CN108707662A - 一种ar-v7表达检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种AR‑V7表达检测试剂盒，其包括针对检测AR‑V7mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，所述捕获探针为茎环状，用于连接目标mRNA与扩增探针；所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。本发明所述检测试剂盒，具有特异性高、信噪比高、准确率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种AR-V7表达检测试剂盒。
背景技术
前列腺癌是一种发生在前列腺的上皮恶性肿瘤，是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其发生受到多种因素的影响，包括年龄、种族、生活习惯、肥胖以及家族病史等。据统计，2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。前列腺癌是雄激素依赖性的肿瘤，雄激素可促进前列腺癌细胞的增殖，通过内分泌疗法降低体内的雄激素水平或拮抗其作用可抑制肿瘤细胞生长，促进其凋亡，因此，内分泌治疗是临床中晚期前列腺癌的首选疗法。然而，经过中位时间为18-24个月的内分泌治疗后，几乎所有的患者终将进展至激素抵抗阶段，即去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)，预后较差。CRPC是前列腺癌治疗领域的共性难题，目前尚缺乏可供临床应用的预测前列腺癌进展至CRPC的分子标志物。
雄激素在前列腺癌的发生和发展中发挥着至关重要的作用，其与胞质中的雄激素受体(androgen receptor,AR)结合进入胞核后发挥生物学作用。目前研究已发现多种AR剪接变异体，这些处于激活状态的AR剪接变异体可能是导致前列腺癌进展至CRPC的重要因素。其中AR-V7(雄激素受体剪接变异体7)是研究最广泛且在前列腺癌中表达最高的剪接变异体之一。众多研究结果显示，AR-V7的表达可作为激素敏感时间的独立且最强的预测因子。因此，对前列腺癌患者体内AR-V7的表达进行检测不仅可以指导患者用药，更是一个潜在的治疗靶点。目前对AR剪接体的检测方法主要包括PCR、PCR-SSCP、Northern blot和免疫组织化学法等，这些方法均无荧光信号放大系统，一定程度上限制了检测的灵敏度和准确性。而目前利用探针直接检测AR-V7的原位杂交法中，选用的探针均为线性寡核苷酸探针，不能区分两端几个碱基的差异，存在非特异性杂交；且在探针杂交过程中，难以避免探针分子与基质本身(如滤膜)的非特异性结合，从而造成一定的荧光背景，降低信噪比和灵敏度。为此，急需提供一种灵敏度好、特异性强、准确率高、信噪比高的AR-V7检测探针和方法，对前列腺癌患者体内的的临床治疗提供AR-V7进行检测，帮助医生制定更好更有效的治疗方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、准确率高、信噪比高的AR-V7表达检测试剂盒，用于检测前列腺癌患者生物样本中AR-V7的表达水平，指导临床治疗。
实现上述目的的技术方案如下：
一种AR-V7表达检测试剂盒，包括针对检测目标mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述目标mRNA为AR-V7；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针为茎环状，用于连接目标mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和R-V7mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和目标mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。
在其中一个实施例中，所述捕获探针中的特异性P1序列与目标mRNA完全互补，同时P2序列与P3序列完全互补，形成目标mRNA-捕获探针-扩增探针复合体时，捕获探针两侧形成的张力才能将茎环状结构打开，标记探针才能与扩增探针的P4序列结合，使目标mRNA带上荧光标记。
在其中一个实施例中，所述目标mRNA还包括针对内参基因的mRNA，优选地，所述内参基因为ACTB，使用内参基因，有助于进一步保证检测结果的可靠性。
在其中一个实施例中，所述目标mRNA的捕获探针中：针对AR-V7mRNA的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的5条或5条以上；针对AR-V7mRNA的捕获探针的茎部结构序列为SEQ ID NO.21；针对AR-V7mRNA的捕获探针的序列P2为SEQ ID NO.22；所述针对AR-V7mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.23，P4序列为SEQ ID NO.24。
在其中一个实施例中，针对ACTB基因mRNA的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的5条或5条以上；针对ACTB基因mRNA的捕获探针的茎部结构序列为SEQ IDNO.25；针对ACTB基因mRNA的捕获探针的序列P2为SEQ ID NO.26；所述针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.27，P4序列为SEQ ID NO.28。
在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5－10个的碱基序列，更优选地，碱基序列为5－10个T。
在其中一个实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。
本发明的主要优点在于：
(1)提供了一种特异性高的目标mRNA原位检测探针，所述检测探针包括捕获探针、扩增探针和标记探针。所述捕获探针为茎环状，当茎环的特异性P1序列与目标mRNA序列完全互补，同时茎环的P2序列与扩增探针的P3序列完全互补时，捕获探针两侧形成的张力才能将茎环状结构打开，使目标mRNA带上荧光，实现检测。传统的线性寡核苷酸检测探针不能区分目标mRNA两端几个碱基的差异，存在非特异性杂交，一定程度上降低了检测的准确率。而本发明提供的检测探针只有在P1序列和目标mRNA序列完全互补时茎环结构才会被打开，使目标mRNA带上荧光标记，从而避免了非特异性杂交，显著提高检测的特异性。
(2)本发明所提供的试剂盒信噪比高、准确率高：当目标mRNA序列与扩增探针P3序列完全与茎环状捕获探针的P1和P2序列互补时，茎环结构消失，探针被拉直，带有荧光基团的标记探针与目标mRNA-捕获探针-扩增探针复合体结合，使目标mRNA被带上荧光标记，从而产生信号放大效果。当捕获探针的特异性序列P1遇到非目标mRNA的序列时，两者不能完全互补，捕获探针茎环状结构不能被打开，其上的P2序列无法与信号放大系统结合，从而不产生荧光信号。此外，茎环状捕获探针分子与基质表面(如滤膜)接触面积小于线性寡核苷酸探针，一定程度上也降低了背景荧光的产生，从而增加信噪比，提高准确率。
