KCl的终浓度为0.01～0.05M，包括但不限于0.02M、0.03M或0.04M。

优选地，所述甲酰胺的终浓度为10％～20％，包括但不限于12％、14％、15％、16％、18％或19％。

优选地，所述扩增试剂包括滚环扩增引物(RCAPrimer)、DNA聚合酶、聚合酶缓冲液(Buffer)、dNTP混合物(dNTP Mix)、牛血清白蛋白(BSA)、甘油或焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC-H₂O)中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述扩增试剂包括RCAPrimer、DNA聚合酶、Buffer、dNTP Mix、BSA、甘油和DEPC-H₂O。

优选地，所述滚环扩增引物包括SEQ ID NO.37所示的核酸序列。

SEQ ID NO.37：GGCTCCACTAAATAGACGCA。

优选地，所述滚环扩增引物的终浓度为0.1～0.4μM，包括但不限于0.2μM、0.22μM、0.24μM、0.28μM、0.3μM、0.32μM、0.34μM、0.36μM或0.38μM。

优选地，所述DNA聚合酶的终浓度为0.5～1U/μL，包括但不限于0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL或0.9U/μL。

优选地，所述Buffer的终浓度为1×。

优选地，所述BSA的终浓度为0.2～0.4μg/μL，包括但不限于0.22μg/μL、0.24μg/μL、0.26μg/μL、0.28μg/μL、0.3μg/μL、0.32μg/μL、0.36μg/μL、0.38μg/μL或0.39μg/μL。

优选地，所述甘油的终浓度为2％～5％，包括但不限于2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、3.2％、3.6％、4％、4.2％、4.4％、4.6％或4.8％。

优选地，所述检测试剂包括检测探针、杂交缓冲液(2×Hyb Buffer)、细胞核染料(DAPI)和焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC-H₂O)中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述检测试剂包括检测探针、2×Hyb Buffer、DAPI和DEPC-H₂O。

优选地，所述检测探针包括AR-V7检测探针和AR检测探针。

优选地，所述AR-V7检测探针经过Cy3(D0001 Lin16 Cy3)标记。

优选地，所述AR检测探针经过Cy5(D0004 Lin33 Cy5)标记。

优选地，所述AR-V7检测探针包括SEQ ID NO.38所示的核酸序列。

SEQ ID NO.38：CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC。

优选地，所述AR检测探针SEQ ID NO.39所示的核酸序列。

SEQ ID NO.39：CCTCAATGCACATGTTTGGCTCC。

优选地，所述D0001 Lin16 Cy3的终浓度为0.1～0.5μM，包括但不限于0.2μM、0.22μM、0.24μM、0.28μM、0.3μM、0.32μM、0.4μM、0.36μM或0.48μM。

优选地，所述D0004 Lin33 Cy5的终浓度为0.1～0.5μM，包括但不限于0.2μM、0.22μM、0.24μM、0.28μM、0.3μM、0.32μM、0.4μM、0.46μM或0.48μM。

优选地，所述2×Hyb Buffer的终浓度为1×。

优选地，所述DAPI的终浓度为0.5～2μg/mL，包括但不限于0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL或1.8μg/mL。

优选地，所述循环上皮细胞采样针包括循环上皮细胞采样针。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的检测AR-V7及AR基因表达的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：