(3)本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
(4)RNA原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的RNA原位杂交方法，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明所述试剂盒检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的mRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏度。本发明使用级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
附图说明
图1是本发明AR-V7阴性和阳性检测结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及了前列腺癌患者AR-V7表达检测方法，主要包括以下步骤：
(1)得到前列腺癌患者生物样本；
(2)对样本进行前处理，使mRNA暴露；
(3)检测AR-V7mRNA是否存在。
所述检测前列腺癌患者AR-V7是否存在，包括以下步骤：
(3.1)捕获探针与AR-V7mRNA序列和扩增探针结合；每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端互补形成茎环结构，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和目标mRNA之间均不存在特异性结合的序列；每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.3)所述扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；
(3.4)通过荧光检测仪检测。
实施例1
本实施例所述的AR-V7检测试剂盒，主要包括有：
一、捕获探针
捕获探针由四部分组成，5’端至3’端依次是茎部结构序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与扩增探针P3序列结合的P2序列，同一目标mRNA其捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5-10个T，本实施例优选为5个T。针对每个mRNA分别设计10条捕获探针，在保证整个检测系统的稳定性的基础，再提高检测的特异性。(具体使用时，针对每种目标基因，选择5条或5条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例6)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标mRNA捕获探针的特异性P1序列见表1，不同类型的目标mRNA的捕获探针的茎部结构序列见表2，P2序列见表3。
表1目标mRNA捕获探针的P1序列
表2捕获探针的茎部结构序列
| mRNA | 捕获探针茎部结构序列(5’→3’) | SEQ ID NO. |
| AR-V7 | GTAAGATG | 21 |
| ACTB | TCACTGAG | 25 |
表3捕获探针的P2序列
| mRNA | 捕获探针P2序列(5’→3’) | SEQ ID NO. |
| AR-V7 | TTGATATAGAAGATTACATCTTAC | 22 |
| ACTB | GAACTGATGCATGCACCTCAGTGA | 26 |
二、扩增探针
扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分组成，5’端是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列，间隔臂序列，3’端是能与标记探针互补配对的序列P4，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增延伸探针间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T)。所述目标mRNA的扩增探针的P4序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
表4扩增探针的P3序列
| mRNA | 扩增探针P3序列(5’→3’) | SEQ ID NO. |
| AR-V7 | GTAAGATGTAATCTTCTATATCAA | 23 |
| ACTB | TCACTGAGGTGCATGCATCAGTTC | 27 |
表5扩增探针的P4序列
| mRNA | 扩增探针P4序列(5’→3’) | SEQ ID NO. |
| AR-V7 | GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG | 24 |
| ACTB | TCGATCAGTCCATTCGAAGCATC | 28 |
三、标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针序列P4互补结合的P5序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，标记探针的FL1和FL2选择的荧光基团互不相同，且所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标mRNA。
表6标记探针的P5序列
实施例2运用实施例1中试剂盒对样本进行检测
所述各种溶液的配方如下：
本实施例优选前列腺癌患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞(circulatingtumor cell，CTC)AR-V7表达水平进行检测，其中捕获混合液、扩增混合液、显色混合液均使用实施例1的AR-V7检测试剂盒相应列表中的全部探针。
一、样本预处理，将待检测细胞过滤至滤膜上
1.收集待检测细胞悬液，600×g水平离心5min，弃上清。
2.加入4mL PBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。
3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mL PBS，洗涤管壁后抽滤液体。
4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μl 4％甲醛溶液，室温固定1h。
5.去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤三次，每次浸泡2min。
二、透化处理
1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。
2.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
三、消化细胞，暴露mRNA，使其与探针杂交
1.配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75ul的PBS、1.25ul的消化酶，总体积50ul。
2.按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。
4.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。
四、探针杂交，形成目标mRNA序列-捕获探针-扩增探针复合体
1.捕获缓冲液、扩增缓冲液和显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制捕获工作液：对于每个样本，探针工作液组成如下：8ul探针混合液、42ul探针缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的探针工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2ul扩增混合液、48ul扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的扩增工作液，涡旋混匀，分装至已含有捕获工作液的24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上(同时包含捕获探针和扩增探针)，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
五、显色，荧光标记目标信号
1.配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成如下：2ul显色混合液、48ul显色缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
六、荧光显微镜观察AR-V7的表达
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。
2.通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量。
3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。
5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表7荧光基团的激发波长和发射波长
七、检测结果判断及分析
1.AR-V7表达判定标准
在滤膜上，富集有待检测细胞，本试剂盒阳性表达判定标准(参见图1)：
1)样本中有1个或1个以上细胞表达AR-V7mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。
2)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对AR-V7mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否为表达AR-V7。
2.使用上述检测方法，对15例前列腺癌患者外周血样本(编号1-15)进行检测，同时选用AR-V7阳性细胞株VCAP和阴性表达细胞株H1975作为阴阳性对照，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个VCAP和H1975细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，编号16-20和21-25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果为：
表8样本检测结果
检测发现，每个标本的每次检测结果相同，且由上述检测结果可知，本发明AR-V7检测试剂盒具有很好的特异性和灵敏度，能实现临床样品的检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对患者循环肿瘤细胞中AR-V7的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3捕获探针结构对试剂盒检测效果的影响
一、试剂盒制备的设计(捕获探针结构设计)
本发明针AR-V7检测试剂盒，针对AR-V7的检测设计了茎环状的捕获探针，与传统的线性寡核苷酸探针相比，茎环状的捕获探针可更有效避免非特异性杂交，同时降低探针与基质的结合，具有更高的特异性和准确率。
为了评估不同结构捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，其中实验组1选用本发明试剂盒中的茎环状捕获探针，实验组2选用线性捕获探针，两实验组除了捕获探针不同之外，其他组分均相同。所述线性捕获探针的组成结构为：从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，其中P1序列、间隔臂序列、P2序列与实验组1中的茎环状捕获探针完全相同，具体设计如表9所示。
表9试剂盒捕获探针的选择
| 实验组 | 捕获探针类型 | 捕获探针组成(5’→3’) |
| 实验组1 | 茎环状捕获探针 | 茎部结构序列、P1序列、间隔臂序列、P2序列 |
| 实验组2 | 线性捕获探针 | P1序列、间隔臂序列、P2序列 |
二、样本检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对前列腺癌患者血液样本26-35进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果为：
表10试剂盒选用不同捕获探针的检测结果比较
通过分析检测结果可知，与常规的线性捕获探针(实验组2)相比，本发明设计的茎环状捕获探针(实验组1)具有更高的特异性和准确度，检测结果与临床检测结果100％吻合。线性捕获探针由于不能区分两端几个碱基的差异，故存在一些非特异性杂交；同时线性探针分子与滤膜表面接触面积大于茎环状探针，在探针杂交过程中难以避免探针分子与滤膜本身的结合造成的非特异性荧光背景，因此线性捕获探针的非特异性荧光值高于茎环状捕获探针，导致一些假阳性结果的产生，故本发明设计的茎环状捕获探针具有更高的特异性和准确率。实施例4捕获探针的特异性
一、试剂盒制备的设计
本发明试剂盒提供一种茎环状的捕获探针，当捕获探针中的特异性P1序列与目标mRNA完全互补，同时P2序列与P3序列完全互补，形成目标mRNA-捕获探针-扩增探针复合体时，捕获探针两侧形成的张力才能将茎环状结构打开，标记探针才能与扩增探针的P4序列结合，使目标mRNA带上荧光标记。如目标mRNA上有1个或以上碱基不能与P1序列完全匹配，则茎环结构不能打开，导致mRNA不能通过捕获探针与信号放大系统相连，从而不产生荧光信号。
以检测AR-V7的捕获探针为例，设计实验组3-4，其中实验组3采用实施例1试剂盒相应列表中的全部探针，实验组4采用P1序列具有1-5个替换碱基的捕获探针，具体设计如表11所示，其他检测组分均与实验组3完全一致，。
表11捕获探针P1序列
二、样本检测