(1)利用所述反转录试剂对待测样本进行反转录，获得反转录产物；

(2)利用所述锁式探针和锁式探针结合试剂对所述反转录产物进行探针杂交，获得杂交产物；

(3)以所述杂交产物为模板，利用所述扩增试剂进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；

(4)利用所述检测试剂对所述滚环扩增产物进行检测，分析结果。

优选地，所述待测样本包括血液细胞和/或循环肿瘤细胞。

优选地，采用所述循环上皮细胞采样针采集循环肿瘤细胞。

作为优选的技术方案，所述使用方法包括以下步骤：

(1)利用所述循环上皮细胞采样针采集循环肿瘤细胞；

(2)利用所述细胞处理试剂对所述循环肿瘤细胞进行处理；

(3)以步骤(2)处理后的循环肿瘤细胞为模板，利用所述反转录试剂进行反转录，获得反转录产物；

(4)利用所述锁式探针和锁式探针结合试剂对所述反转录产物进行探针杂交，获得杂交产物；

(5)以所述杂交产物为模板，利用所述扩增试剂进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；

(6)利用所述检测试剂对所述滚环扩增产物进行荧光检测，并利用荧光显微镜观察荧光信号，分析结果。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明中，首次创造性设计针对AR-V7及AR基因的锁式探针(padlock探针)，所述所示探针具备高特异性及纠错能力，能够高特异特异性地与靶序列结合，并由DNA连接酶特异性催化形成环形分子，随后可利用滚环扩增高效放大环形分子信号，更简单、快速且经济，并显著提高检测灵敏度及准确性；

(2)本发明设计12条AR-V7锁式探针，组合采用12条AR-V7锁式探针进行检测，利用探针间相互配合，能够进一步提高检测的灵敏度；

(3)本发明的检测AR-V7及AR基因表达的试剂盒能进行高灵敏度和特异性检测，能够直接以细胞为样本，进行原位反转录及原位检测AR-V7及AR基因表达，与病理组织免疫荧光染色结果相比，本试剂盒检测灵敏度为95％以上，特异性为95％以上，准确度为95％以上，具有较好的检测效果。

附图说明

图1为前列腺癌患者的循环肿瘤细胞荧光信号结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

本发明实施例中以所述检测AR-V7及AR基因表达的试剂盒进行AR-V7及AR基因表达检测，所述试剂盒包括padlock探针、细胞处理试剂、反转录试剂、padlock探针结合试剂、扩增试剂组和检测试剂，其中，细胞处理试剂用于对采集的循环肿瘤细胞样本进行处理，反转录试剂用于对循环肿瘤细胞样本中靶基因转录产生的mRNA序列进行反转录形成cDNA序列，padlock探针结合试剂用于padlock探针与cDNA序列进行配对结合，与靶序列结合的padlock探针被环化作为扩增模板，扩增试剂用于对扩增模板进行滚环扩增，检测试剂用于使带有不同荧光的探针分别与各自的底物结合，从而可利用荧光显微镜在合适激发光照射观察到目标序列，得到待测基因的表达情况。

本发明实施例中，细胞处理试剂包括固定液、清洗液和透化液，其中，固定液采用甲醛，清洗液采用0.05％PBST，透化液采用0.1M HCl-DEPC-H₂O。

本发明实施例中，反转录试剂包括反转录引物(AR-V7反转录引物和AR反转录引物)、TranscriptMe RT，RNase Inhibitor、Primer-AR-V7、Primer-AR-FL、RT Buffer、dNTPMix、BSA和DEPC-H₂O，其中，AR-V7反转录引物为：SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.26，AR反转录引物为：SEQ ID NO.27～SEQ ID NO.36，此外，TranscriptMe RT的终浓度为20U/μL，RNaseInhibitor的终浓度为1U/μL，反转录引物的终浓度为1μM，RT Buffer的终浓度为1×，dNTPMix的终浓度为0.5mM，BSA的终浓度为0.4μg/μL。

本发明实施例中，若无特殊说明，所述AR-V7 padlock探针为SEQ ID NO.1～SEQID NO.12，所述AR padlock探针为SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.21，padlock探针结合试剂包括Ampligase、RNase H、AMP Buffer、BSA、KCl、甲酰胺和DEPC-H₂O，其中，锁式探针终浓度为0.1μM，Ampligase的终浓度为0.5U/μL，RNase H的终浓度为0.4U/μL，AMPBuffer的终浓度为1×，BSA的终浓度为0.4μg/μL，KCl的终浓度为0.05M，甲酰胺的终浓度为20％。

本发明实施例中，扩增试剂包括DNA聚合酶、RCAPrimer、Buffer、dNTP Mix、BSA、甘油和DEPC-H₂O，其中，RCAPrimer为SEQ ID NO.37，DNA聚合酶的终浓度为1U/μL，RCAPrimer的终浓度为0.1μM，Buffer的终浓度为1×，dNTP Mix的终浓度为0.25mM，BSA的终浓度为0.4μg/μL，甘油的终浓度为5％。