本实施例选用细胞株VCAP和H1975进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约VCAP和H1975细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号36-40和41-45。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本36-45进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，具体实验结果如下：
表12使用不同信号检测探针检测结果比较
从以上检测结果可知，当捕获探针特异性P1序列与AR-V7的mRNA不能完全互补配对时，在AR-V7阳性表达细胞株VCAP中基本上检测不到荧光信号，不能实现检测(实验组4)。本发明提供的茎环状捕获探针具有很高的特异性，当捕获探针P2序列与扩增探针P3序列完全匹配，但特异性P1序列不能与mRNA完全匹配时，探针保持茎环状，导致mRNA不能通过捕获探针与信号放大系统相连，从而不产生荧光信号，无法实现检测。同理，当实验组3的捕获探针遇上非AR-V7的mRNA时，亦不会产生非特异性杂交，即只要序列与AR-V7的mRNA存在1个或1个以上碱基的差异，都不能使茎环状捕获探针打开，不会产生荧光信号，因此，本发明提供的茎环状捕获探针具有很高的特异性，保证了检测结果的准确性。
实施例5内参基因的运用
一、试剂盒制备的设计(目标检测mRNA的选择)
本发明试剂盒目标检测mRNA包括AR-V7和ACTB的mRNA，为了检测内参基因的使用对检测效果的影响，设计实验组5-6，其中实验组5只检测RA-V7mRNA，实验组6同时检测AR-V7和ACTB的mRNA，具体设计如表13所示。
本实施例每组相应目标mRNA的所述捕获探针、扩增探针与标记探针的组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒A和实施例2所述。
表13目标检测mRNA选择
| 实验组 | 目标检测mRNA |
| 实验组5 | AR-V7 |
| 实验组6 | AR-V7、ACTB |
二、样本检测
本实施例选用细胞株VCAP和H1975进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约VCAP和H1975细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号46-50和51-55。按实施例2所述检测过程和方法对样本46-55进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果为：
表14试剂盒选用不同检测目标mRNA的检测结果比较
从上述检测结果可知，本发明试剂盒提供的AR-V7mRNA检测体系，既可以单独使用，也可与内参基因ACTB一起联合使用，均能实现AR-V7的精准检测，说明本发明提供的检测探针具有很好的特异性，相互之间不产生干扰。使用内参基因，可进一步提高检测结果的可靠性(实验组6)，但不使用内参基因也可完成检测(实验组5)，实现AR-V7表达的检测，且两者检测结果没有显著差异。
实施例6捕获探针的数量选择
一、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
本发明AR-V7表达检测试剂盒，针对不同的目标mRNA分别设计了10条捕获探针，且同一目标mRNA捕获探针中的P2序列相同。在实际使用时，可以针对每种目标mRNA，选择对应的至少5条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都能达到需求。
为考察捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，以AR-V7的捕获探针数量选择为例，参见实验组7-9，分别选取2条、5条及10条的捕获探针，对比其检测效果，试剂盒具体设计参见表15。
表15AR-V7捕获探针的选择
二、样本检测
本实施例选用市场上销售的细胞株VCAP和H1975进行实验。分别各取约VCAP和H1975细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号56-60和61-65。按实施例2所述检测过程和方法对样本56-65进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达红色/绿色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果为：
表16AR-V7使用不同数量捕获探针的检测结果比较
通过三组实验对比可知，针对AR-V7的检测，使用2条、5条和10条的捕获探针均可完成检测，但将当捕获探针使用5条或以上时，其特异性和稳定性才都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时，AR-V7检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。
针对ACTB基因mRNA捕获探针的数量的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。
实施例7间隔臂序列碱基数目的选择
一、试剂盒制备的设计(间隔臂序列碱基数目的选择)
本发明提供一种茎环状捕获探针，用于连接目标mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述茎部结构序列可与P2序列3’端互补形成茎环状结构。当茎环状结构被打开，探针被拉直，带有荧光基团的标记探针才能与扩增探针P4序列结合，使目标mRNA被带上荧光标记，从而实现检测。
本发明通过在捕获探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。虽然间隔臂的作用和使用方法，技术人员而言，是非常常见的。但本发明的发明人经过长期实验发现，对于本发明的茎环状捕获探针，必须要用到间隔臂，而且，在茎环状捕获探针的设计时，间隔臂序列长度也非常重要，合理的设计了各P1、、P2序列、颈环序列，还需要综合考虑间隔臂序列的使用问题，从而才能得到本发明所述的完整的适用的茎环状捕获探针。间隔臂序列长度只有在合数的情况下才会提高试剂盒的检测性能，反之会限制检测效果，甚至导致无法成功检测。为了研究间隔臂长度对试剂盒检测效果的影响，以AR-V7的为例，设计实验组10-14，捕获探针分别选择3、5、8、10和15个T作为间隔臂，对比其检测效果，具体设计参见表17，试剂盒其他探针序列和组分与实施例1完全一致。
表17间隔臂序列组成的选择
| 实验组 | 间隔臂序列组成 |
| 实验组10 | 3个T |
| 实验组11 | 5个T |
| 实验组12 | 8个T |
| 实验组13 | 10个T |
| 实验组14 | 15个T |
二、样本检测
本实施例选用有销售的细胞株VCAP和H1975进行实验。分别各取约VCAP和H1975细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号66-70和71-75。按实施例2所述检测过程和方法对样本66-75进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果为：
表18试剂盒选用不同间隔臂的检测结果比较