本发明实施例中，检测试剂包括检测探针、2×Hyb Buffer、DAPI和DEPC-H₂O，其中，检测探针包括AR-V7检测探针(D0001 Lin16 Cy3，SEQ ID NO.38)和AR检测探针(D0004Lin33 Cy5，SEQ ID NO.39)，D0001 Lin16 Cy3的终浓度为0.1μM，D0004 Lin33 Cy5的终浓度为0.1μM，2×Hyb Buffer的终浓度为1×，DAPI的终浓度为2μg/mL。

本发明实施例中，作为优选实施形式，所述试剂盒还包括CellCollector采样针，该采样针的一端具有功能区，该功能区即用于采集循环肿瘤细胞样本，具体实施时，本实施例的采样针采用循环上皮细胞采样针产品(德国Gilupi公司)，采样针进行样本采集时，采样方法见/>采样针使用说明即可。

本发明实施例中，需要的设备有恒温孵育箱或水浴锅、离心机、移液器，以及若干1.5mL/50mL离心管(无DNase和RNase)、带滤芯移液器吸头(无DNase和RNase)和S-tube45管(连云港宁康石英制品有限公司)，所使用的试剂采用如下表1所示的产品。

表1

本发明实施例中需配制使用的试剂的配制方法见下述表2所示。

表2

实施例1

本实施例使用循环上皮细胞采样针采集某前列腺癌患者的循环肿瘤细胞，采样方法见/>采样针使用说明即可，并对细胞进行处理，细胞处理包括以下步骤：

(1)固定：将含有循环肿瘤细胞的采样针置于甲醛中25℃固定30min；

(2)清洗：25℃使用PBST清洗固定后细胞5min；

(3)透化：25℃使用0.1mol/LHCl-DEPC-H₂O处理清洗后细胞5min；

(4)清洗：25℃使用PBST清洗透化后细胞2次，5min/次。

实施例2

本实施例对实施例处理后的循环肿瘤细胞进行反转录，包括以下步骤：

(1)在S-tube45管中加反转录试剂，各组分的体积为TranscriptMe RT：4.5μL，RNase Inhibitor：1.125μL、AR-V7反转录引物：4.5μL、AR反转录引物：4.5μL、RT Buffer：4.5μL、dNTP Mix：2.25μL、BSA：0.9μL、DEPC-H2O：18.225μL；

(2)将实施例1中含有处理后循环肿瘤细胞的采样针上黄帽推至接近采样针金层的位置，并将采样针功能区插入S-tube45管中；

(3)将黄帽套在S-tube45管上封口，防止反应液蒸发，恒温孵育箱中45℃反应3h；

(4)再固定及清洗，将步骤(3)反应完成采样针置于甲醛中25℃固定10min，使用PBST清洗2次，2min/次，得到反转录产物。

实施例3

本实施例利用实施例2制备的反转录产物与锁式探针进行杂交，包括以下步骤：

(1)向S-tube45管中加入padlock探针及padlock探针结合试剂，各组分的体积为AR-V7padlock探针：0.45μL，AR padlock探针：0.45μL，Ampligase：4.5μL、RNase H：3.6μL、AMP Buffer：4.5μL、BSA：0.9μL、KCl：2.25μL、甲酰胺：9μL、DEPC-H2O：18.9μL；

(2)将实施例2中含有反转录产物的采样针上黄帽推至接近采样针金层的位置，采样针功能区插入S-tube45管中，应注意采样针功能区尽量不接触管内壁；

(3)将黄帽套在S-tube45管上封口，以防止反应液蒸发，恒温孵育箱中37℃孵育50min，然后45℃孵育55min；

(4)随后将孵育后的采样针置于37℃的2×SSC-Tween中清洗5min随后置于25℃的PBST中清洗2次，2min/次，完成杂交，获得杂交产物。

实施例4

本实施例对实施例3制备的杂交产物进行滚环扩增，包括以下步骤：

(1)向S-tube45管中加扩增试剂，各组分的体积为RCAPrimer：0.45μL，DNA聚合酶：4.5μL、Buffer：4.5μL、dNTPMix：1.125μL、BSA：0.9μL、甘油：4.5μL、DEPC-H2O：29.025μL；

(2)将实施例3中含有杂交产物的采样针的黄帽推至接近采样针金层的位置，采样针功能区插入S-tube45管中，应注意采样针功能区尽量不接触管内壁；

(3)将黄帽套在S-tube45管上封口，以防止反应液蒸发，25℃过夜孵育；

(4)置于25℃的PBST中清洗2次，2min/次，获得滚环扩增产物。

实施例5

本实施例对实施例4制备的滚环扩增新产物进行荧光标记并进行基因表达分析，包括以下步骤：

(1)向S-tube45管中加检测试剂，各组分的体积为：D0001 Lin16 Cy3：0.45μL，D0004Lin33 Cy5：0.45μL，2×Hyb Buffer：22.5μL，DAPI：0.9μL，DEPC-H₂O：20.25μL；

(2)将实施例4中含有滚环扩增产物的采样针的黄帽推至接近采样针金层的位置，采样针功能区插入S-tube45管中，应注意采样针功能区尽量不接触管内壁；

(3)将黄帽套在S-tube45管上封口，以防止反应液蒸发，恒温孵育箱中37℃孵育30min；

(4)将采样针置于25℃PBST中清洗2次，2min/次；

(5)依次用70％、85％、100％酒精进行梯度脱水，各作用2min，25℃干燥2min；

(6)在荧光显微镜下干燥拍摄检测结果，分别检测4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，发出蓝色荧光)荧光，Cy3染料(与AR-V7检测探针特异结合并显橙色)荧光和Cy5染料(与AR检测探针特异结合并显红色)荧光。

若细胞内Cy3检测通道有阳性信号点，则判为AR-V7表达阳性，若细胞内Cy5检测通道有阳性信号点，则判为AR表达阳性，反之，若细胞内Cy3或Cy5检测通道没有阳性信号点，则判为对应基因表达阴性，以某前列腺癌患者的循环肿瘤细胞采样针样本为例，结果如图1所示，阳性对照为22RV1细胞系(中国科学院细胞库/干细胞库)，阴性对照为PC-3细胞系(中国科学院细胞库/干细胞库)，细胞内阳性信号点统计如表3所示。

表3

检测指标	通道	阳性信号点数
			AR-V7	Cy3	3
AR	Cy5	0
			AR-V7+AR	Cy3/Cy5	0

由表3可知，检测结果为AR-V7表达阳性，表明本发明试剂盒能够进行有效检测。

此外，选用AR-V7表达阳性细胞系22RV1和阴性细胞系PC-1按上述方法进行分析，分别利用细胞活性为95％以上的细胞，制备阳性质控针和阴性质控针各5支，分别编号1-5和6-10，分析本发明试剂盒的特异性。

在显微镜下统计DAPI蓝色细胞核，共计数统计100个细胞，分别读取其橙色/红色荧光的细胞数量，具体结果如表4所示。

表4

从表4检测结果可知，本发明提供的试剂盒具有较好的特异性，不存在非特异性信号干扰。

实施例6

本实施例分析本发明含有不同条数AR-V7 padlock探针的试剂盒的灵敏度和特异性。

分别使用本发明含有3条(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3)、5条(SEQ ID NO.1～SEQID NO.5)及12条AR-V7 padlock探针(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12)的检测试剂盒进行试验。

分析灵敏度：对AR-V7表达阳性标准品(阳性细胞系22RV1)进行检测，制备阳性质控针9支，分别编号P31-33、P51-53、P11-13，灵敏度的计算方法为：灵敏度＝橙色荧光信号细胞数/检测细胞数×100％，结果如表5所示。

分析特异性：分AR-V7表达阴性标准品(阴性细胞系PC-1)进行检测，制备阴性质控针9支，分别编号为N31-33、N51-53、N11-13，特异性的计算方法为：特异性＝(检测细胞数-橙色荧光信号细胞数-红色荧光信号细胞数)/检测细胞数×100％，结果如表6所示。

表5

表6

由表5和表6结果可知，使用3条、5条AR-V7 padlock探针检测的灵敏度均低于使用12条AR-V7 padlock探针，但特异性均为100％，表明在临床检测中，本发明创造性设计12条AR-V7 padlock探针并组合使用，利用探针间相互配合，能够进一步提高检测的灵敏度。