由上述检测结果可知，当间隔臂的组成为5-10个T时(实验组11-13)，试剂盒检测效果最好，能将样本中细胞完全检出。当间隔臂的组成小于5个T时(实验组10)，由于间隔臂序列过短而不能将捕获探针P2序列与目标mRNA有效间隔开来，导致可空间位阻过大，降低了杂交反应的效率以及荧光信号放大效果，使检测效果不稳定，大量阳性细胞不能有效被检出；当间隔臂的组成大于10个T时(实验组14)，造成了过大的空间位阻，导致当目标mRNA和扩增探针结合到捕获探针两侧时，形成的张力不足以将茎环结构打开，从而无法使目标mRNA带上荧光信号，导致检测失败。因此，当捕获探针的间隔臂序列为5-10个T之间时，试剂盒检测效果达到最好，小于5个T或大于10个T均会大大降低试剂盒检测性能，甚至导致无法检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种AR-V7表达检测试剂盒
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Claims (10)
1.一种AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对检测AR-V7mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针为茎环状，用于连接目标mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和AR-V7mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和AR-V7mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。
2.根据权利要求1所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针中的特异性P1序列与目标mRNA完全互补，且P2序列与P3序列完全互补。
3.根据权利要求2所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，针对AR-V7mRNA的捕获探针中：特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的5条或5条以上；针对AR-V7mRNA的捕获探针的茎部结构序列为SEQ ID NO.21；针对AR-V7mRNA的捕获探针的序列P2为SEQID NO.22；针对AR-V7mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.23，P4序列为SEQ ID NO.24。
4.根据权利要求1所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有针对内参基因的mRNA的捕获探针以及信号放大系统，针对内参基因的mRNA的捕获探针以及信号放大系统与针对AR-V7mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针的末端修饰的荧光基团互不相同。
5.根据权利要求4所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB。
6.根据权利要求5所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，所述ACTB mRNA的捕获探针中：特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的5条或5条以上；针对ACTB基因mRNA的捕获探针的茎部结构序列为SEQ ID NO.25；针对ACTB基因mRNA的捕获探针的序列P2为SEQ ID NO.26；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.27，P4序列为SEQID NO.28。
7.根据权利要求1-6任一项所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的长度为5－10个碱基。
8.根据权利要求7所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列为5－10个T。
9.根据权利要求1-6任一项所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、AlexaFluor 488和Alexa Fluor 750。
10.根据权利要6所述的AR-V7表达检测试剂盒，其特征在于，针对AR-V7mRNA的捕获探针中：特异性序列P1为包括有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10；
针对ACTB mRNA的捕获探针中：特异性序列P1为包括有SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110904195A (zh) * | 2019-12-24 | 2020-03-24 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种cd55基因表达检测试剂盒 |
| CN110923323A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-27 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种Twist基因表达检测试剂盒 |
| CN111621570A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-09-04 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种ck8基因表达检测试剂盒 |
| CN111621572A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-04 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种cd45基因表达检测试剂盒 |
| CN112538530A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-23 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种膀胱癌检测试剂盒 |
| CN113025691A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-06-25 | 广东品博易视生物科技有限公司 | 一种预放大核酸及其应用 |
| CN114622000A (zh) * | 2020-12-14 | 2022-06-14 | 厦门大学 | 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法 |
| CN115725727A (zh) * | 2021-08-25 | 2023-03-03 | 德路通（石家庄）生物科技有限公司 | 一种用于检测ar-v7及ar基因表达的锁式探针及试剂盒 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6380377B1 (en) * | 2000-07-14 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| AU2009250528A1 (en) * | 2008-05-19 | 2009-11-26 | Celish Fd, Inc. | RNA in situ hybridization |
| CN102864214A (zh) * | 2012-03-21 | 2013-01-09 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 非对称发夹探针及其应用 |
| CN104031993A (zh) * | 2014-05-27 | 2014-09-10 | 益善生物技术股份有限公司 | 循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法 |
-
2017
- 2017-04-05 CN CN201710217573.3A patent/CN108707662B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6380377B1 (en) * | 2000-07-14 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
| AU2009250528A1 (en) * | 2008-05-19 | 2009-11-26 | Celish Fd, Inc. | RNA in situ hybridization |
| CN102864214A (zh) * | 2012-03-21 | 2013-01-09 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 非对称发夹探针及其应用 |
| CN104031993A (zh) * | 2014-05-27 | 2014-09-10 | 益善生物技术股份有限公司 | 循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| QU,Y.Y. ET AL.: "Constitutively Active AR-V7 Plays an Essential Role in the Development and Progression of Castration-Resistant Prostate Cancer", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110904195A (zh) * | 2019-12-24 | 2020-03-24 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种cd55基因表达检测试剂盒 |
| CN110904195B (zh) * | 2019-12-24 | 2023-09-19 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种cd55基因表达检测试剂盒 |
| CN110923323B (zh) * | 2019-12-26 | 2023-09-19 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种Twist基因表达检测试剂盒 |
| CN110923323A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-27 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种Twist基因表达检测试剂盒 |
| CN111621570A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-09-04 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种ck8基因表达检测试剂盒 |
| CN111621570B (zh) * | 2020-07-03 | 2023-09-19 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种ck8基因表达检测试剂盒 |
| CN111621572A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-04 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种cd45基因表达检测试剂盒 |
| CN111621572B (zh) * | 2020-07-07 | 2023-10-20 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种cd45基因表达检测试剂盒 |
| CN112538530A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-23 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种膀胱癌检测试剂盒 |
| CN112538530B (zh) * | 2020-12-07 | 2024-02-13 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种膀胱癌检测试剂盒 |
| WO2022126721A1 (zh) * | 2020-12-14 | 2022-06-23 | 厦门大学 | 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法 |
| CN114622000A (zh) * | 2020-12-14 | 2022-06-14 | 厦门大学 | 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法 |
| CN114622000B (zh) * | 2020-12-14 | 2024-05-07 | 厦门大学 | 一种高特异性的检测靶核酸序列的方法 |
| CN113025691A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-06-25 | 广东品博易视生物科技有限公司 | 一种预放大核酸及其应用 |
| CN115725727B (zh) * | 2021-08-25 | 2023-09-15 | 德路通（石家庄）生物科技有限公司 | 一种用于检测ar-v7及ar基因表达的锁式探针及试剂盒 |
| CN115725727A (zh) * | 2021-08-25 | 2023-03-03 | 德路通（石家庄）生物科技有限公司 | 一种用于检测ar-v7及ar基因表达的锁式探针及试剂盒 |
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