综上所述，本发明创造性地设计针对AR-V7和AR基因的padlock探针，所述padlock探针特异性更高，并具有超强的纠错能力，可降低碱基错配率，且可利用滚环扩增方式放大信号，利用所述padlock探针制备的试剂盒能够实现低成本、快速检测，并显著提高检测灵敏度。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 德路通（石家庄）生物科技有限公司

<120> 一种用于检测AR-V7及AR基因表达的锁式探针及试剂盒

<130> 20210820

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaaattccg ggttgttcct tttacgacct caatgctgct gctgtactac tcttcggatg 60

actctgggag 70

<210> 2

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggctgacttg cctcattaac ctcaatgctg ctgctgtact acaatgcgtc tatttagtgg 60

agccggctat caccagaccc tgaagaaa 88

<210> 3

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccact catgtagaac ctcaatgctg ctgctgtact acaatgcgtc tatttagtgg 60

agccgcctat cgggctgtag aagtaatagt 90

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcttttcgt ggtgtaacct caatgctgct gctgtactac aatgcgtcta tttagtggag 60

ccgtctatct ctggctcagt cgct 84

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtctgtctg aggttcctaa cctcaatgct gctgctgtac tacaatgcgt ctatttagtg 60

gagccgacta tcttggacaa gaagcaactg 90

<210> 6

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctagccttct ggatcccaac ctcaatgctg ctgctgtact acaatgcgtc tatttagtgg 60

agcccgctat ctatttcccc cttaggtt 88

<210> 7

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agctgatcca cagaagttaa cctcaatgct gctgctgtac tacaatgcgt ctatttagtg 60

gagccatcta tcactgagct gaaggtagt 89

<210> 8

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtccgacttt ccctcttaac ctcaatgctg ctgctgtact acaatgcgtc tatttagtgg 60

agccctctat ccacactgag agactaca 88

<210> 9

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgcttctctt catcagtaac ctcaatgctg ctgctgtact acaatgcgtc tatttagtgg 60

agcccactat ctgctctctc acatcaca 88

<210> 10

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccatagcttc catattgaca acctcaatgc tgctgctgta ctacaatgcg tctatttagt 60

ggagccagct atcatcttgt tctctctctg ct 92

<210> 11

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggatgcagtg aagcaacctc aatgctgctg ctgtactaca atgcgtctat ttagtggagc 60

cggctatcac tgactcaggc 80

<210> 12

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcaacacaga ctttaacctc aatgctgctg ctgtactaca atgcgtctat ttagtggagc 60

cggctatcta ggtttttgct cc 82

<210> 13

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agtggatggg ctgaaaacct caatgcacat gtttggctcc aatgcgtcta tttagtggag 60

ccaactatcc tcttcagcat tattcc 86

<210> 14

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctaccagct caccaaacct caatgcacat gtttggctcc aatgcgtcta tttagtggag 60

cctactatcc ctgctcaaga cgct 84

<210> 15

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcgagagagc tgcataacct caatgcacat gtttggctcc aatgcgtcta tttagtggag 60

ccacctatct ccgtgcagcc tatt 84

<210> 16

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcatctctgt gcaagtaacc tcaatgcaca tgtttggctc caatgcgtct atttagtgga 60

gccttctatc aaatgatggc agaga 85

<210> 17

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tctatttcca cacccagtaa cctcaatgca catgtttggc tccaatgcgt ctatttagtg 60

gagcctgcta tcggaaagtc aagccca 87

<210> 18

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttttcttct tccctcccaa cctcaatgca catgtttggc tccaatgcgt ctatttagtg 60

gagcctccta tcctctttct ctcctttc 88

<210> 19

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gggccaaggc cttgcctggc ctcaatgcac atgtttggct cctaaagtcg gaagtactac 60

tctctcttgt acacgtggtc aagt 84

<210> 20

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aaaatcccac ataacctcaa tgcacatgtt tggctccaat gcgtctattt agtggagcca 60

actatctgca tgcaaaagaa 80

<210> 21

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aacttcgaat gaaacctcaa tgcacatgtt tggctccaat gcgtctattt agtggagcca 60

actatcaatt ctttgatg 78

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aagccacatt acaggaaaca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acaaataaag atggccacag 20

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aaggctagat gtaagagg 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gactccactt ctccacta 18

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gggtctggtc attttgagat gc 22

<210> 27

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tgatttttca gccca 15

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gagttccttg atgtagt 17

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gattagcagg tcaaaagtg 19

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

agaaaggatc ttgggcac 18

<210> 31

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ttccaatgct tcact 15

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tggggtgggg aaatagg 17

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gaagacatct gaaaggggg 19

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tgggagggtt agatagggag 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aatgggaagc aaagtctgaa 20

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ccatctggtc gtccacgtgt aagtt 25

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ggctccacta aatagacgca 20

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cctcaatgct gctgctgtac tac 23

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cctcaatgca catgtttggc tcc 23

Claims

1.一种用于检测AR-V7及AR基因表达的反转录引物和锁式探针组合，其特征在于，所述锁式探针包括AR-V7锁式探针和AR锁式探针；

所述AR-V7锁式探针的核酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.12所示；

所述AR锁式探针的核酸序列如SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.21所示；

所述反转录引物包括AR-V7反转录引物和AR反转录引物；

所述AR-V7反转录引物的核酸序列如SEQ ID NO.22~SEQ ID NO.26所示；

所述AR反转录引物的核酸序列如SEQ ID NO.27~SEQ ID NO.36所示。

2.权利要求1所述的用于检测AR-V7及AR基因表达的反转录引物和锁式探针组合在制备AR-V7及AR基因表达检测产品中的应用。

3.一种检测AR-V7及AR基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测AR-V7及AR基因表达的反转录引物和锁式探针组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞处理试剂、反转录试剂、锁式探针结合试剂、扩增试剂、检测试剂或循环上皮细胞采样针中的任意一种或至少两种的组合；

所述检测试剂包括检测探针、杂交缓冲液、细胞核染料或焦碳酸二乙酯处理的水中的任意一种或至少两种的组合；

所述检测探针包括AR-V7检测探针和AR检测探针；

所述AR-V7检测探针的核酸序列如SEQ ID NO.38所示；

所述AR检测探针的核酸序列如SEQ ID NO.39所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述细胞处理试剂包括固定液、清洗液或透化液中的任意一种或至少两种的组合；

所述固定液包括多聚甲醛；

所述清洗液包括磷酸盐吐温缓冲液；

所述透化液包括浓盐酸和焦碳酸二乙酯处理的水。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录试剂包括反转录引物、反转录酶、核糖核酸酶抑制剂、缓冲液、dNTP混合物、牛血清白蛋白或焦碳酸二乙酯处理的水中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述锁式探针结合试剂包括DNA连接酶、核糖核酸酶H、DNA连接酶缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钾、甲酰胺或焦碳酸二乙酯处理的水中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括滚环扩增引物、DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、dNTP混合物、牛血清白蛋白、甘油或焦碳酸二乙酯处理的水中的任意一种或至少两种的组合；

所述滚环扩增引物的核酸序列如SEQ ID NO.37所示。

9.如权利要求4-8任一项所述的检测AR-V7及AR基因表达的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：

（1）利用所述反转录试剂对待测样本进行反转录，获得反转录产物；

（2）利用所述锁式探针和锁式探针结合试剂对所述反转录产物进行探针杂交，获得杂交产物；

（3）以所述杂交产物为模板，利用所述扩增试剂进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；

（4）利用所述检测试剂对所述滚环扩增产物进行检测，分析结果。

10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述待测样本包括血液细胞和/或循环肿瘤细胞；

采用所述循环上皮细胞采样针采集循环肿瘤细胞。

11.根据权利要求10所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：

（1）利用所述循环上皮细胞采样针采集循环肿瘤细胞；

（2）利用所述细胞处理试剂对所述循环肿瘤细胞进行处理；

（3）以步骤（2）处理后的循环肿瘤细胞为模板，利用所述反转录试剂进行反转录，获得反转录产物；

（4）利用所述锁式探针和锁式探针结合试剂对所述反转录产物进行探针杂交，获得杂交产物；

（5）以所述杂交产物为模板，利用所述扩增试剂进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；

（6）利用所述检测试剂对所述滚环扩增产物进行荧光检测，并利用荧光显微镜观察荧光信号，分析结果。